CN111777767A - 一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与应用 - Google Patents

一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与应用，该荧光纳米探针是以1‑丙炔基‑2‑(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)‑2‑甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，四乙酰基‑a‑D溴代半乳糖，叠氮化钠，四苯基卟啉，2,4‑二硝基苯磺酰氯，9,9‑二辛基聚芴‑苯并噻二唑交替共聚物等为原料制备的一种新型比率荧光纳米探针。该荧光纳米探针能在纯水溶液中能实现硫化氢的高选择性和高灵敏度比率检测，能够对硫化氢进行高选择性零串扰比率检测，并且该探针的端基半乳糖功能化，具有肝靶向的功能，且有着低细胞毒性，优良的水分散性，较大的Stokes位移等优点，在分析化学、生命科学、以及环境科学等技术领域有着巨大的应用前景。

Description

一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与 应用
技术领域
本发明属于化学材料制备及分析检测领域，涉及可比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备及应用，具体地说，涉及一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是一种无色、易溶于水、有臭鸡蛋气味的可燃性气体。H2S在水溶液中会发生电离，有H2S、HS-和S2-三种存在形式，并且其存在形式与溶液的酸碱度有着直接的联系。硫化氢是人体内重要的神经递质分子、调节心血管功能分子、炎症调节因子、内皮源性血管舒张因子等，在人体生理以及病理调节机制中发挥着重要的作用。然而其浓度水平的异常却会导致许多人类疾病，因此，生物机体内对硫化氢的识别检测对疾病的诊断与治疗有着重要的意义。目前硫化氢的检测方法有许多，如紫外吸收法、电化学法、色谱法等，然而相比于复杂而昂贵的仪器和试剂，荧光探针法由于其分析灵敏度高、操作简单、样品用量少、检测成本低、选择性好，并且能够对生理活性细胞进行荧光成像等优点而收到广泛关注。
目前已经报道的探针主要以单发射波长的小分子探针为主，如(CN104945407A、CN105295900A)。这种基于单发射波长的荧光探针由于在检测过程中受背景、浓度、光源干扰较大，导致灵敏度较低，误判率较髙。并且，这些荧光探针主要是基于小分子，涉及到小分子的探针，其水溶性和潜在的生物毒性极大的限制了其在生物和医学领域的应用。相对于单一波长荧光探针而言，比率型荧光探针，通过建立内标，利用两个波长荧光强度比值的变化，提高动态响应的范围，大大地避免了探针浓度、温度、极性、环境的pH值、稳定性等众多可变因素的干扰。但是，大多比率型荧光探针均有光谱串扰的缺点，这将严重干扰其在生物成像领域的检测，而具有零串扰光谱特性的荧光探针由于其两个发射峰之间位移大且几乎无光谱重叠，从而在成像的时候两发射峰之间没有干扰。此外，相比于合成复杂、水溶差的传统小分子荧光探针，以两亲性嵌段聚合物为载体的荧光纳米探针因其优异的水溶性、低细胞毒性、无有机溶剂残留、可设计性强、高灵敏度、高选择性等优点在化学、医学和环境科学等研究领域显示了极其广阔的应用前景，且由于肝脏是体内H2S生成的主要部位，可能对维持循环血液中H2S的浓度起到重要作用，故设计一种具有肝靶向作用的零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针是非常有必要的。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针及制备与应用，该荧光纳米探针以1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，四乙酰基-a-D溴代半乳糖，叠氮化钠，四苯基卟啉，2,4-二硝基苯磺酰氯进一步应用研究表明，该荧光纳米探针能够实现对硫化氢的高灵敏度、高选择性的快速比率检测。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针，由两亲性嵌段共聚物和含卟啉的荧光分子和9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物在水中自组装而成。
其中所述两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure BDA0002184010260000021
式中n/x/y/z为1：2～4：1.5～2：10～15，R1为C7-C17的正烷基中的一种。
该两亲性嵌段共聚物由亲水段聚乙二醇甲醚，2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸和疏水段(苯乙烯)构成，具有肝靶向功能的半乳糖结构位于亲水段的最左端可在一种零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针中起到很好的肝靶向作用。
一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针中，两亲性嵌段共聚物的制备，包括以下步骤：
(1)将一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸、偶氮二异丁腈AIBN溶解于二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物1；
(2)将一定量的产物1、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物2；
(3)将一定量的四乙酰基-a-D溴代半乳糖、叠氮化钠、溶解于5mL二甲基亚砜DMSO中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(4)将一定量的产物3和甲醇钠加入到12mL的甲醇中，室温搅拌24h，反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调节pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(5)将一定量的产物2和产物4抗坏血酸钠、五水硫酸铜、溶于水/四氢呋喃5:1(v/v)的溶液中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后得到产物5，即两亲性嵌段共聚物；
