CN105295899A - 一种检测硫化氢的比率荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测硫化氢的比率荧光探针，是由香豆素荧光团作为供体，半川菁荧光团作为受体，通过哌嗪联接构筑成基于荧光共振能量转移(FRET)机理检测硫化氢的比率荧光探针，该比率荧光探针化学结构式如式(I)所示。实验证实当无硫化氢存在时，由于FRET打开，本发明的探针发射半川菁部分的红荧光；当硫化氢存在时，半川菁与硫化氢发生亲核加成反应，FRET受到抑制，探针发出香豆素部分的蓝荧光，实现“比率计型”的荧光响应，并具有操作简便，响应灵敏等优点。预示该探针在检测含硫化氢样品是含外源性硫化氢或内源性硫化氢的生物细胞，或是含硫化氢的溶液中以及在细胞内的线粒体定位中具有广阔的应用前景。

Description

一种检测硫化氢的比率荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种硫化氢荧光探针，尤其涉及一种检测硫化氢的比率荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

硫化氢(H₂S)作为内源性气体传感信号分子的一种，充当抗氧化剂和活性氧的清除剂。然而，硫化氢浓度异常会引起许多疾病，例如，阿尔茨海默病，唐氏综合症和糖尿病等。因此，定量检测生物系统中的硫化氢引起广泛的关注。

荧光检测法具有操作方便，灵敏度高，选择性强，并能实现对生物样品的实时、在线检测等特点，受到广泛关注。然而，已报道的硫化氢探针大多是荧光“关-开”型(参见X.Li,S.Zhang,J.Cao,N.Xie,T.Liu,B.Yang,Q.-J.HeandY.-Z.Hu,AnICT-basedfluorescentswitch-onprobeforhydrogensulfideinlivingcells,Chem.Commun.,2013,49:8656—8658；Z.-J.Huang,S.-S.Ding,D.-H.Yu,F.-H.HuangandG.-Q.Feng,Aldehydegroupassistedthiolysisofdinitrophenylether:anewpromisingapproachforefficienthydrogensulfideprobes,Chem.Commun.,2014,50:9185-9187；X.-Y.Qu,C.-J.Li,H.-C.Chen,J.Mack,Z.-J.GuoandZ.Shen)，易受到检测环境，如检测温度、探针浓度等条件的影响(K.Komatsu,Y.Urano,H.KojimaandT.Nagano,DevelopmentofanIminocoumarin-BasedZincSensorSuitableforRatiometricFluorescenceImagingofNeuronalZinc,J.Am.Chem.Soc.,2007,129:13447-13454)。然而，比率型荧光探针可以有效解决以上问题。因此，开发具有细胞成像能力，而且可以比率检测硫化氢的荧光探针成为目前亟待解决的课题。

荧光共振能量转移(FRET)是设计比率荧光探针的一种重要检测机理。FRET过程需要两个条件：1、供体的发射谱与受体的吸收谱有足够的重叠，2、供体和受体之间有合适的距离(约10-100)。香豆素荧光团本身具有较大的量子产率，适合作为荧光供体，半川菁荧光团具有吸收和发射波长较长的特点，适合作为荧光受体。另外，哌嗪作为供体和受体之间的连接基团在基于FRET机理的探针中获得应用。然而，如何选择供体和受体，使FRET效率更高，如何提高对识别分子的选择性、灵敏性以及改善其他应用性能(如响应时间、稳定性、透膜性、低毒性等)，目前尚无规律可循。基于此，有关基于FRET机理检测硫化氢的比率荧光探针及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于FRET机理检测硫化氢的比率荧光探针及其应用。

本发明的核心在于利用香豆素作为能量供体，半川菁作为能量受体构筑FRET体系，这尚属首次。当用香豆素部分的激发波长激发探针的时候，由于FRET打开，探针发射半川菁部分的荧光；当硫化氢存在的时候，半川菁与硫化氢发生亲核加成反应，半川菁荧光团共轭体系断裂，这时FRET受到抑制，再用相同激发波长激发探针的时候，探针会发出香豆素部分的荧光。通过上述方案，实现“比率计型”的荧光响应，使探针的灵敏度得到大幅度提高。

