SE445829B - Ny l-gamma-glutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid och salter derav - Google Patents

Description

7965909-2 statisk hepatom. Kronisk hepatit ökar,H*-GTP-halten i serum i det aktiva stadiet under det att halten förblir vid en låg nivå när sjukdomen är i det inaktiva stadiet. Generellt är variationen av ff-GTP-halten i serum specifik för kroniska leversjukdomar och skiljer sig i diagnostiskt avseende helt från halten vid enzym- förlust. Undersökning av 3,-GTP-aktiviteten i serum har därför blivit ett oundgängligt test vid diagnosticeringen av ovannämnda sjukdomar och för att få en uppfattning om varje sjukdomstillstånd.

För undersökning av å”-GTP-aktiviteten har många metoder före- slagits, vid vilka syntetiska substrat användes och de bildade aminföreningarna bestämmes. Alla dessa metoder har emellertid både för- och nackdelar, och man har därför sett fram mot fram- ställningen av ett nytt syntetiskt substrat. Vid en av de enligt ovan föreslagna metoderna användes t.ex. F-glutamyl-di-naftylamid som substrat och den bildade aC-naftylaminen mätes kolorimetriskt efter omvandling till ett diazoniumsalt [Élinica Chimica Acta, volym 7, 755 (l962L]. Denna metod har visat sig opraktisk eftersom naftylamin är känd för att vara ett karcinogent ämne, och metoden är komplicerad och tidsödande. Vid en annan föreslagen metod an- vändesff-glutamyl-p-nitroanilid som subärat vid kolorimetrisk be- stämning av p-nitroanilin, gult till färgen, som bildas av sub- stratet Åëlinica Chimica Acta, volym 65, 21 (l975L]. Denna metod fordrar ett exakt blankt test för varje serumprov för att man skall undvika inverkan av serumbeståndsdelar och resultaten av undersökningarna blir bristfälliga. Den kolorimetriska bestämning- en av p-nitroanilin efter kondensation med p-dimetyl-aminocinna- maldehyd har den nadzdelen att känsligheten vid färgramkallningen kraftigt påverkas av temperaturen, vilket resulterar i otillfreds- ställande återgivning. Vid ett annat förfarande diazoteras p-nitro- anilin och kondenseras därefter med 3,5-xylenol, och den så fram- kallade röda färgen mätes sedan kolorimetriskt ¿fiapanska patent- ansökningen ("Kokai") 32092/78, utlagd7. Denna metod har ej visat sig vara tillräckligt enkel eftersom behandlingen av p-nitroanilin innefattar ett flertal steg. Nyligen har man gjort ett försök att undersöka 3'-GTP-aktiviteten med användning av f-glutamyl-p~dimetyl- aminoanilid som substrat och kolorimetrisk bestämning av bildat p- 7905009-2 dimetylaminoanilin efter färgframkallrting med ett pentacyanojärn- komplex [japanska patentansökningen ("Kokai") 146.693/77, utlagdf.

Denna metod har de nackdelarna att lagringstiden för den färgfram- kallande lösningen endast är några dagar på grund av otillräcklig stabilitet och att mängden cyan som frigöres i avloppsvattnet kan orsaka miljöföroreningar. Vidare har alla ovannämnda substrat då- lig löslighet i vatten, vilket nödvändiggör användning av ett so- lubiliseringsmedel, som t.ex. ett ytaktivt medel, organiskt lös- ningsmedel eller liknande, vilket ej lätt kan kontrolleras. Även när ett sådant medel användes är koncentrationen ofta ej tillräck- lig för reaktionen.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att ge ett substrat som kan användas vid undersökning av Ä'-GTP-aktiviteten, som är till- räckligt lösligt i vatten och som har egenskaper som gör det möj- ligt att komma ifrån problemen med tidigare teknik vad gäller praktiskt utförande, säkerhet, exakthet, återgivning, enkelhet, stabilitet och möjlighet till miljöföroreningar.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att ge en metod att undersöka Å'-GTP-aktiviteten, vilken metod innefattar använd- ning av substratet.

Ett ytterligare syfte med uppfinningen är att ge ett sätt att framställa ifrågavarande substrat.

