CN115109066B - 一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用，其分子式为C18H15F5N2O3，其结构式如式(I)所示，
该荧光探针具有灵敏度高、选择性好，亲和性强以及斯托克斯位移大等优点，可应用于活细胞和斑马鱼模型中内源性的弹性蛋白酶检测和成像。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测领域，尤其涉及一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
中性粒弹性蛋白酶是由中心粒分泌的一种丝氨酸蛋白酶，它能够轻易降解细胞外基质蛋白，包括弹性蛋白，I-IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白。大量研究表明，弹性蛋白酶的过渡表达会导致许多疾病，如慢性阻塞性肺病、急性肺损伤、类风湿性关节炎、囊性纤维化和急性呼吸窘迫综合征等。此外，弹性蛋白酶在促进肿瘤生长、促进肿瘤侵袭转移方面发挥着重要作用，并可引起胰岛素抵抗。因此，建立一种灵敏、选择性的方法来监测细胞和生物体中的弹性蛋白酶具有重要意义。
迄今为止，检测弹性蛋白酶的方法有色谱法、质谱法、电化学法以及比色法，然而，它们大多数操作起来复杂，检测时间长，并且不能用于生物系统的体内监测。因此，迫切需要开发一种有效的检测方法来检测体内弹性蛋白酶。荧光分析法具有灵敏高、选择性好、操作简单、原位无损检测、时空分辨率好、实时监测等优点等，受到了国内外研究人员的广泛关注。
目前用于检测弹性蛋白酶活性的小分子荧光探针只有四种，但是这些探针的斯托克斯位移相对较小，使得自发荧光干扰大、组织穿透，从而限制了复杂生物系统的应用。因此，开发一种具有大的斯托克斯位移的新探针显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针斯托克斯位移大，可降低背景荧光干扰、提高灵敏度。
为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其分子式为C18H15F5N2O3，其结构式如式(I)所示，
第二方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1.以8-羟基久洛尼定-9-甲醛及硝基乙酸乙酯为原料，于溶剂中加热回流反应，经分离纯化，得到第一中间体；
S2.在酸性条件下，以氯化亚锡二水合物及第一中间体为原料，搅拌反应后，经分离纯化，得到第二中间体；
S3.在吡啶存在条件下，以第二中间体及五氟丙酸酐为原料，于溶剂中，搅拌反应，经分离纯化后，即得荧光探针；
其合成路线如下：
优选的，8-羟基久洛尼定-9-甲醛与硝基乙酸乙酯的摩尔比为1:1-2。
优选的，氯化亚锡二水合物与第一中间体的摩尔比为3-4:1。
优选的，第二中间体与五氟丙酸酐的摩尔比为1：1-4。
优选的，步骤S2中，分离纯化的步骤为，在冰水浴的条件下冷却反应产物并用碱调pH值至9，再用乙酸乙酯萃取、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，而后利用硅胶柱层析进行分离。
第三方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的应用，荧光探针用于弹性蛋白酶的体外或体内检测。
优选的，荧光探针用于水环境中弹性蛋白酶的定性定量检测。
优选的，的荧光探针用于活体细胞及活体斑马鱼内源性弹性蛋白酶的检测和成像，细胞用于非治疗目的。
优选的，荧光探针用于检测浓度为0-10U/mL的弹性蛋白酶的定性定量检测。
本申请的有益效果如下：
本发明制备的荧光探针，斯托克斯位移大(165nm)，灵敏度高(0.16 U/mL)，荧光强度倍数高(21倍),亲和力强(Km＝5.02±0.38μM)，选择性好；
本发明制备的荧光探针，细胞毒性低，生物相容性好，能够对细胞和斑马鱼中内源性弹性蛋白酶进行监测和成像。
附图说明
图1为本发明实施例1所得荧光探针的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例1所得荧光探针的13C NMR谱图；
图3为本发明实施例1所得荧光探针的HRMS谱图；
图4为本发明实施例1所得荧光基团的1H NMR谱图；
图5为本发明实施例1所得荧光基团的HRMS谱图；
图6为本发明实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶响应的紫外吸收光谱图；
