JP3298824B2 - 白血球計数方法および白血球計数装置 - Google Patents
白血球計数方法および白血球計数装置Info
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、試料中の白血球数
を計数する方法およびそれに用いる装置に関する。
を計数する方法およびそれに用いる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液検査では血球計数がしばしば行わ
れ、その臨床的意義は大きい。例えば、赤血球の数で貧
血の有無や程度を調べることができ、また組織の酸素欠
乏による多彩な症状の診断も可能である。一方、白血球
は、体内に侵入した細菌やウイルスなどと戦う防御機
能、すなわち免疫機能の中心である。特に、顆粒球また
は白血球は、細菌や異物タンパク質が体内へ侵入する
と、その刺激によりエラスターゼ等のタンパク質分解酵
素を放出して作用する機能がある。白血球数は、多くの
疾患において増減が認められるため、その計数は、疾患
のスクリーニングにとって重要であり、緊急の判定や治
療を要する疾患においては特に重要な検査項目となって
いる。また、白血球数は、年齢、昼と夜、季節その他の
要因により変動するため、日常診療において適時正確に
計数することが望まれる。
れ、その臨床的意義は大きい。例えば、赤血球の数で貧
血の有無や程度を調べることができ、また組織の酸素欠
乏による多彩な症状の診断も可能である。一方、白血球
は、体内に侵入した細菌やウイルスなどと戦う防御機
能、すなわち免疫機能の中心である。特に、顆粒球また
は白血球は、細菌や異物タンパク質が体内へ侵入する
と、その刺激によりエラスターゼ等のタンパク質分解酵
素を放出して作用する機能がある。白血球数は、多くの
疾患において増減が認められるため、その計数は、疾患
のスクリーニングにとって重要であり、緊急の判定や治
療を要する疾患においては特に重要な検査項目となって
いる。また、白血球数は、年齢、昼と夜、季節その他の
要因により変動するため、日常診療において適時正確に
計数することが望まれる。
【０００３】現在、血球の計数方法には、大別して視算
法と自動化法がある。前記視算法は、計算盤上で鏡検し
て計数する方法であり、無処理で血球を計数する場合と
染色剤で血球細胞の核を染色して計数する場合がある。
前記自動化法は、血液を一定量に希釈後これを極細の流
路に通し、電気抵抗や散乱光で血球を検出して血球数を
計数する方法であり、通常、専用の血球計数装置によっ
て実施される。これらの計数方法は、人間の視覚による
か機械によるかの相違はあるが、実際に血球数を計数す
る方法である。しかし、これらの計数方法には、以下の
問題がある。
法と自動化法がある。前記視算法は、計算盤上で鏡検し
て計数する方法であり、無処理で血球を計数する場合と
染色剤で血球細胞の核を染色して計数する場合がある。
前記自動化法は、血液を一定量に希釈後これを極細の流
路に通し、電気抵抗や散乱光で血球を検出して血球数を
計数する方法であり、通常、専用の血球計数装置によっ
て実施される。これらの計数方法は、人間の視覚による
か機械によるかの相違はあるが、実際に血球数を計数す
る方法である。しかし、これらの計数方法には、以下の
問題がある。
【０００４】前記視算法では、赤血球の溶血不備や血球
の凝集による細胞誤認、計算盤内で不均一分散、測定者
の熟練度等により計数誤差を生ずる。また、視算法で
は、赤芽球など白血球以外の有核細胞も白血球として計
数されるので、白血球以外の有核細胞が末梢血に出てい
る場合は、塗末染色標本で白血球とそれ以外の細胞の比
率を調べて補正する必要がある。そして、視算法による
計数は、用手法であり、計数に時間がかかる。
の凝集による細胞誤認、計算盤内で不均一分散、測定者
の熟練度等により計数誤差を生ずる。また、視算法で
は、赤芽球など白血球以外の有核細胞も白血球として計
数されるので、白血球以外の有核細胞が末梢血に出てい
る場合は、塗末染色標本で白血球とそれ以外の細胞の比
率を調べて補正する必要がある。そして、視算法による
計数は、用手法であり、計数に時間がかかる。
【０００５】前記自動化法は、赤芽球の出現、フィブリ
ンの析出、血小板凝集、赤血球の溶血不良などの原因
で、正しい計数値が得られないことがある。また、測定
装置の種類によっては、粒度分布測定機能やパターン認
識により計数結果を分類できるものもあり、これを使用
すれば疾患を発見し易いが、このような装置は高額でし
かも大型である。このような特別な装置に限らず、前記
自動化法に用いる血球計数装置は、大型かつ高価であ
り、また複雑な液体流路の洗浄などのメンテナンスが煩
雑であり、大病院検査室や検査センターなど大量検体を
処理する施設には有効であるが、処理検体が少ない中小
病院や開業医等には大きな負担となる。
ンの析出、血小板凝集、赤血球の溶血不良などの原因
で、正しい計数値が得られないことがある。また、測定
装置の種類によっては、粒度分布測定機能やパターン認
識により計数結果を分類できるものもあり、これを使用
すれば疾患を発見し易いが、このような装置は高額でし
かも大型である。このような特別な装置に限らず、前記
自動化法に用いる血球計数装置は、大型かつ高価であ
り、また複雑な液体流路の洗浄などのメンテナンスが煩
雑であり、大病院検査室や検査センターなど大量検体を
処理する施設には有効であるが、処理検体が少ない中小
病院や開業医等には大きな負担となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、用いる装置が小型となり、正確かつ簡単にしかも低
コストで白血球を計数できる方法およびそれに用いる計
数装置を提供することである。
は、用いる装置が小型となり、正確かつ簡単にしかも低
コストで白血球を計数できる方法およびそれに用いる計
数装置を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の白血球計数方法は、試料中の白血球のう
ち、好中球、好酸球および好塩基球（以下、これらの血
球を「顆粒球」という）内部のエラスターゼを放出さ
せ、このエラスターゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添
加し、前記エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスター
ゼ抗体を測定することにより前記エラスターゼ濃度を測
定し、この濃度から、白血球数、顆粒球数または好中球
数とエラスターゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料
中の白血球数を算出する。
に、本発明の白血球計数方法は、試料中の白血球のう
ち、好中球、好酸球および好塩基球（以下、これらの血
球を「顆粒球」という）内部のエラスターゼを放出さ
せ、このエラスターゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添