Uppfinnarna ledde försöken att förkättra de konventionella meto- derna för undersökmng av J'-GTP-aktiviteten, vilka hade de ovan nämnda nackdelarna. Som ett resultat fann man ett nytt substrat med utmärkta egenskaper. Denna upptäckt har lett till utarbetan- det av föreliggande uppfinning.

Föreliggande uppfinning avser L- anilid representerad av formeln H2N\ coon /cn - cnz - cnz - com: -C><_ on (I) Hoç II o 7905099-2 eller ett syraadditionssalt därav, vilken förening är lämplig att använda som substrat vid undersökning av XïGTP-aktiviteten. Som framgår av ovanstående beskrivning är föreningen enligt uppfinningen avsedd att användas vid undersökning av XÄGTP-aktiviteten. Vid under- sökningen får substratet enligt uppfinningen reagera med KÄGTP hos ett serum i en buffertlösning med pH 7,5-9,5 och 3-karboxi-4-hydroxi- anilin som bildas vid reaktionen utsätts för oxidativ kondensation med ett lämpligt kopplingsmedel för att bilda en färgad substans, vilken sedan mäts kolorimetriskt för bestämning av XLGTP-aktiviteten i serumet.

Lämpliga kopplingsmedel för färgframkallning i sur lösning är ani- linföreningar som t.ex. N,N-dietylanilin, och sådana för färgfram- kallning i alkalisk lösning är fenol- och naftolföreningar som t.ex. 2,6-xylenol och 2,5-xylenol. - Det oxidationsmedel som är lämpligast att använda vid den okida- tiva kondensationen är natriummetaperiodat men olika andra medel, såsom väteperoxid, persulfater och liknande, kan även användas.

Den färgade substans som bildas vid den oxidativa kondensationen mellan 3-karboxi-4-hydroxianilin och ett kopplingsmedel har en maximal absorption i ett brett våglängdsområde från 560 till 770 nm, beroende pådpen av kopplingsmedel. Färgframkallningen är mycket stabil och påverkas mycket litet av temperaturvariationer och är därför lämplig att användas vid undersökning av à“-GTP- aktiviteten.

Eftersom föreningen L-à'-qlutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid har hydrofila funktionella grupper är den lättlöslig i vatten och ford- rar ej något solubiliseringsmedel, såsom ytaktivt medel eller orga- niskt lösningsmedel. Reagensframställningen och mätningsproceduren är därför båda lätta att utföra, och substratet kan användas i koncentrationer som är tillräckligt höga för reaktionen. Dessa är de viktigaste fördelarna med uppfinningen. 7905009-2 G1 Ett utmärkande drag hos uppfinningen är vidare att undersök- ningen av ß”-GTP-aktiviteten knappast pâverkas av närvaron av föroreningar i ett prov taget från en levande varelse. Detta beror på att undersökningen enligt uppfinningen sker vid en våg- längd längre än 560 nm, i motsats till L- I-glutamyl-p-nitroani- lidmetoden vid vilken mätningen sker vid en våglängd kortare än 560 nm. Följaktligen behöver något blankt test ej utföras för var- je prov, vilket medger en snabb undersökning. Reduoerande substan- ser, såsom urinsyra och askorbinsyra, i provet sönderdelas av ett överskott av oxidationsmedel och har följaktligen ej någon inverkan på mätningens noggrannhet.

Av ovanstående beskrivning framgår tydligt att som substrat vid undersökning av'f-GTP-aktiviteten är föreningen enligt uppfinning- en vida överlägsen de konventionella substraten. Som framgår av försöksexemplen nedan föreligger tillfredsställande Korrelation mellan de noterade värden som erhållits vid användning av före- ningen enligt uppfinningen och de som erhållits med en hitintills allmänt använd konventionell metod.

Föreningen enligt uppfinningen representerad av formeln (I) fram- ställes på ett vanligt sätt.

Exempelvis kan den framställas genom att glutaminsyraanhydrid med skyddad aminogrupp bringas reagera med 3-karboxi-4-hydroxiani- lin, varefter skyddsgruppen avlägsnas från reaktionsprodukten.

