HU187334B - Composition for the detection of esterase and/or protease enzymes and process for the preparation of corresponding substrates - Google Patents

Composition for the detection of esterase and/or protease enzymes and process for the preparation of corresponding substrates Download PDF

Info

Publication number
HU187334B
HU187334B HU811244A HU124481A HU187334B HU 187334 B HU187334 B HU 187334B HU 811244 A HU811244 A HU 811244A HU 124481 A HU124481 A HU 124481A HU 187334 B HU187334 B HU 187334B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hydrogen
alkyl
formula
benzenesulfonyl
alkoxy
Prior art date
Application number
HU811244A
Other languages
English (en)
Inventor
Dieter Berger
Guenther Frey
Wolfgang-Reinhold Knappe
Kuhr-Manfred
Walter Rittersdorf
Wolfgang Werner
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6101946&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU187334(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU187334B publication Critical patent/HU187334B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/30—Naphthol derivatives, e.g. alpha-naphthyl-esters, i.e. alpha-NE, beta-naphthyl-esters, i.e. beta-NE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/50—Indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/70—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases the product, e.g. phenol, naphthol being diazotised in situ, e.g. with Fast Red
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805—Test papers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya készítmény leukocitákban lévő észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására és eljárás megfelelő szubsztrátum előállítására.
A vese és az urogenitális traktus megbetegedéseinek diagnosztikájában a leukociták vizeletben való kimutatása nagy jelentőséget kap. Ezt a kimutatást eddig mikroszkópiásan végezték, amennyiben mikroszkóp alatt megszámolták egy meghatározott vizelettérfogatban lévő leukocitákat. Ez a módszer azonban nagyon időigényes, fáradságos és fárasztó, és emellett iskolázott személyzet alkalmazását igényli.
Egy idő óta ezért azzal próbálkoznak, hogy leukociták különböző testfolyadékokban való kimutatásának alapjául enzimes reakciókat alkalmazzanak, mivel a leukociták kiterjedt enzimspektrummal rendelkeznek.
Leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló készítmények, amelyekben a leukocitákban előforduló észterolitikus és/vagy proteolitikus aktivitást használják fel analitikai célokra, a 28 26 965. és 28 36 644. sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratokból már ismertek.
Szulfonftalein-észtereket illetve azoszínezékésztereket alkalmaznak szubsztrátokként a leukocita-észterázokhoz és/vagy -proteázokhoz. Az enzimes reakciónál szabaddá váló színezékeket általánosan ismert módszerek szerint mérjük. Az ezekben az iratokban leírt készítmények még túl érzéketlenek. Reakcióideik túl hosszúak az alsó kimutatási határra, úgy, hogy a gyakorlati alkalmazás még bizonyos hátrányokkal jár, mindenekelőtt a vizsgálat kivitelezésénél túl hosszú várakozási időkkel.
Proteázok és észterázok kimutatására különböző módszerek ismeretesek a hiszto- és citokémiai enzimológiából (lásd például: A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied, 3. kiadás, Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968). Lényegében ezeknél szintén színtelen vagy enyhén színes észtereket használnak, amelyek enzimes hasítással valamilyen színtelen savra és egy ugyancsak színtelen alkohol-(fenol-) komponensre esnek szét. Utóbbit azután az enzimes hidrolízist követő reakcióban színes termékké reagáltatják, például diazóniumsókkal kapcsolva vagy oxidációs reakcióban.
F. Schmalzl és H. Braunsteiner leírnak például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást Naftol-AS-D(klór-acetáttal), mint szubsztráttal és a színes azovegyület képzésére szolgáló valamilyen diazóniumsóval.
Leukociták testfolyadékokban, például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló készítményként az ilyenfajta kétkomponensű rendszerek alkalmatlannak bizonyultak. Például 5000 leukocita/pl-es minták semmilyen reakciót nem mutatnak. Ezenkívül ismeretes, hogy vizeletben előforduló számos vegyület, például urobilinogén, stercobilinogén, bilirubin és mások diazóniumsókkal reagálnak. Ezt legjobban a kereskedelemben kapható, urobilinogén vagy bilirubin vizeletben való kimutatására szolgáló, szabadalmazott tesztek bizonyítják, amelyek a kimutatási reakcióhoz diazóniumsókat használnak. Az irodalomban az észter íz-kimutatásra használt diazóniumsók a leírt mellekreakciót adják a vizelet más alkotórészeivel, és részben saját színük miatt sem használhatók leukocita-teszthez.
A jelen találmány feladata ezért az volt, hogy c lyan készítményt biztosítson észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására észterek és diazóniumsók kombinációjával reakciópartnerként ezen enzimek részére, amellyel ezek egyszerű és könnyen kezelhető módon rövidebb idő alatt kimutathatók, és amelyek a vizsgált minta más alkotórészeivel semmilyen reakciót nem adnak.
Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy alkalmas észterek és speciálisan szubsztituált diazóniumsók bizonyos kombinációját alkalmazzuk, ahol meglepő módon az alkalmazott diazóniumsók a vizelet rtás alkotórészeivel, például bilirubinnal és urobilirogénnel semmilyen mellékreakcióba nem lépnek, 1 anem az alkalmazott észter hasításánál keletkező fenolos komponenssel specifikusan és gyorsan színes vegyület keletkezése közben kapcsolódnak.
Az alkalmazott észtereknek az észteráz és/vagy proteáz enzimekkel szemben eléggé reaktívaknak kell lenniük, hogy a lehető leggyorsabban hasadjanak, a sav- és alkohol-komponensre (amelyeken fenolokat is értünk). Az észtereket abból a szempontból is jól kell megválasztani, hogy a szabaddá x’áló alkohol-komponensek jól és teljesen kapcsolódjanak az alkalmazott diazóniumsókkal. A dia/óniumsók reaktivitását a szubsztituensek alkalmas megválasztásával oly módon kell összehangolni, hogy bár a találmány szerint alkalmazott észterekből szabaddá váló alkohol-komponensekkel kielégítően gyors kapcsolás menjen végbe, a tesztoldat egyéb alkotórészeivel azonban semmilyen reakció ne menjen végbe.
