CN104031014A - 香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物如式（1）所示，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；本发明还提供了香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用，以及一种弹性蛋白酶的检测方法，和一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒。本发明提供的香豆素衍生物荧光探针用于与弹性蛋白酶活性检测有关的应用时的灵敏度高、与酶的亲和力高、原子利用率高，并且本发明的香豆素衍生物为非肽类的荧光探针，相比于肽类荧光探针稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。式（1）

Description

香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
背景技术
现有技术测定弹性蛋白酶（EC号:3.4.21.37）活性的方法主要有三种。第一种是传统的高效液相色谱法（HPLC），该方法可以直接用于检测中性粒细胞弹性蛋白酶介导的水解纤维蛋白原反应。但是，高效液相色谱法实验过程繁琐、周期长、并且很难做到弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的高通量筛选。第二种是紫外吸收光谱法，该方法操作简单、反应快速，目前已获得广泛的使用，但是这种方法存在以下两方面的缺陷：首先，紫外吸收光谱法的背景干扰大导致分析的灵敏度低。其次，用于分析的底物均为多肽衍生物或蛋白质，底物的制备成本高。目前普遍应用的第三种弹性蛋白酶活性的检测方法是荧光发射光谱法，该方法以多肽类为荧光探针，检测的灵敏度高、操作方法简单、并且可以用于高通量筛选。该方法的缺陷在于多肽类探针在常规条件下大都稳定性差，储存和运输条件苛刻，原子利用率低。
目前国内外还没有非肽荧光探针用于检测弹性蛋白酶活性及其抑制剂或促进剂筛选的报道。因此，设计开发基于非肽荧光探针的灵敏、性质稳定、操作简便、成本低廉的检测方法是非常迫切和必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有弹性蛋白酶活性检测技术中存在的缺陷，提供一种灵敏度高、性质稳定、操作简便、易于储运并且成本低廉的非肽弹性蛋白酶活性检测荧光探针和弹性蛋白酶活性检测方法。
为达到上述目的，本发明提供一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物具有式（1）所示结构，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；
式（1）。
本发明提供了上述香豆素衍生物的制备方法，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式（2）所示结构化合物与酰氯或酸酐中的一种接触；
式（2）
其中，所述酰氯选自五氟丙酰氯、七氟丁酰氯中的一种，所述酸酐选自五氟丙酸酐、七氟丁酸酐中的一种。
本发明提供上述香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
本发明提供了一种弹性蛋白酶的活性的检测方法，该方法包括：将含有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的香豆素衍生物接触，得到接触后的物料；检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；所述激发光的波长为340-430nm，所述荧光的发射波长为450-520nm。
本发明同时提供一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：本发明所述的香豆素衍生物、弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液。
本发明的香豆素衍生物在用于检测弹性蛋白酶活性时，与弹性蛋白酶具有更高的亲和力，检测的有效性更高。
本发明提供的香豆素衍生物荧光探针，在用于筛选弹性蛋白酶抑制剂时，与采用多肽类荧光探针相比，具有更高的灵敏度；并且本发明的有机小分子荧光探针，不会与抑制剂发生相互作用，避免了副反应发生对检测准确性的干扰，有利于弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的发现。
因此，本发明提供的香豆素衍生物荧光探针用于与弹性蛋白酶活性检测有关的应用时的灵敏度高、与酶的亲和力高、荧光强度的变化范围广易于探查，原子利用率高，并且本发明的香豆素衍生物为非肽类的荧光探针，非肽类荧光探针相比于肽类荧光探针稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1弹性蛋白酶催化荧光探针水解反应的示意图，其中hv表示：光子能量。
