CN111943923A - 一种香豆素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种香豆素衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和应用，涉及医药技术领域，一种香豆素衍生物，其结构式如式I所示：
Figure DDA0002642225090000011
本公开的香豆素衍生物经TYR催化氧化后可生成一种在445nm处有最大荧光发射信号的代谢产物。其酶促反应具有选择性好、灵敏度高、反应迅速、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

Description

一种香豆素衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)是人体内一类介导黑色素合成的代谢酶，与多种疾病的发病过程有关。该酶的功能减退或缺失时，会导致白癜风或白化病等色素合成障碍性皮肤病；相反，若该酶的表达量过多，又可因黑色素生成旺盛而出现雀斑、暗沉、黄褐斑、老年斑等色素沉着症状。TYR在动植物体也有分布，参与动植物机体的褐变过程。另外，近年来有研究发现，恶性黑色素瘤患者体内TYR的含量异常升高，提示肿瘤部位TYR活性的高低与肿瘤的恶性化程度存在一定的关联。综上所述，建立一种快速灵敏的TYR定量方法具有重要的理论意义和实用价值。
高效、廉价的TYR活性定量检测方法一直是生物医学研究者期望的。截至目前，已开发出的TYR定量方法有基于整个蛋白质结构特征或特异性肽段碎片特征的直接定量法，如酶联免疫吸附法等，以催化代谢产物生成速率表示的活性定量法，如色谱法、比色法和放射法等。前一类方法虽然特异性较好，但需要价格昂贵的抗体、肽段或专门的仪器，且制备样品的过程复杂耗时，更重要的是这类方法所测定的都是TYR总蛋白量而不是它的真实催化活性。后一类方法是以单位时间内TYR催化L-多巴或L-酪氨酸转化生成相应代谢产物的数量来反应其催化活性，是一种目前被广泛采用的定量方法。但由于其检测过程是基于反应生成的代谢产物在特定波长处的紫外吸收信号，所以存在两方面的问题，一是检测灵敏度不高，二是在进行复杂多组分体系的抑制剂或激活剂筛选实验时会存在较强的背景信号干扰，可能会在某种程度上对筛选结果的准确性造成不利影响。因此，开发一种基于新的检测机制的定量方法显得十分必要。与上述检测方法相比，特异性荧光探针可以专一并实时地反映目标酶的活性，并可高效评估多种体内外因素对酶活的影响，从而实现对人体特定功能蛋白实时定量监测的目的。上述问题是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供了一种香豆素衍生物及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种香豆素衍生物，其结构式如式I所示：
Figure BDA0002642225070000021
本发明的有益效果是：本发明提供了一种香豆素衍生物，其可以作为酪氨酸酶荧光探针底物，该香豆素衍生物经TYR催化氧化后可生成一种在445nm处有最大荧光发射信号的代谢产物。其酶促反应具有选择性好、灵敏度高、反应迅速、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。
本申请还提供了一种上述香豆素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二羟基苯乙酸、三乙胺和乙酸酐混合并加热至90～150℃进行反应，反应结束后提纯后得到中间产物；
S2、将所述中间产物和丙酮和稀盐酸混合，加热至60～110℃进行反应，反应结束后提纯得到所述香豆素衍生物。
本申请通过两步即可制备得到上述香豆素衍生物，合成工艺简单。
进一步的是，所述步骤S1中，反应时间为4～10h；所述步骤S2中，反应时间为3～8h。
进一步的是，所述步骤S1中，提纯包括步骤：
将反应液冷却至室温，然后中和至pH为7～8，使用有机溶剂萃取，随后减压除去溶剂，得到所述中间产物；
所述步骤S2中，提纯包括步骤：
将反应液倒入冰水浴中，过滤后洗涤得到粗产物，对所述粗产物进行纯化，得到所述香豆素衍生物。
进一步的是，
所述步骤S1中，所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛与所述3,4-二羟基苯乙酸的摩尔比为1:1～1:2；所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛与所述三乙胺的摩尔比为1:2～1:4，所述乙酸酐与所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛的质量比为5～100；
所述步骤S2中，所述中间产物在丙酮和稀盐酸混合液中的质量分数为1％～20％。
进一步的是，所述稀盐酸的浓度为2M，所述丙酮与所述稀盐酸的体积比为1:1～1:3。
本申请还提供了一种上述香豆素衍生物作为酪氨酸酶的荧光探针底物的应用，所述荧光探针底物用于以下应用中的至少一种：
用于检测酪氨酸酶；以及
用于筛选酪氨酸酶抑制剂；以及
定量评价酪氨酸酶抑制剂的抑制能力。
进一步的是，所述酪氨酸酶荧光探针底物用于检测酪氨酸酶时，荧光检测条件为：激发波长345nm，在375～600nm进行荧光发射谱的检测，其最大荧光发射波长为445nm。
进一步的是，其包括荧光探针储备液，所述荧光探针储备液包括荧光探针、溶剂、酪氨酸酶标准品以及缓冲液，