Lämpliga skyddande grupper är sådana som lätt kan avlägsnas vid de milda betingelser som tillämpas vid vanlig peptidsyntes, som t.ex. ftalylgruppen som kan avlägsnas med hydazin, tert-butoxikar- bonylgruppen och formylgruppen vilka båda kan avlägsnas vid svagt sura betingelser, trifluoracetylgruppen som kan avlägsnas vid svagt alkaliska betingelser och bensyloxikarbonylgruppen som kan avlägsnas med hjälp av bromväte eller katalytisk reduktion. Kon- densationen kan lätt utföras genom värmning i ett lämpligt lös- ningsmedel, såsom ett inert organiskt lösningsmedel. Om nödväne digt kan den fria aminosyraaniliden som frigjorts från den skyd- 7905069-2 dande gruppen omvandlas till ett salt genom tillsats av olika oorganiska eller organiska syror, eller till ett alkalimetallsalt genom reaktion med en alkaliförening eller till ett aminsalt.

Uppfinningen åskådliggöres detaljerat nedan med referens till försöksexempel och exempel, men dessa exempel utgör ej någon be- gränsning av uppfinningen.

Försöksexempel Exempel avseende undersökningen av 2'-GTP-aktiviteten i ett serum med användning av en framkallningslösning av 2,6-xylenol-natrium- metaperiodat.

I 80 ml vatten löstes 0,5 g glycylglycin och 1,3 g tris (hydroxi- metyl)aminometan. Lösningen inställdes på pH 8,2 med 3N klorväte- syra och späddes till 100 ml genom tillsats av vatten så att en buffertlösning erhölls. En substrat-buffertlösning erhölls genom att ll3 mg L- Y-qlutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid löstes i ovan- nämnda buffertlösning.

Till ett provrör innehållande 1,0 ml av substrat-buffertlös- ningen och hållet vid 37°C sattes 0,02 ml av ett serumprov. Efter 20 minuters inkubation sammanblandades blandningen med 3,0 ml av ett färgreagens framställt genom att man löst 86 mg 2,6-xylenol och 32 mg natriummetaperiodat i 100 ml 0,2 N vattenlösning av ka- liumhydroxid. Den resulterande blandningen fick stå under 10 mi- nuter vid rumstemperatur och absorbansen vid 615 nm mättes. Ett blankt test utfördes på samma sätt som ovan med undantag av att 0,02 ml vatten insattes i stället för serum. Värdet på serum-l' -GTP-aktiviteten beräknades med utgång från skillnaden i absor- bans som erhölls vid de två mätningarna enligt ovan och absorban- sen för 0,02 ml av en standardlösning innehållande en känd mängd 3-karboxi-4-hydroxianilin och behandlad på det sätt som beskri- vits ovan.

Som jämförelse visas i följande tabell de så erhållna uppmätta värdena och värdena erhållna med den allmänt använda konventio- 7905009-2 nella metod som utnyttjar L-)'-glutamyl-p-nitroanilid som sub- strat.

De uppmätta värden som erhölls med metoden enligt uppfinningen inprickades på ordinatan och de som erhölls med L-J"-g1utamy1-p- nitroanilidmetoden på abskissan, så att följande reversibla ekva- tion erhölls: y = l,07X ~ 1,50 Korrelationen var tillfredsställande, och korrelationskoefficien- ten var J"= 0,992.

Tabell - Jämförelse mellan uppmätta värden erhållna med me- toden enligt föreliggande uppfinninq och värden er- hållna med L- I'-glutamyl-p-nitroanilidmetoden med användning av humant serum.