图2各种酶或蛋白质催化10μM荧光探针水解的相对速率。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物具有式（1）所示结构，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；
式（1）。
优选情况下，R1为五氟乙基，R2为三氟甲基、甲基或氰基中的一种；最为优选地，R1为五氟乙基，R2为三氟甲基。
其中，如式（4）所标示的香豆素环的命名方式，所述吡啶环可以在香豆素环的3号位或者4号位，所述苯并噻唑环可以在香豆素环的3号位或者4号位。
式（4）
本发明所述的香豆素衍生物的制备方法包括：在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式（2）所示结构化合物与酰氯或酸酐中的一种接触；
式（2）
其中，所述酰氯选自五氟丙酰氯，七氟丁酰氯中的一种，优选情况下，所述酰氯为五氟丙酰氯；所述酸酐选自五氟丙酸酐、七氟丁酸酐中的一种，优选情况下，所述酸酐为五氟丙酸酐。
在本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中，所述亲核反应为氨基与各种取代的酰氯、酸酐发生的反应，所述亲核反应的条件包括温度为零下5至30℃，时间为10-120min，优选情况下，所述亲核反应的条件为温度为0-25℃，时间为15-60min。
本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中，所述接触需要在缚酸剂存在的条件下进行，所述缚酸剂可以为本领域常用的任何能够吸收反应中产生的酸，避免接触反应中生成的酸影响反应或反应平衡的物质，优选地，所述缚酸剂选自三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种，最为优选地，所述缚酸剂为三乙胺或二乙胺。
为了提高接触反应传质和传热的效果，本发明所述接触反应可以在有机溶剂环境中进行，所述有机溶剂可以为任何能够在本发明所述接触条件下不与本发明的反应物发生反应并能为反应提供适宜的溶液环境的有机溶剂，所述有机溶剂的沸点优选为30-150℃，更为优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的至少一种，最为优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿和四氢呋喃中的至少一种。
在本发明的香豆素衍生物的制备方法中，相对于1毫摩尔的7-羟基-4-三氟甲基香豆素，所述酰氯或酸酐的用量为1-3毫摩尔；所述缚酸剂的用量没有特别的限制，为了达到好的对反应生成的酸的吸收效果，所述缚酸剂的用量可以为1-3毫摩尔，优选情况下，所述缚酸剂的用量为2-3毫摩尔；用于本发明的有机溶剂的用量也没有特别的限制，优选情况下，所述有机溶剂的用量为10-20毫升。
在本发明所述的香豆素衍生物的制备方法中，可以用薄层色谱（TLC）对反应的进行情况进行监测，当检测结果显示原料点消失时，表明反应结束。
本发明的制备方法还包括对接触反应的产物进行提纯，提纯的过程可以包括在0-25℃的温度下依次用20-60ml水和20-60ml饱和柠檬酸溶液对反应体系进行洗涤，静置分层分离油相并用无水硫酸钠对油相进行干燥，通过减压方法去除溶剂获得粗产物，最后用硅胶柱对粗产物进行层析获得产品。
本发明提供了本发明所述的香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
所述应用可以为本领域任何涉及弹性蛋白酶活性检测的应用，例如，所述应用可以包括：弹性蛋白酶活性的检测、弹性蛋白酶抑制剂筛选、弹性蛋白酶促进剂筛选，弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的动力学表征等，同时本发明所述的应用也可用于与弹性蛋白酶活性检测有关的疾病的诊断和治疗，但本发明并不仅限于此。
本发明还提供了一种弹性蛋白酶活性的检测方法，该方法包括：
将含有弹性蛋白酶的待测样品与本发明所述的香豆素衍生物接触，得到接触后的物料；
检测接触后的物料在激发光下发出的荧光的强度，所述荧光的强度指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；所述激发光的波长为340-430nm，所述荧光的发射波长为450-520nm。具体的，对于R2为三氟甲基的香豆素衍生物，激发光波长为340-360nm，荧光发射波长为500-520nm；对于R2为甲基的香豆素衍生物，激发光波长为360-380nm，荧光发射波长为450-470nm；对于R2为氰基的香豆素衍生物，激发光波长为410-450nm，荧光发射波长为450-490nm；对于R2为吡啶环的香豆素衍生物，激发光波长为350-380nm，荧光发射波长为460-500nm，对于R2为苯并噻唑环的香豆素衍生物，激发光波长为355-395nm，荧光发射波长为490-520nm。
在本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法中，香豆素衍生物的用量范围与待测弹性蛋白酶样品及香豆素衍生物的种类有关，通常情况下，香豆素衍生物的用量能够达到表征弹性蛋白酶待测样品的活性即可，优选情况下，相对于待测样品中每1μM的弹性蛋白酶，所述香豆素衍生物的用量可以为1-100μM，为了达到最佳的检测效果，所述香豆素衍生物的用量优选为1-10μM。
