HU180431B

HU180431B - Diagnosticum for detecting proteolytic enzymes

Info

Publication number: HU180431B
Application number: HU79BO1813A
Authority: HU
Inventors: Dieter Berger; Franz Braun; Werner Guethlein; Manfred Kuhr; Wolfgang Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1978-12-20
Filing date: 1979-12-19
Publication date: 1983-03-28
Also published as: US4278763A; ZA796880B; PL127198B1; PL220526A1; JPS593475B2; DK155318C; SU1156595A3; PT70608A; DK155318B; DE2960857D1; SU1184444A3; DK535679A; FI77229C; JPS5585561A; ES486932A1; FI793986A; EP0012957A1; DE2854987A1; FI77229B; AU515190B2

Description

NÉMET SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

Diagnosztikum proteolitikns enzimek kimutatására

A leukociták kimutatása a testnedvekben, különösen a vizeletben, igen nagy jelentőségű, elsősorban a vese és az urogenitális traktus megbetegedéseinek diagnosztikájában.

A meghatározást napjainkig a leukociták fárad- 5 ságos megszámlálásával végezték a nem centrifugált vizeletben vagy a vizelet üledékében.

Mindkét módszerben természetesen közös az, hogy csak ép leukocitákat lehet meghatározni. Az viszont ismert tény, hogy a leukociták lízisének .10 sebessége rendkívül eltérő és a vizelet miliőjétől függ; például erősen lúgos vizeletben a leukociták felezési ideje csak 60 perc. Ennek az lehet a következménye, hogy túl kis leukocitaszámot kapunk, illetőleg, ha hosszabb ideig áll a vizelet, álnegatív lelethez jutunk.

A lizis miatt bekövetkezett hibától eltekintve, a leukociták kvantitatív mikroszkopikus meghatározása nem centrifugált, homogenizált vizeletben számlálókamrában rendkívül megbízható értékeket ad. Ezt a módszert a gyakorlatban azonban ritkán alkalmazzák, mivel fárasztó, időrabló és alkalmazásának feltétele a szakképzett személyzet.

Az orvosi gyakorlatban a vizeletben a leukocita meghatározások túlnyomó többségét az ún. látóteres módszerrel vizeletüledékben végzik. A vizsgálandó anyagot (üledéket) centrifugálással kapják. Ennek során azonban a vizsgálandó anyag a vizelet többi alkotórészével is feldúsul, mint például a sókkal, hámsejtekkel, melyek a leukociták mik180431 roszkópos számlálását lényegesen megnehezíthetik. A változó üledéktartalom, az üledék inhomogenitásai, vagy a mikroszkóp esetlegesen eltérő nagyításai, valamint a mikroszkóp eltérő optikai felszereltsége ahhoz vezet, hogy a mikroszkóp egy látóterére megadott leukocitaszám több száz százalékosan hibás.

A találmány feladata tehát az volt, hogy olyan diagnosztikumot állítsunk elő, amelynek segítségével a testnedvekben a leukocitákat könnyen, egyszerűen kezelhető módszerrel, valamint lehetőleg gyorsan és tökéletesen lehessen kimutatni.

Ilyen típusú leukocita teszt kimutatásának alapelve egy enzimes reakció, mivel a leukociták enzim15 spektruma igen széleskörű.

A 3 087 794 számú amerikai szabadalmi leírásban leukociták meghatározását ismertetik, amelyet a granulocita leukociták peroxidatív aktivitásának hasznosításával végeznek. Hidrogén-peroxiddal és 20 valamely szerves indikátorral, például o-toluidinnal impregnált szívóképes hordozó színes oxidációs termék képződésével jelzi a granulociták jelenlétét. Az ilyen jellegű vizsgálatnak azonban döntő hátrányai vannak: o-toluidin alkalmazása esetén a 25 peroxidáz reakciókat nagy mértékben zavarja, hogy a vizeletben más redukáló anyagok is vannak, mint például aszkorbinsav. Ezenkívül több irodalmi hivatkozás [lásd például Mettler, Med. Welt. 23, 399 (1972)] is utal a leukocitaperoxidáz instabili30 tására vizeletben, aminek álnegatív lelet lehet a következménye. Még súlyosabbnak tűnik az a tény, hogy ezen vizsgálati eljárásnak várhatóan hiányos a szelektivitása az eritrocitákkal szemben.

Néhány év óta általánosan elterjedtek a hisztoés eitokémiai kimutatási módszerek, amelyek a 5 meghatározandó rendszerben levő enzimek észterolízises aktivitásán alapulnak (lásd például Pearse, A. G. E., Theoretical and Applied Histochcmistry 3. kiadás 1968. Churchill Livingstone, Edinburgh— London—New York). 10

Ennek az eljárásnak az az alapelve, hogy színtelen vagy halvány színű észtert alkalmaznak, melyek azután enzimes bontással színtelen sav és ugyancsak színtelen alkohol (fenol) alkotórészekre bomlanak. Ez utóbbit enzimes elszappanosítási követően tér- 15 mékké alakítják (például diazoniumsókkal vagy oxidatív reakcióval).

Schmalzl, F. és Braunsteiner, H. például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban specifikus eitokémiai leukocita-eszterázkimutatást ismertetnek, amely- 20 ben szubsztrátumként naftol-AS-D-klór-acetátot alkalmaznak és a színes azovegyület képzéséhez diazoniumsót.

A leukociták gyors és egyszerű kimutatására a testnedvekben, mint például a vizeletben, ilyen két komponensű rendszerek nem alkalmasak díagnosztikumként, mivel a vizeletben levő számos más vegyület — így például urobilinogén, szterkobilinogén, bilirubin stb. — is reagál a diazoniumsókkal. Ezenkívül ez a kimutatás nem elég érzékeny. Például olyan minták, amelyekben 5000 leukocita/μΐ van, nem jeleznek reakciót.

Az 1 128 371 számú brit szabadalmi leírásban a testnedvekben levő hidrolitikus enzimek kimutatására alkalmas diagnosztikumot ismertetnek. Ebben egy szívóképes hordozót itattak át színtelen indoxil- vagy tioindoxilészterrel, adott esetben pufferral és oxidálószerrel, Hidrolitikus enzim jelenlétében az észterbó'l szabad indoxil vagy tioindoxil keletkezik, és a levegő oxigénjének vagy oxidálószer hatására erős színű indigó vagy tíoindigó keletkezik. Az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett vegyületek nem alkalmasak a leukociták meghatározására, mivel 10 000 leukocita/μΐ esetén sem mutatkozik reakció.

így napjainkig sincsen a kereskedelmi forgalomban olyan tesztcsík, amely lehetővé teszi a leukociták egyszerű és gyors kimutatását a vizeletben, annak ellenére, hogy a leukociták kimutatása a 55 vizeletben az egyik leggyakrabban végzett klinikai vizsgálatok közé tartozik.

Meglepő módon azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikumot — amelynek segítségével a testnedvekben a leukocitákat jól ki 55 lehet mutatni — kapunk, ha szubsztrátumként a neutrofil leukocitákban, granulocitákban lévő észterázok (proteázok) kimutatására indoxil- vagy tioindoxil-aminosavésztereket vagy -peptidésztereket alkalmazunk. A kísérletek azt igazolták, hogy 60 ezek a szubsztrátumok a proteolitikus enzimek, így például elasztáz, kimotripszin vagy tripszin tiszta vizes oldatában, vagy testnedvekben, mint például a plazmában, szérumban, liquorban, hasnyálmirigy-váladékban, vagy a széklet vizes ki- 65 vonatában való általános kimutatására is kiválóan alkalmasak.

A találmány tárgya diagnosztikum a proteolitikus enzimek, elsősorban a testnedvekben lévő leukociták proteázainak kimutatására, ami szívóképes hordozóból, filmrétegből, porkeverékből, liofilizátumból, oldatból vagy reagenstablettából áll, amely egy vagy több kromogént és a szokásos adalékanyagokat tartalmazza, a találmány szerinti diagnosztikumot az jellemzi, hogy kromogénként valamely I általános képletü indoxil- és/vagy tioindoxil-aminosav-észtert és/vagy -peptidésztert — amelyben

Rj, R₂, R₃, R₄ jelentése lehet azonos vagy eltérő, hidrogén- vagy halogénatom, 1—4 szénatomszámú alkil, vagy 1—4 szénatomszámú alkoxiesoport.

