CN111592630A - 一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及其制备与应用 - Google Patents

一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及其制备与应用，该荧光传感器是以1‑丙炔基‑2‑(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)‑2‑甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，1‑芘甲醛和1‑(2‑羟乙基)‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚‑1‑溴化铵，丙烯酰氯，四乙酰基‑α‑D‑溴代半乳糖，叠氮化钠为原料制备的一种新型比率荧光纳米探针。相比于现有的荧光检测技术，本发明得到的荧光探针水溶性好，毒性低，具有对次氯酸高选择性快速响应，低有机溶剂残留的特点，且具有肝靶向性，可以进行实时原位检测，投入成本较低，合成路线简单，检测设备和方法简便，同时适于放大合成和实际生产应用，在分析化学、生命科学、以及环境科学等技术领域有着巨大的应用前景。

Description

一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及 其制备与应用
技术领域
本发明涉及可比率检测次氯酸的荧光纳米探针的制备及应用，属于化学材料制备及分析检测领域，具体来说，一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及其制备与应用。
背景技术
在众多环境和生物体内存在的离子、生物活性物种中，活性氧物种(ROS)是广泛存在于生物细胞中一种非常重要的物种,其在生物细胞中的信号传导、分化、迁移和细胞免疫中均起着非常重要的作用。然而由于其在生物体内的活性较高、含量较低、分布不均,使得人们在深入研究其性质时遇到了一些困难。内源性的次氯酸(HClO)作为ROS中的重要的一员，是过氧化氢(H2O2)与氯离子在髓过氧化物酶(MPO)的催化下反应得到的。此外，HClO被自然界中的多种生物以细菌杀手的身份用于防御系统。作为一种高效的杀菌武器，其机理是由于细菌缺少分解HClO的酶而必然受到HClO强氧化性，高活性的作用，导致细菌死亡。在人体内，HClO也是非常重要的，正常水平的HClO对于人体健康的维持非常重要。然而人体内HClO水平的异常变化时会导致如下的疾病：如关节炎，动脉硬化症等。目前的很多生活用水都采用氯气消毒处理，氯气消毒难免产生一定量的次氯酸，随着环境的变化，会重新释放出氯气，氯气作为一种高危险性的气体，很容易引起呼吸系统疾病。并且次氯酸因其高强度的氧化性和漂白性，使得经过氯气消毒处理的生活用水会给生活带来诸多不便。
目前，已经发展起来的检测次氯酸的方法很多，如电化学方法，原子吸收光谱法等。然而，大部分的检测方法成本投入较高，检测过程过于复杂，这些因素都严重制约了某些方法在实际检测中的运用。因此，发明一种简单、低成本且高效的快速检测技术具有相当重要的现实意义和应用前景。近年来，荧光探针因其优异的光学性能,受到了越来越多的关注，在化学、医学和环境科学等研究领域显示了极其广阔的应用前景。此外，相比于合成复杂、水溶差的传统小分子荧光探针，以两亲性嵌段聚合物为载体的荧光纳米探针因其优异的水溶性、低细胞毒性、无有机溶剂残留、可设计性强、高灵敏度、高选择性等优点在化学、医学和环境科学等研究领域显示了极其广阔的应用前景。此外，LPS可以诱导髓过氧化物酶过表达，进而导致髓过氧化酶介导的氯离子和过氧化氢作用而产生内源性次氯酸(HClO)增多，增多的HClO导致体内氧化还原平衡被破坏进而导致肝损伤。故设计一种具有肝靶向作用的可视化比率检测HClO的荧光纳米探针是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针及其制备与应用，该荧光纳米探针以1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，芘甲醛和1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵，丙烯酰氯，四乙酰基-α-D-溴代半乳糖，叠氮化钠为原料合成一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针，进一步应用研究表明，该荧光纳米探针能够实现对次氯酸的高灵敏度、高选择性的快速比率检测且具有肝靶向性。
本发明的目的是通过下述方式实现的：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)取一定量的1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵和1-芘甲醛加入到圆底烧瓶，加入精制乙醇溶解，再加入哌啶，在氮气保护下，75℃反应20h，将有机溶剂减压旋干。用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到黄色固体产物1；
(2)取步骤(1)合成产物1加入到圆底烧瓶，再加入精制二氯甲烷溶解，接着加入三乙胺，在搅拌下，再将溶于精制二氯甲烷的丙烯酰氯溶液缓慢加到圆底烧瓶中，室温反应24h。减压旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷1:50,v/v作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到亮黑色固体产物2；
(3)取一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、偶氮二异丁腈AIBN溶解于二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物3；
(4)取一定量的产物2、产物3、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物4；
(5)取一定量的四乙酰基-α-D溴代半乳糖、叠氮化钠、溶解于5mL二甲基亚砜DMSO中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得产物5；
(6)将一定量的产物5和甲醇钠加入到12mL的甲醇中，室温搅拌24h，反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调节pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物6；