加し、前記エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスター
ゼ抗体を測定することにより前記エラスターゼ濃度を測
定し、この濃度から、白血球数、顆粒球数または好中球
数とエラスターゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料
中の白血球数を算出する。
【０００８】このように、本発明の計数方法は、実際に
白血球数を計数するのではなく、顆粒球内部にあるエラ
スターゼ濃度を測定することにより間接的に白血球数を
算出する方法である。
白血球数を計数するのではなく、顆粒球内部にあるエラ
スターゼ濃度を測定することにより間接的に白血球数を
算出する方法である。
【０００９】白血球には、好中球・好酸球・好塩基球・
単球・リンパ球の５種類があり、前記好中球・好酸球・
好塩基球の３者を合わせて顆粒球という。そして、血液
中における白血球の数と各分画の比率は、小児と老人で
若干分画が異なるものの、性差は認められず、ほぼ一定
である。例えば、成人において、血液中の白血球数は約
６７００個／μｌであり、その分画の平均比率は、好中
球５５．３％、好酸球３．５％、好塩基球０．５％、単
球５．０％、リンパ球３６．６％である。また、顆粒球
は、白血球のなかで最も多く、その内部にはエラスター
ゼが多量に存在する。顆粒球エラスターゼは、顆粒球が
食細胞や炎症の刺激あるいは損傷を受けると放出される
もので、これにより病変に対応する。血中において、前
記エラスターゼは、α１−アンチトリプシン等のプロテ
アーゼインヒビターと結合して不活性化された状態で存
在し、その平均対流時間は約１０時間程度であり、組織
や尿中にいったん排出されると再度循環血中にもどらな
い。また、血しょう中のエラスターゼ濃度は、通常、顆
粒球中濃度の数百分の１程度であり、ほとんど無視でき
る。さらに、顆粒球エラスターゼは、膵臓由来のエラス
ターゼとは異なるもので、その抗体も膵臓由来エラスタ
ーゼと全く交差反応しない。本発明は、これらのことを
利用している。すなわち、顆粒球を溶血させ、その内部
のエラスターゼを放出させてその濃度を免疫学的手法に
より測定すれば、試料が血液であってもその濃度を正確
に測定することができ、この値から、白血球数等とエラ
スターゼ濃度との既知の割合を用い試料中の白血球数を
算出することができる。このように、顆粒球内部のエラ
スターゼ濃度により白血球数を計数するから、赤芽球等
の白血球以外の有核細胞、フィブリンの析出、血小板の
凝集、赤血球の溶血不良の影響を受けず、また用いる装
置も小型化することができ、計数にかかるコストも低減
でき、さらに免疫学的手法を用いるため測定者の熟練度
も影響がない。
単球・リンパ球の５種類があり、前記好中球・好酸球・
好塩基球の３者を合わせて顆粒球という。そして、血液
中における白血球の数と各分画の比率は、小児と老人で
若干分画が異なるものの、性差は認められず、ほぼ一定
である。例えば、成人において、血液中の白血球数は約
６７００個／μｌであり、その分画の平均比率は、好中
球５５．３％、好酸球３．５％、好塩基球０．５％、単
球５．０％、リンパ球３６．６％である。また、顆粒球
は、白血球のなかで最も多く、その内部にはエラスター
ゼが多量に存在する。顆粒球エラスターゼは、顆粒球が
食細胞や炎症の刺激あるいは損傷を受けると放出される
もので、これにより病変に対応する。血中において、前
記エラスターゼは、α１−アンチトリプシン等のプロテ
アーゼインヒビターと結合して不活性化された状態で存
在し、その平均対流時間は約１０時間程度であり、組織
や尿中にいったん排出されると再度循環血中にもどらな
い。また、血しょう中のエラスターゼ濃度は、通常、顆
粒球中濃度の数百分の１程度であり、ほとんど無視でき
る。さらに、顆粒球エラスターゼは、膵臓由来のエラス
ターゼとは異なるもので、その抗体も膵臓由来エラスタ
ーゼと全く交差反応しない。本発明は、これらのことを
利用している。すなわち、顆粒球を溶血させ、その内部
のエラスターゼを放出させてその濃度を免疫学的手法に
より測定すれば、試料が血液であってもその濃度を正確
に測定することができ、この値から、白血球数等とエラ
スターゼ濃度との既知の割合を用い試料中の白血球数を
算出することができる。このように、顆粒球内部のエラ
スターゼ濃度により白血球数を計数するから、赤芽球等
の白血球以外の有核細胞、フィブリンの析出、血小板の
凝集、赤血球の溶血不良の影響を受けず、また用いる装
置も小型化することができ、計数にかかるコストも低減
でき、さらに免疫学的手法を用いるため測定者の熟練度
も影響がない。
【００１０】なお、本発明において、白血球とは、好中
球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球の個々の白血球
および全白血球の双方を意味する。したがって、本発明
において計数されるのは、好中球、好酸球および好塩基
球等の３者を合わせた顆粒球等の白血球を構成する各血
球数でもよいし、全白血球数でもよい。
球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球の個々の白血球
および全白血球の双方を意味する。したがって、本発明
において計数されるのは、好中球、好酸球および好塩基
球等の３者を合わせた顆粒球等の白血球を構成する各血
球数でもよいし、全白血球数でもよい。
【００１１】本発明において、放出されたエラスターゼ
に、試料中に存在するプロテアーゼインヒビターと同一
のプロテアーゼインヒビターを結合させた後、前記試料
に抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加することが好まし
い。血液等の試料中にプロテアーゼインヒビターがある
場合、この影響を排除できるからである。したがって、
試料が全血である場合は、プロテアーゼインヒビター
は、α１−アンチトリプシンであることが好ましい。α
１−アンチトリプシンは、血液中のプロテアーゼインヒ
ビターの中で最も量が多い（約９０％）からである。
に、試料中に存在するプロテアーゼインヒビターと同一
のプロテアーゼインヒビターを結合させた後、前記試料
に抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加することが好まし
い。血液等の試料中にプロテアーゼインヒビターがある
場合、この影響を排除できるからである。したがって、
試料が全血である場合は、プロテアーゼインヒビター
は、α１−アンチトリプシンであることが好ましい。α
１−アンチトリプシンは、血液中のプロテアーゼインヒ
ビターの中で最も量が多い（約９０％）からである。
【００１２】本発明の計数方法において、免疫学的手法
としては、ラテックス凝集免疫測定法を採用することが
好ましい。すなわち、抗顆粒球エラスターゼ抗体をラテ