本发明所述的检测硫化氢的比率荧光探针，其特征在于：所述比率荧光探针是由香豆素荧光团作为供体，半川菁荧光团作为受体，通过哌嗪联接构筑成基于荧光共振能量转移(FRET)机理检测硫化氢的比率荧光探针，该比率荧光探针化学结构式如式(I)所示(简称CPC)：

上述检测硫化氢的比率荧光探针(式(I)所示化合物)的制备方法，步骤如下：

步骤1：由已知方法合成4-哌嗪基苯甲醛和7-二乙胺基-3-香豆素酰氯，然后在氮气保护下，二者加入到干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺，反应得到式(II)所示化合物。

步骤2：在氮气保护下，式(II)所示化合物与1,2,3,3-四甲基吲哚碘化盐在乙醇中回流即得到式(I)所示化合物。

本发明所述的探针自身发红色荧光，当硫化氢存在的时候，探针与其发生亲核加成反应，抑制FRET进程，从而达到比率检测的效果。加成产物经质谱验证，结果如图1所示。

本发明所述检测硫化氢的比率荧光探针在检测含硫化氢样品中的应用。

上述应用中：所述含硫化氢样品优选是含外源性硫化氢或内源性硫化氢的生物细胞，或是含硫化氢的溶液。其中所述生物细胞优选是HeLa细胞。

具体的：配制检测硫化氢的比率荧光探针(CPC)的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液，分别加入定量的H₂S和Cl^-,CH₃CO₂ ^-,N₂H₄,SO₃ ^2-,Br^-,HCO₃ ^-,SO₄ ^2-,EDA,CH₃NH₂,CO(NH₂)₂,CS(NH₂)₂,H₂O₂,NH₃.H₂O,I^-,HClO,GSH,Hcy,Cys,NO,O₂ ^-,K⁺,Na⁺,Ca²⁺的水溶液。通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试其对不同硫醇、常见阴阳离子的选择性和响应能力。结果显示探针对硫化氢有很好的选择性，两个发射波长相差113nm，具有非常好的比率响应。见图2，3。

配制检测硫化氢的比率荧光探针(CPC)的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液，向其加入硫化氢且硫化氢的浓度依次递增，如图4所示，探针在587nm处的荧光逐渐减弱，在474nm处的荧光逐渐增强。探针对硫化氢的响应非常灵敏，检测限为40nM，如图5所示。

在加入3.0μM的荧光探针CPC的HeLa细胞中不加入或加入硫化氢，观察细胞荧光显微成像变化。荧光成像显示：探针渗透进细胞内，并随着硫化氢浓度增加，红色荧光逐渐减弱，相应地，蓝色荧光逐渐增强，见图6。

在加入2.0μM的荧光探针CPC的HeLa细胞中不加入或加入半胱氨酸，观察细胞荧光显微成像变化。荧光成像显示：加入半胱氨酸的一组，红光明显减弱，蓝光有所增强，见图7。

本发明所述检测硫化氢的比率荧光探针在细胞内的线粒体定位中的应用。

在加入3.0μM的荧光探针CPC的HeLa细胞中继续加入0.3μM线粒体红，进行共聚焦成像。荧光成像显示：a组收集蓝光部分，c组收集红光部分，如图8所示，预示本发明的探针可以进行线粒体定位。

本发明提供的硫化氢比率荧光探针可以选择性地与硫化氢作用，具有荧光比率响应效应、选择性强、不受生物硫醇的干扰、灵敏度高、响应快速等优点。可以比率检测硫化氢，实现细胞内的外源性和内源性硫化氢比率成像，另外探针可以进行线粒体定位，有望在生物科学中发挥作用，具有广阔的应用前景。