(7)将一定量的产物2和产物4、抗坏血酸钠、五水硫酸铜、溶于水/四氢喃5:1v/v的溶液中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后得到产物7，即两亲性嵌段共聚物；
(8)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
其中所述两亲性嵌段共聚物的结构式为：
Figure BDA0002542811640000031
式中x/y/n/z为30～45:60～80：7～19：50～140，R1为C7-C17的正烷基中的一种；
该两亲性嵌段聚合物由亲水段聚乙二醇甲醚和疏水段(苯乙烯)构成，具有肝靶向功能的半乳糖结构位于亲水段的最左端可在一种可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针中起到很好的肝靶向作用。
进一步地，步骤(1)中，1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚(PEGMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)的摩尔比为10:150～300:15～1.5，1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯在DMF的中的浓度为0.05mmol/mL～0.15mmol/mL；步骤(2)中产物1、苯乙烯、偶氮二异丁腈(AIBN)的摩尔比为10:3000～7000:4～8，其中产物1在DMF中的浓度为0.005～0.015mmol/mL；步骤(3)中的四乙酰基-a-D溴代半乳糖、叠氮化钠的摩尔比为1:3～7,其中四乙酰基-α-D溴代半乳糖在DMSO中的浓度为0.17～0.26mmol/mL；步骤(4)中的产物3和甲醇钠按的摩尔比为1:4～8,其中产物3在甲醇中的浓度为0.065～1.125mmol/mL；步骤(5)中产物2、产物4、抗坏血酸钠、五水硫酸铜的摩尔比为1:50～150：10～20:5～9，其中产物2在水/四氢呋喃3:2的溶液中的浓度为0.001～0.002mmol/mL。
根据上述制备方法制备的两亲性嵌段共聚物，其具体的反应过程如下
Figure BDA0002542811640000041
本发明提供了一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针在检测肝细胞中的次氯酸的应用。
可比率检测次氯酸的荧光纳米探针的制备方法：取两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
本发明1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯，苯乙烯(St)，聚乙二醇甲醚(PEGMA)，1-芘甲醛和1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵，丙烯酰氯，四乙酰基-α-D-溴代半乳糖，叠氮化钠为原料合成一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针，，该荧光纳米探针在pH值5.5的缓冲溶液中，在有HClO存在的时候，570nm处会随着HClO的浓度增加而出现明显的荧光降低现象，而在450nm处的荧光随着HClO的浓度增加没有明显变化。该荧光纳米探针对次氯酸的检测具有明显的高选择性，能达到较高灵敏度检测的效果。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光化学探针成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对次氯酸实现快速特异性识别。
总而言之，本发明提供了一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备及其应用，该荧光纳米探针制备简单，灵敏度高，有望在生物材料科学领域得到广泛应用。
附图说明
图1为制备的荧光纳米探针的粒径图。
图2为制备的荧光纳米探针对HClO的识别示意图。
图3为不同HClO浓度时，荧光纳米探针的荧光发射光谱变化图(激发波长：400nm)，[HClO]＝0(a),0.06×10-6mmol/L(b),0.1×10-6mol/L(c),0.6×10-6mol/L(d),1.5×10- 6mol/L(e),3×10-6mol/L(f),5×10-6mol/L(g),7×10-6mol/L(h),10×10-6mol/L(i),14×10-6mol/L(j),18×10-6mol/L(k),22×10-6mol/L(l),26×10-6mol/L(m),30×10-6mol/L(n),34×10-6mol/L(o),38×10-6mol/L(p),42×10-6mol/L(q)(注：该荧光探针浓度为0.2mg/mL)。
图4为荧光纳米探针随HClO浓度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。
图5为各种离子对该荧光纳米探针荧光比率强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为1×10-4mol/L，HClO浓度为4.2×10-5mol/L，I570和I450为各离子和过氧化物加入前后的荧光纳米探针在以400nm为激发波长，570nm和450nm为发射波长处的荧光强度变化值。
图6为各种离子对荧光纳米探针的荧光比率强度的干扰性对比数据图，加入后的各种离子的浓度均为1.0×10-4mol/L，HClO浓度为4.2×10-5mol/L，I570和I450为各离子和过氧化物加入前后的荧光纳米探针在以400nm为激发波长，570nm和450nm为发射波长处的荧光强度变化值。
图7为荧光纳米探针的肝靶向细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)取一定量的1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵(2.5mmol)和1-芘甲醛(2.5mmol)加入到25mL圆底烧瓶，加入15mL精制乙醇溶解，再加入哌啶(1mL)，在氮气保护下，75℃反应20h，将有机溶剂减压旋干。用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到红色固体产物1；