ックス粒子に結合させた抗体粒子を、顆粒球から放出さ
れたエラスターゼと抗原抗体反応させ、前記ラテックス
粒子の凝集程度を測定することにより、前記エラスター
ゼに結合した前記抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定する
ことが好ましい。ラテックス凝集免疫測定法は、抗原抗
体反応が速く、しかもＢ／Ｆ分離が不要なホモジニアス
イムノアッセイであるため、工数が少なく簡単でしかも
低コストで実施できるからである。この他に、放出され
たエラスターゼを、固相に結合した抗顆粒球エラスター
ゼ抗体に結合させ、この状態で標識化抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を添加し、前記エラスターゼに結合した前記標
識化抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定してもよい。前記
標識の相違により、酵素免疫法、放射免疫法、蛍光免疫
法などの免疫学的手法がある。
としては、ラテックス凝集免疫測定法を採用することが
好ましい。すなわち、抗顆粒球エラスターゼ抗体をラテ
ックス粒子に結合させた抗体粒子を、顆粒球から放出さ
れたエラスターゼと抗原抗体反応させ、前記ラテックス
粒子の凝集程度を測定することにより、前記エラスター
ゼに結合した前記抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定する
ことが好ましい。ラテックス凝集免疫測定法は、抗原抗
体反応が速く、しかもＢ／Ｆ分離が不要なホモジニアス
イムノアッセイであるため、工数が少なく簡単でしかも
低コストで実施できるからである。この他に、放出され
たエラスターゼを、固相に結合した抗顆粒球エラスター
ゼ抗体に結合させ、この状態で標識化抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を添加し、前記エラスターゼに結合した前記標
識化抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定してもよい。前記
標識の相違により、酵素免疫法、放射免疫法、蛍光免疫
法などの免疫学的手法がある。
【００１３】本発明の計数方法において、既知の割合
は、例えば、つぎの第一の割合または第二の割合を使用
することが好ましい。
は、例えば、つぎの第一の割合または第二の割合を使用
することが好ましい。
【００１４】前記第一の割合は、白血球数または顆粒球
数とエラスターゼ濃度との統計的な割合である。この統
計的な割合は、例えば、血液などの試料中のエラスター
ゼ濃度と白血球数等とを別個に測定し、両者の値から求
められる回帰式等がある。前記回帰式は、例えば、エラ
スターゼ濃度と顆粒球数との回帰直線式、エラスターゼ
濃度と全白血球数との回帰直線式等がある。
数とエラスターゼ濃度との統計的な割合である。この統
計的な割合は、例えば、血液などの試料中のエラスター
ゼ濃度と白血球数等とを別個に測定し、両者の値から求
められる回帰式等がある。前記回帰式は、例えば、エラ
スターゼ濃度と顆粒球数との回帰直線式、エラスターゼ
濃度と全白血球数との回帰直線式等がある。
【００１５】前記第二の割合は、顆粒球１個当たりのエ
ラスターゼ濃度である。この割合を用いれば、試料中の
顆粒球数が算出できる。したがって、試料中の全白血球
数を求めたい場合は、この顆粒球数から、全白血球に対
する顆粒球合計や好中球の既知の割合を用いればよい。
ラスターゼ濃度である。この割合を用いれば、試料中の
顆粒球数が算出できる。したがって、試料中の全白血球
数を求めたい場合は、この顆粒球数から、全白血球に対
する顆粒球合計や好中球の既知の割合を用いればよい。
【００１６】なお、本発明にかかる白血球数とエラスタ
ーゼ濃度の既知の割合は、従来公知の割合を用いてもよ
いし、試料の種類に応じ予め求めた割合を使用してもよ
い。また、前記白血球数の計数は、前述の視覚法または
自動化法のいずれの方法で行ってもよい。また、前記エ
ラスターゼ濃度の測定も特に制限されないが、本発明に
おいて使用する免疫学的手法を用いることが好ましい。
ーゼ濃度の既知の割合は、従来公知の割合を用いてもよ
いし、試料の種類に応じ予め求めた割合を使用してもよ
い。また、前記白血球数の計数は、前述の視覚法または
自動化法のいずれの方法で行ってもよい。また、前記エ
ラスターゼ濃度の測定も特に制限されないが、本発明に
おいて使用する免疫学的手法を用いることが好ましい。
【００１７】つぎに、本発明の白血球数計数装置は、前
記本発明の白血球計数方法を実施するのに使用する装置
であって、試料中の顆粒球内部から放出されたエラスタ
ーゼ濃度から、白血球数、顆粒球数または好中球数とエ
ラスターゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料中の白
血球数を算出する手段を有する。
記本発明の白血球計数方法を実施するのに使用する装置
であって、試料中の顆粒球内部から放出されたエラスタ
ーゼ濃度から、白血球数、顆粒球数または好中球数とエ
ラスターゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料中の白
血球数を算出する手段を有する。
【００１８】前記白血球計数装置は、試料中の顆粒球内
部のエラスターゼを放出させる手段と、このエラスター
ゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加する手段と、前記
エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスターゼ抗体を測
定することにより前記エラスターゼ濃度を測定する手段
と、この濃度から白血球数とエラスターゼ濃度との既知
の割合を用いて前記試料中の白血球数を算出する手段と
を有することが好ましい。
部のエラスターゼを放出させる手段と、このエラスター
ゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加する手段と、前記
エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスターゼ抗体を測
定することにより前記エラスターゼ濃度を測定する手段
と、この濃度から白血球数とエラスターゼ濃度との既知
の割合を用いて前記試料中の白血球数を算出する手段と
を有することが好ましい。
【００１９】つぎに、本発明の試薬キットは、前記本発
明の白血球計数方法を実施するのに使用する試薬キット
であって、抗顆粒球エラスターゼ抗体を有する。
明の白血球計数方法を実施するのに使用する試薬キット
であって、抗顆粒球エラスターゼ抗体を有する。
【００２０】前記ラテックス凝集免疫測定法を適用する
本発明の計数方法に使用する本発明の試薬キットは、抗
顆粒球エラスターゼ抗体をラテックス粒子に結合させた
抗体粒子を有する。
