CN106814055A - 二肽肽酶i体外微量快速检测方法 - Google Patents

二肽肽酶i体外微量快速检测方法 Download PDF

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Abstract

二肽肽酶I(dipeptidyl peptidase,DPPI)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，高表达于免疫系统的颗粒细胞包括肥大细胞、中性粒细胞、粘膜T淋巴细胞。二肽肽酶I的释放和颗粒细胞的激活有关，而颗粒细胞的激活和一些炎症、自身免疫性疾病的发生有关。本发明是基于二肽肽酶I与其专属性底物相互作用后释放自由三氟甲基香豆素的原理，建立了一个二肽肽酶I活性检测的纸层析系统，纸层析结果表明二肽肽酶I的浓度和荧光强度正相关(图A)，可以作为一个体外微量快速检测的便携式新方法(图B)。本发明适用于人、大鼠和颗粒细胞的研究，特点是微量，无需血清制备，分析耗时短，易操作。

Description

二肽肽酶I体外微量快速检测方法
技术领域
本发明涉及到血液二肽肽酶I活性表达的体外快速检测方法
背景技术
二肽肽酶I(dipeptidyl peptidase,DPPI)是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶，又称组织蛋白酶C)，具有肽链外切酶的活性，高表达于人体免疫系统颗粒免疫细胞，包括肥大细胞、中性粒细胞和粘膜T细胞，是丝氨酸炎症蛋白酶原的专属激活酶。在炎症、细胞外基质重构和组织微环境的稳态维持起到重要作用。DPPI血液中的表达和活性和一些特定的病理生理状态相关，所以DPPI检测方法的建立，无论是实验室还是医院临床都有着重要意义。
现有的测定DPPI的方法为ELISA法或者WESTEN BLOTTING法，耗时长且耗资高，而结果只能说明样品中有或无DPPI蛋白质的存在但无法表明DPPI酶活性功能的存在和变化。我们前期发明的荧光仪高通量方法检测血清中DPPI的活性已经能够表明样品中DPPI酶活性的存在和变化，但问题一是制备血清过程长，病人血的用量大；二是实验仪器昂贵，属于大型分析仪器，保养维护昂贵复杂；三是单个样品检测成本较高，不能实现现场检测。所以，建立简单易行耗时耗资少的DPPI活性表达的检测的方法对与免疫颗粒细胞相关的疾病研究和DPPI的活性检测，包括类风湿疾病的早期诊断都有着重要的意义。
本发明的反应原理是：DPPI与其专属性底物相互作用后释放自由的三氟甲基香豆素产物，而自由的三氟甲基香豆素产物产生荧光，在紫外灯下可见。本发明是基于我们自己前期使用大型荧光仪器设备的研究结果，进一步转化为纸层析系统的快速检测手段。本发明不但改善了上述使用荧光仪器设备高通量方法的三个问题，并建立了一个体外快速检测的新方法。本发明用XYZ1601纸层析的方法检测血液中DPPI的活性表达水平，特点是鲜血微量(0.5-1微升)，无需血清制备，分析耗时短，易操作，可用于现场测定。
本发明使用了human recombinant DPPI(hrDPPI)作为预测试对象首先建立测定系统，然后用hrDPPI作为系统阳性对照，测定人血液或大鼠中的DPPI活性表达水平，同时用荧光仪测定作为纸层析的结果确认。
研究表明，类风湿疾病的发生和发展和免疫颗粒细胞的激活相关(EklundKK.Mast cells in the pathogenesis of rheumatic diseases and as potentialtargets for anti-rheumatic therapy.Immunological Reviews.2007,217(1):38-52.和Wright H L.The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis[J].Nature Reviews Rheumatology,2014,10(10):593-601.)，DPPI来源于颗粒细胞，包括肥大细胞，中性粒细胞，粘膜T淋巴细胞，并和这类细胞的激活有关，所以，DPPI的检测代表了体内免疫系统中颗粒细胞的激活。我们前期的研究(X.Zhou,et al.,Serum basedfluorescent assay for evaluating dipeptidyl peptidase I activity in collageninducedarthritis rat model,Molecular and Cellular Probes(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.mcp.2016.10.009和X.Zhou,et al.Activation of mast cellsand their subsets in the synovium in osteoarthritis(OA)and rheumatoidarthritis(RA).Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010；125(2),S178.)也表明了DPPI与类风湿关节炎的炎症发展有关。本研究将本发明的检测方法应用在类风湿的大鼠模型中，以进一步确认本发明的准确性。
牛II型胶原作为抗原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型具有人类疾病的许多病理特征，例如炎症，自身免疫，关节炎和骨侵蚀，一直以来都是实验室广泛接受的研究类风湿关节炎的模型。我们前期的研究使用了自行合成的荧光探针XYZ1601以及荧光仪(Ex400nm/Em492nm)测定，发现DPPI在胶原诱导的类风湿关节炎大鼠的血液、关节滑膜和骨髓中均有高表达，并和类风湿的发病程度呈相关性。我们又用了本发明的XYZ1601纸层析方法检测CIA大鼠血液中DPPI的活性，结果表明，本发明的检测结果和荧光仪的检测结果一致。