所述荧光探针为权利要求1所述的香豆素衍生物。
进一步的是，所述储备液中所述荧光探针的摩尔浓度为0.01～10mM；所述溶剂为甲醇、乙醇和二甲基亚砜中的至少一种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH＝5.5～10.5。
附图说明
图1为本申请公开的香豆素衍生物随TYR蛋白浓度增大的荧光谱图；
图2为本申请公开的香豆素衍生物随TYR蛋白浓度增大的标准曲线；
图3为本申请公开的香豆素衍生物代谢产物生成量与孵育时间的线性关系；
图4为本申请公开的香豆素衍生物与TYR反应前后荧光光谱扫描；
图5为本申请公开的香豆素衍生物的反应选择性筛选试验结果；
图6为TYR催化本申请公开的香豆素衍生物米氏动力学拟合；
图7为曲酸对TYR半数抑制浓度拟合结果；
图8为利用本申请公开的香豆素衍生物测定斑马鱼体内TYR的活性的结果；
图9为本申请公开的香豆素衍生物的1H-NMR谱图；
图10为本申请公开的香豆素衍生物的13C-NMR谱图；
图11为本申请公开的香豆素衍生物的高分辨质谱图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述公开了多种不同的实施所述的主题技术方案的实施方式或实施例。为简化公开内容，下面描述了各特征存在的一个或多个排列的具体实施例，但所举实施例不作为对本发明的限定,在说明书中随后记载的第一特征与第二特征连接，即可以包括直接联系的实施方式，也可以包括形成附加特征的实施方式，进一步的，也包括采用一个或多个其他介入特征使第一特征和第二特征彼此间接连接或结合，从而第一特征和第二特征可以不直接联系。
所应理解的是，本公开出现的以下名词或条件，均为本领域的专业技术名词，本领域技术人员可以毫无异议的确认下述名词的含义，为了便于理解，本公开对部分名词进行解释说明：
室温：25±5℃；
冰水：0℃的水；
TYR：酪氨酸酶；
Tris-HCl缓冲溶液：三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸的混合缓冲溶液。
在本申请公开的实施例中提供了一种香豆素衍生物，其结构式式I所示：
Figure BDA0002642225070000051
本申请还公开了上述香豆素衍生物的制备方法，其合成路线如下：
Figure BDA0002642225070000061
为了便于理解，本申请提供了以下几种具体的实施：
实施例1
上述香豆素衍生物通过以下步骤制备，具体的包括：
S1、将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(0.3g，2.0mmol)，3,4-二羟基苯乙酸(0.34g，2.0mmol)，三乙胺(0.4g，4.0mmol)和乙酸酐(5mL)置于50mL圆底烧瓶中，油浴加热至90℃，反应10h后将反应液冷却至室温，用NaHCO3溶液中和并用乙酸乙酯萃取，随后减压除去溶剂，其中，残留物作为中间产物。
S2、将上述中间产物添加到8mL丙酮与2M HCl的混合液(1:1，v/v)中，然后加热至60℃反应8h，反应结束后将该溶液倒入冰浴中，过滤并用冷水洗涤，得到粗产物，粗产物采用硅胶色谱法进行纯化，并采用乙酸乙酯和石油醚的混合液(1:2，v/v)进行洗脱，得到黄色固体，最终得到的产物产率为44％。
对得到的产物进行核磁分析，其结果如下：
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:9.15(s,1H),9.02(s,1H),8.04(s,1H),7.66(d,1H,J＝8.6Hz),7.19(d,1H,J＝2.1Hz),7.02-6.99(m,2H),6.95(dd,1H,J＝8.6Hz,J＝2.4Hz),6.79(d,1H,J＝8.2Hz),3.86(s,3H)；
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ:161.87,160.02,154.33,145.79,144.76,138.70,129.30,125.92,123.25,119.54,115.79,115.30,113.22,112.43,100.09,55.87。
ESI-HRMS(m/z)计算值:C16H13O5[M+H]+:285.0757,实测值:285.0746。
通过上述结果分析可证实，本申请结构式为：
Figure BDA0002642225070000071
实施例2
S1、将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(0.3g，2.0mmol)，3,4-二羟基苯乙酸(0.51g，3.0mmol)，三乙胺(0.6g，6.0mmol)和乙酸酐(5mL)置于50mL圆底烧瓶中，油浴加热至120℃，加热反应6h后，将反应液冷却至室温，用NaHCO3溶液中和并用乙酸乙酯萃取，随后减压除去溶剂。
S2、将残留物添加到9mL丙酮与2M HCl的混合液(1:2，v/v)中，然后加热80℃反应5h。将该溶液倒入冰浴中，过滤并用冷水洗涤。粗产物采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯和石油醚的混合液(1:2，v/v)进行洗脱，得到黄色固体。产率48％。
实施例3