本発明の計数方法に使用する本発明の試薬キットは、抗
顆粒球エラスターゼ抗体をラテックス粒子に結合させた
抗体粒子を有する。
【００２１】前記標識化抗体を利用する本発明の計数方
法に使用する本発明の試薬キットは、標識化抗顆粒球エ
ラスターゼ抗体および固相に結合した抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を有する。前記標識化抗顆粒球エラスターゼ抗
体は、酵素標識化抗顆粒球エラスターゼ抗体が好まし
い。
法に使用する本発明の試薬キットは、標識化抗顆粒球エ
ラスターゼ抗体および固相に結合した抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を有する。前記標識化抗顆粒球エラスターゼ抗
体は、酵素標識化抗顆粒球エラスターゼ抗体が好まし
い。
【００２２】本発明の試薬キットは、測定対象試料中に
存在するプロテアーゼインヒビターと同一のプロテアー
ゼインヒビターを有することが好ましい。また、測定対
象試料が全血の場合は、前記プロテアーゼインヒビター
は、α１−アンチトリプシンが好ましい。また、本発明
の試薬キットは、溶血剤を有することが好ましい。
存在するプロテアーゼインヒビターと同一のプロテアー
ゼインヒビターを有することが好ましい。また、測定対
象試料が全血の場合は、前記プロテアーゼインヒビター
は、α１−アンチトリプシンが好ましい。また、本発明
の試薬キットは、溶血剤を有することが好ましい。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の計数方法では、まず、顆
粒球を溶血させる。溶血の方法は、特に制限されず従来
公知の方法が使用でき、例えば、超音波等を用いる物理
的方法、浸透圧の差を用いる方法、界面活性剤等を用い
る化学的方法等がある。このなかで、操作性等の理由か
ら、界面活性剤水溶液に試料を浸漬する方法が好まし
い。前記界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメ
チルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアン
モニウムクロライド、サポニン、レシチン、コール酸、
ドデシル硫酸ナトリウム、３−［（コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロ
パンスルホン酸、ポリオキシエチレンオクチルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等
がある。界面活性剤水溶液の濃度は、特に制限されず、
通常、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１
重量％である。
粒球を溶血させる。溶血の方法は、特に制限されず従来
公知の方法が使用でき、例えば、超音波等を用いる物理
的方法、浸透圧の差を用いる方法、界面活性剤等を用い
る化学的方法等がある。このなかで、操作性等の理由か
ら、界面活性剤水溶液に試料を浸漬する方法が好まし
い。前記界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメ
チルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアン
モニウムクロライド、サポニン、レシチン、コール酸、
ドデシル硫酸ナトリウム、３−［（コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロ
パンスルホン酸、ポリオキシエチレンオクチルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等
がある。界面活性剤水溶液の濃度は、特に制限されず、
通常、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０５〜１
重量％である。
【００２４】つぎに、顆粒球から放出されたエラスター
ゼを免疫学的手法により測定する。
ゼを免疫学的手法により測定する。
【００２５】なお、先に述べたように、試料が全血の場
合は、この測定に先立ち、前記試料にプロテアーゼイン
ヒビターを添加することが好ましい。これは、顆粒球エ
ラスターゼは血漿中でプロテアーゼインヒビターと結合
した複合体として存在するが、顆粒球中から放出された
エラスターゼは遊離状態であり、測定対象としては複合
体とする方が好ましいから、遊離状態のエラスターゼを
プロテアーゼインヒビターとの複合体にするためであ
る。前記プロテアーゼインヒビターとしては、α１−ア
ンチトリプシンの他に、例えば、α２−マクログロブリ
ン等がある。また、プロテアーゼインヒビターの添加割
合は、試料濃度などにより適宜決定されるが、通常、顆
粒球エラスターゼ８０００個に対し２００μｌ／ｍｌで
ある。
合は、この測定に先立ち、前記試料にプロテアーゼイン
ヒビターを添加することが好ましい。これは、顆粒球エ
ラスターゼは血漿中でプロテアーゼインヒビターと結合
した複合体として存在するが、顆粒球中から放出された
エラスターゼは遊離状態であり、測定対象としては複合
体とする方が好ましいから、遊離状態のエラスターゼを
プロテアーゼインヒビターとの複合体にするためであ
る。前記プロテアーゼインヒビターとしては、α１−ア
ンチトリプシンの他に、例えば、α２−マクログロブリ
ン等がある。また、プロテアーゼインヒビターの添加割
合は、試料濃度などにより適宜決定されるが、通常、顆
粒球エラスターゼ８０００個に対し２００μｌ／ｍｌで
ある。
【００２６】前記免疫学的手法は、前に述べたように、
例えば、ラテックス凝集免疫測定法、酵素免疫法、放射
免疫法、蛍光免疫法がある。
例えば、ラテックス凝集免疫測定法、酵素免疫法、放射
免疫法、蛍光免疫法がある。
【００２７】本発明において使用する抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体は、常法により、顆粒球エラスターゼを用いて
特異的に免疫した動物の血清から分離することにより調
製でき、また通常のハイブリドーマ法によっても調製で
きる。抗体の調製に使用する前記動物としては、例え
ば、羊、兎等があるが、本発明ではこれらに限定しな
い。
ーゼ抗体は、常法により、顆粒球エラスターゼを用いて
特異的に免疫した動物の血清から分離することにより調
製でき、また通常のハイブリドーマ法によっても調製で
きる。抗体の調製に使用する前記動物としては、例え
ば、羊、兎等があるが、本発明ではこれらに限定しな
い。
【００２８】前記ラテックス凝集法は、ラテックス粒子
を結合させた抗顆粒球エラスターゼ抗体を使用する方法
であり、前記抗体が前記顆粒球エラスターゼに結合すれ
ば、ラテックスの凝集がおこり、Ｂ／Ｆ分離することな
く前記凝集程度を測定することにより前記エラスターゼ
濃度を測定する方法である。前記凝集程度の測定は、通