A jelen találmány tárgya tehát készítmény, különösen leukocitákban lévő észteráz és/vagy proteáz enzimek kimutatására, amely az említett enzimek meghatározására szolgáló kimutató-reagenst, puffért és adott esetben további adalékanyagot tartalmaz és szívóképes hordozóból, filmrétegből, porkeverékből, liofilizátumból, oldatból vagy reagens’ablettából áll; a találmány szerinti készítményt az jellemzi, hogy az említett enzimek kimutatóeagenseként valamely I általános képletű szubsztirnált diazóniumsóból - a képletben
Rj jelentése 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatonos alkoxi- vagy morfolino-csoport, halogén- vagy hidrogénatom, R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxiesoport, R3 jelentése 1-3 szénatomos alkoxi-, fenoxi-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, di-(l-3 szénatomos alkil)-amino-, hidroxi-, morfoiino-, tiomorfolino-, 1-pirrolidinil; adott esetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal 4-helyzetben alkilezett piperazinil-, piperidino-, fenil-amino- vagy adott esetben 4-helyzetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált fenil-csoport, halogénvagy hidrogénatom, R4 és R5 jelentése azonos vagy eltérő és 1-3 szénatomos alkoxiesoportot vagy hidrogénatomot képvisel, R, és R2 adott esetben együtt egy —CH=CH—CH=CH—csoportot jelent és X jelentése tetrafluoro-borát- vagy tetra-21
187 334 klór-cinkát-anion és egy II általános képletű indoxil- és tio-indoxil-aminosav-észterből vagy -peptidészterből álló kombinációt - a képletben
Rj, Rj, Rj, R4 jelentése azonos vagy eltérő és hidrogén- vagy halogénatomot, 1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoportot jelent, X' jelentése kénatom vagy adott esetben 1-3 szénatomos alkil-, benzil- vagy benzoilcsoporttal Nszubsztituált iminocsoport, A jelentése glikókollmaradék vagy D-, L- vagy DL-alakban lévő alanin-, valin-, leucin-, izoleucin-, fenil-alanin-, tirozin- vagy O-acetil-tirozin-maradék, alanil-alaninvagy alanil-alanil-alanin-maradék és B jelentése az A szubsztituensnél felsorolt aminosavak nitrogénatomjához kapcsolódó, alábbi csoportok egyike: toluol-4-szulfonil-, benziloxi-karbonil-, toluol-2'szulfonil-, toluol-3-szulfonil-, acetil-, szukcinil-, benzoil-, ftaloil-, etoxi-karbonil-, ciklohexiloxikarbonil-, feniloxi-karbonil-, 4'-metil-benziloxikarbonil-, 4'-nitro-benziloxi-karbonil-, benziltiokarbonil-. metánszulfonil-, benzilszulfonil-, 4'bróm-benzolszulfonil-, 4'-nitro-benzolszulfonil-, 4'-acelil-amino-benzolszulfoniI-, 42(n-butil)benzolszulfonil-, 4'-(terc-butil)-benzolszulfonil-, 4'(n-oktil)-benzolszulfonil-, 4'-hidroxi-benzólszulfonil-. 4'-metoxi-benzolszulfonil-, 4'-benzil-oxibenzolszulfonil-, 4'-(3-oxa-5-hidroxi-n-pentiloxij-benzolszulfonil-, 4'-(3,6-di-oxa-n-heptiloxi)benzolszulfonil-, 4'-(2-hidroxi-etiI)-benzoIszulfonil-, 4'-[2-(4'-nitro-benziloxi)-etil]-benzolszulfonil-, 4'-benziloxi-karbonil-benzol-szulfonil-, 4'-karbamoil-benzolszulfonil-, 4'-(dimetil-karbamoil)benzolszulfonil-, 2',4',6'-trimetil-benzolszulfonil-, bifenil-4'-szulfonil-, naftalin-2'-szulfonil-, 4'-acetilamino-naftalin-1 '-szulfonil-, 5'-dimetil-aminonaflalin-l'-szulfonil-, benziloxi-karbonil-, tercbutiloxi-karbonil-, formil-, 4'-metoxi-benziloxikarbonil-. N’-(piperidino)-oxikarbonil-, tienil-(2')metoxi-karbonil-, kinolin-8'-szulfonil-, difenilkarbanioil-, furil-(2')-metoxi-karbonil-, 4'-dimetilamino-benzolszulfonil-, 4'-metoxi-karboniIbenzolszulfonil-, 4'-karboxi-metil-benzolszulfonil-, 4'-karboxi-metoxi-benzolszulfonil-, 4'-karboximetil-amino-benzolszulfonil-, 4'-(benziloxi-karbonil-metil-amino)-benzolszulfonil-, 4'-fluor-benzolszulfonil-. piridin-3’-szulfonil-, 5',5'-dimetil-3'-oxociklohcxen-l'-il-, 4'-brómbenzil-foszforiI-, 3',6’-dioxa-(n-hepliloxi)-karbonil-, 2'-nitro-benzolsz.ulfenil-, l'-metil-2’-benzoil-vinil-csoport - vagy valamely I általános képletű szubsztituáit diazóniumsóból és egy III általános képletű fenoxi-aminosavészterből álló kombinációt - a képletben
Rj jelentése hidrogénatom, Rj jelentése hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- vagy di-( 1—3 szénatomos alkil)-aminocsoport, Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxiesoport, Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxiesoport, A' jelentése L-alanil-csoporl és B' jelentése az. alanilcsoport nitrogénatomjához kapcsolódó tozilcsoport, emellett az Rj szubsztituens az R, szubsztituenssel vagy az Rj szubsztituens az Rj szubsztituenssel együtt egy — CH -CH — CH--CH—csoportot is képviselhet - tartalmaz, emellett az egyes komponensek aránya az alábbi:
észter 0,035 - 7,1 mól % diazóniumsó 0,01 - 13,2 mól puffer (pH 6-10) maradék 100 mól „-ig és a készítmény adott esetben járulékosan a következő komponenseket is tartalmazhatja, a megadott mennyiségekben:
stabilizátor 0 - 85,8 mól „ aktivátor 0 - 79,2 mól % galénuszi adalékanyag 0 -32,1 mól /„ emellett p stabilizátor egy VI általános képletű fosztórsa\ származék, a képletben
R6 jelentése dimetil-amino-, rövidszénláncú, alkoxi-, feniloxi-, rövidszénláncú alkil- vagy fenilvagy naftil- vagy N-morfolino-csoport és R7 és R8 jelentése dimetil-amino- vagy N-morfoiinocsoport, és az aktivátor
a) valamely VII általános képletű piridinszármazék - a képletben
R,, R2, R3, R4 és Rs jelentése azonos vagy eltérő és hidrogén- vagy halogénatomot, rövidszénláncú alkil-, rövidszénláncú alkoxi-, vagy vinilcsoportot képvisel, amely adott esetben egy vagy több rövidszénláncú alkoxi-, vagy rövidszénláncú dialkilamino-csoporttal helyettesített fenil- vagy naftilcsoporttai vagy egy 5-7 tagú, egy nitrogén, oxigén vagy kén heteroatomot tartalmazó heteroatomot tartalmaz) heterociklusos csoporttal szubsztituáit, és két szomszédos szubsztituens egy, adott esetben halogénatommal, hidroxicsoporttal, rövidszénláncú alkil- vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituáit olyan indéno- vagy benzo-anellált csoportot jelenthet, amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkilcsopcrttal szubsztituáit benzo- vagy piridoanellált csoportot tartalmazhat és R3 még vinilkinuklidil karbinol-csoportot is jelenthet -, vagy
b) valamely VIII általános képletű imidazolszármazék - p képletben
R, jelertése hidrogénatom, rövidszénláncú alkilcsoport v; gy adott esetben egy hidroxi- vagy rövidszénláncú alifás acilcsoporttal szubsztituáit fenilvagy naftilcsoport és R, jelentése hidrogénatom, amino-(rcvidszénláncú)-alkil-, N-(rövidszénláncú)-alifás-acil-amino-(rövidszénláncú)-alkil- vagy rövidszéniáncú alifás, adott esetben telítetlen karbonsav-maradék vagy adott esetben a nitrogénatomon rövidszénláncú alifás karbonsavval acilezett rövidszénáncú alifás α-aminosav-maradék -, vagy
c) valamely IX általános képletű alkohol - a képletben
X jelentése hidrogénatom vagy hidroxiesoport és A jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy
1-5-ször telítetlen, 3-25 szénatomos alkil-, vagy telített vagy 1-3-szor telítetlen, 3-20 szénatomos cikloalkilcsoport -, vagy
d) vala nely X általános képletű fémkomplex, a képletben
D jelertése alkálifémion, B jelentése nehézfémion, m értéke 2, 3, 4 vagy 5, n értéke 4, 5, 6. 7 vagy 8 és p értéke 0 vagy 1, ahol az m számértéke a nehézfém on vegyértékéből és az n számértékéből adódik.
-3187 334
A lí es Hl általános képletű észtereket észterázok és/vagy proteázok, például a neutrofil granulocitákban előforduló észterázok és proteázok gyorsan es tel jesen elszappanosítják. A szabaddá való fenolkomponensek jól. gyorsan és szeiektive reagálnak az I általános képletű kevéssé elektrofil diazóniumsokkal. így a találmány szerinti slabil készitménynyel a Ieukociták gyorsan kimutathatók testfolyadékokban. -Ezenkívül kiderült, hogy a találmány szerinti készítmények kiválóan alkalmasak proteolitikus enzimek, például elasztáz, kimotripszin vagy tnps/in vizes oldatokban, illetve testtolyadékokoan, például teljes vérben, szérumban és liquorban, pankreászvaladékban vagy vizes székletkivonatok::au való kimutatására.
Az í általános képletű diazóniumsók részben ismert vegyületek. Az olyan származékok, amelyek epieteben R3 jelentése tiomorfolino-, 1-pirrolidiπιϊ-, adott esetben 4-helyzetben alkilezett piperazimi vagy piperidínoesoport, új vegyületek. Ezek azonban az ismert vegyületek analógiájára Önma-m:-;oan ismert módszerekkel előállíthatok.
li altalános képletű vegyületeket 180 431 sz. magyar szaoadalmi leírás ismerteti.