S1、将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(0.3g，2.0mmol)，3,4-二羟基苯乙酸(0.68g，4.0mmol)，三乙胺(0.8g，8.0mmol)和乙酸酐(5mL)置于50mL圆底烧瓶中，油浴加热至150℃，加热反应4小时后，将反应液冷却至室温，用NaHCO3溶液中和并用乙酸乙酯萃取，随后减压除去溶剂。
S2、将残留物添加到8mL丙酮与2M HCl的混合液(1:3，v/v)中，然后加热100℃反应3小时。将该溶液倒入冰浴中，过滤并用冷水洗涤。粗产物采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯和石油醚的混合液(1:2，v/v)进行洗脱，得到黄色固体。产率40％。
本申请还公开了上述香豆素衍生物作为荧光探针底物应用的几种实施例，其可以用于测定TYP的酶活，还可以用于快速筛选TYR酶的抑制剂及抑制能力的定量评价方面的应用，该荧光探针底物的水解反应体系pH介于5.5～10.5之间；探针底物的浓度介于1/10～10米氏常数之间；孵育体系反应温度介于20～60℃之间，同时水解产物的转化率应介于0.1％～20％之间。
本申请具体的公开了以下实施例，为简化公开和便于理解，下述实施例中将实施例1制备的香豆素衍生物记为探针分子：
实施例4
TYR催化荧光探针底物反应的线性蛋白浓度确定：
准备代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲(40mM)和一系列蘑菇来源TYR(体系终浓度为0-2U/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
向体系中加入终浓度为10μM的探针分子起始反应；
30分钟后，加入等体积冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
进行荧光检测(激发波长345nm，发射波长扫描范围375-600nm)；通过计算445nm处荧光强度来确定TYR酶的线性蛋白浓度，其结果如图1和3所示。
通过图1和图2可以看出，本申请公开的香豆素衍生物的最大荧光发射波长在445nm，荧光强度随TYR的浓度增加而增加。
实施例5
代谢体系中探针分子的线性孵育反应时间：
准备代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(40mM)、蘑菇来源TYR(体系终浓度为2U/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
向体系中加入终浓度为10μM的探针分子起始反应；
每隔2分钟进行一次荧光扫描检测(激发波长345nm，发射波长445nm)；通过拟合445nm处的荧光强度与孵育时间，来计算TYR酶的线性反应时间，其结果如图3所示，并对孵育开始时(0min)和孵育结束时(60min)体系的荧光光谱进行了扫描(激发波长345nm，发射波长扫描范围375-600nm)其结果如图4所示。可见，随着反应时间的增加，荧光强度也随之增强。
实施例6
探针分子的反应选择性筛选试验：
准备代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(40mM)、蘑菇来源TYR(20U/ml)、Ca2+、HCO3-、Mg2+、Al3+、Cl-、牛血清白蛋白、脂肪酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及人血清白蛋白等，最终体系中离子浓度为100μM、TYR浓度为2U/ml、其他酶的浓度为10μg/ml，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
向体系中加入终浓度为10μM的探针分子起始反应；
30分钟后，加入等体积冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
进行荧光检测(激发波长345nm，发射波长扫描范围375-600nm)；计算各体系中荧光强度，结果如图5所示；可以见，本申请对酪氨酸酶表现出了高度的灵敏性和特异性。
实施例7
TYR催化探针分子代谢反应的米氏动力学：
准备代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(40mM)、蘑菇来源TYR(体系终浓度为2U/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
向反应体系中加入终浓度为1-200μM的多组探针分子起始反应；
15分钟后，加入等体积冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
进行荧光检测(激发波长345nm，发射波长445nm)；结果如图6所示，从而可以计算TYR酶的最大催化速率Vmax和米氏常数Km。
体外定量测定曲酸对TYR的抑制能力：
准备代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(40mM)、蘑菇来源TYR(体系终浓度为2U/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
向反应体系中加入终浓度为10-1000μM的曲酸，震荡5min后，加入终浓度为10μM的探针分子起始反应；
30分钟后，加入等体积冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
进行荧光检测(激发波长345nm，发射波长445nm)；计算曲酸对TYR酶的半数抑制浓度为17.85μM，其结果如图7所示。