常、分光光度計を用い、濁度として透過光を測定する。
凝集程度が大きくなるにしたがい散乱光が増して透過光
が低下し、前記濁度は上昇する。なお、測定波長は、通
常、４００〜１５００ｎｍ、好ましくは５００〜８００
ｎｍである。また、前記抗体の添加割合は、試料の種類
や濃度等により適宜決定されるが、試料が全血の場合、
前記添加割合は、通常、０．１〜５ｍｇ／ｍｌであり、
好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌである。また、前記凝集程
度の測定は、散乱光を測定するネフェロ法を用いてもよ
い。さらに、前記凝集程度は、目視でも測定できる。こ
の場合は、目視測定用の市販の試薬を使用すれば、精度
が高い測定が可能となる。
を結合させた抗顆粒球エラスターゼ抗体を使用する方法
であり、前記抗体が前記顆粒球エラスターゼに結合すれ
ば、ラテックスの凝集がおこり、Ｂ／Ｆ分離することな
く前記凝集程度を測定することにより前記エラスターゼ
濃度を測定する方法である。前記凝集程度の測定は、通
常、分光光度計を用い、濁度として透過光を測定する。
凝集程度が大きくなるにしたがい散乱光が増して透過光
が低下し、前記濁度は上昇する。なお、測定波長は、通
常、４００〜１５００ｎｍ、好ましくは５００〜８００
ｎｍである。また、前記抗体の添加割合は、試料の種類
や濃度等により適宜決定されるが、試料が全血の場合、
前記添加割合は、通常、０．１〜５ｍｇ／ｍｌであり、
好ましくは１〜３ｍｇ／ｍｌである。また、前記凝集程
度の測定は、散乱光を測定するネフェロ法を用いてもよ
い。さらに、前記凝集程度は、目視でも測定できる。こ
の場合は、目視測定用の市販の試薬を使用すれば、精度
が高い測定が可能となる。
【００２９】前記ラテックス粒子を結合させた抗顆粒球
エラスターゼ抗体は、常法により、調製することができ
る。例えば、ポリスチレンにポリエチレンをグラフト共
重合させた平均粒径０．１〜０．２μｍのラテックス粒
子に、約２００ｎｇ／ｃｍ2の割合で抗体を物理的に吸
着させてもよいし、共有結合によって結合させてもよ
い。なお、前記ラテックス粒子を結合させた抗顆粒球エ
ラスターゼ抗体は、市販品を使用してもよい。
エラスターゼ抗体は、常法により、調製することができ
る。例えば、ポリスチレンにポリエチレンをグラフト共
重合させた平均粒径０．１〜０．２μｍのラテックス粒
子に、約２００ｎｇ／ｃｍ2の割合で抗体を物理的に吸
着させてもよいし、共有結合によって結合させてもよ
い。なお、前記ラテックス粒子を結合させた抗顆粒球エ
ラスターゼ抗体は、市販品を使用してもよい。
【００３０】前記酵素免疫法は、先に述べたように、ま
ず、顆粒球内部から放出されたエラスターゼを固相に固
定した抗顆粒球エラスターゼ抗体に結合させ、この状態
で、さらに酵素で標識した抗顆粒球エラスターゼ抗体を
添加し、非結合の前記抗体を洗浄等の手段により分離
し、前記エラスターゼに結合した前記酵素標識化抗顆粒
球エラスターゼ抗体を前記酵素と基質の反応により測定
する方法である。
ず、顆粒球内部から放出されたエラスターゼを固相に固
定した抗顆粒球エラスターゼ抗体に結合させ、この状態
で、さらに酵素で標識した抗顆粒球エラスターゼ抗体を
添加し、非結合の前記抗体を洗浄等の手段により分離
し、前記エラスターゼに結合した前記酵素標識化抗顆粒
球エラスターゼ抗体を前記酵素と基質の反応により測定
する方法である。
【００３１】前記酵素および基質の組み合わせとして
は、例えば、ペルオキシダーゼと過酸化水素とオルトフ
ェニレンオレンジとの組み合わせ、アルカリ性フォスフ
ァターゼと４−ニトロフェニリン酸との組み合わせがあ
る。前記ペルオキシダーゼ、過酸化水素およびオルトフ
ェニレンオレンジを用いる場合、酵素反応によりオルト
フェニレンオレンジが発色し、これを波長４９２ｎｍで
測定すればよい。
は、例えば、ペルオキシダーゼと過酸化水素とオルトフ
ェニレンオレンジとの組み合わせ、アルカリ性フォスフ
ァターゼと４−ニトロフェニリン酸との組み合わせがあ
る。前記ペルオキシダーゼ、過酸化水素およびオルトフ
ェニレンオレンジを用いる場合、酵素反応によりオルト
フェニレンオレンジが発色し、これを波長４９２ｎｍで
測定すればよい。
【００３２】また、前記固相に固定した抗体は、常法に
より調製でき、例えば、酸処理や熱処理等により抗体を
固相に固定化できる。また、前記酵素標識化抗体は、常
法により調製できる。これらは、市販品を使用してもよ
い。
より調製でき、例えば、酸処理や熱処理等により抗体を
固相に固定化できる。また、前記酵素標識化抗体は、常
法により調製できる。これらは、市販品を使用してもよ
い。
【００３３】また、前記固定化抗体の割合および前記酵
素標識化抗体の添加割合は、試料の種類や濃度等により
適宜決定される。また、前記固相としては、ビーズ表面
やチューブ表面などがある。
素標識化抗体の添加割合は、試料の種類や濃度等により
適宜決定される。また、前記固相としては、ビーズ表面
やチューブ表面などがある。
【００３４】前記放射免疫法は、前記酵素に代えて放射
性物質で抗顆粒球エラスターゼ抗体を標識したものを使
用する方法であり、前記放射性物質を測定する以外は、
前記酵素免疫法と同様にして実施される。前記放射性物
質としては、例えば、126−Ｉ−Ｎａがあげられる。
性物質で抗顆粒球エラスターゼ抗体を標識したものを使
用する方法であり、前記放射性物質を測定する以外は、
前記酵素免疫法と同様にして実施される。前記放射性物
質としては、例えば、126−Ｉ−Ｎａがあげられる。
【００３５】前記蛍光免疫法は、前記酵素に代えて蛍光
物質で抗顆粒球エラスターゼ抗体を標識したものを使用
する方法であり、前記蛍光物質を測定する以外は、前記
酵素免疫法と同様にして実施される。前記蛍光物質とし
ては、例えば、ローダミン、フルオレッセイン、クマリ
ン等があげられる。
物質で抗顆粒球エラスターゼ抗体を標識したものを使用
する方法であり、前記蛍光物質を測定する以外は、前記
酵素免疫法と同様にして実施される。前記蛍光物質とし
ては、例えば、ローダミン、フルオレッセイン、クマリ
ン等があげられる。
【００３６】つぎに、前記免疫学的手法により測定して
得られた前記エラスターゼ濃度から、白血球数または顆
粒球数と顆粒球エラスターゼ濃度との既知の割合を用い
て前記試料中の白血球数等を算出する。前記既知の割合
は、例えば、前述した統計的な割合または顆粒球一個当
たりのエラスターゼ濃度が使用できる。また、前記割合
は、試料の種類に応じて適宜決定することが好ましい。
例えば、試料が、成人の全血、子供の全血または老人の
全血の場合は、それぞれの割合を使用すればよい。
得られた前記エラスターゼ濃度から、白血球数または顆
粒球数と顆粒球エラスターゼ濃度との既知の割合を用い
て前記試料中の白血球数等を算出する。前記既知の割合
は、例えば、前述した統計的な割合または顆粒球一個当
たりのエラスターゼ濃度が使用できる。また、前記割合
は、試料の種類に応じて適宜決定することが好ましい。