发明内容
1.发明内容简述：
首先我们合成了基于香豆素的荧光探针XYZ1601，探针包含香豆素染料和特异性多肽，以在初始状态下产生“关闭”荧光信号。血液样品中高表达的DPPI激活荧光探针XYZ1601，释放出游离三氟甲基香豆素，其导致“开启”荧光信号。DPPI与荧光探针XYZ1601反应后释放出的自由三氟甲基香豆素浓度和其荧光强度相关。
同时我们的发明提供了利用纸层析检测血液中DPPI活性的方法，成为一项体外快速检测的手段。血液中的DPPI和XYZ1601相互作用，经过孵育和纸层析分离后，反应产物在紫外灯下释放出的荧光，观察Rf定值(0.62-0.66)区间的样品点荧光亮度的强弱和面积大小。
2.发明技术方案
2.1.荧光探针XYZ1601
本发明提供了以7-氨基-4-三氟甲基香豆素与BOC-苯丙氨酸通过生成酰胺的方法获得BOC-苯丙氨酸-三氟甲基香豆，在三氟乙酸的条件下脱去BOC保护，再与BOC-甘氨酸反应，生成BOC甘氨酸-苯丙氨酸-三氟甲基香豆素，最后脱去BOC得到XYZ1601的方法。合成路线如下。
上述合成路线的具体步骤是：
a.中间产物化合物3的合成：以7-氨基-4-三氟甲基香豆素，BOC-苯丙氨酸为原料，将溶液倒入水中，乙酸乙酯萃取。然后有机层用NaHCO3水溶液洗涤，Na2SO4干燥，低压旋蒸，残余物通过硅胶柱分离提纯(DCM/石油醚)纯化，得到化合物3。
b.中间产物化合物4的合成：
将化合物3在TFA/DCM(1:1)中的溶液在室温下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩，得到游离胺的盐酸盐，然后用饱和碳酸氢钠溶液，盐水洗涤三次，并用Na2SO4干燥。将有机粗产物通过硅胶柱(DCM)纯化，得到化合物4。
c.向化合物4和Boc-甘氨酸的无水DMF溶液中加入DIPEA，HBTU和EDCI。反应溶液氮气保护搅拌过夜。将残余物溶于乙酸乙酯中，有机层依次用10％柠檬酸水溶液，水，10％碳酸钾水溶液和盐水洗涤，Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩。粗产物通过硅胶柱(环己烷/EA)纯化，得到中间产物化合物5。
d.将化合物5在5mL的4M盐酸的乙酸乙酯溶液中室温下搅拌4小时。将反应混合物真空浓缩，得到游离胺的盐酸盐，为黄色油状物。然后将有机层用饱和NaHCO3水溶液，盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。过滤并减压旋蒸后，将粗产物通过硅胶柱色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到荧光探针XYZ1601，并经质谱和核磁表征分析，其结构得以确认，其在Ex400nm处有激发和在Em492nm处有发射。
2.2.纸层析法
材料：纸层析用滤纸，展开剂石油醚-二氯甲烷，点样毛细吸管。
过程：现场取静脉新鲜血液(人鲜血或大鼠鲜血)微量与0.5mM的XYZ1601溶液混合孵育10-20分钟。
用毛细吸管吸取混合样液于层析点样，样点的直径在0.5cm-1cm。
置于容器中，展开剂为石油醚-二氯甲烷，样品分离，当展开剂至纸层析条前沿(约10分钟)，取出纸层析条，风干；置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm，层析纸上出现黄绿色的亮斑，计算其移动速度Rf值以示二肽肽酶I的活性表达。
Rf值(比移值)的计算公式：斑点中心距原点的距离/溶剂展开前沿距原点距离的比值。
3.本发明的优点：
3.1.特异性强，方法和设备简单便携，检测时间短，检测成本低，便于操作；
3.2.现场采血，不用分离血红蛋白，不用血清制备，可用于个体基础值的确定和快速现场检测。
附图说明
图1.产品装置设计示意图
图1A为本发明XYZ1601纸层析检测结果；图1B为本发明装置设计示意图，该装置主要分为三部分，点样槽，显示槽和条形码/样品名的标记，其长度和宽度视样品数量而设置。
图2.XYZ1601底物检测DPPI活性和DPPI抑制剂的抑制作用(动力学曲线)
如图所示hrDPPI与底物XYZ1601相互作用后，释放出游离香豆素导致荧光强度迅速增加。在hrDPPI在5分钟之后被加入DPPI抑制剂Gly-Phe-CHN2后(深色动力学曲线)，荧光强度被抑制；而没有加入抑制剂的hrDPPI继续和底物作用(浅色动力学曲线)，荧光强度继续增强。
图3.XYZ1601纸层析DPPI活性检测结果的灰度分析和荧光仪检测DPPI活性的确认
A.XYZ1601纸层析检测结果，即对外加不同浓度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)用XYZ1601纸层析法检测DPPI活性，结果表明荧光强度和DPPI浓度成正相关；B.纸层析法检测结果的灰度值分析(分析软件ImageJ2x)；C.hrDPPI与XYZ1601的酶反应动力学；D.对外加不同浓度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)用荧光仪(Ex400nm/Em492nm)检测以确认本发明XYZ1601纸层析法的检测结果，荧光仪(Ex400nm/Em492nm)的检测结果表明和XYZ1601纸层析法的检测结果一致。
图4.XYZ1601纸层析检测检测人血DPPI活性
图4A.DPPI高表达的人血液，在其基础值、发病和给药后血液中DPPI的纸层析活性检测。由图可以看出正常情况(基础值)下血液DPPI的活性表达较低，发病之时DPPI的活性表达升高，服药之后DPPI的表达降低，而且基本达到其基础值水平。图4B.纸层析法检测结果的灰度值分析。
图5.血液背景干扰的分析和XYZ1601纸层析检测方法有效性的确认