根据上述制备方法制备的两亲性嵌段共聚物，其特征是，步骤(1)中，1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚(PEGMA)、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸、偶氮二异丁腈(AIBN)的摩尔比为10:150～300:15～45:0.5～1.5，1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯在DMF的中的浓度为0.05mmol/mL～0.15mmol/mL；步骤(2)中产物1、苯乙烯、偶氮二异丁腈(AIBN)的摩尔比为10:3000～7000:4～8，其中产物1在DMF中的浓度为0.005～0.015mmol/mL；步骤(3)中的四乙酰基-a-D溴代半乳糖、叠氮化钠的摩尔比为1:3～7,其中四乙酰基-a-D溴代半乳糖在DMSO中的浓度为0.17～0.26mmol/mL；步骤(4)中的产物3和甲醇钠按的摩尔比为1:4～8,其中产物3在甲醇中的浓度为0.065～1.125mmol/mL；步骤(5)中产物2、产物4、抗坏血酸钠、五水硫酸铜的摩尔比为1:50～150：10～20:5～9，其中产物2在水/四氢呋喃5:1的溶液中的浓度为0.001～0.002mmol/mL。
根据上述制备方法制备的两亲性嵌段共聚物，其具体的反应过程如下
Figure BDA0002184010260000031
其中所述含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)的结构式为：
Figure BDA0002184010260000041
一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针中，含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)的制备包括以下步骤：
(1)将一定量的四苯基卟啉溶于三氟乙酸(TFA)中，快速加入一定量的NaNO2室温反应90s后快速加水淬灭反应，后用氨水将反应液pH调至8，冷却后用二氯甲烷萃取，旋转蒸发除去溶剂后，产物用浓盐酸溶解后加入一定量的氯化亚锡在90℃下回流反应12h，待反应液冷却后加氨水调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯得5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(2)将一定量5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉用冰醋酸和浓磷酸体积比为1:1的溶液溶解后加入的用浓硫酸溶解的NaNO2溶液，在0℃下反应2h后将反应液加入到50％的硫酸溶液中95℃回流反应12h，待反应液冷却后加NaOH调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(3)将一定量的5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉、2,4-二硝基苯磺酰氯，溶于二氯甲烷(DCM)：四氢呋喃(THF)3:1中，加入一定量的三乙胺，室温反应24h，反应结束后旋转蒸发除去的溶剂，柱分离提纯产物，真空干燥，得到产物含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)，一种可检测H2S的小分子有机化合物。
根据上述制备方法制备的小分子有机化合物，其特征是，步骤(1)中，四苯基卟啉和NaNO2的摩尔比为1:6.5～10.5，四苯基卟啉在三氟乙酸的中的浓度为0.003～0.009mmol/mL；步骤(2)中5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉，NaNO2的摩尔比为1:10～30，其中5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉在冰醋酸和浓磷酸体积比为1:1的溶液中的浓度为0.196mmol/mL；步骤(3)中5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉、2,4-二硝基苯磺酰氯、三乙胺的摩尔比为1:5～15:5～15,其中5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉在DCM中的浓度为0.025mmol/mL～0.045mmol/mL。
根据上述制备方法制备的含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)，其具体的反应过程如下：
Figure BDA0002184010260000051
其中所述9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物的结构式为：
Figure BDA0002184010260000052
该共轭聚合物，具有优良的光稳定性，对硫化氢无响应，且由于其在激发光谱与含卟啉的荧光分子有重叠，可以共激发之外，两者的发射光谱峰值相差126nm，且无光谱重叠，故在该肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针中是一个很好的参比基团。
本发明提供了一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针在检测肝细胞中的硫化氢的应用。
可比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法：取两亲性嵌段共聚物配制为一定浓度的四氢呋喃(THF)溶液A和含卟啉的荧光分子配制为一定浓度的四氢呋喃(THF)溶液B和9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物配制为一定浓度的四氢呋喃(THF)溶液C，然后分别取A、B、C混合，在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去THF，用水定容到10mL得到所需的荧光纳米探针，即一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
本发明以1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，四乙酰基-a-D溴代半乳糖，叠氮化钠，四苯基卟啉，2,4-二硝基苯磺酰氯为原料来制备所需要的荧光纳米探针，该荧光纳米探针在pH值7.4的缓冲溶液中，在有H2S存在的时候，659nm处会随着H2S的浓度增加而出现明显的荧光增强现象，而在533nm处的荧光随着H2S的浓度增加没有明显变化。该荧光纳米探针响应基团荧光波长位于近红外区在应用到细胞成像时可以降低生物体自身荧光干扰，且该荧光纳米探针对硫化氢的检测具有明显的高选择性，能达到较高灵敏度检测的效果，且Storks位移小。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光化学探针成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对硫化氢实现快速特异性识别。