X jelentése kénatom, vagy adott esetben 1—4 szénatomszámú rövidszénláncú alkilcsoporttal, fenil- vagy naftilcsoporttal vagy fenil- vagy naftil- (1—4 szénatomszámú)—alkilcsoporttal vagy benzoilcsoporttal szubsztituált aminocsoport,

A jelentése alifás, aromás, nem heterociklusos, természetes L-monoamino-karbonsavak valamelyike, vagy ezek D- vagy DL-alakja vagy 2—5 tagú, fenti aminosavakból álló peptidcsoport,

B jelentése a peptidkémiában szokásos nitrogénvédőcsoport — tartalmaz.

A találmány további tárgya eljárás az I általános képletü indoxil- és/vagy tioindoxil-aminosavésztereket és/vagy -peptid-észtereket tartalmazó diagnosztikumok előállítására, amelyek segítségével proteolitikus enzimeket, elsősorban a testnedvekben lévő leukociták proteázait lehet kimutatni. Valamennyi I általános képletü indoxil- és tioindoxil-aminosav-észter és -peptid-észter új vegyület.

A találmány tárgya továbbá az I általános képletű indoxil- és tioindoxil-aminosav-észterek és -peptid-észterek előállítási eljárása is.

Az I általános képletü új indoxil- és tioindoxil-aminosav-észtereket és -peptid-észtereket a peptidkémiában ismert módszerekkel állíthatjuk elő.

Előnyös — ismert módon — valamely megfelelő II általános képletü indoxil- vagy tioindoxilszármazékot — ahol az R_1; R₂, R₃, R₄ és X jelentése a fenti — egy III általános képletü aminosavval és pepiiddel — ahol az A és B jelentése a fenti —, illetve ezek egy reakcióképes származékával reagáltatunk. Reakciószármazékként például savkloridokat, illetőleg a peptidszintézisben szokásosan használt vegyes anhidrideket, például klórhangyasav-etil-észtert vagy aktív észtert alkalmazhatunk.

A II általános képletü indoxil- és tioindoxilszármazékok, valamint a III általános képletü aminosavak és peptidek ismert anyagok [lásd például Friedlaender, P. Fortschritte dér Teerfarbenfabrikation und verwandter Industriezweíge, 3—

20. kötet, illetőleg Houben—Weyl, Methoden dér organischen Chemie, 15/lk.], vagy ismert vegyületek analógiájára előállíthatok.

Az R_n R₂, R₃, R₄ szubsztituens definíciójában a

180 431 halogénatom fluor-, klór-, bróm- és jódatomot jelont, előnyösen klór- és brómatom.

Az R_1; R₂, R₃ és R₄ meghatározásában szereplő „rövidszénláncú alkoxicsoport”, valamint az R_1;R₂, R₃, Rj-ben és az X-ben szereplő „rövidszénláncú alkilcsoport” 1—4, előnyösen 1—3 szénatomot tartalmaz, a metoxi-, illetőleg a metilcsoport különösen eló'nyös.

Az A meghatározásban szereplő aminosavak elsősorban a természetes «-aminosavak, valamint ezek D-alakban, vagy racém formában. Különösen előnyös a glicin, az alanin, a Valin, a leucin, az izoleucin, a fenil-alanin és a tirozin maradéka. Az adott esetben jelenlévő szabad hidroxilcsoport acilezve, előnyösen acetilezve lehet.

Az A meghatározásban szereplő „peptidcsoport” például di-, tri-, tetra- és pentapeptidet, előnyösen di- és tripeptidet jelent, aminosav-kompenensként a fent említett aminosavakat alkalmazzuk.

A B meghatározásban szereplő „a peptidkémiában szokásos nitrogénvédőcsoport” jelentése például acil-, oxikarbonil-, tiokarbonil-, szulfonil-, szulfenil-, vinil-, ciklohexenil-, foszforil- vagy karbamoilcsoport. Számos ilyen típusú védőcsoportot ismertetnek a Houben—Weyl: Methoden dér organ Chemie-ben (15/1 k.)

A találmány szerint 1 általános képletü, kromogénként alkalmazott indoxil- vagy tioindoxilaminosavésztereket és peptidésztereket 10^-4 — 1 mól/liter, előnyösen 10^-3 — 10^_I mól/liter konceentrációban alkalmazzak, impregnálóoldatként, rétegképző anyagként vagy vizsgáló oldatként.

A proteolitikus enzimek, különösen a leukocit-ákban lévő proteázok diagnosztikumának további alkotórésze a megfelelő puffer-rendszer. Alkalmazhatunk például foszfát-, borát-, barbitvirát-, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-( =Tris)-, 2-amino-2-metil-propándiol-l,3-(=Amediol)- vagy aminosavpuffereket. A pH-értéket és a kapacitást úgy kell kiválasztanunk, hogy a mérőoldat, illetőleg a tesztcsík pH-értékét 6 és 10 közöttire állítsa be, előnyös a 7—9-es pll-érték.

A proteolitikus enzimek, különösen a testnedvekben lévő leukociták proteázainak kimutatására alkalmas találmány szerinti diagnesztikum előállításához továbbá oxidálószort is alkalmazhatunk, hogy az enzimes reakció során elsődlegesen keletkezett indoxil-, illetőleg tioindoxil-származékokat a színes indigó-, illetőleg tioindigo-vegyületté alakíthassuk át. Az oxidálószereket, így például a kálium-[hexaciano-ferrát(III)]-ot, káliumbromátot, kálium-kromátot, fenazin-metaszulfátot vagy tetrazoliumsókat az impregnálóoldathoz — 10⁴ — 1 mól/ liter, előnyösen 10³—10¹ mól/liter koncentrációban alkalmazzuk a rétegképző anyaghoz vagy a vizsgáló folyadékhoz.

A proteolitikus enzimek, különösen a leukociták proteázainak kimutatására alkalmas diganosztikum további alkotórésze egy nedvesítőszer, mivel ezzel a reakció idejét lerövidíthetjük, és részben csillogóbb színt érünk el. Előnyös a nem-ionosnedvesítőszer, de amfoter, kation- vagy anionaktív nedvesítőszert is alkalmazhatunk, 0,05-től 2%-ig terjedő koncentrációban, előnyös a 0,1—1%-os koncentráció.

A találmány szerinti szer előállításához például szívóképes hordozót, előnyösen szűrőpapírt, cellulózt vagy mesterséges szálak szövedékét alkalmazzuk, melyeket azután a tesztcsíkok előállításához szükséges és szokásos reagensek (szubsztrátum, puffer, adott esetben nedvesítőszer, oxidálószer stb.) könnyen párolgó oldószerrel, mint például vízzel, metanollal, etanollal vagy acetonnal készített oldataival impregnálunk. Ezt célszerűen két lépésben végezzük, először vizes oldattal impregnálunk, amely a puffért és a többi vízoldékony adalékanyagokat tartalmazza. Ezután az I általános képletü proteázszubsztrátum oldatával impregnálunk. Különleges esetekben fordított impregnálási sorrendet is alkalmazhatunk.

A kész tesztpapirokat önmagukban is felhasználhatjuk, vagy ismert módon hordozóra ragaszthatjuk, vagy előnyösen a Német Szövetségi Köztársaság-beli 21 18 455 számú szabadalmi leírás szerint műanyag- és finomszálú hálózat közé rögzíthetjük.

A filmréteges tesztcsíkok előállítására az összes reagenst egy filmképző anyag, így például polivinil-észter vagy poliamid oldatával vagy diszperziójával homogénné keverjük. A keveréket vékony rétegben műanyaghordozóra visszük és megszárítjuk. A találmány szerinti, filmmel bevont tesztcsíkokat szárítás után feldarabolva önmagukban is használhatjuk, vagy ismert módon hordozóra ragaszthatjuk, vagy, például a 21 18 455 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerinti, műanyag- és finomszálú hálózat közé rögzíthetjük.