A 111 általános képletű észterek új vegyületek. Ezek úgy állíthatók elő, hogy IV általános képletű vegyületeket - amelyek képletében Rj, R2, R3 és R4 ielentese az előbb megadottakkal azonos - V általános képletű aminosavakkal - ameiy képletben A' és B' jelenlese az előbb megadottakkal azonos .Sietve ezek alkalmas reakcióképes származékaival reagáltatjuk a peptidkémiában szokásos módszerekkel.
Reakcióképes származékokként például a savkloridok, illetve a petidszintézisnél általában alkalmazott, például klór-hangyasav-etil-észterrel képzett vegyes anhidndek vagy aktív észterek reagál-, íaíhatók.
A találmány további tárgyát képezi a III általános képletű új észterek előállítási eljárása.
Az Rt, es R3, illetve R,, R,, R3 és R4 szubsztituensek meghatározásánál halogénatomon fluor-, klór-, bróm- és jódatom, előnyösen klór- és brómatom értendő.
Az R:R5, R|-R4 valamint R,-R4 szubsztituensek meghatározásánál említett alkil-, alkoxi-, alkiltio-, alkil-armno- és dialkil-amino-esoportok közül legelőnyösebbek a metilcsoportot tartalmazók.
Az A meghatározásánál megadott aminosavgyökök közül mindenkor az L-alak előnyös.
A találmány szerint alkalmazott I általános képletű díazómumsókat és a II és III általános képletű észtereket 10“4-10‘1 mól/liter, előnyösen 10!l0 mól/liter koncentrációban adjuk az impregnálóoldut-bevonómasszához vagy a vizsgálandó folyadékhoz.
A proteolitikus enzimek és különösen a leukocita-proteázok kimutatására szolgáló találmány szerinti készítmény további alkotórésze egy alkalmas pufferrendszer. Erre a célra például foszfát-, borát-, barbiturát-, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán(= 1 RIS), 2-amino-2-metil-l,3-propándiol( = Amediol) vagy aminosav-pufí’erok jönnek számításba, amelyeknél a ρΗ-értéket és kapacitást úgy kei! megválasztani, hogy a mérőoldatban illetve a tesztcsíkon 6 10, előnyösen 7-9 pH-érték álljon be.
\ proteolitikus enzimek kimutatására szolgáló talilmány szerinti készítmény további alkotórésze lelet még egy nedvesítőszer, mivel ezáltal homogénebb színeloszlás és részben ragyogóbb színek érhető;: el. Alkalmazhatók kationaktív, anionaktív valamint amfoter és nem-ionos nedvesítőszerek 0,05-2% (súly.tf), előnyösen 0,1-1% (súly/tf) koncé ítrációban.
A VI általános képletű foszfor- és foszfonsavamidok ismert vegyületek, amelyeket például a 22 35 127 sz. német szövetségi köztársaságbeii szabadalmi leírásban írnak le stabilizátorokként olyan te ztcsik-receptekhez, amelyek peroxidázkimutatás alapján működnek.
A VI általános képletű vegyületek segítségével a reieptúrák meglepően jól stabilizálhatok,
A VI általános képletű foszfor- és foszfonsavanid típusú stabilizátorokat a vizes vagy előnyösen a szerves impregnálóoldathoz 1-20% (súly/tf), előnyösen 5-15% /.súly/tf) koncentrációban adjuk hozzá.
Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a proteolitikus enzimek, különösen proteolitikus leukocitaei zimek kimutatására szolgáló találmány szerinti diagnosztikai készítmény' reakcióidői jelentősen rregrövidíthetők, ha a diazóniumsókon, észtereken és eddig felsorolt segédanyagokon kívül egy vagy tc bb aktivátort is hozzáadunk, A találmány szerinti készítményhez alkalmas aktivátoroknak a 1 ;2 102 sz. magyar szabadalmi leírásban leírt és felhasznált vegyületek bizonyultak.
Az aktivátorokat 0,5-10% (súly/tf), előnyösen
I 5% (súly/tf) koncentrációban használjuk az impn gnálóoldatban.
A találmány szerinti készítmények előállítása célj; ból például szívóképes hordozókat, előnyösen s 'űrőpapírt, cellulózt vagy műanyagrostfilcet a s tükséges, a tesztcsíkok előállításához szokásosan a kalmazott reagensek (szubsztrát, puffer, adott ecetben nedvesítőszerek) könnyen illő oldószerekkel, például vízzel, metanollal, etanollal, vagy acet innal készített oldataival impregnáljuk. Ez célszerűen két külön szakaszban történik: először valamilyen vizes oldattal impregnálunk, amely a puffért és más vízoldható anyagokat tartalmazza, utána a
II illetve III általános képletű proteáz-szubsztrátak, I általános képletű diazóniumsók és aktivátorok oldalával impregnálunk. Az impregnálás véf ezhető azonban más sorrendben illetve két másfajta összetételű impregnálóoldattal is.
A kész tesztpapírok így is használhatók, vagy ismert módon fogókra ragasztva vagy előnyösen a 21 18 455 sz. német szövetségi köztársaságbeii szabadalmi leírás szerint műanyag és finomlyukú háló közé behegesztve.
Filmmel bevont tesztcsíkok előállítására az ösz:zes reagenst egy filmképzö anyag - igy például polivinilészter vagy poliamid - oldatába vagy diszperziójába adagoljuk, majd alaposan összekeverjük. A keveréket vékony rétegben műanyag hordozóra kenjük, majd szárítjuk. A találmány szerinti, ilmmel bevont tesztcsíkokat szárítás után felvégük és mint ilyeneket használjuk, vagy önmagában
187 334 ismert módon fogókra ragasztjuk vagy például műanyag és finomlyukú háló közé hegesztjük, a 21 18 455 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint.
A proteolitikus enzimek, különösen a leukocitaproteázok kimutatására szolgáló találmány szerinti diagnosztikai készítmény porkeverékek vagy reagenstabletták formájában is elkészíthető, amennyiben a teszt fent felsorolt alkotórészeit szokásos galénuszi adalékanyagokkal elegyítjük és granuláljuk. Ilyenfajta adalékanyagok például szénhidrátok, azaz mono-, oligo- vagy poliszacharidok vagy cukoralkoholok, azaz mannit, szorbit vagy xilit vagy más oldható inért vegyületek, mint a polietilén-glikolok vagy polivinil-pirrolidon. A porkeverékek vagy reagens tabletták végső súlya általában körülbelül 50-200 mg, előnyösen 50-80 mg.
Körülbelül 5-20 mg, előnyösen körülbelül 10 mg összsúlyú liofilizátumok készítése céljából fagyasztva szárítunk olyan oldatot, amely a teszthez szükséges szokásos reagensek mellett egyéb szokásos vázképzőket, például polivinil-pirrolidont és esetleges további töltőanyagokat, például mannitot, szorbitot vagy xilitet is tartalmaz.
A találmány szerinti diagnosztikai készítmény oldat formájában előnyösen a teszthez szükséges összes reagenst tartalmazza. Oldószerként víz vagy víznek vízzel elegyedő szerves oldószerekkel, például metanollal, etanollal, acetonnal vagy dimetilformamiddal készült elegyei jönnek számításba. Eltarthatósági okokból előnyös lehet, ha a teszthez szükséges reagenseket két vagy több oldatra osztjuk szét, amelyeket csak a tulajdonképpeni vizsgálatnál egyesítünk.
Az így előállított diagnosztikai készítmények lehetővé teszik, hogy vizsgálandó testfolyadékba való bemártás vagy a vizsgálandó testfolyadék hozzáadása után proteolitikus enzimek, különösen a leukocita-proteázok jelenlétét gyorsan és egyszerűen olyan színképzödés útján észleljük, amely vizuálisan vagy fotometriásan, például remissziós fotometriásan vagy küvettában kiértékelhető. Mivel a sejtenkénti leukocita-proteáz aktivitás lényegében állandó nagyságúnak tekinthető, a színképződés intenzitásából a vizsgált testfolyadék leukocitakoncentrációjára következtethetünk. A találmány szerinti diagnosztikai készítmény mind intakt, mind lizált leukocitákhoz alkalmazható, mert a leukocita-proteázok aktivitása a leukociták lízise után is teljes egészében megmarad. Lízis-hiba következésképpen nem lép fel.