本发明具有如下特点：

1)本发明提供的荧光探针对硫化氢选择性专一，而且成比例检测。

2)本发明提供的荧光探针是新型的FRET比例探针。

3)本发明提供的荧光探针对硫化氢灵敏度高，检测限为40nM。

4)本发明提供的荧光探针对硫化氢响应快速。

5)本发明提供的荧光探针可以检测HeLa细胞中的外源性和内源性硫化氢。

6)本发明提供的荧光探针可以定位线粒体检测硫化氢。

附图说明

图1为荧光探针CPC与硫化氢加成产物的LCQFleet质谱。

图2为荧光探针CPC的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液加入常见阴阳离子和多种硫醇的紫外吸收图谱。

图3为荧光探针CPC的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液加入常见阴阳离子和多种硫醇的荧光比例(I₅₈₇/I₄₇₄)柱状图。(I₅₈₇为探针在587nm处的荧光强度，I₄₇₄为探针在474nm处的荧光强度)

图4为荧光探针CPC的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液中加入依次递增浓度硫化氢的荧光滴定图谱。

图5为荧光探针CPC的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液加入依次递增浓度硫化氢的荧光滴定线性比率图。

图6为式荧光探针CPC在HeLa细胞内有硫化氢存在或不存在时的共聚焦荧光成像图。

图7为荧光探针CPC在HeLa细胞内有半胱氨酸存在或不存在时的共聚焦荧光成像图。

图8为共定位实验的共聚焦荧光成像图。其中，a为加入CPC的细胞成像，激发光405nm,发射光405-560nm；，b为加入CPC的细胞成像，激发光555nm,发射光640-700nm；c为加入线粒体红(MitoTrackerRed)的细胞成像，激发光555nm,发射光640-700nm；d为(a)和(c)的叠加图。

具体实施方式

实施例1本发明所述检测硫化氢的比率荧光探针(CPC)的制备：

步骤(a)具体是：

冰盐浴下，将4-哌嗪基苯甲醛和(0.118g,0.618mmol)溶于20mL干燥的二氯甲烷，加入0.3mL三乙胺，氮气保护下，加入7-二乙胺基-3-香豆素酰氯(0.157g,0.562mmol)，搅拌0.5h,撤掉冰盐浴，室温下反应3h，TLC监测，反应完全。减压蒸除溶剂，用DCM：MeOH＝50：1为展开剂，硅胶柱层析，得到式(II)所示化合物(0.140g,89.1％)，熔点：195-197℃。

核磁共振氢谱测定：¹HNMR(300MHz,d-DMSO):δ9.73(s,1H),8.02(s,1H),7.74(d,J＝9Hz,2H),7.51(d,J＝9Hz,1H),7.06(d,J＝9Hz,2H),6.76(dd,J＝9,2.4Hz,1H),6.57(d,J＝2.4Hz,1H),3.72-3.46(m,12H),1.14(t,J＝7.2Hz,6H).

步骤(b)具体是：

在氮气保护下，式(II)所示化合物(0.135g,0.311mmol)与1,2,3,3-四甲基吲哚碘化盐(0.085g,0.282mmol)加入到20mL乙醇，然后加热回流3h，减压蒸出溶剂，用DCM：MeOH＝10：1为展开剂，硅胶柱层析，得到式(I)所示化合物(0.137g,68.0％)。

红外测定(KBr,cm^-1):3449.5,2973.2,2935.4,1713.6,1577.9,1522.5.

核磁共振氢谱测定：(300MHz,d-DMSO):δ8.32(d,J＝15.9Hz,1H),8.11(d,J＝9Hz,2H),8.04(s,1H),7.78(dd,J＝14.1,7.2Hz,2H),7.60-7.49(m,3H),7.36(d,J＝15.9Hz,1H),7.11(d,J＝9Hz,2H),6.77(dd,J＝9,2.2Hz,1H),6.58(d,J＝2.2Hz,1H),4.02(s,3H),3.75-3.58(m,8H),3.47(q,J＝6.9Hz,4H),1.76(s,6H),1.15(t,J＝7.2Hz,6H).