总而言之，本发明提供了一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备及其应用，该荧光纳米探针制备简单，灵敏度高，有望在生物材料科学领域得到广泛应用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1为制备的荧光纳米探针的粒径图。
图2为制备的荧光纳米探针对硫化氢的识别示意图。
图3为不同H2S浓度时，荧光纳米探针的荧光发射光谱变化图(激发波长：440nm)，[H2S]＝0(a)，1.0×10-2mol/L(b),1.8×10-2mol/L(c),2.6×10-2mol/L(d)，3.8×10-2mol/L(e)，6.6×10-2mol/L(f),7.6×10-2mol/L(g),8.6×10-2mol/L(h)，10.6×10-2mol/L(i),12.6×10-1mol/L(j),14.6×10-1mol/L(k),16.6×10-1mol/L(l),18.6×10-1mol/L(m),20.6×10-1mol/L(n),22.6×10-1mol/L(o),24.6×10-1mol/L(p),26.6×10-1mol/L(q),28.6×10-1mol/L(r),30.6×10-1mol/L(s),32.6×10-1mol/L(t)。
图4为荧光纳米探针随H2S浓度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。
图5为各种离子对该荧光纳米探针荧光比率强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为2.0×10-3mol/L，H2S浓度为2.0×10-4mol/L，I659和I533为各离子和过氧化物加入前后的荧光纳米探针在以440nm为激发波长，659nm和533nm为发射波长处的荧光强度变化值。
图6为各种离子对荧光纳米探针的荧光比率强度的干扰性对比数据图，加入后的各种离子的浓度均为2.0×10-3mol/L，H2S浓度为2.0×10-4mol/L，I659和I533为各离子和过氧化物加入前后的荧光纳米探针在以440nm为激发波长，659nm和533nm为发射波长处的荧光强度变化值。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：一种基于卟啉的可比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)将1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚(PEGMA)(1.5mmol)、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸(0.15mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.005mmol)按照摩尔比溶解于2mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至60～80℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物1；
(2)将产物1(0.01mmol)、苯乙烯(3mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.004mmol)溶解于1mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至90℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物2；
(3)将四乙酰基-a-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(3.45mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(4)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(3.88mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(5)将产物2(0.0067mmol)、产物4(0.335mmol)、抗坏血酸钠(0.067mmol)、五水硫酸铜(0.0335mmol)溶于水/四氢呋喃5:1的溶液(25mL)中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后旋转蒸发除去溶剂得到产物5，即两亲性嵌段共聚物；
(6)将的四苯基卟啉(2mmol)溶于三氟乙酸(TFA)中，快速加入NaNO2(13mmol)室温反应90s后快速加水淬灭反应，后用氨水将反应液pH调至8，冷却后用二氯甲烷萃取，旋转蒸发除去溶剂后，产物用浓盐酸溶解后加入一定量的氯化亚锡在90℃下回流反应12h，待反应液冷却后加氨水调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯得5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(7)将5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.6mmol)用冰醋酸和浓磷酸体积比为1:1的溶液溶解后加入的用浓硫酸溶解的NaNO2(6mmol)溶液，在0℃下反应2h后将反应液加入到50％的硫酸溶液中95℃回流反应12h，待反应液冷却后加NaOH调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯得到5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(8)将的5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.41mmol)、2,4-二硝基苯磺酰氯(2.05mmol)，溶于二氯甲烷(DCM)：四氢呋喃3:1中，加入三乙胺(2.05mmol)，室温反应24h，反应结束后旋转蒸发除去的溶剂，柱分离提纯产物，真空干燥，得到含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)即一种可检测H2S的小分子有机化合物。