Szubsztrátok:
S1: 3-(N- tozil-L-alaniloxi)-indol,
S2: 3-(N tozil-L-alaniloxi)-l-metoxi-naftalin,
S3: 1-(N· tozil-L-alaniloxi)-4-metoxi-naftalin,
S4: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-4-izopropoxi-naftalin, S5: 1 -(N- tozil-L-alaniloxi)-4-pentil-oxi-naftalin,
S6: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3-(dimetil-amino)benzol,
S7: l-(N-tozil-L-alaníloxi)-3-(dietil-amino)-benzol, S8: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3,5-dimetoxi-benzoI,
S9: 1 -(N-tozil-L-alaniloxi)-3-metil-5-metoxibenzol.
Diazóniumsók:
D1: 2,4-dimetoxi-benzol-diazónium-tetrafluoroborát,
D2: 4-metoxi-naftalin-l-diazónium-tetrafluoroborát,
D3: 2,5-dimetoxi-4-(dimetil-amino)-benzol-diazónium-tetr ífluoro-borát,
D4: 4-(dirnetil-amino)-benzol-diazónium-tetrafluoro-borát.
így olyan papírokat kapunk, amelyek 100 leukocita/μΐ leukocita-tartalmú vizeletbe való bemártáskor körülbelül 3 perc elteltével a táblázatban felsorolt színekre színeződnek. A kiértékelés remissziós fotometri isan is történhet.
Szubsztrát Diazóniumsó Szín
Sl Dl vörös-barna
Sl D2 vörös-barna
Sl D3 kék-szürke
Sl D4 zöld
S2 Dl vörös
S2 D2 világosvörös
S2 D3 ibolya
S2 D4 lila
S3 Dl vörös-ibolya
S3 D2 ibolya
S3 D3 kék-szürke
S4 Dl lila
S5 Dl lila
S6 Dl világosvörös
S7 Dl világosvörös
S8 Dl vörös-ibolya
S9 Dl vörös-barna
1. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher und Schüll 23SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk:
1. oldat:
0,2 mólos bórax-sósav puffer, pH 8,
10% foszforsav-trimorfolid.
2. oldat:
x 10 3 mól/Iiter szubsztrát, 2 mól/liter diazóniumsó oldva acélon/1-dekanol (98 : 2) elegyben.
2. példa
Szűrőpapírt egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és 60 °C-on megszárítjuk.
1. oldat:
0,1 mólos borát-puffer, pH 8.
2. oldat:
2x 10~J mól/liter 2-metoxi-4-morfolino-benzoldiazónium-tetraklór-cinkát, x 103 nól/liter szubsztrát*,
10% foszforsav-trimorfolid etanol/l-iekanol (98 : 2) elegyben oldva.
* szubsztrá ok:
A: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-indol,
187 334
B: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5-metilindol,
C: 3-[N-(beftzilöxi-karbonil)-L-alartíloxi]-7-metilindol,
D: 3-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-4-klórindol,
E: 3-[N-(benziIoxi-karbonÍl)-L-alaniloxi]-5-brómindol,
F: 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol,
G: 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-5-metoxi-indol,
H: 3-[N-(4'-acetilamino-benzolszulfonil)-L-alaniloxi]-indol,
I: 3-[N-(4'-metoxi-tozil)-L-alaniloxi]-indol,
K: (N-tozil-L-alaniloxi)-benzol,
L: 1 -(N-tozil-L-alaniloxi)-naftalin,
M: l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3-metoxi-benzol.
Az így kapott reagenspapírokkal leukocitatartalmú vizeletben 100 leukocita/μΐ kimutatható.
összehasonlító reaktivitással rendelkező reagenspapírok is készíthetők, ha a fent nevezett diazóniumsók helyett
2-metoxi-4-pirrolidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot,
2-metoxi-4-piperidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot,
2,6-dimetoxi-4-morfolino-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot,
4-metoxi-2-morfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot,
2-metoxi-4-(4-metil-piperazinil)-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot,
2-metoxi-4-tiomorfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot használunk.
3. példa
A következő törzsoldatokat készítjük:
1. oldat:
2xl0-11 mől/liter l-(N-tozil-L-alaniloxi)-4-izopropoxi-naftalin,
I0 2 mól/liter 2,4-dimetoxi-benzol-diazóniumtetrafluoro-borát aceton/1-dekanol (98 : 2) elegyben oldva.
2. oldat:
0,2 mólos bórax-sósav puffer,
10% foszforsav-trimorfolid.
Miután vagy az 1. oldathoz vagy a 2. oldathoz hozzáadtuk az alább felsorolt aktivátorokat az ott megadott koncentrációkban, a szűrőpapírokat átitatjuk az 1. és 2. oldatokkal, és 60 °C-on megszárítjuk.
Az ellenőrző vizsgálat során 300 leukocita/μΐ leukocita-tartalmú izotóniás nátrium-klorid oldatban a tesztek az alább megadott idők alatt reagáltak.
mg aktivátor-adalék
Aktivátor 1 20 ml . oldathoz 2. reakcióidő [sec] oldathoz
semmi — 54
4-azafluorén 33 17
benzo-[h]-kinolin 36 8
kinin 33 32
1,2-’oisz(4-piridil)-etilén 37 34
1-dekanol 400 5
1-tetradekanol 400 4
Aktivátor 1 rtlg akiivútöf-adalék 20 ntl reakcióidő [sec] . oldathoz 2. oldathoz
nitroprusszld-nátrium 31 38
tetrakálium-hexaciano- 40 30
ferrát (íí)
4. példa
Szűrőpapírt átitatunk a következő oldatokkal, és az átitatás után 60 °C-on szárítjuk.
1. oldat:
2x 10 ’ mól/liter 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol, 2x 103 mól/liter 2-metoxi-4-morfolino-benzoldiazónium-tetraklór-cinkát aceton/l-dekanol (98 : 2) elegyben oldva.
2. oldat:
0,2 mólos bórax-sósav puffer, pH 8,
10% foszforsav-trimorfolid.
Egy további kísérletben a 2. oldatból a foszforsav-trimorfolidot elhagytuk.
A foszforsav-trimorfoliddal készült minták 2 napig 60 °C-on való tárolás után színtelenek maradtak, és leukocita-tartalmú oldatokkal jó reakciókat adtak. A foszforsav-trimorfolid nélküli minták szürkén elszíneződtek.
5. példa
Ismert módon reagenstablettát készítünk, amely a következő komponenseket tartalmazza:
mg 3-(N-tozil-L-alaniloxi)-indol, mg 2-metoxi-4-morfolino-benzol-diazóniumtetraklór-cinkát,
1,5 mg kálium-dihidrogén-foszfát, mg dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, mg mannit.
Ezt a tablettát 2 ml leukocita-tartalmú vizeletben oldjuk, és jól összekeverjük, Leukociták jelenlétében vöröses ibolya színeződés lép fel.
100 leukocita körülbelül 2 perc alatt mutatható ki.
Ha a vizeletet a tabletta hozzáadása előtt és a reakció alatt 37 °C-on temperáljuk, úgy ugyanennyi idő alatt 20 leukocita kimutatható.
6. példa l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3,5-dimetoxi-benzol.