例えば、試料が、成人の全血、子供の全血または老人の
全血の場合は、それぞれの割合を使用すればよい。
【００３７】つぎに、本発明の白血球計数装置は、試料
中の顆粒球内部のエラスターゼを放出させる手段と、こ
のエラスターゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加する
手段と、前記エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を測定することにより前記エラスターゼ濃度を
測定する手段と、この濃度から、白血球数、顆粒球数ま
たは好中球数と顆粒球エラスターゼ濃度との既知の割合
を用いて前記試料中の白血球数を算出する手段とを有す
ることが好ましい。この装置は、全自動で白血球数を計
数できる。
中の顆粒球内部のエラスターゼを放出させる手段と、こ
のエラスターゼに抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加する
手段と、前記エラスターゼに結合した抗顆粒球エラスタ
ーゼ抗体を測定することにより前記エラスターゼ濃度を
測定する手段と、この濃度から、白血球数、顆粒球数ま
たは好中球数と顆粒球エラスターゼ濃度との既知の割合
を用いて前記試料中の白血球数を算出する手段とを有す
ることが好ましい。この装置は、全自動で白血球数を計
数できる。
【００３８】前記放出手段および抗体添加手段は、例え
ば、試薬の分注等のためのポンプ、弁、ノズル、攪拌
機、容器、温度調節機構等の要素により構成される。ま
た、前記エラスターゼ濃度を測定する手段は、例えば、
前記要素に加え光学的測定系等により構成される。ま
た、前記算出する手段は、例えば、前記エラスターゼ濃
度と前記既知の割合から試料中の顆粒球数や全白血球数
等を算出するようにプログラムされた計算機構およびこ
の結果を表示する手段（ディスプレーやプリンター等）
により構成される。
ば、試薬の分注等のためのポンプ、弁、ノズル、攪拌
機、容器、温度調節機構等の要素により構成される。ま
た、前記エラスターゼ濃度を測定する手段は、例えば、
前記要素に加え光学的測定系等により構成される。ま
た、前記算出する手段は、例えば、前記エラスターゼ濃
度と前記既知の割合から試料中の顆粒球数や全白血球数
等を算出するようにプログラムされた計算機構およびこ
の結果を表示する手段（ディスプレーやプリンター等）
により構成される。
【００３９】このように、本発明の計数方法を実施する
ための装置は、その占有面積をＡ４サイズの用紙と同様
にすることも可能であり、従来の自動化法の装置に比べ
極めて小型で安価なものである。
ための装置は、その占有面積をＡ４サイズの用紙と同様
にすることも可能であり、従来の自動化法の装置に比べ
極めて小型で安価なものである。
【００４０】前記本発明の白血球計数装置は、少なくと
も、試料中の顆粒球内部から放出されたエラスターゼ濃
度から、白血球数、顆粒球数または好中球数とエラスタ
ーゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料中の白血球数
を算出する手段を有すればよいから、これ以外は、例え
ば、人間の手で試薬や抗体を添加してもよい。また、エ
ラスターゼ濃度の測定は、前記光学的測定系や、目視に
よる測定であってもよい。
も、試料中の顆粒球内部から放出されたエラスターゼ濃
度から、白血球数、顆粒球数または好中球数とエラスタ
ーゼ濃度との既知の割合を用いて前記試料中の白血球数
を算出する手段を有すればよいから、これ以外は、例え
ば、人間の手で試薬や抗体を添加してもよい。また、エ
ラスターゼ濃度の測定は、前記光学的測定系や、目視に
よる測定であってもよい。
【００４１】つぎに、本発明の試薬キットには、前述し
た計数方法であげた試薬を使用できる。
た計数方法であげた試薬を使用できる。
【００４２】
【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。
する。
【００４３】（実施例１）成人の全血を、リン酸緩衝液
を用い、１倍、１／２倍、１／４倍、１／８倍および１
／１６倍に希釈し、これらを試料とした。これら各試料
を０．１重量％ドデシルトリメチルアンモニウムクロラ
イド水溶液中に添加して白血球を溶血させた。これを、
α１−アンチトリプシンを含む０．０１重量％ポリオキ
シエチレンソルビトールエステルを用いて希釈して複数
の検液を調製した。これらの各検液１００μｌについ
て、固定化抗体（抗ヒト顆粒球エラスターゼマウスモノ
クローナル抗体）と酵素標識抗体（ペルオキシダーゼ標
識抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジポリクローナル抗
体）を用い、前述の手法（酵素免疫法）によりエラスタ
ーゼ濃度を測定した。
を用い、１倍、１／２倍、１／４倍、１／８倍および１
／１６倍に希釈し、これらを試料とした。これら各試料
を０．１重量％ドデシルトリメチルアンモニウムクロラ
イド水溶液中に添加して白血球を溶血させた。これを、
α１−アンチトリプシンを含む０．０１重量％ポリオキ
シエチレンソルビトールエステルを用いて希釈して複数
の検液を調製した。これらの各検液１００μｌについ
て、固定化抗体（抗ヒト顆粒球エラスターゼマウスモノ
クローナル抗体）と酵素標識抗体（ペルオキシダーゼ標
識抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジポリクローナル抗
体）を用い、前述の手法（酵素免疫法）によりエラスタ
ーゼ濃度を測定した。
【００４４】すなわち、まず、前記各検液１００μｌを
反応溶液中の前記固定化抗体に結合させて洗浄した。つ
ぎに、前記酵素標識抗体を添加した後、洗浄した。最後
に、反応液中に過酸化水素及びオルトフェニレンジアミ
ン溶液を添加した。この酵素反応による発色を波長４９
２ｎｍの吸光度で測定し、予め作成した検量線によりエ
ラスターゼ濃度を算出した。
反応溶液中の前記固定化抗体に結合させて洗浄した。つ
ぎに、前記酵素標識抗体を添加した後、洗浄した。最後
に、反応液中に過酸化水素及びオルトフェニレンジアミ
ン溶液を添加した。この酵素反応による発色を波長４９
２ｎｍの吸光度で測定し、予め作成した検量線によりエ
ラスターゼ濃度を算出した。
【００４５】他方、別の成人全血の試料について、全白
血球数とエラスターゼ濃度の回帰直線式を作成した。前
記全白血球数は、自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東
亜医用電子社製）により計数し、また顆粒球エラスター
ゼ濃度は、前記の酵素免疫法と同様にして測定した。こ
の回帰直線式（１）を下記に示す。この回帰直線式
（１）を用い、前記エラスターゼ濃度から各試料の全白
血球数を算出した。この結果を下記の表１に示す。
血球数とエラスターゼ濃度の回帰直線式を作成した。前
記全白血球数は、自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東