图7为本发明实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶响应的荧光光谱图；
图8为本发明实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的荧光强度与响应时间的关系；
图9为本发明实施例1所得荧光探针对不同浓度的弹性蛋白酶滴定测试图；
图10为本发明实施例1所得荧光探针在低浓度范围内检测弹性蛋白酶的检测限测试图；
图11为本发明为不同浓度的荧光探针和荧光团在535nm处的荧光光谱图；
图12为本发明实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的酶动力学测试图；
图13为本发明实施例1所得荧光探针对弹性蛋白酶及其他分析物响应的选择性实验图；
图14为本发明实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的高效液相色谱；
图15为本发明实施例1所得荧光探针检测活细胞中弹性蛋白酶的荧光成像图；
图16为本发明实施例1所得荧光探针检测斑马鱼中弹性蛋白酶的荧光成像图；
图17为荧光探针与弹性蛋白酶的作用机理。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本申请提供本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其分子式为C18H15F5N2O3，其结构式如式(I)所示，
该荧光探针具有灵敏度高、选择性好，亲和性强以及斯托克斯位移大等优点。该探针与弹性蛋白酶结合后，荧光强度增强约21倍；本发明的荧光探针与0-10U/mL弹性蛋白酶的具有良好的线性关系，可用于低浓度的定性定量实验；还可应用于活细胞和斑马鱼模型中内源性的弹性蛋白酶检测和成像。荧光探针(I)与弹性蛋白酶响应后的产物(II)具有绿荧光，并在535nm处的荧光强度逐渐增加，属于荧光增强型荧光探针，该产物的分子式为C15H16N2O2，其结构式如式(II)所示：
第二方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1摩尔当量的8-羟基久洛尼定-9-甲醛以及1-2摩尔当量的硝基乙酸乙酯溶解于正丁醇中，加热回流12-13小时，反应物冷却到室温后过滤，再用石油醚洗涤并干燥得到紫色固体化合物2即第一中间体；
S2.将10-20mL 37％盐酸、3-4摩尔当量氯化亚锡二水合物装入到50mL 圆底烧瓶中，将1摩尔当量的化合物2分批加入到上述混合物中，反应12-24h, 在冰水浴的条件下冷却混合物并用5M氢氧化钠调pH值至9，再用乙酸乙酯萃取、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，而后利用硅胶柱层析进行分离得到黄绿色固体HNCOU即第二中间体。
S3.将1摩尔当量的化合物HNCOU溶于无水二氯甲烷中，并加入3-4摩尔当量的吡啶，常温搅拌25-30min，再往里加入含1-4摩尔当量的五氟丙酸酐的无水二氯甲烷，常温搅拌12-20小时，待反应完全后，萃取、洗涤、柱层析得到目标探针化合物HNCOU-NE即为大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针。
其合成路线如下：
本方案的制备方法原料价格低廉、反应条件温和、易于合成，得到的探针能够在体外检测弹性蛋白酶的活性，表现出高的灵敏度、好的选择性、低的检测限、高的亲和力，大的斯托克斯位移，此外，该探针还能检测细胞以及斑马鱼内源性弹性蛋白酶的活性。
第三方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的应用，荧光探针用于弹性蛋白酶的体外或体内检测，弹性蛋白酶的体外检测包括水环境中弹性蛋白酶的定性定量检测，弹性蛋白酶的体内检测包括在活体细胞及活体斑马鱼内源性弹性蛋白酶的检测和成像，细胞用于非治疗目的，检测范围为0-10U/mL的弹性蛋白酶。
本发明的荧光探针与弹性蛋白酶的作用原理如下：荧光基团的10位上具有给电子能力的氨基，当受到光激发时，发生分子内电子转移现象，荧光探针(I)将具有吸电子能力的五氟酰基团作为识别基团，阻碍了分子内电荷转移，使荧光探针处于淬灭状态，当加入弹性蛋白酶后，荧光探针上的酰胺键断裂，释放出荧光基团，其荧光信号在535nm处的荧光强度逐渐变强，荧光强度的变化可以定性定量检测弹性蛋白酶的活性及含量，反应路线如下：
以下通过具体实施例对本方案进行说明。
实施例1
一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其制备方法包括以下步骤：