Az aktivált észteres eljárás szerinti reakcióhoz
14,6 g (0,06 mól) N-tozil-L-alanint és 12,2 g (0,09 mól) N-hidroxi-benztriazolt oldunk 300 ml vízmentes etil-acetátban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és 12,4 g (0,06 mól) dicíklohexil-karbodiimiddel elegyítjük. Az aktivált észter képződése céljából 2 órát kevertetjük 0 °C-on, utána további 2 órát szobahőmérsékleten. Hozzáadunk 6,2 g (0,04 mól) 3,5-dimetoxi-fenolt és 5,5 ml (0,04 mól) trietil-amint, majd utána a reakcióelegyet 15 órát kevertetjük szobahőmérsékleten. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük. A szürletet vákuumban legfeljebb 50
187 334 °C hőmérsékletű fürdőn bepároljuk. A maradékot ! 200 ml etil-acetáttal oldjuk, és egymásután 3 x 100 ml 5%-os citromsavoldattal és utána 3 x 100 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfáttal való szári- £ tás után vákuumban bepároljuk. Az olajos nyersterméket szilikagéllel töltött oszlopon toluol/etilacetát (4: 1) oldószereleggyel eluálva tisztítjuk.
A megfelelő összegyűjtött frakciók bepárlása után a maradékot kevés diklór-metánban oldjuk, és di- 1 θ etil-éter hozzáadásával kicsapjuk. így 5,8 g (38%) l-(N-tozil-L-alaniloxi)-3,5-dimetoxi-benzolt kapunk színtelen kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 110 ’C.
[a]2D° = -52,5° (c = 1; aceton), 15
Hasonló módon N-tozil-L-alanin és a megfelelően szubsztituált fenolok vagy naftolok reakciójával a következő anyagokat kapjuk:
6.1. (N-Tozil-L-alaniloxi)-benzol; színtelen kris- 2Q tályok, olvadáspont: 113 °C.
t«]o = ~ 63,8° (c = 1; aceton).
6.2. l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3-(dimetil-amino)benzol; színtelen, amorf por.
Md = ~36,6° (c= 1; metanol). 25
Vékonyrétegkromatográfia: kész szilikagél lemezen, futtatószer: toluol/dioxán 2:1 elegy; detektálás ultraibolya fényben;RF-érték: 0,68.
6.3. l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3-metoxi-benzol; színtelen kristályos anyag, olvadáspont: 30 60-61 °C.
Md = ~62,9° (c=l; metanol).
6.4. l-(N-Tozil-L-a!aniloxi)-naftalin; színtelen viszkózus olaj.
[a]2D°= - 27,3° (c= 1; metanol). 35
Vékonyrétegkromatográfia: kész szilikagél lemezen; futtatószer: toluol/dioxán (4:1) elegy; detektálás: ultraibolya fényben; R, érték: 0,53.
6.5. I-(N-Tozil-L-álaniloxi)-4-metoxi-naftalin: színtelen kristályok, olvadáspont: 136 °C.
[ct]p = -42,6° (c= 1; aceton).
6.6. l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-4-izopropoxi-naftalin: színtelen kristályok, olvadáspont: 93-96 ’C.
[a];,0 = -38,0° (c = 1; aceton).
6.7. l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-4-pentiloxi-naftalin: színtelen kristályok, olvadáspont: 87 °C.
[a]p = -36,9° (c = I; aceton). 50
6.8. l-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3-(dietil-amino)benzol: színtelen kristályok, olvadáspont: 83-84 ’C.
[a]; = -59,4° (c = 1; metanol). Vékonyrétegkromatográfia: kész szilikagél le- 55 mezen, futtatószer: xilol/2-butanon (1 : 1) elegy; R,.-érték: 0,68.
6.9. I-(N-Tozil-L-alaniloxi)-3-metil-5-metoxibenzol: színtelen kristályok, olvadáspont: 79-81 ’C. 60 [a];” = 62,2° (c= 1; metanol).
Vékonyrétegkromatográfia: kész szilikagél lemezen, futtatószer: kloroform/metanol (20 : 1) elegy; R,.-érték: 0,79.
7. példa
2-(N-ToziI-L-alaniloxi)-4-metoxi-naftalin.
1. oldat:
A sav-k lóridnak az egylépcsős módszer szerinti előállításához 19,44 g (0,08 mól) N-tozil-L-alanint oldunk 100 ml vízmentes dimetil-formamidban, és az oldatot -20 °C-ra hű tjük. Utána keverés és hűtés közben hozzápipettázunk 5,81 ml (0,08 mól) tionil-kloridot, és a reakcióelegyet 30 percig a - 20 °C-os hűtőfürdőben hagyjuk.
2. oldat: , ;
6,96 g (0,04 mól) 4-metoxi-2-naftol 50 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült oldatához 11,0 ml(0,08 mól) trietil-amint adunk. Az elegyet — 20 °C-ra hűtjük.
Reakció:
Az 1. oldatot a 2. oldatba öntjük, és nedvesség kizárásával körülbelül 4 órát kevertetjük -20 ’Con, utána a reakcióelegyet éjszakán át jégszekrényben hagyjuk állni.
Feldolgozáshoz a reakcióelégyet vákuumban legfeljebb 50 °C fürdőhőmérsékleten bepároljuk. A maradékot körülbelül 150 ml etil-acetáttal oldjuk, és egymásután 3 x 100 ml 5%-os citromsavoldattal és utána 3 x 100 ml 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát oldattal mossuk. Nátrium-szulfáton való szárítás után a szerves fázist vákuumban bepároljuk. A nyersterméket szilikagéllel töltött oszlopon toluol/etil-acetát (4: 1) eleggyel eluálva tisztítjuk. A megfelelő összegyűjtött frakciók vákuumban való bepárlása után a maradékot kevés diklór-metánban oldjuk, és utána dietil-éter/petroléter (1:2) eleggyel kicsapjuk. így 2,8 g (18%) 2-(N-tozil-Lalaniloxij-4-metoxi-naftalint kapunk színtelen kristályos anyagként, ámelynek olvadáspontja: 119 ’C.
Md = —57,9° (c= 1; aceton).
8. példa.
2-Metoxi-4-morfolino~benzol-diazómum-tetraklór-cinkát.
5-Klór-2-nitro-anizolt 1,5-szeres moláris feleslegű morfolinnal toluolban több órán (10-14 óra) át visszafolyó hűtő alatt forralva reagáltatunk. A reakció célszerűen oldószerként morfolinban is végrehajtható. Ekkor az 5-klór-2-nitro-anizolt 5-10szeres térfogatú morfolinnal elegyítjük. Az esetleg demetilezett terméket nátrium-hidroxid oldattal extrahálva eltávolítjuk, vagy diazometánnal reagáltatva utánmetilezzük. A kapott nitrovegyületet szokásos módon palládiumosszénnel metanolban vagy ón(II)-kloriddal sósavban amiddá redukáljuk, és ezt diazotáljuk. A diazónium-vegyületet ismert módon sósavas oldatban tömény cink(II)-klorid oldat hozzáadásával a tetraklór-cinkáttá vagy tetrafluoro-bórsav hozzáadásával a tetrafluoro-boráttá alakítjuk, és így különítjük el.
Olvadáspont:
170-172 °C (tetraklór-cinkát),
166-168 °C (tetrafluoro-borát).
-7187 334
9. példa.
4~Metoxi-2-morfolino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borát.
18,76 g (0,1 mól) 3-klór-4-nitro-anizolt (olvadáspont: 52 °C) 87,1 g (1 mól) morfolinnal 4 órán át forralunk visszafolyó hűtő alatt. Utána lehűtjük szobahőmérsékletre, a reakeióelegyhez 100 ml jeges vizet adunk, a kivált sárga reakcióterméket kiszűrjük, jéghideg 10%-os ecetsavoldattal mossuk, és a kapott anyagot vákuumban 60 °C-on szárítjuk. így
19,5 g N-(3-hidroxi-6-nitro-fenil)-morfolinból és N-(3-metoxi-6-nitro-fenil)-morfolinból és N-(3metoxi-6-nitro-fenil)-morfolinból álló keveréket kapunk. Ezt a terméket diklór-metánban oldjuk, és dietil-éteres diazometán-oldatot adunk hozzá. Szobahőmérsékleten 2 napig állni hagyjuk, majd utána a fölösleges diazometánt 2 n ecetsavoldat hozzácsepegtetésével elbontjuk, a szerves fázist többször összerázzuk 2 n nátrium-hidroxid oldattal, és az oldószert vákuumban eldesztilláljuk. így 19,1 g (80,2%) N-(3-metoxi-6-nitro-fenil)-morfolint kapunk, amelynek olvadáspontja 84-86 °C. Ezt az anyagot végül 250 ml metanolban szuszpendáljuk, és 1,9 g 10%-os palládiumosszén hozzáadásával 20-30 °C-on hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után alaposan bepároljuk, és a felszabadított bázist dietil-éteres sósavoldattal a hidrokloriddá alakítjuk. 20,6 g (73,1%) N-(3-métoxi-6-aminofenil)-morfolino-dihidroklorid kristályosodik ki, amelynek olvadáspontja 237-240 °C.