(9)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制为8mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液A，步骤(8)合成的含卟啉的荧光分子配制为2.3mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液B，9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物配置成2.1mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液C然后分别取1mL的A和0.15mL的B和0.09mL的C混合，在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去THF，用水定容到10mL得到所需的荧光纳米探针，即一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针。
实施例2：一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)将1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚(PEGMA)(2.25mmol)、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸(0.3mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.01mmol)按照摩尔比溶解于2mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至60～80℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物1；
(2)将产物1(0.01mmol)、苯乙烯(5mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.006mmol)溶解于1mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至90℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物2；
(3)将四乙酰基-a-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(5.75mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(4)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(5.83mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(5)将产物2(0.0067mmol)、产物4(0.67mmol)、抗坏血酸钠(0.1005mmol)、五水硫酸铜(0.0469mmol)溶于水/四氢呋喃5:1的溶液(25mL)中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取旋转蒸发除去溶剂得到产物5，即两亲性嵌段共聚物；
(6)将的四苯基卟啉(2mmol)溶于三氟乙酸(TFA)中，快速加入NaNO2(19mmol)室温反应90s后快速加水淬灭反应，后用氨水将反应液pH调至8，冷却后用二氯甲烷萃取，旋转蒸发除去溶剂后，产物用浓盐酸溶解后加入一定量的氯化亚锡在90℃下回流反应12h，待反应液冷却后加氨水调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯得5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(7)将5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.6mmol)用冰醋酸和浓磷酸体积比为1:1的溶液溶解后加入的用浓硫酸溶解的NaNO2(12mmol)溶液，在0℃下反应2h后将反应液加入到50％的硫酸溶液中95℃回流反应12h，待反应液冷却后加NaOH调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(8)将的5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.41mmol)、2,4-二硝基苯磺酰氯(4.1mmol)，溶于二氯甲烷(DCM)：四氢呋喃3:1中，加入三乙胺(4.1mmol)，室温反应24h，反应结束后旋转蒸发除去的溶剂，柱分离提纯产物，真空干燥，得到含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)即一种可检测H2S的荧光分子。
(9)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制为8mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液A，步骤(8)合成的含卟啉的荧光分子配制为2.3mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液B，9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物配置成2.1mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液C,然后分别取1mL的A和0.108mL的B和0.072mL的C混合，在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去THF，用水定容到10mL得到所需的荧光纳米探针，即一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针。
实施例3：一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)将1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚(PEGMA)(3mmol)、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸(0.45mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.015mmol)按照摩尔比溶解于2mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至60～80℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物1；