化合物2的合成：称取8-羟基久洛尼定-9-甲醛(500mg，2.3mmol)和硝基乙酸乙酯(334mg 2.5mmol)溶解于15mL正丁醇中，加热到120℃回流12小时，TLC检测反应完全，反应结束后，反应混合物冷却到室温后抽滤，用石油醚洗涤，收集滤饼，不需进一步纯化，放于真空干燥一晚，得到紫色固体，592 mg,产率约为90％。
化合物HNCOU的合成：称取化合物2(300mg，1.0mmol)置于圆底烧瓶中，再称取氯化亚锡二水合物(710mg，3.1mmol)溶于12mL 37％HCl中，溶解完毕后，逐滴加入到上述体系中，常温反应24h，TLC监测反应完全，反应结束后，冰水浴冷却，加入5M NaOH碱化，所得溶液用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机相三次，无水Na2SO4干燥，旋干，然后通过硅胶柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:15，v/v)提纯得到黄色固体，真空干燥后得到产物HNCOU214 mg,产率约为80％。
本实例所得荧光团HNCOU的1H NMR如图4所示，1H NMR(400MHz, DMSO-d6)波谱δ6.79(s,1H),6.62(s,1H),4.97(s,2H),3.11-3.14(m,4H), 2.67-2.74(m,4H),1.85-1.91(m,4H)。
本实例所得荧光团HNCOU的HRMS如图5所示，HR-MS(ESI)calculated forC15H17N2O2 +[M+H]+257.1285；Found:257.1276。
荧光探针HNCOU-NE的合成：称取化合物HNCOU(150mg，0.6mmol)、吡啶(79mg2.3mmol)溶于15mL无水二氯甲烷中，待完全溶解后，在冰水浴的条件下，逐滴加入含五氟丙酸酐(363mg 1.2mmol)的10mL无水二氯甲烷溶液，常温搅拌10h，用二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥，柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:40,v/v)，真空干燥后得到黄绿色固体200mg,即为荧光探针HNCOU-NE，产率约为85％。
本实例所得荧光探针HNCOU-NE的1H NMR如图1所示。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.75(s,1H),8.51(s,1H),6.89(s,1H),3.29-3.27(m,4H),2.88(t,J ＝4.0Hz,2H),2.77(t,J＝4.0Hz,2H),2.01-1.94(m,4H).
本实例所得荧光探针HNCOU-NE的13C NMR如图2所示。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ159.04,155.65,155.39,155.13,148.53,145.73,128.79,125.46, 119.64,119.21,116.35,115.68,107.22,106.69,106.25,82.11,49.98,49.55,31.91, 29.68,29.34,27.46,22.67,21.28,20.40,20.21,14.09.
本实例所得荧光探针HNCOU-NE的HRMS谱图如图3所示。HR-MS(ESI) calculatedfor C18H16F5N2O3 +[M+H]+403.1076；Found:403.1035.
实施例2
测定实施例1所得荧光探针与弹性蛋白酶反应的效果：
使用二甲亚枫(DMSO)将实施例1所得荧光探针分子HNCOU-NE配制成为10mM的储液，再使用(二甲亚枫)将荧光团HNCOU配制成10mM的储液，再使用PBS缓冲溶液和甘油配制1500U/mL的弹性蛋白酶储液。先取1μL上述荧光团的溶液和999μLHepes缓冲溶液(pH＝7.4)于比色皿中，测试其紫外吸收光谱和荧光光谱。再取1μL上述荧光探针分子的溶液和999μLHepes缓冲溶液(pH＝7.4)于比色皿中，测试其紫外吸收光谱和荧光光谱，最后取1μL上述荧光探针分子的溶液、932μLHepes缓冲溶液(pH＝7.4)和67μL的弹性蛋白酶储液于比色皿中，分别测试其紫外吸收光谱和荧光光谱。图7为荧光探针检测弹性蛋白酶的紫外光谱图。从图7中可看出荧光探针在400nm、450nm有强吸收峰，而荧光团在370nm有一强吸收峰，当荧光探针与弹性蛋白酶孵育后，400nm、 450nm吸收峰消失，在370nm处出现一强吸收峰，这与荧光团的峰相一致。图8为荧光探针检测弹性蛋白酶的荧光光谱，从图中可以看出，荧光探针本身荧光背景低，当与弹性蛋白酶孵育后，荧光强度显著增加，在535nm处的荧光强度增加21倍，结合紫外和荧光光谱图，可以知道荧光探针具有大的斯托克斯位移165nm，上述结果说明该荧光探针是一种荧光增强型弹性蛋白酶探针。