正常人(A和B)血液以及在等量血液中外加hrDPPI(不同浓度)之后的纸层析法DPPI活性检测。(-)表示正常血液，(+)表示等量正常血液中外加hrDPPI。从图5A可以看出，外加DPPI血液的荧光强度比未加的要强。表明本检测方法无背景干扰，荧光仪分析结果给予确认。
正常人血液中外加不同浓度的hrDPPI之后的纸层析法DPPI活性检测。图5B依次表示正常血液，外加0、1、10mU/mL的hrDPPI之后进行纸层析法DPPI活性检测的结果。从图可以看出，随着hrDPPI在血液中的浓度增大，荧光亮度也依次变强，表明本检测方法的有效性。图5C表示纸层析法检测结果的灰度值分析。
图6.XYZ1601纸层析检测检测类风湿RA大鼠(CIA)免疫后新鲜血液中DPPI的活性
如图6A所示，与健康大鼠相比，RA大鼠新鲜血液中DPPI的活性表达水平有显著性提高和持续性表达。免疫后连续观察健康大鼠和RA大鼠，并采血进行纸层析法分析和荧光仪法(Ex400nm/Em492nm)平行确认。免疫后分别在d2，d6，d12，d13取血进行DPPI纸层析检测。由图可以看出RA大鼠的急性炎症过程中的DPPI荧光强度的变化，在免疫后第6天的血液中，荧光强度和斑点达到最大值(说明：黑白灰颜色体系中间反光部分为超高值)。纸层析法的结果与荧光仪测定的结果一致(见图7)。图6B表示纸层析法检测结果的灰度值分析。图7.荧光仪(Ex400nm/Em492nm)检测CIA大鼠免疫前后新鲜血液中DPPI活性变化
免疫之后CIA大鼠新鲜血液中DPPI的活性表达水平较正常组有显著性提高和持续性表达，d6天达到最高，此结果确认了纸层析的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明工作程序进一步说明。
实施例1：人的血液纸层析检测、血液背景干扰以及检测有效性确认
1).二肽肽酶I高表达血样：
实验对象为DPPI高表达的人，采血于正常情况、发病服药之前和服药之后。吸取手指鲜血一滴，加入XYZ1601，37℃孵育10-20分钟，在纸层析用滤纸条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm。将点样后的滤纸在展开剂中展开，展开剂接近纸层析条前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长同上。层析纸上展开的亮斑，即为DPPI和XYZ1601反应后释放出的荧光样品点。原点至层析斑点距离2.8cm，原点至溶剂前沿距离5cm，计算Rf值0.65(图4)。同时用荧光仪(PerkinElmer)作平行检测以确认结果。
2).二肽肽酶I血样干扰测定：
实验对象为正常人(低表达)，分别吸取每个人的手指鲜血一滴。血液分别置于两个孔中，其中一个加入1μL的缓冲液，另一个加入1μL的500mU/ml的hrDPPI，然后分别加入XYZ1601，37℃，孵育10-20分钟，在纸层析条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm。将点样后的滤纸在展开剂中展开，接近纸层析条前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，波长同上，层析纸上黄绿色的亮斑，为即为DPPI和XYZ1601反应后释放出的荧光样品点，其强度不受血液背景干扰。原点至层析斑点距离3.3cm，原点至溶剂前沿距离5cm，计算Rf值0.66(图5A)。同时用荧光仪(Perkin Elmer)作平行检测以确认结果。
3).检测有效性确认：
实验对象为正常人，分别吸取一个人的手指鲜血一滴，置于三个孔中，分别加入1μL不同浓度的hrDPPI(0、1、10mU/mL)，然后加入3μL的0.5mM的XYZ1601，37℃，孵育10-20分钟，在纸层析条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm。将点样后的滤纸在展开剂中展开，接近纸层析条前沿时取出，风干，置于紫外灯下观察，波长同上，观察层析纸上黄绿色的亮斑，即为DPPI和XYZ1601反应释放出的荧光样品点，其荧光强度和hrDPPI浓度成正相关性。原点至层析斑点距离3.1cm，原点至溶剂前沿距离5cm，计算Rf值0.62(图5B)。同时用荧光仪(Perkin Elmer)作平行检测以确认结果。
实施例2：大鼠胶原诱导的类风湿关节炎(CIA)模型，纸层析检测大鼠新鲜血液中DPPI的活性。
大鼠眼眶取1μl新鲜血液，分别加入1.65μL的XYZ1601，37℃孵育10-20分钟，在纸层析用滤纸条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm。将点样后的滤纸在展开剂中展开，展开剂前段接近纸层析条前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm。层析纸上展开的亮斑，即为DPPI和XYZ1601反应释放出的荧光样品点。原点至层析斑点距离2.8cm，原点至溶剂前沿距离5cm，计算Rf值0.50(图6)。同时用荧光仪(PerkinElmer)作平行检测以确认结果(图7)。
本发明中所采用的纸层析是用滤纸为固定相支持物的纸层析分析，有机溶剂作为流动相，有机相流经层析纸时，荧光反应产物的分配系数区别于XYZ1601，因而扩散速度不同，近而达到分离的目的。本发明对人和CIA大鼠的新鲜血液进行DPPI的纸层析的分析检测，检测结果表明：a.血液中外加hrDPPI的活性无血液背景干扰，并和加入的hrDPPI浓度呈正相关，并且纸层析检测结果和荧光仪检测结果一致；b.人鲜血中DPPI活性的表达和给药前后相关；c.CIA大鼠血液中DPPI水平和大鼠的炎症发展一致，而且纸层析的检测结果与荧光仪检测的结果也一致。本发明的有益效果是简单快速微量，省时省钱省材，重要的是填补了现行检测DPPI方法的不足。