在本发明提供的弹性蛋白酶活性的检测方法中，所述弹性蛋白酶待测样品与香豆素衍生物接触的条件包括：温度为25-37℃，pH值为6-8，时间为5-30min。优选情况下，所述接触的条件包括：温度为28-34℃，pH值为6.5-8.0，时间为10-25min。
本发明所述的检测方法中，所述接触在避光条件下进行，并对接触的容器进行预热，以保持待测样品的生物活性。优选地，所述接触的反应容器为黑色平底孔板、比色杯或酶标板，并且在接触前将参加接触的各组分及反应容器预热至适宜的反应温度，预热所要达到的温度优选为28-30℃。
本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法的条件还包括在50-100mM的Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液中进行，所述接触前可以将适量的含弹性蛋白酶样品、10μM香豆素衍生物分别与50-150μl所述Tris-HCl缓冲液混合。
对所述弹性蛋白酶待测样品与香豆素衍生物接触后的物料的荧光强度的检测可以在酶标仪或荧光分光光度计中进行，可以采用时间依赖性检测的方法获得弹性蛋白酶在接触过程中催化香豆素衍生物水解的荧光光谱随时间变化的情况，获得荧光强度随时间变化的增加值。此外，可以采用多次重复试验和设置若干对照组的方式保证检测的可靠性。
当本发明所述的弹性蛋白酶活性的检测方法用于弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的筛选时，可以按以下方法进行，分别将一定浓度的弹性蛋白酶、一定浓度的抑制剂或促进剂溶解于50-150μl50-100mM Tris-HCl(含有10mMCaCl2，pH=7.0）缓冲液中，并置于恒温水槽中预热至适宜温度；同时将反应容器置于孵育箱中预热至适宜温度。随后，在反应容器中将适量的已经预热的缓冲溶液、一定量的弹性蛋白酶抑制剂或促进剂与适量的荧光探针混合。避光条件下加入弹性蛋白酶启动反应，并用酶标仪或者荧光分光光度计对样品荧光强度的变化情况进行监测。
本发明还提供一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括本发明所述的香豆素衍生物、弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液，所述弹性蛋白酶标准品在检测时可以用作为对照组或绘制标准曲线。
本发明所提供的试剂盒可以应用于检测待测样品中弹性蛋白酶的活性，筛选弹性蛋白酶抑制剂或促进剂以及其它与弹性蛋白酶活性检测或弹性蛋白酶抑制剂或促进剂功能相关的领域，另外，本试剂盒也可用于与弹性蛋白酶活性检测有关的医学检测和治疗领域，但本发明并不仅限于此。
在本发明所提供的试剂盒中，优选情况下，弹性蛋白酶标准品纯度不低于70%，反应缓冲液为100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0），本试剂盒的保存条件为在零下20至4℃避光保存。所述试剂盒的具体使用方法可以按照以下所列举的方法进行：
（1）配置10mM香豆素衍生物的DMSO溶液,并且在零下20℃或4℃下避光保存。
（2）将弹性蛋白酶标准品用0.1M的Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液溶解，配制成100U/ml的弹性蛋白酶标准品溶液，并以10倍的稀释度进行梯度稀释。
（3）将含有弹性蛋白酶的待测样品用100μl的100m M Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液溶解。
（4）分别将0.2ml的Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液，香豆素衍生物、待测的弹性蛋白酶样品和弹性蛋白酶标准品加入于黑色酶标板中。利用本发明所述的弹性蛋白酶的检测方法检测待测样品和弹性蛋白酶标准品中弹性蛋白酶的活性。
（5）以检测到的梯度稀释的弹性蛋白酶标准品的荧光强度变化值绘制标准曲线，通过比对确定被检测的样品中弹性蛋白酶的活性。
当本发明的试剂盒用于弹性蛋白酶抑制剂或促进剂的筛选时，可以将所述抑制剂在检测前以适当比例或粘度添加于反应混合液中。随后加入适量的弹性蛋白酶标准品启动反应，反应的条件为30℃，时间为5-30min。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中所使用多肽类底物Suc-Ala-Ala-Ala-pNA为购自Sigma-alderich试剂公司产品编号为70967-97-4的市售品。硅胶层析柱为欣维尔公司产品。酶标仪为MolecularDevices公司（型号SpectraMax M5）。
以下实施例中所使用的酶的来源及参数如下：
乙酰胆碱酯酶购自a-Aldrich（C1682）比活力≥1,500units/mg
丁酰胆碱酯酶购自Sigma-Aldrich（C1057）比活力≥900units/mg
牛血清蛋白购自百灵威科技公司（109636）纯度为98%