实施例8
测定斑马鱼体内TYR的活性：
斑马鱼的麻醉与自身成像：称取2g乌来糖溶于盛有10mL纯化水的15mL离心管中配得20％乌来糖，再量取500μL 20％乌来糖加至盛有9500μL NaCl溶液的15ml离心管中稀释得1％乌来糖，该浓度下斑马鱼30s以内腮动停止，血液循环正常，无组织破坏现象。
斑马鱼探针孵育成像：分为准备对照组(NaCl组，无抑制剂)，曲酸组和探针反应组。实验过程分三步进行，第一步，用一次性吸管吸取4-5尾幼鱼移入NaCl组和已配好的并预热的500μM曲酸，各组操作过程间隔依序进行，体系体积保持一致，28℃水浴孵育30min；第二步，用吸管将各组幼鱼分别转移至等体积的已配好并预热的含有10μM本申请香豆素衍生物的探针体系中，28℃水浴孵育30min；第三步，吸取完成探针孵育的各组幼鱼至NaCl溶液中清洗2次并转移至盛有1％乌来糖麻醉剂的玻璃底培养皿中，待麻醉后至荧光显微镜下观察明场及荧光成像并叠加处理，对比三组荧光强弱。
结果如图8所示，在Andor Zyla sCMOS相机和5倍镜头的荧光显微镜的视野中，(a)对照组中，没有被探针分子染色的斑马鱼自身几乎不显示荧光，(b)探针分子染色的斑马鱼中有明显的荧光，(c)探针分子染色的曲酸预孵育的斑马鱼有荧光，但强于(a)组且弱于(b)组。在斑马鱼体内加入探针分子后有明显荧光，加曲酸抑制剂后，荧光强度明显减弱，结果证明本公开的香豆素衍生物可以作为酪氨酸酶的特异性荧光探针底物，为用作实时成像细胞内酪氨酸酶活性的可视化工具提供了可能。
本申请公开的实施例中还提供了一种酪氨酸酶检测试剂盒。
该酪氨酸酶检测试剂盒由以下成分组成：酪氨酸酶标准品、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、乙腈以及的荧光探针，该荧光探针为本申请实施例1制备的香豆素衍生物，其中，荧光探针的摩尔浓度可以是0.01mM、5mM或10mM。
将试剂盒中的二甲基亚砜加入探针分子中，充分振摇溶解，溶液为荧光探针储备液，储备液需放置在-20℃以下进行冷冻储存备用。
将试剂盒中的磷酸盐缓冲液加入酪氨酸酶标准品中，充分振摇溶解，溶液为酪氨酸酶标准溶液，为保证酶的活性，标准溶液需现用现配。
本发明试剂盒检测酪氨酸酶具体按照以下步骤进行：
标准曲线的制备：
取上述酪氨酸酶标准溶液，分别加入至磷酸盐缓冲液中，配成酪氨酸酶标准溶液浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0U/mL的系列反应液。
加入探针储备液，于37℃条件下震荡孵育30分钟后，加入等体积冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应。
进行荧光检测(激发波长为345nm，发射波长扫描范围375-600nm)；通过计算445nm处荧光强度，以荧光强度为纵坐标，酪氨酸酶蛋白浓度作为横坐标，绘制标准曲线。
未知样品中酪氨酸酶含量的测定：
将标准曲线制备中的酪氨酸酶标准溶液替换成待检测的未知样品，采取同样的操作步骤进行反应与荧光强度记录。将记录得到445nm处的荧光强度F代入建立好的标准曲线中，即可计算得到该样品中酪氨酸酶的含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种香豆素衍生物，其特征在于，其结构式如式I所示：
Figure FDA0002642225060000011
2.一种如权利要求1所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二羟基苯乙酸、三乙胺于乙酸酐中混合并加热至90～150℃进行反应，反应结束后提纯后得到中间产物；
S2、将所述中间产物和丙酮、稀盐酸混合，加热至60～110℃进行反应，反应结束后提纯得到所述香豆素衍生物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，反应时间为4～10h；所述步骤S2中，反应时间为3～8h。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述提纯步骤包括：
将反应液冷却至室温，然后中和至pH为7～8，使用有机溶剂萃取，随后减压除去溶剂，得到所述中间产物；
所述步骤S2中，所述提纯步骤包括：
将反应液倒入冰水浴中，过滤后洗涤得到粗产物，对所述粗产物进行纯化，得到所述香豆素衍生物。
5.如权利要求2至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛与所述3,4-二羟基苯乙酸的摩尔比为1:1～1:2；所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛与所述三乙胺的摩尔比为1:2～1:4，所述乙酸酐与所述2-羟基-4-甲氧基苯甲醛的质量比为5～100；
所述步骤S2中，所述中间产物在丙酮和稀盐酸混合液中的质量分数为1％～20％。
6.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述稀盐酸的浓度为2M，所述丙酮与所述稀盐酸的体积比为1:1～1:3。
7.一种如权利要求1所述的香豆素衍生物作为酪氨酸酶的荧光探针底物的应用，其特征在于，所述荧光探针底物用于以下应用中的至少一种：
用于检测酪氨酸酶；以及
用于筛选酪氨酸酶抑制剂；以及
定量评价酪氨酸酶抑制剂的抑制能力。