亜医用電子社製）により計数し、また顆粒球エラスター
ゼ濃度は、前記の酵素免疫法と同様にして測定した。こ
の回帰直線式（１）を下記に示す。この回帰直線式
（１）を用い、前記エラスターゼ濃度から各試料の全白
血球数を算出した。この結果を下記の表１に示す。
【００４６】 Ｙ＝２１３２．９８９７Ｘ−２４５．６５１９ ・・・（１） Ｘ：顆粒球エラスターゼ濃度（μｇ／ｍｌ） Ｙ：全白血球数（個／μｌ）
【００４７】また、対照として、前記各試料の白血球数
を、自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東亜医用電子社
製）を用いて計数した。この結果も下記の表１に示す。
を、自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東亜医用電子社
製）を用いて計数した。この結果も下記の表１に示す。
【００４８】（実施例２）実施例１において、回帰直線
式を使用せず、好中球１個当たりのエラスターゼ濃度
０．９０８４ｎｇ／ｍｌおよび全白血球数に対する好中
球数の割合５５．３％を用いて全白血球数を算出した。
なお、前記好中球１個当たりのエラスターゼ濃度は、成
人全血を、常法（視覚法）により好中球のみを計数し、
また実施例１と同じ方法（酵素免疫法）でエラスターゼ
濃度を測定して算出した値である。この結果を下記の表
２に示す。
式を使用せず、好中球１個当たりのエラスターゼ濃度
０．９０８４ｎｇ／ｍｌおよび全白血球数に対する好中
球数の割合５５．３％を用いて全白血球数を算出した。
なお、前記好中球１個当たりのエラスターゼ濃度は、成
人全血を、常法（視覚法）により好中球のみを計数し、
また実施例１と同じ方法（酵素免疫法）でエラスターゼ
濃度を測定して算出した値である。この結果を下記の表
２に示す。
【００４９】（比較例）実施例１と同様にして５種類の
検液を調製した。これら各検液１０μｌをグッド緩衝液
（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）２５０μｌに添加し、３７
℃で３分間インキュベートした。これに、４ｍｇ／ｍｌ
のＡＡＰＶ（メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−ニトロアニリド）水溶液を加えて攪拌
し、３７℃で６分間インキュベートした。その後、反応
液の波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、エラスターゼ活
性を測定した。また、対照として、実施例１と同様に、
自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東亜医用電子社製）
を用いて全白血球数を計数した。この結果を下記の表３
に示す。
検液を調製した。これら各検液１０μｌをグッド緩衝液
（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）２５０μｌに添加し、３７
℃で３分間インキュベートした。これに、４ｍｇ／ｍｌ
のＡＡＰＶ（メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−ニトロアニリド）水溶液を加えて攪拌
し、３７℃で６分間インキュベートした。その後、反応
液の波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、エラスターゼ活
性を測定した。また、対照として、実施例１と同様に、
自動血球計数装置（Ｋ−４５００、東亜医用電子社製）
を用いて全白血球数を計数した。この結果を下記の表３
に示す。
【００５０】
【表１】 実施例１ 試料希釈倍率 対照白血球数 エラスターゼ濃度 算出白血球数 （個／μｌ） （μｇ／ｍｌ） （個／μｌ） １／１６ １０００ ０．３６ ５２２ １／８ ２１００ １．５１ ２９７５ １／４ ４２００ ２．０２ ４０６３ １／２ ６３００ ２．９９ ６１３２ １ ８４００ ４．０１ ８３０８
【００５１】
【表２】 実施例２ 試料希釈倍率 対照白血球数 エラスターゼ濃度 算出白血球数 （個／μｌ） （μｇ／ｍｌ） （個／μｌ） １／１６ １０００ ０．３６ ７１７ １／８ ２１００ １．５１ ３００６ １／４ ４２００ ２．０２ ４０２１ １／２ ６３００ ２．９９ ５９５２ １ ８４００ ４．０１ ７９８３
【００５２】
【表３】 比較例 試料希釈倍率 対照白血球数 エラスターゼ活性 （個／μｌ） （Ｕ／ｍｌ） １／１６ ７３０ ４．３ １／８ １０９０ ２４．８ １／４ １５４０ ７．８ １／２ １９７０ ５２．８ １ ２６７０ ３３．４
【００５３】前記表１および表２に示すように、実施例
１および２では、エラスターゼ濃度から算出した全白血
球数と自動血球計数装置により計数した全白血球数とは
高い相関関係（相関係数ｒ＝０．９８６）を示した。こ
れに対し、比較例では、エラスターゼ濃度（酵素活性）
と自動血球計数装置により計数した全白血球数との相関
は低かった（相関係数ｒ＝０．６２６８）。この原因
は、比較例ではエラスターゼ濃度を酵素法により測定し
た結果、試料中のプロテアーゼインヒビター（α１−ア
ンチトリプシン等）によりエラスターゼの活性が阻害さ
れためと考えられる。
１および２では、エラスターゼ濃度から算出した全白血
球数と自動血球計数装置により計数した全白血球数とは
高い相関関係（相関係数ｒ＝０．９８６）を示した。こ
れに対し、比較例では、エラスターゼ濃度（酵素活性）
と自動血球計数装置により計数した全白血球数との相関
は低かった（相関係数ｒ＝０．６２６８）。この原因
は、比較例ではエラスターゼ濃度を酵素法により測定し
た結果、試料中のプロテアーゼインヒビター（α１−ア
ンチトリプシン等）によりエラスターゼの活性が阻害さ
れためと考えられる。
【００５４】（実施例３）実施例１と同様にして５種類
の試料を調製した。この各試料について、以下に示すラ
テックス凝集免疫測定法によりエラスターゼ濃度を測定
した。すなわち、まず、前記試料を０．１重量％サポニ
ン水溶液中に添加して白血球を溶血した。これを、実施
例１と同様にして希釈し検液とした。この検液１０μｌ
をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０μｌに添加し、こ
れに抗ヒト顆粒球エラスターゼ抗体を感作させたラテッ
クス懸濁液（濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ、）５０μｌを添
加し、３７℃で１５分間インキュベートした。前記ラテ
ックス懸濁液は、ポリスチレンにポリエチレンをグラフ
ト共重合させた平均粒径０．１〜０．２μｍのラテック
ス粒子に前記抗体を約２００ｎｇ／ｃｍ2 の割合で物理
的に吸着させて調製した。そして、この緩衝液の波長６
６０ｎｍの吸光度（濁度）を分光光度計により測定しエ