A proteolitikus enzimek, elsősorban a leukociták proteázainak kimutatására alkalmas találmány szerinti diagnosztikumot porkeverék vagy reagenstabletták alakjában is előállíthatjuk, ha a vizsgálathoz szükséges és a fentiekben megadott alkotórészeket a szokásos galenusi adalékanyagokkal keverjük és granuláljuk. Ilyen jellegű adalékanyagok például a szénhidrátok, mint például mono-, oligo- vagy poliszacharidok,. vagy cukoralkoholok, mint például mannit, szorbit vagy a xilit, vagy egyéb oldékony inért vegyületek, mint poli(etilén-gikol) vagy poli(vinil-pirrolidon). A porkeverékek vagy a reagens-tabletták súlya általában körülbelül 50—200 rag, előnyös az 50—80 mg.

A liofilizátumok előállításához, amelyek összsúlya körülbelül 5—20 mg, előnyösen kb. 10 mg, először egy oldatot — amely a vizsgálathoz szükséges összes reagenst, valamint a szokásos vázképzőket, mint például poli(vinil-pirrolidon)-t és esetlegesen további töltőanyagokat, mint például manitot, szorbitot vagy xilitet tartalmaz — fagyasztva szárítjuk.

A találmány szerinti diagnosztikum oldat alakjában előnyösen a vizsgálathoz szükséges összes reagenciát tartalmazza. Oldószerként vizet vagy víz és vízzel elegyedő szerves oldószer — mint például metanol, etanol, aceton vagy dimetil-formamid — elegyet alkalmazzuk. Eltarthatóság szempontjából előnyös lehet, ha a vizsgálathoz szükséges reagenseket két vagy több oldatra osztjuk el, és csak a vizsgálat előtt közvetlenül töltjük össze.

Az így előállított diagnosztikumok lehetővé te3

180 431 szik, hogy a vizsgálandó testnedvekben bemártás, vagy pedig a kérdéses testnedvekhez való hozzáadás után a proteolitikus enzimek, különösen a leukociták proteázainak jelenlétét gyorsan és egyszerűen meghatározhassuk, színképződés alapján, amelynek mértékét vizuálisan, fotometriásan, például remissziós fotometriával, vagy küvettában mérve állapíthatjuk meg. A leukociták proteázainak sejtenkénti aktivitását lényegében konstans értéknek tekinthetjük, a vizsgált testnedvben lévő leukocita-koncentráció szabja meg a színképződés intenzitását. A találmány szerinti diagnosztikum alkalmazásával mind az intakt, mind pedig a lízises leukociták meghatározhatók, mivel a leukociták proteázainak aktivitása a leukociták lízise után is teljes mértékben megmarad. Ezért lízis miatti hiba nincsen.

1. példa

Szűrőpapírt (például Schleicher+Schüll 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impegnálunk, majd 60°C-on megszárítjuk.

1. oldat

Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 1,91 g

Desztillált víz kb. 30 ml

Az oldat. pH-ját 0,1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be Desztillált víz ad 100,0 ml

2. óidat

3—[N-(Benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol 33,8 g Aceton ad 100,0 ml

Színtelen tesztpapírt kapunk, amely leukocita-tartalmú vizeletbe mártva, a leukocita-koncentrációtól függően világos türkiztől kékig színeződik. 5000 leukocita/μΐ vizelet körülbelül 2 perc múlva, 1000 leukocita/μΐ vizelet körülbelül 6 perc múlva, 500 leukocíta/μΐ vizelet körülbelül 10 perc múlva, 200 leukocita/μΐ vizelet körülbelül 15 perc múlva, mutatható ki.

A vizsgálati módszer érzékenysége 200 leukocita/μΐ. A meghatározást remissziós fotometriával is elvégezhetjük 620 nm-nél.

Hasonló tulajdonságokkal rendelkező tesztcsíkokat (érzékenység 200—2000 leukocita/μΐ) kaphatunk, ha 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]indol helyett az alább felsorolt anyagokat alkalmazzuk; amennyiben külön említés nem történik, szintén türkiztől kék színeződés keletkezik, ha a tesztcsíkot leukocita-tartalmú vizeletbe mártjuk:

1.1. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-4-metil-indol,

1.2. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-5-metil-indol,

1.3. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-6-metil-indol,

1.4. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-7-metil-indol,

1.5. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-4-7-dimetil-indol,

1.6. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-4-klór-indol,

1.7. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-5-bróm-indol,

1.8. 3- [N-(benzil-oxi-karbonil) -L-alanil-oxi ]-6-

-klór-indol, színeződés: színtelentől bíborszínig.

1.9. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-alanil-oxi]-4-klór-5-bróm-indol,

1.10. 3- [N-toluol-4’-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-4-klór-5-bróm-7-metil-indol,

1.11. l-metil-3- [N-(benzil-oxi-karbonil) -L-alanil-oxi]-indol, színeződés: színtelentől zöldig,

1.12. l-benzil-3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-alanil-

-oxi]-indol, színeződés: színtelentől zöldig,

1.13. l-benzoil-3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színeződés: színtelentől ibolyaszínűig,

1.14. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-glicil-oxi]-indol,

1.15. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-glicil-oxi]-indol,

1.16. 3-[N-(toluol-2’-szulfonil)-L-alanil-oxi]-idol,

1.17. 3-[N-(toluol-3’-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.18. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.19. 3-[N-(toluoI-4’-szulfoniI)-D-aIaniI-oxi]-indol,

1.20. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-D,L-alanil-oxi]-indol,

1.21. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-oxi]-indol,

1.22. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-valil-oxi]-indol,

1.23. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-leucil-oxiJ-indol,

1.24. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-izoleucil-oxi]-indol,

1.25. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-fenil-alanil-oxi]-indol,

1.26. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-fenil-alanil-oxi]-indol,

1.27. 3- [N-(benzil-oxi-karbonil) -L-tirozil-oxi ]-indol,

1.28. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-L-tirozil-oxi]-indol,

1.29. 3-[N-(toluoI-4’-szulfoniI)-0-acetil-L-tirozil-oxi]-indol,

1.30. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-oxi]-indol,

1.31. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-D-alanil-L-alanil-oxi]-indol,

1.32. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-L-alanil-oxi ]-indol,

1.33. 3-[N-(toluol-4’-szulfonil)-D-alanil-D-alanil-L-alanil-oxi ]-indol,

1.34. 3- [N-formil-L-alanil-oxi ]-indol,

1.35. 3- [N-acetil-L-alanil-oxi ]-indol,

1.36. 3- [N-szukcinil-L-alanil-oxi ]-indol,

1.37. 3.[N-benzoil-D,L-alanil-oxi]-indol,

1.38. 3- [N-ftaloil-L-alanil -oxi]-indol,

1.39. 3-[N-(etoxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.40. 3-[N-(terc-butil-oxi-karbonil)-L-aIanil-oxiJindol,

1.41. 3-[N-(3’,6’-dioxa-n-heptil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.42. 3-[N-(ciklohexiI-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.43. 3-[N-(fenil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.44. 3-[N-(4’-metil-benzil-oxi-karbonil)-L-alaml-oxi]-indol,

1.45. 3-[N-(4’-metoxi-benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.46. 3-[N-(4’-nitro-benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.47. 3-[N-(N’-{piperidino}-oxi-karbonil)-L-alanil-

-oxi]-indol,

180 431

1.48. [N-(furil-{2’}-metoxi-karbonil)-L-alanil-oxiJ-

-indol,

1.49. 3-[N-(tienil-{2’}-metoxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.50. 3-[N-(benzil-tiokarbonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.51. 3-[N-(metánszulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.52. 3.[N-(benzjl-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.53. 3-[N-(benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.54. 3-[N-(4’-bróm-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxij-indol,