(2)将产物1(0.01mmol)、苯乙烯(7mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(0.008mmol)溶解于1mL DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至90℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物2；
(3)将四乙酰基-a-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(8.05mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(4)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(7.76mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(5)将产物2(0.0067mmol)、产物4(1.005mmol)、抗坏血酸钠(0.134mmol)、五水硫酸铜(0.0603mmol)溶于水/四氢呋喃5:1的溶液(25mL)中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后旋转蒸发除去溶剂得到产物5，即两亲性嵌段共聚物；
(6)将的四苯基卟啉(2mmol)溶于三氟乙酸(TFA)中，快速加入NaNO2(20.1mmol)室温反应90s后快速加水淬灭反应，后用氨水将反应液pH调至8，冷却后用二氯甲烷萃取，旋转蒸发除去溶剂后，产物用浓盐酸溶解后加入一定量的氯化亚锡在90℃下回流反应12h，待反应液冷却后加氨水调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯得5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(7)将5,10-二(4-氨基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.6mmol)用冰醋酸和浓磷酸体积比为1:1的溶液溶解后加入的用浓硫酸溶解的NaNO2(18mmol)溶液，在0℃下反应2h后将反应液加入到50％的硫酸溶液中95℃回流反应12h，待反应液冷却后加NaOH调pH至8。用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后，通过柱分离提纯5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉。
(8)将的5,10-二(4-羟基苯基)-15,20-二苯基卟啉(0.41mmol)、2,4-二硝基苯磺酰氯(6.2mmol)，溶于二氯甲烷(DCM)：四氢呋喃3:1中，加入三乙胺(6.15mmol)，室温反应24h，反应结束后旋转蒸发除去的溶剂，柱分离提纯产物，真空干燥，得到含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)即一种可检测H2S的荧光分子。
(9)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制为8mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液A，步骤(8)含卟啉的荧光分子(5,10-二(4-(2,4-二硝基苯磺酸酯))15,20-二苯基卟啉)配制为2.3mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液B，9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物配置成2.1mg/mL的四氢呋喃(THF)溶液C然后分别取1mL的A和0.09mL的B和0.16mL的C混合，在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去THF，用水定容到10mL得到所需的荧光纳米探针，即一种基于卟啉的可比率检测硫化氢的荧光纳米探针。
实施例4:硫化氢的检测实验
取20个5mL样品瓶，分别加入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液0.6mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.84mg/mL)，依次加入2.4mL的pH为7.4的缓冲溶液溶液，搅拌3min之后分别将浓度为[H2S]＝0(a)，1.0×10-2mol/L(b),1.8×10-2mol/L(c),2.6×10-2mol/L(d)，3.8×10-2mol/L(e)，6.6×10-2mol/L(f),7.6×10-2mol/L(g),8.6×10-2mol/L(h)，10.6×10-2mol/L(i),12.6×10-1mol/L(j),14.6×10-1mol/L(k),16.6×10-1mol/L(l),18.6×10-1mol/L(m),20.6×10-1mol/L(n),22.6×10-1mol/L(o),24.6×10-1mol/L(p),26.6×10- 1mol/L(q),28.6×10-1mol/L(r),30.6×10-1mol/L(s),32.6×10-1mol/L(t)的3μL硫化氢溶液加入20个样品瓶中，常温下搅拌45min后，以440nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光发射光谱，得20个样品的荧光发射光谱变化图，见图3。测定结果表明：该荧光纳米探针在659nm处的荧光强度随着硫化氢浓度的逐渐增加而逐步上升，而在533nm处的荧光强度基本保持不变。根据图3中659nm和533nm处荧光强度比率变化值与浓度的变化关系可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图(y＝a+b*x，a＝0.51，b＝0.006，R2＝0.9969)，见图4
实施例5：其它离子、还原性物质、过氧化物的影响对比检测实验。
取12个5mL样品瓶，分别装入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液0.6mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.84mg/mL)，然后依次加入2.4mL的pH为7.4的缓冲溶液，搅拌3min之后分别将浓度为2.0mol/L的Zn2+、Cu2+、Fe3+、GSH、Cys、H2O2(过氧化氢)、HClO(次氯酸)、t-BuO·(过氧化叔丁基自由基)1O2(单线态氧)、·HO(羟基基自由基)和浓度为2.0×10-1mol/L的H2S溶液各取3μL加入另外11个样品瓶中，1号样品为空白样。然后分别测定12个样品在440nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在659nm和533nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图5。测定结果表明：除了硫化氢外，其它上述各种离子和过氧化物对所制备的荧光纳米探针的荧光比率强度没有明显影响。