弹性蛋白酶购自玛雅公司（10095）比活力≥30U/mg
胰蛋白酶购自玛雅公司（10020）比活力≥250U/mg
糜蛋白酶购自玛雅公司（10001）比活力≥1500U/mg
羧肽酶购自Worthington（CLS005304）比活力>170U/mg
以下实施例中荧光强度变化率（ΔF/Δt）按照以下公式计算：
ΔF Δt = F 2 - F 1 t 2 - t 1
其中，F2表示t2时刻样品的荧光强度，F1表示t1时刻样品的荧光强度。
紫外可见吸收值的变化率（ΔA/Δt）按照以下公式计算：
ΔA Δt = A 2 - A 1 t 2 - t 1
其中，A2表示t2时刻样品在405nm处的紫外可见吸收值，A1表示t1时刻样品在405nm处的紫外可见吸收值。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的香豆素衍生物的制备方法。
在有机溶剂（二氯甲烷，20ml）中，在缚酸剂（吡啶，2.5mmol）存在下，将式（2）所示的化合物（7-氨基-4-三氟甲基香豆素，1mmol）与酸酐（五氟丙酸酐，2mmol）在5℃下，维持30分钟的接触，得到接触后的物料。然后依次用水（50ml）和饱和柠檬酸溶液（50ml）洗涤接触后的物料，得到洗涤后的物料。分离洗涤后的物料中的油相并用无水硫酸钠进行干燥，减压去除溶剂获得粗产品，将粗产品经硅胶柱纯化获得白色固体产品（1）0.15g。
用NMR和MS检测该白色固体产品，数据为1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm:7.03(s,1H),7.79(s,2H),7.88(s,1H),11.82(s,1H).19FNMR(376MHz,CD3OD):δ-122.63,-83.31,-65.09ppm.GC-MS calcd for[C13H5F8NO3]375.17,found374.94.HRMS[M-H]-,calc.374.0069,found.374.0079.
该数据与式（1）所示的化合物的理论值完全相符，证明该产品为如式（3）所示的化合物。
式（3）
测试例1
本测试例用于说明本发明提供的弹性蛋白酶活性的检测方法。
将1mg弹性蛋白酶样品溶解于100mM Tris-HCl（含有10mM CaCl2，pH=7.0）缓冲液中并进行梯度稀释，按表1中给出的浓度配制不同浓度的弹性蛋白酶标准品溶液，将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶液置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，各取40μl已预热的弹性蛋白酶标准品溶液于预热的黑色平底96孔板中，加入120μl 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液于已预热的黑色平底96孔板中，并设置阴性对照组（只加160μl的缓冲液），在避光条件下，将40μl实施例1中制得的产品（1）分别与弹性蛋白酶标准品及对照组缓冲液接触，用酶标仪对各弹性蛋白酶标准品溶液及对照组溶液在395nm的激发光下的接触后荧光强度进行动力学扫描，获得5-10分钟内的荧光强度的变化率，结果列于表1。
对比例1
该对比例用于说明现有技术中弹性蛋白酶活性的检测方法。
采用与测试例2相同的方法检测弹性蛋白酶标准品催化系列浓度梯度的底物水解的情况，不同的是，所用的底物探针为Sigma-alderich试剂公司的多肽类底物Suc-Ala-Ala-Ala-pNA，在波长为405nm的激发光下对接触后紫外可见吸收值进行动力学扫描，获得5-10分钟内的紫外可见吸收值的变化率，结果列于表1。
表1
测试例2
本测试例用于说明本发明提供的弹性蛋白酶活性检测方法的专一性。
将1mg各种酶样品溶解于100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液中配置酶样品的溶液并置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，各取40μl已预热的酶溶液于预热的黑色平底96孔板中，加入120μl 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液于已预热的黑色平底96孔板中，在避光条件下，将10μl实施例1中制得的产品（1）分别与各个酶样品接触，用酶标仪在405nm的激发光下检测各种酶催化10μl实施例1中制得的产品（1）水解的相对速率，结果如图2所示。
测试例3
本测试例用于说明根据本发明的弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法。