1.55. 3-[N-(4’-nitro-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.56. 3- [N-(4’-dimetil-amino-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.57. 3-[N-(4’-acetil-amino-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.58. 3-[N-(4’-n-butil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.59. 3-[N-(4’-terc-butil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.60. 3-[N-(4’-n-oktil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.61. 3-[N-(4’-hidroxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.62. 3-[N-(4’-metoxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.63. 3-[N-(4’-benzil-oxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.64. 3[N-(4'%3''-oxa-5-hidroxi-n-pentiloxi}-benzol-szulf onil) - 1-alanil-oxi ]-indol,

1.65. 3-[N-(4'-{3-di-oxa-n-heptil-oxi}-benzil-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol

1.66. 3-[N-(4'-{2-hidroxi-etil}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.67. 3-[N-(4'-{2-klór-etil}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.68. 3-[N-(4'-ciano-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.69. 3-[N-(4'-karboxi-benzol-szulfonil)-L-aIanil-oxi[-indol,

1.70. 3-[N-(4^,-metoxi-karbonil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.71. 3- [N-(4'-benzil-oxi-karbonil-benzol-szulfonil) -L-alanil-oxi ]-indol,

1.72. 3-[N-(4'-karbamoil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.73. 3-[N-(4'-{dimetil-karbamoil}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.74. 3-[N-(4'-karboxi-metil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.75. 3-[N-(4'-karboxi-metoxi-bénzol-szulfonil)-L-alanil-oxiJ-indol,

1.76. 3-[N-(4'-karboxi-metil-amino-benzol-szul-fonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.77. 3-[N-(4'-{benziloxi—karbonil-metilaminoj-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.78. 3-[N-(4'-fluor-benzol-szulfonil)-L-alani]-oxi]-indol,

1.79. 3-[N-metil-N-(toIuol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.80. 3-[N-acetil-N'-(toluol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.81. 3-[N-(2',4',6'-trimetil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.82. 3-[N-(bifenil-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.83. 3-[N-(naftalin-2'-gzulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.84. 3-[N-(4'-acetil-amino-naftalm-l'-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.85. 3- [N-(5'-dimetil-amino-naf talin-l'-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol,

1.86. 3-[N-(kinolin-8'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.87. 3-[N-(piridin-3'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-

-indol,

1.88. 3-[N-(2'-nitro-benzol-szulfenil)-L-alanil-oxi]-indol, színeződés: sárgától zöldig,

1.89. 3-[N-(l'-metil-2'-benzoil-vinil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.90. 3-[N-(5',5-dimetil-3'-oxo-ciklohexen-l'-il)-L-alanil-oxi]-indol,

1.91. 3-[N-(difenil-karbamoil)-L-alanil-oxi]-indol,

1.92. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-5-metoxi-indol.

2. példa

Szűrőpapírt (például Schleicher+Schüll 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impregnálunk és azután 60°C-on megszárítjuk.

1. oldat

Trisz (hidroxi-metil)-aminometán 0,61 g

Kálium-[hexaciano-ferrát(III)] 32,9 mg

Desztillált víz kb. 30 ml

Az oldat pH-ját 0,1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be. Desztillált víz ad 100,0 ml

2. oldat

3-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-benzo[b]-tiofén 35,5 mg

Aceton ad 100,0 ml

Sárga színű tesztcsíkot kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe bemártva piros színű lesz.

A vizsgálati módszer érzékenysége körülbelül 1000 leukocita/μΐ vizelet

A kiértékelést remissziós fotometriás úton is elvégezhetjük 576 mm-nél.

Az 1. példa szubsztrátumaival és oxidálószerekkel, mint például a fent alkalmazott kálium- [hexaciano-ferrát(III)]-tal, vagy például kálium-bromáttal, kálium-kromáttal, fenazin-metoszulfáttal vagy tetrazoliumsókkal olyan tesztcsíkokat kaphatunk, amelyeknek az oxidálószerek nélküli analóg tesztcsíkokkal szemben, részben kis mértékben rövidebb a reakcióidejük.

3. példa

Szűrőpapírt (például Schleicher+Schüll 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impregnálunk, majd 60°C-on megszárítjuk.

1. oldat

Dinátrium-teraborát-dekahidrát 1,91 g

Desztillált víz kb. 30 ml

Nonilfenil-poliglikoléter (Arkopon NO40, Hoechst AG) , . 0,2 g

-511

180 431

2. oldat 3-[N-(Benzil-oxi-karbonil)-L-alaniI-oxi]-indol 33,8 g

Aceton ad 100,0 ml

Színtelen tesztcsíkot kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe bemártva világos türkiztől kékig színeződik, a leukocita tartalomtól függően. Az

1. példa receptúrájához képest a reakcióidő kissé rövidebb és valamivel élénkebbek a színek.

Az 1. és 2. példa egyéb szubsztrátumaival és nedvesítőszerekkel, mint például a fent alkalmazott nonílfeníl-poliglikoléterrel (nemionos), de például kókuszimidazolin-vegyületekkel, [Miranol-CM conc. (Miranol Chem. Co. Amerikai Egyesült Allamok-beli cég készítménye)] (amfoter) is, vagy benziltrimetil-ammónium-kloriddal (kationaktív) vagy nátrium-szulfonát-dodecilbenzollal (anionaktív) is előállíthatunk olyan tesztcsíkokat, melyeknek az analóg, nedvesítőszert nem tartalmazó tesztpapírokhoz képest reakcióideje kis mértékben rövidebb, és a színek valamivel élénkebbek.

4. példa

1. óidat

3-[N-Benzoil-D,L-alaniloxid]-indol 154,2 mg

Metanol ad 100,0 ml

2. oldat

Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 7,63 g

Desztillált víz kb. 50 ml

Az oldat pH-ját 1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be. Desztillált víz ad 100,0 ml

Kémcsőben összekeverünk: az 1. oldatból 1 ml-t, a 2. oldatból 1 ml-t és a leukocita-tartalmú vizeletből 2 ml-t.

A keverék a leukocita-koncentrációtól függően világos zöldtől mély kékig színeződik.

Szobahőmérsékleten 10 percig hagyjuk állni, a leukocitakoncentrációt vizuálisan összehasonlító oldatokkal vagy fotometriásan például 620 nm-nél lehet meghatározni.

A vizsgálat érzékenysége 200 leukocital/μΐ vizelet

Az 1. és 2. példa egyéb szubsztrátumaival is lehet hasonló érzékenységű (200—lOOO/leukocita/μΙ vizelet) vizsgálatokat végezni, kémcsövekben vagy küvettában.

5. példa

Egy tabletta, amelyben 3-[N-(4'-karboxi-metil-amino-benzol-szulfonil)-L-alaniloxi]-indol 2,0mg kálium-dihidrogén-foszfát 0,8mg dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát 16,8mg mamiit ad 70,0 mg van, 2 ml leukocitákat tartalmazó vizelethez adunk. A vizelet fokozatosan elszíneződik a leukocita-tartalomtól függően — világos zöldtől sötétkékig. A keveréket 10 percig állni hagyjuk szobahőmérsékleten, majd a leukocita-koncentrációt összehasonlító színsorozattal vizuálisan vagy fotometriásan, például 1 cm-es mikroküvettában 620 mn-nél meghatározzuk.

A vizsgálat érzékenysége körülbelül 200 leukocita/μΐ vizelet. A reakcióidőt lényegesen lerövidíthetjük, ha az inkubációt 37°C-on végezzük.

Az 1. és 2. példában szereplő egyéb anyagokkal is hasonló érzékenységet (200—1000 leukocita/<xl) érhetünk el, ajánlatos a nehezen oldódó anyagokhoz szerves oldószereket, például metanolt vagy dimetil-formamidot adni.

6. példa

Szűrőpapírt (például Schleicher+Schüll 23 SL) egymás után a következő oldatokkal impregnálunk, majd 60°C-on szárítjuk.