实施例6：其它离子、还原性物质、过氧化物共存时的影响的对比检测实验。
取12个5mL样品瓶，分别装入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液0.6mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.84mg/mL)，然后依次加入2.4mL的pH为7.4的缓冲溶液，搅拌3min之后，1号为空白样品，其余样品瓶依次加入2.0×10-1mol/L的H2S溶液3μL，继续搅拌45min，再分别将3μL的浓度为2.0mol/L的Zn2+、Cu2+、Fe3+、GSH、Cys、H2O2(过氧化氢)、HClO(次氯酸)、t-BuO·(过氧化叔丁基自由基)1O2(单线态氧)、·HO(羟基基自由基)加入到3号至12号样品瓶中。搅拌45min之后然后分别测定12个样品在440nm为波长激发下的荧光光谱数据，得到在659nm和533nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图6。测定结果表明：除了硫化氢外，其它上述离子、还原性物质、过氧化物对所制备的荧光纳米探针的荧光比率强度没有明显影响。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针，其特征在于，由两亲性嵌段共聚物、含卟啉的荧光分子和9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物在水中自组装而成，所述两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure FDA0002184010250000011
式中x/y/n/z为1:10～30：5～15：70～130，R1为C7-C17的正烷基中的一种。
2.一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
步骤(1)，将一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸、偶氮二异丁腈AIBN溶解于二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物1；
步骤(2)，将一定量的产物1、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物2；
步骤(3)，将一定量的四乙酰基-a-D溴代半乳糖、叠氮化钠、溶解于5mL二甲基亚砜DMSO中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
步骤(4)，将一定量的产物3和甲醇钠加入到12mL的甲醇中，室温搅拌24h，反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调节pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
步骤(5)，将一定量的产物2和产物4抗坏血酸钠、五水硫酸铜、溶于水/四氢呋喃5:1(v/v)的溶液中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后得到产物5，即两亲性嵌段共聚物；
步骤(6)，取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液A，含卟啉的荧光分子配制成一定浓度的四氢呋喃溶液B，并将9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃溶液C，然后分别取一定量的A、B、C三种溶液混合，其中A、B、C的摩尔比为在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针。
3.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸、偶氮二异丁腈AIBN的摩尔比为10:150～300:15～45:0.5～1.5；其中1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯在DMF的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/mL。
4.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中产物1、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN的摩尔比为10:3000～7000:4～8，其中产物1在DMF的浓度为0.005mmol/mL～0.015mmol/mL。
5.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的四乙酰基-a-D溴代半乳糖、叠氮化钠的摩尔比为1:3～7，其中四乙酰基-a-D溴代半乳糖在DMSO中的浓度为0.17mmol/L～0.26mmol/L。
6.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(4)中的产物3与甲醇钠摩尔比为1:4～8，其中产物3在甲醇中的浓度为0.065mmol/mL～1.125mmol/mL。
7.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(5)中的产物2和产物4、抗坏血酸钠、五水硫酸铜的摩尔比为1:50～150：10～20:5～9，其中产物2在水/四氢呋喃5:1(v/v)中的浓度为0.001mmol/mL～0.002mmol/mL。
8.根据权利要求2所述的一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤(6)中的A、B、C的质量比为80：20～30：10～20，其中两亲性嵌段共聚物在水中的浓度为0.6～1.0mg/mL。
9.如权利要求1所述一种肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针或权利要求2-8任一所述制备方法制备的肝靶向零串扰比率检测硫化氢的荧光纳米探针在检测肝细胞中硫化氢的应用。
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