(2)取步骤(1)合成产物1(0.994mmol)加入到100mL圆底烧瓶，再加入50mL精制二氯甲烷溶解，接着加入三乙胺(2.98mmol)，在搅拌下，再将溶于10mL精制二氯甲烷的丙烯酰氯(4.97mmol)溶液缓慢加到圆底烧瓶中，室温反应24h。减压蒸发旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷1:50,v/v作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到亮黑色固体产物2；
(3)取一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚PEGMA(2mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.01mol)溶解于2mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物3；
(4)取一定量的产物2(0.0071mmol)、产物3(0.24mmol)、苯乙烯(6.86mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.00284mol)溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物4；
(5)取四乙酰基-α-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(3.45mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(6)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(3.88mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(7)将一定量的产物4(0.001mmol)和产物6(0.1mmol)、β-抗坏血酸钠(0.03mmol)五水硫酸铜(0.015mmol)于10mL的封管，加入四氢呋喃:水3:2混合溶剂5mL，充氮排氧，室温下反应24h，减压旋干，用二氯甲烷多次洗涤干燥，再用蒸馏水多次洗涤，得到粉红色固体，真空干燥，得所需的荧光探针，即：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
(8)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。该荧光纳米探针以纳米粒子的形式存在，其粒径数据如图1所示。同时，制备的荧光纳米探针对HClO的识别示意图，如图2所示。
实施例2：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)取一定量的1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵(2.5mmol)和1-芘甲醛(2.5mmol)加入到25mL圆底烧瓶，加入15mL精制乙醇溶解，再加入哌啶(1mL)，在氮气保护下，75℃反应20h，将有机溶剂减压旋干。用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到黄色固体产物1；
(2)取步骤(1)合成产物1(0.994mmol)加入到100mL圆底烧瓶，再加入50mL精制二氯甲烷溶解，接着加入三乙胺(2.98mmol)，在搅拌下，再将溶于10mL精制二氯甲烷的丙烯酰氯(4.97mmol)溶液缓慢加到圆底烧瓶中，室温反应24h。减压蒸发旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷1:50,v/v作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到亮黑色固体产物2；
(3)取一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚PEGMA(2mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.01mol)溶解于2mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物3；
(4)取一定量的产物2(0.0071mmol)、产物3(0.24mmol)、苯乙烯(6.86mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.00284mol)溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物4；
(5)取四乙酰基-α-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(3.45mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(6)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(3.88mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(7)将一定量的产物4(0.001mmol)和产物6(0.1mmol)、β-抗坏血酸钠(0.03mmol)五水硫酸铜(0.015mmol)于10mL的封管，加入四氢呋喃:水3:2混合溶剂5mL，充氮排氧，室温下反应24h，减压旋干，用二氯甲烷多次洗涤干燥，再用蒸馏水多次洗涤，得到粉红色固体，真空干燥，得所需的荧光探针，即：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
(8)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
实施例3：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备，具体步骤如下：
(1)取一定量的1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵(2.5mmol)和1-芘甲醛(2.5mmol)加入到25mL圆底烧瓶，加入15mL精制乙醇溶解，再加入哌啶(1mL)，在氮气保护下，75℃反应20h，将有机溶剂减压旋干。用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到黄色固体产物1；