1. oldat

Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 1,91 g

Desztillált víz kb. 30 ml

Az oldat pH-ját 0,1 n sósavval 8,0-ra állítjuk be Desztillált víz ad 100,0 ml

2. oldat 3-[N-(toluol-4'-szulfoml)-L-tirozil-oxi]-indol 45,1 mg

Aceton ad 100,0 ml

Színtelen tesztpapírt kapunk, amely kimotripszin proteolitikus enzimet tartalmazó vizes oldatba mártva kékre színeződik. 0,02 E kimotripszin/ ml-es koncentrációt még 6—7 perc múlva is kimutathatunk.

A megadott enzimaktivitást N-acetil-L-tirozinetilészterrel mint szubsztrátummal határoztuk meg 25°C-on, pH=7,0-nél és λ =237 nm-nél.

Az 1. és a 2. példa egyéb szubsztrátumaival — az aminosav-, illetőleg peptidcsoporttól függően — is kimutathatunk kimotripszint, vagy más proteolitikus enzimeket, például elasztázt vagy tripszmt, vizes oldatokban, vagy például testnedvekben, például teljes vérben, szérumban, liquorban, pankreász-váladékban vagy a széklet vizes kivonatában.

7. példa 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alaniloxi]-indol

1. oldat

A savkloridot egylépcsős módszerrel úgy állítjuk elő, hogy 5,35 g (0,022 mól) N-(toluol-4-szulfonil)-l-alanint 20 ml abszolút dimetil-formamidban (DMF) oldunk, és —30°C-ra hűtjük, majd keverés és hűtés közben 1,76 ml (0,024 mól) tíonil-kloridot pipettázunk hozzá, és a reakcióelegyet 30 percen át —30°C-os hűtőfürdőben hagyjuk.

2. oldat

Keverővei, hőmérővel és gázelvezetővel és -bevezetó'vel ellátott 250 ml-es háronmyakú lombikba — amelyből a levegőt teljes mértékben eltávolítóttűk gyenge nitrogénáram segítségével — 2,90 g (0,022 mól) indoxil (3-hidroxi-indol) 40 ml abszolút dimetil-formamiddal készített oldatát töltjük, majd 9,74 ml abszolút piridint adunk hozzá, és —15°C-ra hű tjük.

Reakció

Az 1. oldatot a 2. oldathoz öntjük, majd oxigén és víz kizárásával körülbelül 5 órán át —15°C-on keverjük, amíg vékonyréteg-kromatográfiásan indoxil már nem mutatható ki.

A reakcióelegyet vákuumban maximálisan 40— 50’C-os hőmérsékleten bepároljuk. A maradékot 100 ml etil-acetátban felvesszük, és kétszer 30—30 ml 1 n citromsavval, 20 ml vízzel, 50 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 25 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist- nátrium-szulfát fölött szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. Az így kapott nyers terméket oszlop-kromatográfiásan kovasav-gélen toluol-dioxán (9:1) arányú elegyévcl tisztítjuk. Az oldószert az összegyűjtött frakciókból vákuumban ledesztillálva, majd a maradékot éterrel összekeverve 1,45 g (18,4%) 3-[N(toluol-4'-szulfonil)-L-alaniloxi ]-indolt kapunk, színtelen kristályok alakjában; op.-ja 103°C;

[a];,⁰: —56,6° (c=l%, metanolban),

A fent említett oszlop-kromatográfiás elválasztás egyéb frakcióiból melléktermékként 0,89 g (11,3%) 1 - [N-( toluol-4'-szulf onil) -L-alaniloxi ]-3-hidroxi-indolt = l-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alaniloxi]-3-oxo-indolint kapunk etil-aeetátból átkristályosítva színtelen kristályok alakjában, op. 187—188 °C, [α]ζ^ο:—41,7° (c = l%, dimetil-formamidban).

Ennek analógiájára állíthatjuk elő a megfelelően szubsztituált indoxil-származékőknak a megfelelő aminosavakkal való reagáltatásával a következő szubsztrátumokat, minden esetben (a 7.23.-7.27. kivételével) melléktermékként a fent megadott 1-szubsztituált 3-hidroxi-indolok keletkeznek:

7.1. 3-[N-(benzil-oxi-karboniI)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 123 °C. [a]n°: —49,0°, c =1% (metanolban);

7.2. 3- [N-(benzil-oxi -karbonil) -L-alanil-oxi ]-4-metil-indol, színtelen kristályok, op.: 113 °c, [<x]o°: —44,6°, c = 1% (metanolban);

7.3. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-5-metil-indol, színtelen kristályok, op.: 143— 144°C, [a]/: —48,2°, c = 1% (metanolban);

7.4. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-6-metil-indol, színtelen kristályok, op.: 148°C, [a]n : —49,0°, c= 1% (metanolban).

7.5. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-7-metil-indol, színtelen kristályok, op.: 146 °C, [a%“: —51,2°, c = 1% (metanolban);

7.6. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-4,7-dimetil-indol, színtelen kristályok, op.: 212 °C, [ajn : —46,3°, c = 1% (metanolban);

7.7. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-4-klór-indol, színtelen kristályok op.: 142— 143 °C, [a]Ő°: —61,4°, c =1% (metanolban);

7.8. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-5-bróm-indol, színtelen kristályok, op.: 138°C, —28,0°, c= 1% (metonalban);

7.9. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-6-klór-indol, színtelen kristályok, op.: 170°C, [a]°: —41,3°, c = 1% (metanolban);

7.10. [N-(toluol-4'-szulfoniI)-L-alanil-oxi]-4-klór-5-bróin-indol, színtelen kristályok, op.: 150—152 °C, [α]π : —31,0°, c = 1% (metanolban);

7.11. 3-[N-(toIuol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-4-klór-5-bróm-7-metil-indol, halvány homokszínű kristályok, op.: 143— 145 °C, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen (futtatószer: toluol-dioxán 2:1 arányú elegye; értékelés: ultraibolya, HN₃ (gáz) R,-értéke: 0,56);

7.12. l-metil-3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 92 °C, [a];,⁰: —49,5 ’C, c = 1% (metanolban);

7.13. l-benzil-3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxij-indol, színtelen kristályok, op.: 149—152 °C, [«];»: —54,9 °C, c = 1% (dimetil-formamidban);

7.14. l-benzoil-3-[N-(toluol-4]-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok op.: 155—156 °C, [a]/°: —54,7° c = 1% (dimetil-formamidban);

7.15. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-gliciloxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 122—124 °C;

7.16. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-gliciloxi]-indoI, színtelen kristályok, op.: 103—105 °C;

7.17. 3-[N-(toluol-2'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen amorf por, [a];,⁰: —62,5°, c = = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen (futtatószer: toluol-dioxán 9:1 arányú elegye;

értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,20);

7.18. 3-[N-(toiuol-3'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 94 °C, [a]p°: — —54,9°, c= 1% (metanolban);

7.19. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-D-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 98 °C, [“]d⁰: +53,1°, c= 1% (metanolban);

7.20. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-D,L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok op.: 110—111 °C;

7.21. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-valil-oxí]-indol, színtelen kristályok, op.: 64—65 °C, [a]Ő“: = —41,1°, c = 1% (metanolban);

7.22. 3[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-leucil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 73—75 °C, [a]n : —42,4°, c = 1% (metanolban);

7.23. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-izoleucil-oxi]-indol, színtelen, amorf por, [a]n : —30,6°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél-lemezen (futtatószer: toluol-dioxán 2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), Rj-értéke: 0,57);

7.24. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-fenil-alanil-oxij-indol, sárgás kristályok, op.: 125 °C, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen (futtatószer: toluol-dioxán 9:1

-715 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gaz), R,-értéke: 0,56);

7.25. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-fenil-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 167—169 °C, [a]ő°: —34,4°, e = 1% (metanolban);

7.26. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-tirozil-oxi]-indol, színtelen amorf hab, [<x]d : —22,6°, c = 1 (metanolban), vékonyrétegkromatográf ia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,27);

7.27. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-tirozil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 171 °C, [a]n : —28,3°, c = 1% (metanolban);

7.28. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-0-acetil-L-tirozil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 168—170 °C, [α]ζ^ο: —24,1°, e = 1% (dimetil-formamidban);

7.29. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 144 °C, [a]p : —17,3°, c = 1% (metanolban);