8.一种如权利要求7所述的香豆素衍生物作为酪氨酸酶的荧光探针底物的应用，其特征在于，荧光检测条件为：激发波长345nm，在375～600nm进行荧光发射谱的检测，最大荧光发射波长为445nm。
9.一种酪氨酸酶检测试剂盒，其特征在于，其包括荧光探针储备液，所述荧光探针储备液包括荧光探针、溶剂、酪氨酸酶标准品以及缓冲液，
所述荧光探针为权利要求1所述的香豆素衍生物。
10.如权利要求6所述酪氨酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述储备液中所述荧光探针的摩尔浓度为0.01～10mM；所述溶剂为甲醇、乙醇和二甲基亚砜中的至少一种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH＝5.5～10.5。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114516850A (zh) * 2022-03-04 2022-05-20 武汉工程大学 一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031014A (zh) * 2013-03-08 2014-09-10 华中师范大学 香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒
CN107235946A (zh) * 2017-06-20 2017-10-10 济南大学 一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用
EP3553054A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-16 Universidade de Évora Fluorescent coumarin compounds and method of synthesis thereof
CN110894193A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 南京大学 一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031014A (zh) * 2013-03-08 2014-09-10 华中师范大学 香豆素衍生物及其制备方法以及弹性蛋白酶活性检测方法和检测试剂盒
CN107235946A (zh) * 2017-06-20 2017-10-10 济南大学 一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用
EP3553054A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-16 Universidade de Évora Fluorescent coumarin compounds and method of synthesis thereof
CN110894193A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 南京大学 一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CIHAN GUNDUZ等: "The synthesis and fluorescence properties of novel chromenone-crown ethers", 《SUPRAMOLECULAR CHEMISTRY》 *
LI, HONGQI等: "Coumarin-based multifunctional chemosensor for arginine/lysine and Cu2+/Al3+ ions and its Cu2+ complex as colorimetric and fluorescent sensor for biothiols", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICA》 *
M. J. MATOS等: "Design and discovery of tyrosinase inhibitors based on a coumarin scaffold", 《RSC ADV.》 *
UMEZAWA, NAOKI等: "Selective recognition and detection of biomacromolecules utilizing chemical property of amino acid or peptide", 《YAKUGAKU ZASSHI》 *
张方可 等: "一种基于香豆素衍生物的酪氨酸酶荧光探针", 《分析实验室》 *
盛筱 等: "香豆素类近红外荧光染料应用研究进展", 《济宁医学院学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114516850A (zh) * 2022-03-04 2022-05-20 武汉工程大学 一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用
CN114516850B (zh) * 2022-03-04 2023-10-13 武汉工程大学 一种检测酪氨酸酶荧光探针及其制备方法和应用

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