将1mg弹性蛋白酶样品溶解于100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液中配置弹性蛋白酶浓度为0.05mg/mL的待测弹性蛋白酶标准品溶液，将西维塞斯钠（sivelestat）溶解于1ml 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液中配置成浓度梯度为0.1、1、4、7、10、20μM的抑制剂溶液，将0.01mmol实施例1中制得的产品（1）溶解于10ml 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液中配置成浓度为1mM的荧光探针溶液，分别将配置获得的弹性蛋白酶标准品溶液、抑制剂溶液和荧光探针溶液置于30℃恒温水槽中预热；同时将黑色平底96孔板置于30℃孵育箱中预热。随后，分别将40μl各浓度梯度的抑制剂溶液、100μl 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液和40μl荧光探针(终浓度为5μM)溶液加入到黑色平底96孔板中混合为实验组，并设立140μl 100mM Tris-HCl(含有10mM CaCl2，pH=7.0)缓冲液和40μl荧光探针溶液混合的对照组，在避光条件下，分别在实验组和对照组中用排枪迅速加入20μl弹性蛋白酶标准品溶液启动反应。最后用酶标仪分别对实验组和对照组荧光强度的变化和紫外可见吸收值的变化进行检测，结果列于表2。
对比例2
本对比例用于说明现有技术弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法。
采用与实施例7相同的方法进行弹性蛋白酶抑制剂的筛选，不同的是，将荧光探针溶液换为Sigma-Aldrich试剂公司的多肽类底物Suc-Ala-Ala-Ala-pNA，其终浓度为200mM。可见光的吸收波长为405nm。结果列于表2。
表2
通过实施例1的结果可以看出，利用本发明的方法能够制得式（1）所示结构的香豆素衍生物。
通过测试例1和对比例1的结果可以看出与现有的多肽类底物荧光探针相比，本发明的非肽香豆素衍生物荧光探针与弹性蛋白酶具有更高的灵敏度和亲和力。
通过测试例2的结果可以看出，弹性蛋白酶对本发明所提供的香豆素衍生物荧光探针的水解能力明显的高于其他种类的酶，因此，本发明所提供的香豆素衍生物的专一性高。
通过测试例3和对比例2的结果可以看出本发明所提供的方法能够用于弹性蛋白酶抑制剂的筛选，并且本发明提供的弹性蛋白酶抑制剂的筛选方法与采用多肽类底物荧光探针相比，荧光信号的变化范围较大易于检测的进行，而多肽类底物荧光探针的紫外可见吸收值的变化率小（需精确至小数点后两位数字）不易于检测的进行，同时，本发明所提供的香豆素类衍生物具有更高的原子经济性，此外从获得原料的容易程度方面考虑，本发明所提供的香豆素类衍生物荧光探针易于合成，而对比例1中所使用的Sigma-Aldrich试剂公司提供的多肽类底物Suc-Ala-Ala-Ala-pNA则难于合成。因此，本发明所提供的香豆素衍生物相较于现有技术所提供的荧光探针具有实施更加容易，成本更低的优势。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种香豆素衍生物，该香豆素衍生物如式（1）所示，其中，R1为五氟乙基和七氟丙基中的一种，R2为三氟甲基、甲基、氰基、吡啶环和苯并噻唑环中的一种；
式（1）。
2.权利要求1所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式（2）所示的化合物与酰氯或酸酐接触；
式（2）
其中，所述酰氯选自五氟丙酰氯，七氟丁酰氯中的一种，所述酸酐选自五氟丙酸酐、七氟丁酸酐中的一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，相对于1毫摩尔的式（2）所示结构化合物，所述酰氯或酸酐的用量为1-3毫摩尔，所述缚酸剂的用量为1-3毫摩尔，所述有机溶剂的用量为10-20毫升。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述亲核反应条件包括：温度为零下5℃至30℃，时间为10-120min。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述缚酸剂为三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种，所述有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的至少一种。
6.权利要求1所述的香豆素衍生物在检测弹性蛋白酶的活性中的应用。
7.一种弹性蛋白酶的活性的检测方法，其特征在于，该方法包括：
将待测样品与权利要求1中所述的香豆素衍生物接触，得到接触后的物料；
检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中弹性蛋白酶的活性；所述激发光的波长为340-430nm，所述荧光的发射波长为450-520nm。
8.权利要求7所述的检测方法，其中，相对于1μM的弹性蛋白酶，所述香豆素衍生物的用量为1-100μM。
9.权利要求7或8所述的检测方法，其中，接触的条件包括：温度为25-37℃，pH值为6-8，时间为5-30min。
10.一种弹性蛋白酶的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：权利要求1所述的香豆素衍生物、弹性蛋白酶标准品以及反应缓冲液。
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