7.30. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-D-alanil-L-alanil-oxi]-indol, sárgás amorf hab, [a]n : +5,8°, c= 1 (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,19);

7.31. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-L-alanil-oxi ]-indol, színtelen kristályok, op.: 156 °C, [a]o“: —39,5°, c = 1% (metanolban);

7.32. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-D-alanil-D-alanil-L-alanil-oxi ]-indol, színtelen kristályok, op.: 216 °C, [α]η°; +53,8°, c = 1% (metanolban);

7.33. 3-[N-acetil-L-alanil-oxi]-indol, színtelen amorf hab, [a]n : —12,5°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: etil-ecatát-diklór-metán: 10:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH_S (gáz), R,-értéke: 0,33);

7.34. 3-[N-szukcinil-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 142 °C, [a]'⁰: —63,9° , c = 1% (metanolban);

7.35. 3-[N-benzoil-D,L-alanil-oxi]-índol, színtelen kristályok, op.: 171 °C;

7.36. 3-[N-ftaloil-oxi-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 58 °C, [a]ő°: —26,3°, c= 1% (metanolban);

7.37. 3-[-N(etoxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 96 °C, [a]™:—69,8°, c = 1% (metanolban);

7.38. 3-[N-(ciklohexil-oxi-kabronil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 149 °C, [oc]*°: —60,4°, c = 1% (metanolban);

7.39. 3-[N-(feniloxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 161 °C, [a]°°: —96,0°, c = 1% (metanolban);

7.40. 3-[N-(4'-metil-benzil-oxi-karbonil)-L-alanil-oxij-indol, színtelen kristályok, op.: 135 °C, [α]ζ°: —45,9°, c = 1% (metanolban);

7.41. 3-[N-(4'-nitro-benziloxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, sárgás kristályok, op.: 160 °C, [a]/: —29,4°, e = 1% (metanolban);

7.42. 3-[N-(benzil-tiokarbonil)-L-alanil-oxiJ-indol, színtelen kristályok, [a],,°: —77,8°, c = 1% (metanolban);

7.43. 3-[N-(metán-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 164—466 °C, [a]Ő°: —54,0°, c = 1% (metanolban);

7.44. 3-[N-(benzil-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen, viszkózus olaj, [α]ρ — 54,8°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-etilacetát 2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,40);

7.45. 3-[N-(benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen, viszkózus olaj, [a]*°: —59,8°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-etil-acetát 2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,48);

7.46. 3-[N-(4'-bróm-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, sárgás, amorf por vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,39);

7.47. 3-[N-(4'-nitro-benzpl-Szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 136—137 °C, [a]],⁰: —35,9°, c = 1% (metanolban);

7.48. 3-[N-(4'-acetil-amino-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol, színtelen kristályok, op.: 162—163 °C, [a];,⁰ —57,2°, c = 1% (metanolban);

7.49. 3-[N-(4'-n-butil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxij-indol, színtelen kristályok, op.: 105 °C, [a]n : —46,1°, c — 1% (metanol);

7.50. 3-[N-(4'-terc-butil-benzol-szulfonil)-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 140 °C, [a]”: —43,3°, c = 1% (metanolban);

7.51. 3-[N-(4'-n-oktil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol„ színtelen kristályok, op.: 57 °C, [a]o°: —34,2°, c = 1% (metanolban);

7.52. 3-[N-(4'-hidroxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, viszkózus, halványpirosas olaj, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán: 1:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,62);

7.53. 3-(N-(4'-metoxi-benzol-szulfonil)-L-alanil17

180 431

-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 126— 128 °C,

%]%—54,3°, c = 1% (metanolban);

7.54. 3-[N-(4'-benzil-oxi-benzol-szulfonil)-Lalanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 112 °C, [a]^“: —40,3°, c = 1% (metanolban);

7.55. 3-[N-4'-{2-hidroxi-etoxi}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol;

7.56. 3-[N-(4'-{3-oxa-5-hidroxi-n-pentil-oxi}-benzol-szulfonil-)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen, viszkózus olaj, [«]/': — 36,4°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-ecetsavas-etilészter 1:10 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,37);

7.57. 3-[N-(4'-{3,6-di-oxa-n-heptil-oxi}-benzol-szuIfoniI)-L-alanil-oxi]-indol, halványpirosas, viszkózus olaj, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH_a (gáz), R,-értéke: 0,21);

7.58. 3-[N-(4'-(2-hidroxi-etil}-benzol-szulfonil)L-alanil-oxi ]-indol, sárgás, amorf por, [aj|,°: —54,5°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-hromatográfía: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-ecetsavas-etilészter 1:2 arányú elegye, értékelés: UV, NH_a (gáz), R,-értéke: 0,26);

7.59. 3-[N-(4'-{2-klór-etil}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, halványpirosas, amorf hab, [“Id —48,3^P, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-otil-acetát 5:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH_a (gáz), R,-értéke: 0,20);

7.60. 3-[N-(4'-ciano-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 131 °C, [a]Ő°: —47,0°, c = 1% (dimetil-formamidban);

7.61. 3-[N-(4'-karboxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 143 °C, [a]“°: —51,0°, c = 1% (metanolban);

7.62. 3-[N-(4'-benzil-oxi-karbonil-benzol-Szulfonil) -L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 178 ’C, [oc]d°: —42,8°,c=l% (acetonban);

7.63. 3-[N-4'-karbamoil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indoI, színtelen kristályok, op.: 206 °C, [α]π°:—58,0°, c= 1% (acetonban);

7.64. 3-[N-(4'-{dimetil-karbamoil}-benzolszulf onil) -L-alanil-oxi ]-indol, színtelen kristályok, op.: 170—172 °C, [a]p°: —46,4°, c = 1% (dirnetilformamidban);

7.65. 3-[N-metil-N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 82 °C, [a]n : —42,2°, c = 1% (metanolban);

7.66. 3-[N-(2',4', 6'-trimetil-benzol-szulfonil)-L-

-alanil-oxij-indol, * színtelen kristályok, op.: 192—194 °C, [α]π : —63,8°, c = 1% (metanolban);

7.67. 3-[N-(bifenil-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 159 °C, —42,0°, c = 1% (metanolban);

68. 3-[N-(naftalin-2'-szulfonil)-L-alanil-oxiJ15 -indol, halványpirosas kristályok, op.: 103—105 °C, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH_a (gáz), R,-értéke: 0,41);

7.69. 3-[N-(4'-acetil-amino-naftalin-l'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 129—132 °C, [a]n : —63,2°, c = 1% (metanolban);

7.70. 3-[N-(5'-dimetil-amino-naftalin-l'-szulfonil)-L-alanil-oxi ] -indol, színtelen kristályok, op.: 170 °C, [a]?,”: —30,7°, c = 1% (metanolban);

7.71. 3-[N-(benzil-oxi-karbonil)-L-alaniI-oxi]-benzo[b]- tiofén, színtelen viszkózus olaj, [a]n : —42,2°, c = 1% (metanolban); vékonyrétegkromatográfia: kovasavgél 35 lemezen, (futtatószer: diklór-metán, értékelés: UV, NaOH/K₃Fe(CN),, R,-értéke: 0,13);

8. példa

- [N-(terc-butil-oxi-karbonil)-L-alaniloxi ]-indol

A karbodiimid eljárás szerinti reakcióhoz 3,23 g (0,017 mól) N-terc-butiloxi-karbonil-L-alanint és 2,27 g (0,017 mól) indoxilt 100 ml abszolút dioxán45 -diklórmetán 1:1 arányú elegy ében oldunk. 3,87 g (0,019 mól% diciklohexil-karbodiimidet (DCC) 20 ml abszolút dioxánban oldunk, és az előző oldathoz adjuk, majd a keveréket víz és oxigén kizárásával szobahőmérsékleten 68 órán át vákuumban kever50 jük. A kivált Ν,Ν'-diciklohexil-karbamidot leszívatjuk, az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot körülbelül 100 ml etil-acetátban oldjuk. A még kivált Ν,Ν'-diciklohexil-karbamidot leszívatjuk, és a tiszta etil-acetát-oldatot egymás után kétszer 55 mossuk az alábbiakkal: 30 ml 1 n citromsav, 20 ml víz, 50 ml 5—10%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat és 25 'ml víz. Ezután nátrium-szulfát fölött szárítjuk, majd az etil-acetátos fázist vákuumban bepároljuk. Az amorf maradékot kovasav60 gélen oszlopkromatográfiásan toluol-dioxán 9:1 arányú elegyével tisztítjuk.