(2)取步骤(1)合成产物1(0.994mmol)加入到100mL圆底烧瓶，再加入50mL精制二氯甲烷溶解，接着加入三乙胺(2.98mmol)，在搅拌下，再将溶于10mL精制二氯甲烷的丙烯酰氯(4.97mmol)溶液缓慢加到圆底烧瓶中，室温反应24h。减压蒸发旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷1:50,v/v作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到亮黑色固体产物2；
(3)取一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯(0.1mmol)、聚乙二醇甲醚PEGMA(2mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.01mol)溶解于2mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物3；
(4)取一定量的产物2(0.0071mmol)、产物3(0.24mmol)、苯乙烯(6.86mmol)、偶氮二异丁腈AIBN(0.00284mol)溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物4；
(5)取四乙酰基-α-D溴代半乳糖(1.15mmol)、叠氮化钠(3.45mmol)溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得产物3；
(6)将产物3(0.97mmol)和甲醇钠(3.88mmol)加入到10mL的甲醇中，室温搅拌24h。反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物4；
(7)将一定量的产物4(0.001mmol)和产物6(0.1mmol)、β-抗坏血酸钠(0.03mmol)五水硫酸铜(0.015mmol)于10mL的封管，加入四氢呋喃:水3:2混合溶剂5mL，充氮排氧，室温下反应24h，减压旋干，用二氯甲烷多次洗涤干燥，再用蒸馏水多次洗涤，得到粉红色固体，真空干燥，得所需的荧光探针，即：一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
(8)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
实施例4：HClO的检测实验。
取17个5mL样品瓶，分别加入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液1mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.6mg/mL)，依次加入2mL的pH为5.5的缓冲溶液，搅拌3min之后分别将浓度为[HClO]＝0(a),0.06×10-3mol/L(b),0.1×10-3mol/L(c),0.6×10-3mol/L(d),1.5×10-3mol/L(e),3×10-3mol/L(f),5×10-3mol/L(g),7×10-3mol/L(h),10×10-3mol/L(i),14×10-3mol/L(j),18×10-3mol/L(k),22×10-3mol/L(l),26×10-3mol/L(m),30×10-3mol/L(n),34×10-3mol/L(o),38×10-3mol/L(p),42×10-3mol/L(q)的3μL次氯酸溶液加入17个样品瓶中，常温下搅拌5min后，以400nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光发射光谱，得17个样品的荧光发射光谱变化图，见图3。测定结果表明：该荧光纳米探针在570nm处的荧光强度随着HClO浓度的逐渐增加而逐步下降，而在450nm处的荧光强度基本保持不变。根据图3中450nm和570nm处荧光强度比率变化值与浓度的变化关系可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图(y＝a+b*x，a＝0.46304，b＝0.02668，R2＝0.9939)，见图4。
实施例5：其它离子和过氧化物影响的对比检测实验。
取12个5mL样品瓶，分别装入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液1mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.6mg/mL)，然后依次加入2mL的pH为5.5的缓冲溶液，分别将浓度为0.1mol/L的Mn2+、Ca2+、Hys、Cys、GSH、H2S、H2O2、t-BuOH(过氧化叔丁醇)、HO·(羟基基自由基)、t-BuO·(过氧化叔丁基自由基)溶液各取3μL加入后10个样品瓶中，取3μL浓度为42×10-3mol/L的HClO溶液加入到12号，0号样品为空白样，搅拌3min之后，然后分别测定12个样品在400nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在450nm和570nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图5。测定结果表明：在PBS缓冲溶液中，除了HClO外，其它上述各种离子和过氧化物对所制备的荧光传探针的荧光比率强度没有明显影响。
实施例6：其它离子、还原性物质、过氧化物共存时的影响的对比检测实验。
取12个5mL样品瓶，分别装入实施例2中所得的荧光纳米探针溶液1mL(该荧光纳米探针原溶液的浓度为0.6mg/mL)，然后依次加入2mL的pH为5.5的缓冲溶液，搅拌3min之后，1号为空白样品，其余样品瓶依次加入42×10-3mol/L的HClO溶液3μL，继续搅拌5min，再分别将3μL的浓度为0.1mol/L的Mn2+、Ca2+、Hys、Cys、GSH、H2S、H2O2、t-BuOH(过氧化叔丁醇)、HO·(羟基基自由基)、t-BuO·(过氧化叔丁基自由基)溶液加入到3号至11号样品瓶中。搅拌5min之后然后分别测定12个样品在400nm为波长激发下的荧光光谱数据，得到在450nm和570nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图6。测定结果表明：除了HClO外，其它上述离子、还原性物质、过氧化物对所制备的荧光纳米探针的荧光比率强度没有明显影响。