ラスターゼ濃度を測定した。この値から、実施例１と同
様にして試料中の白血球数を算出した。また、対照は、
実施例１と同様である。その結果、両者に高い相関が認
められた。
の試料を調製した。この各試料について、以下に示すラ
テックス凝集免疫測定法によりエラスターゼ濃度を測定
した。すなわち、まず、前記試料を０．１重量％サポニ
ン水溶液中に添加して白血球を溶血した。これを、実施
例１と同様にして希釈し検液とした。この検液１０μｌ
をリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０μｌに添加し、こ
れに抗ヒト顆粒球エラスターゼ抗体を感作させたラテッ
クス懸濁液（濃度：２．０ｍｇ／ｍｌ、）５０μｌを添
加し、３７℃で１５分間インキュベートした。前記ラテ
ックス懸濁液は、ポリスチレンにポリエチレンをグラフ
ト共重合させた平均粒径０．１〜０．２μｍのラテック
ス粒子に前記抗体を約２００ｎｇ／ｃｍ2 の割合で物理
的に吸着させて調製した。そして、この緩衝液の波長６
６０ｎｍの吸光度（濁度）を分光光度計により測定しエ
ラスターゼ濃度を測定した。この値から、実施例１と同
様にして試料中の白血球数を算出した。また、対照は、
実施例１と同様である。その結果、両者に高い相関が認
められた。
【００５５】
【発明の効果】以上のように、本発明の白血球計数方法
は、免疫学的手法により測定された顆粒球内部のエラス
ターゼの濃度を用いて試料中の白血球数を算出する。こ
の方法によれば、赤芽球等の白血球以外の有核細胞、フ
ィブリンの析出、血小板の凝集、赤血球の溶血不良の影
響を受けず、また用いる装置も小型化でき、計数コスト
も低減され、さらに免疫学的手法を用いるため測定者の
熟練度も影響がない。
は、免疫学的手法により測定された顆粒球内部のエラス
ターゼの濃度を用いて試料中の白血球数を算出する。こ
の方法によれば、赤芽球等の白血球以外の有核細胞、フ
ィブリンの析出、血小板の凝集、赤血球の溶血不良の影
響を受けず、また用いる装置も小型化でき、計数コスト
も低減され、さらに免疫学的手法を用いるため測定者の
熟練度も影響がない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ ５８７ ５８７ 33/573 33/573 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/49 G01N 33/50 G01N 33/53 G01N 33/543 515 G01N 33/543 555 G01N 33/543 575 G01N 33/543 587 G01N 33/573
Claims (16)
- 【請求項１】 試料中の白血球のうち、好中球、好酸球
および好塩基球（以下、これら３血球を「顆粒球」とい
う）内部のエラスターゼを放出させ、このエラスターゼ
に抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加し、前記エラスター
ゼに結合した抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定すること
により前記エラスターゼ濃度を測定し、この濃度から白
血球数、顆粒球数または好中球数とエラスターゼ濃度と
の既知の割合を用いて前記試料中の白血球数を算出する
白血球計数方法。 - 【請求項２】 放出されたエラスターゼに、試料中に存
在するプロテアーゼインヒビターと同一のプロテアーゼ
インヒビターを結合させた後、前記エラスターゼに抗顆
粒球エラスターゼ抗体を添加する請求項１に記載の計数
方法。 - 【請求項３】 試料が全血であり、プロテアーゼインヒ
ビターがα１−アンチトリプシンである請求項２に記載
の計数方法。 - 【請求項４】 抗顆粒球エラスターゼ抗体をラテックス
粒子に結合させた抗体粒子を、顆粒球から放出されたエ
ラスターゼと抗原抗体反応させ、前記ラテックス粒子の
凝集程度を測定することにより前記エラスターゼに結合
した前記抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定する請求項１
〜３のいずれか一項に記載の計数方法。 - 【請求項５】 顆粒球から放出されたエラスターゼを、
固相に結合した抗顆粒球エラスターゼ抗体に結合させ、
この状態で標識化抗顆粒球エラスターゼ抗体を添加し、
前記エラスターゼに結合した前記標識化抗顆粒球エラス
ターゼ抗体を測定する請求項１〜３のいずれか一項に記
載の計数方法。 - 【請求項６】 既知の割合が、白血球数または顆粒球数
とエラスターゼ濃度との統計的な割合である請求項１〜
５のいずれか一項に記載の計数方法。 - 【請求項７】 既知の割合が、顆粒球１個当たりのエラ
スターゼ濃度である請求項１〜５のいずれか一項に記載
の計数方法。 - 【請求項８】 顆粒球数から、全白血球数に対する顆粒
球数の既知の割合を用いて試料中の全白血球数を算出す
る請求項７に記載の計数方法。 - 【請求項９】 請求項１記載の白血球計数方法を実施す
るのに使用する装置であって、試料中の顆粒球内部から
放出されたエラスターゼ濃度から、白血球数、顆粒球数
または好中球数とエラスターゼ濃度との既知の割合を用
いて前記試料中の白血球数を算出する手段を有する白血
球計数装置。 - 【請求項１０】 試料中の顆粒球内部のエラスターゼを
放出させる手段と、このエラスターゼに抗顆粒球エラス
ターゼ抗体を添加する手段と、前記エラスターゼに結合
した抗顆粒球エラスターゼ抗体を測定することにより前
記エラスターゼ濃度を測定する手段と、この濃度から、
白血球数、顆粒球数または好中球数とエラスターゼ濃度
との既知の割合を用いて前記試料中の白血球数を算出す
る手段とを有する請求項９記載の白血球計数装置。 - 【請求項１１】 請求項１記載の白血球計数方法を実施
するのに使用する試薬キットであって、抗顆粒球エラス
ターゼ抗体を有する試薬キット。 - 【請求項１２】 請求項４記載の白血球計数方法を実施
するのに使用する試薬キットであって、抗顆粒球エラス
ターゼ抗体をラテックス粒子に結合させた抗体粒子を有
する試薬キット。 - 【請求項１３】 請求項５記載の白血球計数方法を実施
するのに使用する試薬キットであって、標識化抗顆粒球
エラスターゼ抗体および固相に結合した抗顆粒球エラス
ターゼ抗体を有する試薬キット。 - 【請求項１４】 測定対象試料中に存在するプロテアー
ゼインヒビターと同一のプロテアーゼインヒビターを有
する請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の試薬キッ
ト。 - 【請求項１５】 測定対象試料が全血であり、プロテア
ーゼインヒビターが、α１−アンチトリプシンである請
求項１４記載の試薬キット。 - 【請求項１６】 さらに溶血剤を有する請求項１１〜１
５のいずれか一項に記載の試薬キット。
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