Az összegyűjtött frakciókat vákuumban bepápároljuk, majd a maradékot etil-acetát-éter 1:10 arányú elegyében átkristályosítjuk. 1,04 g (20%) 65 3-[N-(terc-butil-oxi-karbonií)-L-alaniloxi]-indolt

-919

180 431 kapunk, színtelen kristályok alakjában, op. 158 ’C, [«];“: — 65,0’ (c = 1%, metanol).

Ebben a reakcióban is keletkezik 1-helyzetben szubsztituált 3-hidroxi-indol (lásd 7. példa).

Ennek analógiájára állíthatjuk elő a megfelelően szubsztituált indoxilvegyületeknek megfelelő aminosavakkal való reakciójával a következő szubsztrátumoKat, és ezeknél is minden esetben 1-helyzetben szubsztituált 3-hidroxi-indolok keletkeznek melléktermékként:

8.1. 3-[N-formil-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 121—122 ’C, [a]n : —2,5°, c - 1% (metanolban);

8.2. 3-[N-(4'-metoxi-benzil-oxi-karbonil)-l-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 92 ’C, [“Jd⁰ = —42,9°, c = 1% (metanolban);

8.3. 3-[N-(Npiperidino}-oxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 104 ’C, [a]/,’ = —24,7°, c = 1% (metanolban);

8.4. 3-[N-(tienil-(2')-metoxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 134 ’C, [a|;,° : —55,7°, c = 1% (metanolban);

8.5. 3-[N-(kinolin-8'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, amorf, halványpírosas por, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,23);

8.6. 3-[N-(difenil-karbamoil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 188—190 °C, [a]o“ : +22,2°, c = 1% (piridinben).

9. példa 3-[N-(furil-[2'}-metoxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol

Az aktív észteres eljárás szerinti reakcióhoz 4,26 g (0,02 mól) N-furil-{2'}-metoxi-karbonil)-L-alanint és 5,4 g (0,04 mól) N-hidroxi-benzotriazolt oldunk 50 ml abszolút tetrahidrofuránban (THF), 0°C-ra lehűtjük, majd hozzáadunk 4,4 g (0,022 mól) diciklohexil-karbodiimid (DCC) 10 ml abszolút tetrahidrofuránnal készített oldatát. Az aktív észter előállításához a reakcióelegyet 1,5 órán át 0 °C-on, majd szobahőmérsékleten 2 órán át kiérjük. Ezt követően oxigén és víz kizárásával 2,66 g (0,02 mól) indoxilt és 2,77 ml (0,04 mól) abszolút trietil-amint adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órán át keverjük. A keletkezett N,N'-diciklohexilkarbamidot leszívatjuk, az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, és a maradékot 7. példában ismertetett módon feldolgozzuk. A kapott amorf nyers terméket kovasavgélen oszlopkromatográfiásan toluol-etil-acetát 5:1 arányú elegyével tisztítjuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk, és etil-acetát-petroléter 1:1 arányú elegyéből átkristályosítjuk. 3 g (45,7%)3-[N-(furil-[2'}-metoxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indolt kapunk, színtelen kristályok alakjában, olvadáspontja 129 °C; [a]n : —51,9° (c = 1%, metanolban).

Ennek analógiájára állíthatjuk elő a megfelelően szubsztituált aminosavak vagy peptidek és a megfelelő indoxilvegyiiletek reakciójával a következő termékeket is:

9.1. 3-[N-(toluol-4'-szulfonil-L-vaIil-oxi]-indoI, színtelen kristályok, op.: 125—127 ’C, [α]θ°: —24,5°, c = 1% (metanolban);

9.2. 3-[N-(4'-dimetil-amino-benzol-szulfonil)-L-

-alanil-oxi]-indol, amorf, halványpirosas por, vékonyrétegkromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 3:1 arányú elegye, 10 értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,25);

9.3. 3-[N-(4'-metoxi-karbonil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 140;—141 ’C, [a]’°: —40,3°, c = 1% (metanolban);

9.4. 3-[N-(4'-karboxi-metil-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol, amorf, színtelen hab, ]«]?“: —82,1°, c = 1% (metanolban); vékonyrétegkromatográfia: kovasavgél leme20 zen (futtatószer: izopropanol-ecetsav-n-butilészter-víz 5:3:2 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,68);

9.5. 3-[N-(4'-karboxi-metoxi-benzol-szulfonil)-L-

-alanil-oxi]-indol, amorf, színtelen hab, [α]π°: —47,7°, c = 1% (metanolban); vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán-jégecet 6:2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R_f-értéke: 0,27);

9.6. 3-[N-(4'-karboxi-metilamino-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi ]-indol, színtelen kristályok, op.: 151—153 °C (bomlással), [a]2°: —71,5°, c = 1% (metanolban);

9.7. 3-[N^z-(4'-{benzil-oxi-karboniI-metil-amino}-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 110—113 °C, [α]ξ°: —60,0°, c = 1% (metanolban);

9.8. 3-[N-(4'-fluor-benzol-szulfoni1)-L-alanil-oxi]-

-indol, színtelen kristályok, op.: 94—95 ’C, —48,5°, c = 1% (metanolban);

9.9. 3-[N-acetil-N-(toluol-4'-szulfonil)-L-alanil-

-oxi]-indol, színtelen, amorf por, [a];,: —10,6°, c = 1% (metanolban), vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 9:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,17);

9.10. 3-[N-(piridin-3'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol, színtelen kristályok, op.: 155—157 ’C, [α]®°: —55,1°, c = 1% (metanolban);

9.11. 3-[N-(5',5'-dimetil-3'-oxo-ciklohexen-l'-il)-L-alanil-oxij-indol, gg színtelen kristályok, op.: 154 ’C·, [a]n“: —272,2°, c = 1% (metanolban);

9.12. 3-[N-(toloul-4'-szulfonil)-L-alanil-oxi]-5-metoxi-indol, színtelen, viszkózus olaj, —46,8°, c =

1% (metanolban).

-1021 vékonyréteg-kromatográfiai kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-ecetsavas-etilészter 2:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R_t-értéke: 0,45).

10. példa 3-[N-(3',6'-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol

A vegyes-anhidrid-eljáiás szerinti reakcióhoz 3,52 g (0,015 mól) N-(3,6-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alanint 35 ml abszolút tetrahidrofuránban oldunk. Az elegyhez 2,1 ml (0,015 mól) trietil-amint adunk, —15 °C-ra hűtjük, és a vegyes anhidrid előállításához 1,43 ml (0,015 mól) klórhangyasavas etil-észterrel elegyítjük. 1 órán át keverjük —15 °Con, majd oxigén és víz kizárásával 2,00 g (0,015 mól) indoxil 20 ml tetrahidrofuránnal készített és —15 °C-ra lehűtött oldatát adjuk hozzá. Az elegyet további 2 órán át —15 °C és —20 °C közötti hőmérsékleten keverjük, és éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. A képződött trietilamin-hidrokloridot leszívatjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot a 7. példában ismertetett eljárás szerint feldolgozzuk. Az amorf, nyers terméket oszlop-kromatográfiásan kovasavgélen először metilénklorid — metanol 95:5 arányú elegyével, majd toluol — metil -etilketon 1:2 arányú elegyével tisztítjuk. Az összegyűjtött frakciókat aktív szénnel kezelve, az oldószer eltávolítása után 0,51 g (9,5%) színtelen viszkózus olajként 3-[N-(3',6'-dioxa-n-heptiloxi-karbonil)-L-alanil-oxi]-indolt kapunk. [a]Ő°: —40,4° (c = 1%, metanolban). Vékonyréteg-kromatográfia: előregyártott kovasavgél (futtatószer: toluol — metiletilketon 1:2 arányú elegye), értékelés ultraibolya fényben, NH₃ (gáz), R_t értéke: 0,54.