实施例7:聚合物荧光纳米探针对肝细胞的荧光成像
对于细胞摄取实验，将HepG2细胞和HeLa细胞分别在含有所得的荧光纳米探针(终浓度：0.2mg/mL)的RPMI1640培养基中于37℃孵育180分钟。用PBS洗涤3次后，通过共聚焦荧光显微镜分析获得所有荧光图像。激发：400nm，收集的蓝色发射：425-510nm(通道A)；收集的红色发射：550-650nm(通道B)。通过对HepG2细胞和HeLa细胞进行明场、蓝通道和红通道进行荧光成像，并进行蓝红通道/红通道的比率成像。所得的荧光纳米探针孵育后，在HepG2细胞中仅发现红色和蓝色荧光很强，而在类似的实验条件HeLa细胞却没有显示出明显的荧光，结果见图7。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明所作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针，其特征在于，所述的聚合物的结构式为：
Figure FDA0002542811630000011
式中x/y/n/z为30～45:60～80：7～19：50～140，R1为C7-C17的正烷基中的一种。
2.一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)取一定量的1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵和1-芘甲醛加入到圆底烧瓶，加入精制乙醇溶解，再加入哌啶，在氮气保护下，75℃反应20h，将有机溶剂减压旋干，用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到黄色固体产物1；
(2)取步骤(1)合成产物1加入到圆底烧瓶，再加入精制二氯甲烷溶解，接着加入三乙胺，在搅拌下，再将溶于精制二氯甲烷的丙烯酰氯溶液缓慢加到圆底烧瓶中，室温反应24h，减压旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷1:50,v/v作为洗脱剂进行柱层析纯化，得到亮黑色固体产物2；
(3)取一定量的1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、偶氮二异丁腈AIBN溶解于二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至70℃反应4h，反应结束后用乙醚沉淀，真空干燥，得产物3；
(4)取一定量的产物2、产物3、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN溶解于1mL二甲基甲酰胺DMF中，抽真空-充氮气循环三次然后快速升温至80～100℃反应24h，反应结束后用乙醚/石油醚1:1沉淀，真空干燥，得产物4；
(5)取一定量的四乙酰基-α-D溴代半乳糖、叠氮化钠、溶解于5mL二甲基亚砜DMSO中，常温反应30min，反应结束后加2mL蒸馏水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，将有机溶剂减压旋转蒸发除去后真空干燥，得产物5；
(6)将一定量的产物5和甲醇钠加入到12mL的甲醇中，室温搅拌24h，反应完成后加入阳离子交换树脂IR120钠型调节pH至7，然后过滤除去不溶物，将有机溶剂旋转蒸发除去后真空干燥，得到产物6；
(7)将一定量的产物2和产物4抗坏血酸钠、五水硫酸铜、溶于水/四氢喃3:2,v/v的溶液中，常温搅拌24h，用二氯甲烷萃取后得到产物7，即两亲性嵌段共聚物；
(8)取步骤(5)合成的两亲性嵌段共聚物配制成一定浓度的四氢呋喃THF溶液、在超声条件下加入到10mL的水中，滴加完成之后继续超声10min，然后在室温下减压除去四氢呋喃，用蒸馏水定容到10mL得到所需的荧光传感器，即得到一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针。
3.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中1-(2-羟乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-溴化铵和1-芘甲醛的摩尔比为1:0.8～0.9，步骤(2)中产物2和丙烯酰氯的摩尔比为1:4.5～5.5。
4.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯、聚乙二醇甲醚PEGMA、偶氮二异丁腈AIBN的摩尔比为10:150～300:15～1.5；其中1-丙炔基-2-(((十二烷基硫代)硫代碳酰基)硫代)-2-甲基丙酸酯在DMF的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/mL。
5.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中产物2、产物3、苯乙烯、偶氮二异丁腈AIBN的摩尔比为10:3000～7000:4～8，其中产物1在DMF的浓度为0.005mmol/mL～0.015mmol/mL。
6.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中的四乙酰基-α-D溴代半乳糖、叠氮化钠的摩尔比为1:3～7，其中四乙酰基-α-D溴代半乳糖在DMSO中的浓度为0.17mmol/L～0.26mmol/L。
7.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的产物3与甲醇钠摩尔比为1:4～8，其中产物3在甲醇中的浓度为0.065mmol/mL～1.125mmol/mL。
8.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(7)中的产物4和产物6、抗坏血酸钠、五水硫酸铜的摩尔比为1:50～150：10～20:5～9，其中产物2在水/四氢呋喃3:2v/v中的浓度为0.001mmol/mL～0.002mmol/mL。
9.根据权利要求2所述的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(8)中的产物7在水中的浓度为0.6～1.0mg/mL。
10.如权利要求2-9任一所述的制备方法制备的一种肝靶向可视化比率检测次氯酸的聚合物荧光纳米探针在检测肝细胞中次氯酸中的应用。
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