Ezt az anyagot - 5 °C-on 96 ml 6 n sósavoldatban szuszpendáljuk, és 30 perc alatt hozzácsepegtetjük 6 g nátrium-nitrit 12 ml vízzel készült oldatát. A keletkező barnásvörös diazóniumsóhoz 0 °C-on keverés közben 120 ml 35%-os tetrafluorobórsav-oldatot adunk. Több órás állás után 19,5 g (63,5%) 4-metoxi-2-morfolino-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot kapunk sárga kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 115-116 °C (bomlás).
Hasonló módon kapjuk
a) 5-klór-2-nitro-anizolból és tiomorfolinból a
2-metoxi-4-(N-tiomorfolino)-benzol-diazóniumtetrafluoro-borátot; olvadáspont 106-108 °C (bomlás).
A köztitermék 2-amino-5-(N-tiomorfolino)anizol-dihidroklorid a következőképp állítható elő:
Keverővei ellátott 1 literes háromnyakú lombikban 100 g ón(II)-klorid-dihidrátot oldunk 400 ml 6 n sósavoldatban, és szobahőmérsékleten keverés közben részletekben hozzáadunk 25,4 g (1 mól)
2-nitro-5-(N-tiomorfolino)-anizolt. Utána 30 percig 75 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjűk, és a reakcióelegyet jeges hűtés közben 750 ml 30%-os nátrium-hidroxid oldatba öntjük. A felszabadított bázist dietil-éterreí többször extraháljuk, és ezt szárítás és az oldószer részbeni eldesztillálása után dietil-éteres sósavoldat hozzáadásával a hidro-kloriddá alakítjuk át. így 24,9 g (83,8%)
2-amino-5-(N-tiomorfolino)-anizol-dihidrokloridot kapunk, amelynek olvadáspontja 218-220 °C.
b) 5-klór-2-nitro-anizolból és piperidinből a 2metoxi-4-piperidino-benzol-diazónium-tetrafluoro-borátot.
Olvadáspont: 123-125 °C (bomlás).
;) 5-klór-2-nitro-anizolból és pirrolidinből a 2metoxi-4-pirrolidino-benzol-diazónium-tetrafluoro borátot.
Olvadáspont: 137-139 °C (bomlás), j) 5-klór-2-nitro-anizolból és N-metil-piperazinbcl a 2-metoxi-4-(4-metil-piperazinil)-benzoIdi.izónium-tetrafluoroborát-dihidro-tetrafluoroborá ot, amelynek olvadáspontja 163 °C (bomlás).
Ennek a vegyületnek az előállításánál a diazotálást amil-nitriítel metanolban végezzük. E célból
35,6 g (0,1 mól) 2-amino-5-(4-metil-piperazinil)arizol-dihidro-tetrafluoro-borátot oldunk 175 ml metanolban, hozzáadjuk 11,6 g (0,1 mól) amilniirit 25 ml metanollal készült elegyét, és 0 °C-on lassan, keverés közben 60 ml 35%-os tetrafluoroborsavat csepegtetünk hozzá. Állás közben 24,8 g (51,7%) barnás kristályos 2-metoxi-4-(4-metil-piper. izinilj-benzol-diazónium-tetrafluoroborát-dihidrc-tetrafluoroborát válik ki, amelynek olvadáspontja: 163 °C (bomlás).
e) 5-klór-2-nitro-anizolból és morfolinból a 2inetoxi-4-morfolino-benzol-diazónium-tetrafluorc-borátot, amelynek olvadáspontja 166-168 °C (bomlás).
10. példa
Indikátorkeverék
71,7 mg N-tozil-L-alanin-indoxil-észtert
7,5 g foszforsav-trimorfolidot és mg, az 1. Táblázatban felsorolt diazóniumsót porkeverékként - 98 rész etanolból és 2 rész dekanolból képezett - 100 ml mennyiségű elegyben oldunk.
Az így kapott oldat 2 cseppjét mikrotiter lemezen olyan vizes oldat 2 cseppjével egyesítjük, amely t ;ljes vérből mikroliterenként 1000 leukocitát és 0,2 rtoláros, bórax/sósav puffért (pH = 8) tartalmaz, majd a reakciót 1 perc múlva kiértékeljük.
Az összehasonlító eredményeket a következő táblázat szemlélteti:
Táblázat
diazóniumsó leukociták 1000/μ1 reakciószín
1. képletű vegyület + zöld
2. képletű vegyület + zöld
3. képletű vegyület + zöld
4. képletű vegyület + zöld
5. képletű vegyület + zöld
6. képletű vegyület + ibolya
7. képletű vegyület ( + ) vöröses ibolya
8. képletű vegyület + vörösbar- na
9. képletű vegyület ( + ) vöröses ibolya
10. képletű vegyület ( + ) vöröses ibolya
11. képletű vegyület + vörös
12. képletű vegyület + vörös
13. képletű vegyület + vöröses ibolya

Claims (2)

1. Készítmény leukocitákban lévő észteráz és/ vagy proteáz enzimek kimutatására, amely az említett enzimek meghatározására szolgáló kimutatóreagenst, puffért és adott esetben további adalék-, anyagot tartalmaz és szívóképes hordozóból, filmrétegből, porkeverékből, liofilizátumból, oldatból vagy reagenstablettából áll, azzal jellemezve, hogy az említett enzimek kimutató-reagenseként valamely I általános képletű szubsztituált diazóniumsóból - a képletben
R, jelentése 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- vagy morfolino-csoport, halogén- vagy hidrogénatom, R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxiesoport, R3 jelentése 1-3 szénatomos alkoxi-, fenoxi-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, di-(l-3 szénatomos alkil)-amino-, hidroxi-, morfoiino-, tiomorfolino-, 1 -pirrolidinil-, adott esetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal 4-helyzetben alkilezett piperazinil-, piperidino-, fenil-amino- vagy adott esetben 4-helyzetben 1-3 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport, halogén- vagy hidrogénatom, R4 és Rs jelentése azonos vagy eltérő és 1-3 szénatomos alkoxicsoportot vagy hidrogénatomot képvisel, R, és R2 adott esetben együtt egy —CH=CH—CH=CH— csoportot jelent és X jelentése tetrafluoro-borát- vagy tetraklórcinkát-anion - és egy II általános képletű indoxilés tio-indoxil-aminosav-észterből vagy -peptidészterből álló kombinációt - a képletben
R,, R2, R3, R4 jelentése azonos vagy eltérő és hidrogén- vagy halogénatomot, 1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoportot jelent, X’jelentése kénatom vagy adott esetben 1-3 szénatomos alkil-, benzil- vagy benzoilcsoporttal Nszubsztituált iminocsoport, A jelentése glikokollmaradék vagy D-, L- vagy DL-alakban levő alanin-, valin-, leucin-, izoleucin-, fenil-alanin-, tirozin- vagy O-acetil-tirozin-maradék, alanilalanin- vagy alanil-alanil-alanin maradék és B jelentése az A szubsztituensnél felsorolt aminosavak nitrogénatomjához kapcsolódó, alábbi csoportok egyike:
toluol-4'-szulfonil-, benziloxi-karbonil-, toluol2'-szulfonil-, toluol-3'-szulfonil-, acetil-, szukcinil-, benzoil- ftaloil-, etoxi-karbonil-, ciklohexiloxikarbonil-, feniloxi-karbonil-, 4'-metil-benziloxikarbonil-, 4'-nitro-benziloxi-karbonil-, benziltiokarbonil-, metánszulfonil-, benzilszulfonil-, 4'bróm-benzolszulfonil-, 4'-nitro-benzolszulfonil-, 4'-acetil-amino-benzol-szulfonil-, 4'-(n-butil)benzolszulfonil-, 4'-(terc-butil)-benzolszulfonil-, 4'(n-oktil)-benzolszulfonil-, 4'-hidroxi-benzolszulfonil-, 4'-metoxi-benzolszulfonil-, 4'-benziloxibenzolszulfonil-, 4'-(3-oxa-5-hidroxi-n-pentiloxi)-benzolszulfonil-, 4'-(3,6-di-oxa-n-heptiloxi)benzolszulfonil-, 4'-(2-hidroxi-etil)-benzolszulfonil-, 4'-[2-(4'-nitro-benziloxi)-etil]-benzolszulfonil-, 4'-(2-klór-etil)-benzolszuIfonil-, 4'-cianobenzolszulfonil-, 4'-karboxi-benzolszulfonil-, 4'benziloxi-karbonil-benzolszulfonil-, 4'-karbamoilbenzolszulfonil-, 4'-(dimetil-karbamoil)-benzolszulfonil-, 2',4',6'-trimetil-benzolszulfonil-, bifenil4'-szulfonil-, naftalin-2'-szulfonil-, 4'-acetil-aminonaftalin-1 ' szulfonil-, 5'-dimetil-amino-naftalin-1 szulfonil-, benziloxi-karbonil-, terc-butiloxi-karbonil-, form;l-, 4'-metoxi-benziloxi-karbonil-, N'(piperidinc)-oxikarbonil-, tienil-(2')-metoxi-karbonil-, kinolin-8'-szulfonil-, difenil-karbamoil-, furil(2')-metoxi-karbonil-, 4'-dimetil-amino-benzolszulfonil-, 4'-metoxí-karbonil-benzolszulfonil-, 4'karboxi-mctil-benzolszulfonil-, 4'-karboxi-metoxibenzolszulfonil-, 4'-karboxi-metil-amino-benzolszulfonil-, 4'-(benziloxi-karbonil-metil-amino)benzolszulíonil-, 4'-fluor-benzolszulfonil-, piridin3'-szulfonil-, 5',5'-dimetil-3'-oxo-ciklohexen-r-il-, 4'-brómbenzil-foszforil-, 3',6'-di-oxa(n-heptiloxi)karbonil-, 2'-nitro-benzolszulfenil-, l'-metil-2'benzoil-vin il-csoport - vagy valamely I általános képletű szubsztituált diazóniumsóból és egy III általános képletű fenoxi-aminosav-észterből álló kombinációt - a képletben
Rj jelentése hidrogénatom, Rj jelentése hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- vagy di-(l-3 szénatomos alkilj-aminocsoport, Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxi-csoport, R4 jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxi-csoport, A' jelentése L-alanil-csoport és B'jelentése az alanílesoport nitrogénatomjához kapcsolódó tozilcsoport, emellett az Rj szubsztituens az Rj szubsztituenssel vagy az Rj szubsztituens az Rj szubsztituenssel együtt egy — CH=C 4—CH=CH— csoportot is képviselhet - tartalmaz, emellett az egyes komponensek aránya az ; lábbi:
észter 0,035 - 7,1 mól % diazóniu nsó 0,01 - 13,2 mól % puffer (pH 6-10) maradék 100 mól %-ig és a készítméry adott esetben járulékosan a következő komporenseket is tartalmazhatja, a megadott mennyiségekben:
stabilizátor 0 - 85,5 mól % aktívától 0 - 79,3 mól % galéniuszi adalékanyag 0-32,1 mól %, emellett a stabilizátor egy VI általános képletű foszforsavszármazék, a képletben
R6 jelentése dimetil-amino-, rövidszénláncú alkoxi-, feniloxi-, rövidszénláncú alkil- vagy fenilvagy naftil- vagy N-morfolino-csoport és R7 és R8 jelentése dimetil-amino- vagy N-morfolinocsoport, és az aktivátor
a) valamely VII általános képletű piridinszármazék - a képletben
R1; R2i R3, R4 és Rs jelentése azonos vagy eltérő és hidrogén- vagy halogénatomot, rövidszénláncú alkil-, rövidszénláncú alkoxi-, vagy vinilcsoportot képvisel, amely adott esetben egy vagy több rövidszénláncú alkoxi, vagy rövidszénláncú dialkilamino-csoporttal helyettesített fenil- vagy naftilcsoporttal vagy egy 5-7 tagú, egy nitrogén, oxigén vagy kén heteroatomot tartalmazó heterociklusos csoporttal szubsztituált, és két szomszédos szubsztituens egy adott esetben halogénatommal, hidroxicsoporttal rövidszénláncú alkil- vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált olyan indenovagy benzo-anellált csoportot jelenthet, amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkilcsoporttal
187 334 szubsztituált benzo- Vagy piridő-anellált öSööőFtöí tartalmazhat és Rj meg viníl-kinuklÍdil-karbiriob esöpöftot is jelenthet vagy
b) valamely Vili általáttös képietü imidaíölszái·mazék - a képletben
Rj jelentése hidrogénatom, rövidszénláncú alkilcsoport vagy adott esetben egy hidroxi- vagy rövidszénláncú alifás acilcsoporttal szubsztituált fenilvagy naftilcsoport és R2 jelentése hidrogénatom, amino-(rövidszénláncú)-alkil-, N-(rövidszénláncú)-alifás-acil-amino-(rövidszénláncú)-alkil- vagy rövidszénláncú alifás, adott esetben telítetlen karbonsav-maradék vagy adott esetben a nitrogénatomon rövidszénláncú alifás karbonsavval acilezett rövidszénláncú alifás α-aminosav-maradék -, vagy
c) valamely IX általános képietü alkohol - a képletben
X jelentése hidrogénatom vagy hidroxicsoport és A jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy 1-5-ször telítetlen, 3—25 szénatomos alkil-, vagy telített vagy 1-3-szor telítetlen, 3-20 szénatomos cikloalkilcsoport -, vagy
d) valamely X általános képletű fémkomplex, a képletben
D jelentése alkálifémion, B jelentése nehézfémion, m értéke 2, 3, 4 vagy 5, n értéke 4, 5, 6, 7 vagy
8 és p értéke ö vagy 1, ahol az m számértéke a iuhézfémiön vegyértékéből és n számértékébél adódik.
2. Eljárás a III általános képietü fefloxi-amiftö5 sav-észtérék előállítására, a képletben
Rj jelentése hidrögénatöffi, Rj jeientése hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- vagy di-(l—3 szénatomos alkilj-aminocsoport, Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport, A' jelentése L-aíanil-csoport és B' jelentése az alanilcsoport nitrogénatomjához kapcsolódó tozilcsoport, emellett 15 az R, szubsztituens az Rj szubsztituenssel vagy az Rj szubsztituens az Rj szubsztituenssel együtt egy —CH=CH—CH=CH-csoportot képviselhet azzal jellemezve, hogy valamely IV általános képietü vegyületet - mely képletben
Rj, Rj, Rj és Rjjelentése az előbb megadottakkal azonos - egy V általános képietü aminosavval mely képletben
A' és B'jelentése az előbb megadottakkal azonos - illetve ezek megfelelő reakcióképes származékaival reagáltatunk a peptidkémiában szokásos módszerekkel.