Ezzel analóg módon állíthatjuk elő a megfelelően szubsztituált aminosavak és indoxil vegyületek reagáltatásával a következő termékeket:

10.1. 3-[N-(2'-nitro-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]indol, sárga kristályok, op.: 133—134 ’C, [α]%. —116,0°, c = 1% (metanolban);

10.2. 3-[N-(l'-metil-2'-benzoil-vinil)-L-alanil-oxi]indol, halványpirosas kristályok, op.: 130—133 °C, vékonyréteg-kromatográfia: kovasavgél lemezen, (futtatószer: toluol-dioxán 4:1 arányú elegye, értékelés: UV, NH₃ (gáz), R,-értéke: 0,45).

11. példa

A következőkben felsorolt, alaposan homogeni-

zált filmréteg-masszát 100 μπι vastagságú rétegben
visszük fel polikarbonát fóliára:
3%-os vizes nátrium-alginát-oldat	15 g
poli(vinil-propionát)	16 g
kovaföld	24 g
kál ium-dihidrogén-f oszf át	0,2 g
dinátrium-hidrogén-foszfát. 2H₂O	4,2 g
ionmentesített víz	35 g

3-[N-(toluol-4'-szulfonil)-L-aIanil-oxi]-indol 7,2 mg ml etanollal készített oldata

Az így rétegzett fóliát 50 °C-on szárítjuk és felvágjuk, ezt követően színtelen tesztcsíkokat kapunk, amelyek leukocita-tartalmú vizeletbe mártva — a leukocita koncentrációtól függően — világos türkisztől kékig színeződnek.

A következő leukocita számot lehet kimutatni: 10 000 leukocita/μΐ vizelet kb. 8 perc múlva.

000 leukocita/μΐ vizelet kb. 15 perc múlva.

A vizsgálat érzékenysége kb. 5000 leukocita/μΐ vizelet. Az 1. és 2. példa vegyíileteivel hasonló érzékenységet (5000—20 000 leukoeita/μΐ vizelet) lehet elérni.

12. példa

A következőkben megadott oldatot 1 ml-es adagokban liofilezzük: 3-[N-(4'-karboxi-benzol-szulfonil)-L-alanil-oxi]-indol 155,4 mg poli(vinil-pirrolidon) 300 mg bórsav 618 mg ionmentesített víz körülbelül 50 ml az oldat pH-értékét n nátrium-hidroxid-oldattal 8,0-ra állítjuk be ionmentesített víz ad 100 ml

A leukocita-koncentráció meghatározásához a liofilizátumot 2 ml leukocita tartalmú vizelettel elegyítjük. A vizelet elszíneződik — a leukocita koncentrációtól függően — világos zöldtől sötétkékig. Szobahőmérsékleten 10 percen át állni hagyj iik — néha rázogatjuk — a leukocita koncentrációt vizuálisan összehasonlító színekkel vagy fotometriásan, például 1 cm mikro-küvettában 620 nm-nél.

A vizsgálat érzékenysége 500 leukocita/μΐ vizelet. A reakcióidő lényegesen rövidebb, ha az elegyet 37 °C-on inkubáljuk.

Az 1. és 2. példa többi vegyületeivel is hasonló érzékenységet (500—2000 leukocita/μΙ) lehet elérni, a nehezen oldódó vegyületeket szerves oldószerek, így például metanol vagy dimetil-formamid hozzáadásával növelni lehet.

Claims

1. Diagnosztikum proteolitikus enzimek kimutatására, amely szívóképes hordozóra itatott, filmrétegre felvitt, porkeverék-, liofilizátum-, oldat vagy reagenstabletta formájú, és egy vagy több kromogént, megfelelő pufferanyagot, valamint adott esetben szokásosan alkalmazott járulékos segédanyagokat tartalmaz, azzal jelemezve, hogy kromogénként I általános képletű indoxilés/vagy tioindoxil-aminosav-észtert és/vagy -peptid-észtert tartalmaz, ahol a képletben R_1; R₂, R₃ és R₄ jelentése azonos vagy eltérő, hidrogénatom, halogénatom, 1—4 szénatomszámú alkilcsoport vagy 1—4 szénatomszámú alkoxicsoport,

X jelentése kénatom, vagy adott esetben 1—4 szénatomszámú alkilcsoportt^l, fenil- vagy naftilcsoporttal, fenil-vagy naftil-(l—4 szén11

-1123

180 431 atomszámú)-alkil-csoporttal vagy benzoilcsoporttal szubsztituált iminocsoport,

A jelentése alifás, aromás, nem heterociklusos, természetes L-monoamino-karbonsavak valamelyike, vagy ezek D- vagy DL- alakja vagy 2—5 tagú, fenti aminosavakból álló peptidcsoport,

B jelentése valamely, a peptidkémiában szokásos nitrogén-védőcsoport.

2. Az 1. igénypont szerinti diagnosztikum kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy járulékos segédanyagként nedvesítőszert, oxidálószert, filmképzőt, galenusi adalékanyagokat és/vagy vázképzőket tartalmaz.

3. Eljárás proteolitikus enzimek kimutatására alkalmas diagnosztikumok, tabletták, porkeverékek, filmrétegek, szívóképes hordozók és liofilizátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy kromogénként egy vagy több I általános képletü indoxil- és/ vagy tioindoxil-aminosav-észter és/vagy -peptid-észtert — amely képletben.

R_n R₂, R₃, R„ X, A és B jelentése az 1. igénypontban megadottakkal egyezik — alkalmazunk, és porkeverékek és tabletták előállításakor a kromogént és a puffért a szokásos galenusi segédanyagokkal összekeverjük és granuláljuk, a kapott porkeveréket adott esetben tablettává préseljük; vagy filmrétegek előállításakor a kromogént és a reagenseket valamely filmképző anyag oldatával vagy diszperziójával elegyítjük, az elegyet műanyaghordozóra visszük fel és szárítjuk; vagy szívóképes hordozó előállításakor a kromogén és a reagensek illékony oldószerrel készült oldatával impregnáljuk a szívóképes hordozót és szárítjuk; vagy liofilizátum előállításakor a kromogént, a reagenseket és a szokásos vázképzőket megfelelő oldószer5 ben oldjuk és fagyasztva szárítjuk.

4. Eljárás az I általános képletü indoxil- és tioindoxil-aminosav-észterek és -peptid-észterek előállítására, ahol a képletben

Rí, R₃, R₃ és R, jelentése azonos vagy eltérő, hidro10 génatom, halogénatom, 1—4 szénatomszámú alkilcsoport, 1—4 szénatomszámú alkoxiesopoit,

X jelentése kénatom, vagy adott esetben 1—4 szénatomszámú alkilesoporttal, fenil- vagy 15 naftil csoporttal, fenil- vagy naftil-( 1—4 szénatomszámú)-alkilcsoporttal vagy benzoilesoporttal szubsztituált iminocsoport,

A jelentése alifás, aromás, nem heterociklusos, természetes L-monoamino-karbonsavak va20 lamelyike, vagy ezek D- vagy DL- alakja vagy 2—5 tagú, fenti aminosavakból álló peptidcsoport, és

B jelentése valamely, a peptidkémiában szokásos nitrogén-védőcsoport,

25 azzal jellemezve, hogy valamely II általános képletü vegyületet — ahol R,, R₂, R₃, R, és X jelentése a fenti, önmagában ismert módon, előnyösen —30 °C és 80 °C közötti hőmérsékleten, adott esetben valamely bázis, célszerűen piridin vagy trietil-amin je30 lenlétében — egy ül általános képletü aminosavval és peptiddel — ahol A és B jelentése a fenti —, illetve ezek valamely reakcióképes származékával, előnyösen karbonsavkloriddal, vegyes anhidriddel vagy aktív észterrel, reagáltatunk.