实施例3
测定实施例1所得荧光探针与弹性蛋白酶反应的荧光强度随时间的变化。
往比色皿中加入1μL上述荧光探针分子的储液、932.33μL的Hepes(pH＝7.4)缓冲溶液和66.67μL的弹性蛋白酶储液，每隔10min检测反应体系在535nm 下的荧光强度，如图9所示。加入弹性蛋白酶后，随着孵育时间的延长，荧光强度逐渐增加，当反应孵育到180分钟时，荧光强度达到一个最大值，当时间延长到200分钟时，荧光强度基本保持不变。
实施例4
测定实施例1所得荧光探针与不同浓度的弹性蛋白酶反应的荧光强度随浓度的变化。
往比色皿中分别加入1μL上述荧光探针分子的储液、pH＝7.4的Hepes缓冲溶液(999，998.33，997.67，996.33，995，993.67，992.33，985.67,972.33， 959，945.67，932.33)和不同体积(0，0.67，1.33，2.67，4，5.33，6.67，13.33， 26.67，40，53.33，66.67)上述弹性蛋白酶储液，对应弹性蛋白酶的工作浓度分别为0，1，2，4，6，8，10，20，40，60，80，100U/mL，反应180分钟后，测试各个混合物的荧光强度。随着弹性蛋白酶浓度的增大，荧光强度在535nm 下逐渐增加，当弹性蛋白酶浓度为100U/mL时，荧光强度不再发生变化，这说明100U/mL弹性蛋白酶能够催化水解10μM的荧光探针。
实施例5
测定实例1所得荧光探针与荧光团的荧光强度随浓度的变化
往比色皿中分别加入不同体积(0.1，0.2，0.5，1，2，3，4μL)上述荧光探针分子和荧光团的储液，对应荧光探针分子和荧光团的工作浓度分别为1，2， 5，10，20，30，40U/mL，测试各个浓度下的荧光强度，如图10所示，在535 nm处的荧光强度与不同浓度的荧光探针和荧光团呈一个很好的线性关系，R2均在两个9以上，说明该探针能够定量检测弹性蛋白酶。
实施例6
测定实例1所得探针与弹性蛋白酶的检测限
往比色皿中分别加入1μL上述荧光探针分子储液、pH＝7.4的Hepes缓冲溶液(999，998.33，997.67，996.33，995，993.67,992.33μL)以及不同体积(0， 0.67，1.33，2.67，4，5.33，6.67μL)分别对应弹性蛋白酶的工作浓度为0，1，2， 4，6，8，10U/mL,反应180分钟后，测试各个混合物的荧光强度。如图11所示，荧光强度与不同浓度的弹性蛋白酶有一个良好的线性关系，通过3σ/k可计算出该探针的检测限为0.16U/mL。
实施例6
测定实例1所得荧光探针与弹性蛋白酶的酶动力学参数
往比色皿中分别加入不同体积(0.1，0.2，1，2，3，4μL)上述荧光探针分子，分别对应于荧光探针的工作浓度为0，1，2，10，20，30，40μM以及 66.67μL上述弹性蛋白酶储液，从0时刻开始计时，每隔30s测试混合液在535 nm处的荧光强度。如图12所示，随着荧光探针的浓度越来越大，反应速率也逐渐增大，当加入更大浓度荧光探针时(40μM)，反应速率不再增加，以此计算得到米氏常数Km为5.02±0.38μM，最大反应速率Vmax为1.20±0.044μM min-1，说明该探针与弹性蛋白酶之间的亲和力比较强。
实施例7
测定实例1所得探针识别弹性蛋白酶的特异性
向比色皿中分别加入1μL上述荧光探针分子(工作浓度为10μM)、Hepes (pH＝7.4)缓冲溶液与不同分析物的混合液(a:空白；b.CaCl2(100μM)；c.MgCl2(100μM)；d.ZnCl2(100μM)；e.NaCl(100μM)；f.Cys(100μM)；g.GSH(20μM)； h.Glu(100μM)；i.Gly(100μM)；j.Arg(100μM)；k.Leu(100μM)；l. Chymotrypsin(100U/mL)；m.Acetylcholinesterase(2U/mL)；n.Trypsin(100 U/mL)；o.Neutrophil Elastase(100U/mL),测试上述混合液在1h，2h，3h后在 535nm处的荧光强度。如图13所示，在各种金属离子，氨基酸，以及生物大分子酶存在下，荧光探针的荧光强度基本保持不变，而加入弹性蛋白酶之后，荧光强度显著增加，说明荧光探针能够对弹性蛋白酶进行特异性识别。