Prov Metod enligt föreliggande )-g1utamyl-p-nitro- uppfinning anilidmetoden 1 205 209 2 58 58 3 206 196 4 529 495 5 91 81 6 85 114 7 144 143 8 53 49 9 32 " 31 10 9 9 11 22 19 12 21 19 13 6 6 14 11 ll 15 10 10 16 62 61 17 26 26 7905099-2å s 18 21 20 19 7 20 21 72 so 22 326 283 23 164 142 24 392 354 25 13 14 26 16 17 21 22 20 28 _ 42 40 29 s a 30, _ 17 ' 16 31 L 9 8 32 33 13 14 Exemgel Syntes av L-å'-glutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid Till en blandning av 25,9 g (0,1 mol) ftaloylglutaminsyra-an- hydrid och l5,3 g (0,1 mol) 3-karboxi-4-hydroxianilin sattes 60 ml ättiksyra. Blandningen fick reagera genom värmning vid 60°C och omröring under 30 minuter. Efter avslutad reaktion kyl- des reaktionsblandningen till rumstemperatur och hälldes i 500 ml eter, fick stå med kylning under 2 timmar varefter fällning- en avlägsnades genom filtrering genom ett glasfilter. Filtratet sattes långsamt och under omröring till l l n-hexan som införts i en separat 2-liters kolv. Fällningen som bildades uppsamlades genom filtrering, tvättades med n-hexan och torkades i vakuum, varvid erhölls 41,0 g (99,5%) rå ftaloyl-Iw-J@glutamyl-3-karboxi- 4-hydroxianilid. Den råa substansen löstes i 431 ml metanol, blandades med 26,8 ml l00%~igt hydrazinhydrat och fick reagera vid rumstemperatur under 24 timmar för avlägsnande av ftalyl- gruppen. Fällningen som erhölls avlägsnades genom filtrering och filtratet indunstades helt. Återstoden löstes i 212 ml vat- ten och filtrerades. Filtratet inställdes på ett pH-värde av l-2 och fick stå över natten. Den bildade fällningen uppsamlades ge- 7905009-2 vatten*och aceton och torkades i smältpunkc: 17s-177°c (sönder- __/,,¿]D2° = +a,6 (c = Loosn mon). nom filtrering, tvättades med vakuum. Utbyte: 11,5 g (4l%); delning); specifik rotation: l Elementaranalys: Cl2Hl4N206. Ü H20 (molekylvikt 288,3) funnet: C% 49,78 H% 4,90 N% 9,69 beräknat: 50,00 5,13 9,71 Jämförande försök har utförts mellan y-L-glutamyl-3-karboxi-4-hydroxiani- lid enligt uppfinningen och Y-L-glutamyl-3-karboxianilid som är tidigare känd och som har en struktur som liknar föreningen enligt uppfinningen.

Härvid har följande undersökts: (i) reaktiviteten med Y-GTP (ii) problem vid färgframkallningen för den bildade fria radikalen, och (iii) andra faktorer som påverkar reaktionen, speciellt effekten av Gly-Gly (glycylglycin).

Härav framgår att y~L-glutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid fungerar utmärkt som substrat för analys av-Y-GTP~aktiviteten i jämförelse med y-L-g1utamyl-3- karhoxianilid. (1) Reaktivitet gentemot Y-GTP: Reaktiviteten av substraten'y-glutamyl-3-karboxianilid (i det följande benämnd Y-L-Glu-CA) som i stor utsträckning tidigare använts, och Y-glutamyl-3- karboxi-4-hydroxianilid (i det följande benämnda Y-L-Glu~CHA) enligt föreliggan- de uppfinning på enzymet Y~GTP undersöktes.