HU811244A 1980-05-09 1981-05-08 Composition for the detection of esterase and/or protease enzymes and process for the preparation of corresponding substrates HU187334B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19803017721 DE3017721A1 (de) 1980-05-09 1980-05-09 Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU187334B true HU187334B (en) 1985-12-28

Family

ID=6101946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU811244A HU187334B (en) 1980-05-09 1981-05-08 Composition for the detection of esterase and/or protease enzymes and process for the preparation of corresponding substrates

Country Status (24)

Country Link
US (2) US4551428A (hu)
EP (1) EP0039880B2 (hu)
JP (2) JPS578798A (hu)
AR (1) AR228452A1 (hu)
AT (1) ATE3993T1 (hu)
AU (1) AU523744B2 (hu)
BR (1) BR8102876A (hu)
CA (1) CA1186201A (hu)
CS (1) CS223999B2 (hu)
DD (1) DD158559A5 (hu)
DE (2) DE3017721A1 (hu)
DK (1) DK169974B1 (hu)
ES (1) ES502034A0 (hu)
FI (1) FI77692C (hu)
HK (1) HK82586A (hu)
HU (1) HU187334B (hu)
MY (1) MY8600605A (hu)
PL (1) PL131123B1 (hu)
PT (1) PT73005B (hu)
SG (1) SG38786G (hu)
SU (1) SU1466663A3 (hu)
UA (1) UA6035A1 (hu)
YU (2) YU117781A (hu)
ZA (1) ZA812961B (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3017721A1 (de) * 1980-05-09 1981-11-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate
US4499185A (en) * 1982-05-17 1985-02-12 Miles Laboratories, Inc. Test for esterase activity in a liquid sample
DE3309544A1 (de) * 1983-03-17 1984-09-20 Macherey-Nagel & Co Chemikalienhandel, 5160 Düren Teststreifen zum nachweis von leukozyten im harn
DE3329394A1 (de) * 1983-08-13 1985-02-28 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Chromogene und fluorogene carbonsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur bestimmung von hydrolasen
EP0146348B1 (en) * 1983-12-14 1991-07-31 The Upjohn Company Substituted naphthalenes, indoles, benzofurans and benzothiophenes as lipoxygenase inhibitors
US4657855A (en) * 1984-04-06 1987-04-14 Miles Laboratories, Inc. Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample
DE3413119A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3413118A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3413077A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-17 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3413120A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
US4637979A (en) * 1984-04-06 1987-01-20 Miles Laboratories, Inc. Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent
DE3413078A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3446714A1 (de) * 1984-12-21 1986-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
US4777267A (en) * 1986-02-07 1988-10-11 Kanebo Ltd. 1,3-dioxol-2-one derivatives
US4677075A (en) * 1986-05-05 1987-06-30 Louderback Allan Lee Urobilinogen control
DE3813503A1 (de) * 1988-04-22 1989-11-02 Boehringer Mannheim Gmbh Traegergebundenes mehrkomponentiges nachweissystem zur kolorimetrischen bestimmung esterolytisch oder/und proteolytisch aktiver inhaltsstoffe von koerperfluessigkeiten
US5084324A (en) * 1989-08-25 1992-01-28 W. R. Grace & Co.-Conn. Micro-bubble laminate with perforated substrate
US4950354A (en) * 1989-08-25 1990-08-21 W. R. Grace & Co.-Conn. Method of making a micro-bubble laminate
JPH0465584U (hu) * 1990-10-12 1992-06-08
EP0661280A1 (en) * 1993-12-29 1995-07-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Novel amino acid ester and reagent composition for detecting leucocytes or elastase in body liquid
CA2161574A1 (en) 1994-11-15 1996-05-16 James Noffsinger Methodology for colorimetrically determining the concentration of white blood cells in a biological fluid
US6348324B1 (en) 1999-01-21 2002-02-19 Hypoguard America Limited Composition and device for detecting leukocytes in urine
US6528652B1 (en) 1999-01-21 2003-03-04 Chronimed Composition and device for detecting leukocytes in urine
US6203496B1 (en) * 1999-08-12 2001-03-20 Michael R. Gael Apparatus with reagents for detection of medical conditions
IL140993A0 (en) 2000-05-15 2002-02-10 Bayer Ag Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
US6955921B2 (en) 2001-04-30 2005-10-18 Bayer Corporation Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
US6709868B2 (en) * 2002-05-20 2004-03-23 Portascience Inc. Method and apparatus for measuring white blood cell count
US7727206B2 (en) * 2005-12-27 2010-06-01 Gorres Geoffrey H Device for monitoring a patient for a urinary tract infection
EP3848708A1 (en) * 2020-01-13 2021-07-14 Roche Diagnostics GmbH Reagent formulation for leukocyte test strip

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1128371A (en) * 1965-10-04 1968-09-25 Miles Lab Diagnostic composition
US3585001A (en) * 1969-02-17 1971-06-15 Miles Lab Stabilized test device and process for detecting couplable compounds
US3715325A (en) * 1970-10-02 1973-02-06 Miles Lab Insoluble polymeric diazonium salt chromogen
US3905872A (en) * 1973-12-14 1975-09-16 American Cyanamid Co Alkaline phosphatase test material
DE2531539A1 (de) * 1975-07-15 1977-01-20 Riedel De Haen Ag Indikatorsubstanz zum nachweis von kuppelnden fluessigkeits-inhaltsstoffen, diese enthaltende diagnostische mittel und verfahren zu deren herstellung
DE2836644A1 (de) * 1978-08-22 1980-03-06 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene
DE2854987A1 (de) * 1978-12-20 1980-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene
DE2905531A1 (de) * 1979-02-14 1981-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
DE3017721A1 (de) * 1980-05-09 1981-11-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate

Also Published As

Publication number Publication date
DK169974B1 (da) 1995-04-18
HK82586A (en) 1986-11-07
JPS61199800A (ja) 1986-09-04
DE3160522D1 (en) 1983-08-04
AU7023981A (en) 1981-11-12
PL131123B1 (en) 1984-10-31
JPS6145982B2 (hu) 1986-10-11
FI77692C (fi) 1989-04-10
CS223999B2 (en) 1983-11-25
CA1186201A (en) 1985-04-30
DE3017721A1 (de) 1981-11-26
PL231002A1 (hu) 1981-12-23
ES8202792A1 (es) 1982-03-01
AU523744B2 (en) 1982-08-12
JPS578798A (en) 1982-01-18
EP0039880B2 (de) 1987-06-03
SG38786G (en) 1989-09-01
JPH0243480B2 (hu) 1990-09-28
MY8600605A (en) 1986-12-31
UA6035A1 (uk) 1994-12-29
PT73005A (de) 1981-06-01
PT73005B (de) 1982-07-01
EP0039880A1 (de) 1981-11-18
SU1466663A3 (ru) 1989-03-15
BR8102876A (pt) 1982-02-02
ATE3993T1 (de) 1983-07-15
US4749648A (en) 1988-06-07
YU117781A (en) 1983-12-31
ZA812961B (en) 1982-05-26
ES502034A0 (es) 1982-03-01
YU112483A (en) 1989-10-31
FI77692B (fi) 1988-12-30
US4551428A (en) 1985-11-05
DK204881A (da) 1981-11-10
DD158559A5 (de) 1983-01-19
FI811418L (fi) 1981-11-10
YU45887B (sh) 1992-09-07
EP0039880B1 (de) 1983-06-29
AR228452A1 (es) 1983-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU187334B (en) Composition for the detection of esterase and/or protease enzymes and process for the preparation of corresponding substrates
JP3814630B2 (ja) 体液中の白血球の濃度を比色法により測定するための改良法
FI77229B (fi) Indoxyl-aminoestrar och -peptidestrar, deras framstaellning och anvaendning foer paovisande av proteolytiska enzymer.
US4637979A (en) Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent
US4723020A (en) Chromogenic amino acid esters and peptide esters
US4814271A (en) Method for detecting esterolytic and proteolytic enzymes
US6051391A (en) Detection of microbial metabolites
FI81359C (fi) Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser.
HUT71703A (en) Method for determining analite with pqq-depending dehydrogenase
HU179936B (en) Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens
JP2654355B2 (ja) キノンイミン誘導体およびその製造方法
US4469789A (en) Amino acid and peptide esters of leuko-indoaniline compounds and compositions for the detection of proteolytic enzymes
US4155916A (en) Fluorescence method for enzyme analysis which couples aromatic amines with aromatic aldehydes
US4755462A (en) Analytical process and agents for the detection of esterolytic and/or proteolytic enzymes
JP2002069055A (ja) トリプシン基質及び診断具ならびにその使用方法
CA1248697A (en) Phenoxyamino acid esters and peptide esters
SI8311124A8 (sl) Sredstvo in postopek za dokaz ekterolitskih in/ali proteolitskih encimov
JPH0550276B2 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628