实施例8
验证实例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的机理
分别于1mL塑料EP管里加入10μL上述荧光探针分子(工作浓度为100 μM)、10μL荧光基团(工作浓度为100μM)、10μL荧光探针分子(工作浓度为100μM)和66.67μL弹性蛋白酶(工作浓度为100U/mL)，在37℃反应 150分钟，再对其进行高效液相色谱测试。如图14所示，荧光基团化合物1的保留时间为4.12分钟，荧光探针的保留时间为7.14分钟，而加入弹性蛋白酶后，在保留时间为4.12分钟时生成了一个新峰，这与荧光基团的保留时间一致，说明荧光探针与弹性蛋白酶反应后生成了荧光基团。
实施例9
测定实例1所得荧光探针检测活细胞中的弹性蛋白酶。
取1μL实施例1所得探针(工作浓度为10μM)与活细胞(293T,HeLa, SKOV3和HepG2细胞)共孵育30分钟，用PBS洗涤后对细胞进行过荧光成像。如图15所示，从图15中可以看出，在加入探针后，只有HepG2细胞具有强烈的荧光，293T，HeLa细胞中表现出微弱的荧光，SKOV3细胞几乎是没有荧光的。说明该探针能够将HepG2细胞与其他细胞区分开，能够特异性诊断肝癌。
实施例10
测定实例1所得荧光探针检测斑马鱼中的弹性蛋白酶。
将斑马鱼分成四组，第一组将实施例1所得探针(10μM)与斑马鱼孵育30 分钟，用PBS洗涤后对斑马鱼进行荧光成像。第二组用脂多糖诱导剂预孵育斑马鱼720分钟，再将实施例1所得探针(10μM)与斑马鱼孵育30分钟，接着用 PBS洗去残留的探针和脂多糖诱导剂，进行荧光成像，第三组先用脂多糖诱导剂孵育30分钟,再用西维来司钠孵育，最后将实施例1所得探针(10μM)与斑马鱼孵育30分钟，接着用PBS洗去残留的探针和脂多糖诱导剂，进行荧光成像。如图16所示，第一组斑马鱼几乎是没有荧光的，而加入脂多糖诱导剂后，从斑马鱼中可以观测到强的荧光，然而，加入脂多糖诱导剂后再加入西维来司钠，从斑马鱼中可以看到荧光减弱。说明该探针可以在活体中作为一种潜在工具检测弹性蛋白酶。
另外，与相关技术中检测识别弹性蛋白酶的荧光探针相比，本申请与其区别如表1所示：
表1不同荧光探针的性质区别
经对比可知，检测弹性蛋白酶的荧光探针需要解决的问题有：增大斯托克斯位移，降低背景荧光干扰，提高检测的灵敏度；降低米氏常数，增强探针和弹性蛋白酶间的亲和力；与已报道的检测弹性蛋白酶的荧光探针相比，本发明的荧光探针具有以下优点：本发明的荧光探针具有大的斯托克斯位移，能够减小自吸收，提高检测灵敏速度。本发明的荧光探针具有低的米氏常数，表明探针和弹性蛋白酶之间具有大的亲和性；该探针能实现活细胞、活体斑马鱼内源性的检测和成像。具有检测与弹性蛋白酶相关疾病的应用前景。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其特征在于，其分子式为C18H15F5N2O3，其结构式如式（I）所示，
（I）。
2.一种如权利要求1所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针在检测试剂中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于弹性蛋白酶的体外或体内检测。
3.根据权利要求2所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针在检测试剂中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于水环境中弹性蛋白酶的定性定量检测。
4.根据权利要求2所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针在检测试剂中的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于活体细胞及活体斑马鱼内源性弹性蛋白酶的检测和成像。
5.根据权利要求2所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针在检测试剂中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于检测浓度为0-10U/mL的弹性蛋白酶的定性定量检测。
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|---|---|
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