核磁共振碳谱测定：(100MHz,d-DMSO):δ206.88,180.80,164.82,158.95,157.19,154.46,154.20,151.90,144.75,143.30,142.48,134.19,130.67,129.23,128.48,124.32,123.15,116.09,114.46,114.13,109.96,107.64,107.37,96.80,51.67,44.66,33.87,31.14,26.50,12.78.

高分辨质谱:m/z[M]⁺calcdforC₃₇H₄₁N₄O₃ ⁺:589.3179,found:589.3159.

上述荧光探针CPC与硫化氢发生亲核加成反应，加成产物质谱如图1，其反应过程如下式所示：

实施例2荧光探针CPC选择性检测硫化氢

用微量注射器分别向盛有10mL配好的荧光探针CPC的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液中，分别定量加入10当量的H₂S和20当量的Cl^-,CH₃CO₂ ^-,N₂H₄,SO₃ ^2-,Br^-,HCO₃ ^-,SO₄ ^2-,EDA,CH₃NH₂,CO(NH₂)₂,CS(NH₂)₂,H₂O₂,NH₃.H₂O,I^-,HClO,GSH,Hcy,Cys,NO,O₂ ^-,K⁺,Na⁺,Ca²⁺的水溶液，作用3小时后进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法(激发波长为410nm)测试，结果见图2，3。

实施例3荧光探针CPC对硫化氢滴定测试

配制10mL荧光探针CPC(5μΜ)的PBS缓冲液(0.2M,pH＝7.4)的溶液，向其依次加入硫化氢(0-11当量)，如图4所示，激发波长为410nm，探针在587nm处的荧光逐渐减弱，在474nm处的荧光逐渐增强。探针对硫化氢的响应非常灵敏，检测限为40nM，结果如图5所示。

实施例4细胞内外加硫化氢荧光成像测试

在37℃条件下，对照组：HeLa细胞在加入3.0μM的荧光探针CPC的细胞培养液中培养1小时；实验组：HeLa细胞在加入3.0μM的荧光探针CPC的细胞培养液中培养1小时，PBS缓冲溶液洗涤三次后，然后再在分别含有0.5,1,5mMNa₂S的细胞培养液中浸泡1小时。然后进行共聚焦荧光成像，激发波长405nm,收集波段405-560nm(蓝色通道)和560-700nm(红色通道)，结果见图6。

实施例5细胞内内源性硫化氢荧光成像测试

在37℃条件下，对照组：HeLa细胞在加入2.0μM的荧光探针CPC的细胞培养液中培养1小时；实验组：HeLa细胞在加入200μM半胱氨酸的细胞培养液中浸泡1小时，然后在2.0μM的荧光探针CPC的细胞培养液中培养1小时。然后进行共聚焦荧光成像，激发波长405nm,收集波段405-560nm(蓝色通道)和560-700nm(红色通道)，结果见图7。

实施例6共定位实验

HeLa细胞在加入2.0μM的荧光探针CPC的细胞培养液中培养1小时，然后再加入0.3μM线粒红，培养0.5小时，进行共聚焦成像，a组激发波长405nm,收集波段405-560nm；b组激发波长555nm,收集波段640-700nm；c组激发波长555nm,收集波段640-700nm，结果如图8所示。

Claims (5)

1.一种检测硫化氢的比率荧光探针，其特征在于：所述比率荧光探针是由香豆素荧光团作为供体，半川菁荧光团作为受体，通过哌嗪联接构筑成基于荧光共振能量转移(FRET)机理检测硫化氢的比率荧光探针，该比率荧光探针化学结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述检测硫化氢的比率荧光探针在检测含硫化氢样品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含硫化氢样品是含外源性硫化氢或内源性硫化氢的生物细胞，或是含硫化氢的溶液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述生物细胞是HeLa细胞。

5.权利要求1所述检测硫化氢的比率荧光探针在细胞内的线粒体定位中的应用。