Claims (2)

1.一种涉及到血液二肽肽酶I活性表达的体外快速检测方法，特征在于用于纸层析法进行检测，步骤如下：
A.准备工作：
底物XYZ1601的制备：以7-氨基-4-三氟甲基香豆素与BOC-苯丙氨酸通过生成酰胺的方法获得BOC-苯丙氨酸-三氟甲基香豆，在三氟乙酸的条件下脱去BOC保护，再与BOC-甘氨酸反应，生成BOC-甘氨酸-苯丙氨酸-三氟甲基香豆素，最后脱去BOC得到XYZ1601的方法；
缓冲液的准备：XYZ1601--DPPI专属底物0.5mM溶于缓冲液(25mM柠檬酸,10mM氯化钠，pH 6.0)；
样液的准备：rhDPPI溶液、人鲜血和CIA大鼠眼眶取新鲜血液1μL，加入1.65μL的XYZ1601，37℃孵育10-20分钟；
展开剂准备：石油醚和二氯甲烷，比例为2:1配制成展开液；
B.点样和层析：在纸层析用滤纸条的一端点加样品溶液，样品间距2.0cm，将点样后的滤纸在展开剂中展开；
C.观察：展开剂前段接近纸层析条前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm；
D.DPPI活性的确认：测量原点至层析斑点距离，原点至溶剂前沿距离，计算Rf值，确认DPPI水解XYZ1601后释放的三氟甲基香豆素的位置，紫外灯下观察层析纸上黄绿色的亮斑大小和强弱，确定血液中DPPI的活性的大小。
2.如权利要求1所述血液中二肽肽酶I的活性表达的检测，其特征在于Rf值根据样品的特性而有变化，在人血Rf＝0.62-0.66，大鼠血Rf＝0.50的条件下，层析纸上黄绿色斑块的大小和强弱(紫外灯下)和血液样品中DPPI活性表达的大小呈正相关，本发明可以适用于人血，大鼠模型、人源及大鼠源的颗粒细胞模型。
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