En buffertlösning av substratet framställdes genom upplösning av 4,0 mM/1 substrat i en buffertlösning innehållande 100 mM/l tris(hydroxlmety1)am1n0me;¿n och 80 mM/1 glycylglycin och inställning av lösningens pH på 8,30. Till 1,0 mi av substratbuffertlösningen sattes 0,02 ml humanserum och efter reaktion i 20 min vid 37°C sattes därtill 3,0 ml färgreagens för att stoppa enzymreaktionen och framkalla en färg. Absorbansen därav mättes med hjälp av en spektrofoto- meter. Genom att använda absorbansvärdet för en standardlösning som erhållits genom ett förfarande liknande det ovanstående, beräknades enzymaktiviteten från skillnaden i absorbans. Resultaten anges i tabell 1 nedan. 79Û5Û09~2 10 Tabell l: Enzymaktivitet för substratet Serum Y -L-Glu-CHA Y -L~G1u-CA nr l 24,2 mU/ml 15,3 mU/ml 2 4,8 2,4 3 67,3 49,7 4 937 _ 6,6 5 126,9 95,1 6 61,0 46,9 7 240,2 172,1 8 13,6 ' 14,2 9 28,6 23,8 IO 9,7 4,1 X 58,6 mU/ml 43,0 mU/ml Relativ aktivitet 1002 73,42 Som framgår av tabell I är den relativa reaktivlteten för'y-L-Glu-CA så låg som ca 73,42 om densamma för Y-L-Glu-CHA enligt uppfinningen sätts till 100%. Detta innebär att föreningen enligt föreliggande uppfinning är ca 1,4 gånger bättre. (ii) Färgframkallningens stabilitet: Vid en kolorimetrisk bestämning under användning av'Y-L-Glu-CA kan m-amino-bensoesyra som därvid bildas, som till strukturen skiljer sig från 3,5-amino-salicylsyra som bildas av Y-L-Glu-CHA, ej bilda färg av indofenol-typ som är stabil, därför att Y-L-Glu-CA ej har någon OH-grupp i strukturen. En lïgg metod för kolorimetrlsk bestämning som finns tillgänglig i detta fall är således endast en kolorlmetrisk bestämning genom kondensation med p-dimety1aminokanel- aldehyd, vilket är en konventionell metod, liknande den som används med p-nitro- anilin. Denna färgframkallníng, liksom 1 fallet med p~n1troanilin, har de väl kända olägenheterna att sensibiliteten av Eärgframkallningen i hög grad påverkas av temperaturen och färgen är således ej stabila 11 7905009-2 COOH H C\\ H 142m + 3 »IQ-CH = cH-c: H3c/ o COOH H C *à 3 \N ca = cH-cu = N n c/ 3 lysande röd färg Ä max = 535 mm Tabell 2 Kromogen Kopplingsmedel. Ä max Ahsorbans 2o°c 25°c 3s°c m-amino- p-dimetyl- ' nm _ bensoesyra aminokanel- 535 ' l9.SQO 17.000 12.320 aldehyd 5-aminosal1- 2,6-xylenol 615 2l.600 21.600 21.600 cylsyra Som framgår av tabell 2 är temperaturens inverkan på absorbansen mycken anmärkningsvärd i fallet m~aminobensoesyra, under det att absorbansen är helt stabil vid användning av 5-aminosalicylsyra.

Detta visar att en förening utan OH-grupp är behäftad med en allvarlig brist 1 mätningen. (iii) Effekt av glycylglycin på substratets stabilitet.

Eftersom'Y-GTP enzymet har en sådan funktion att Y-glutaminsyra omvandlas till glyeylglyein, är det nödvändigt att reaktiunen mellan enzym och subsgrat utföres i närvaro av en tillräcklig mängd glycylglycin i reaktionssystemet.

Detta förhållande undersöktes, varvid erhölls de resultat som visas 1 bifogade fig. 1.

Som framgår av fig. l fortskrider en icke-enzymatisk nedbrytning av substratet vid en ökning av mängden tillsatt glycylglycin i fallet næd Y-L- Glu-CA, varför de s k blankvërdet för substratet varierar avsevärt och det blir svårt att upprätthålla praktiska mätbetingelser. Å andra sidan förekommer knappt någon påverkan av mängden glycylglycin i fallet med Y~L-Glu-CHA.

Claims (1)

1. 7905009-2 12 Ovanstående faktum, dvs. den anmärkningsvärda effekten av glycylglycin på Y-L-Glu-CHA begränsar kraftigt betingelserna för enzymreaktionen och gör det svårt att åstadkomma en riktig mätning. Detta visar således att Y-L-Glu-CA ej lämpar sig som substrat. Av ovanstående försök framgår klart att Y*L-Glu-CHA som har en -OH-grupp 1 p-ställning är vida över1ägsen'y~LfGlu-CA, vad gäller reaktiviteten, färgfram- kallningen och påverkan av glycylglycin. PATENTKRAV. Föreningen L- å'-glutamyl-3-karboxi-4-hydroxianilid, k ä n n e t e c k n a d av att den motsvarar formeln COOH OH (I) HZN \cH-cn -cn -comxj - 2 2 \=__ HO ,// i eller ett syraadåitionssalt därav.