ES2262569T3

ES2262569T3 - Ensayo para el inhibidor urinario de la tripsina que contiene un agente de quelacion.

Info

Publication number: ES2262569T3
Application number: ES01110137T
Authority: ES
Inventors: Gary B. Rehm; Michael J. Pugia; Paul F. Corey
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2021-05-04
Also published as: US20010055816A1; NO20012262D0; DE60118651D1; EP1156121A2; EP1156121B1; AU2650601A; IL140994A0; ZA200102449B; CA2334321A1; JP4699631B2; US7001737B2; PT1156121E; IL140994A; EP1156121A3; ATE323175T1; JP2002014096A; DE60118651T2; NO20012262L; DK1156121T3

Abstract

Un ensayo para los inhibidores de la tripsina en la orina que comprende (a) poner en contacto una muestra de orina con un medio analítico tamponado, en el que el pH está tamponado a un nivel de 6, 0 a 8, 0, que está compuesto de (i) tripsina en una cantidad de 10 a 750 UI/ml, (ii) un sustrato de tripsina que producirá una respuesta detectable cuando se escinda por la tripsina presente a una concentración de 0, 2 a 50 mM e (iii) una agente quelante policarboxílico presente en una cantidad de 0, 2 a 50 mM; y (b) correlacionar la concentración del inhibidor de la tripsina con la respuesta detectable procedente de la escisión del sustrato, en el que el agente quelante policarboxílico reduce la variación en las cantidades detectadas de inhibidor de la tripsina causada por la presencia de iones de calcio presentes en la orina en referencia con una muestra de control carente de agente quelante policarboxílico.

Description

Ensayo para el inhibidor urinario de la tripsina que contiene un agente de quelación.

Antecedentes de la invención

Hace tiempo que se sabe que el inhibidor de la tripsina urinaria (ITU) está presente en la orina humana y que su concentración en la orina aumenta debido a las enfermedades del riñón.

Piette et al. informan en "The European Journal of Medicine", Vol. 1, 5 de septiembre de 1992, que la actividad inhibitoria de la tripsina urinaria puede ser un marcador útil, particularmente, en pacientes con fiebre de origen desconocido y/o una velocidad de sedimentación eritrocítica elevada. Kuwajima et al. informan en "Clinical Biochemistry", Vol. 23, abril de 1990, pp.: 167-171, que el ensayo automatizado del inhibidor de la tripsina urinaria puede ser útil para el diagnóstico clínico de la respuesta de fase aguda.

En Ausubel F.M.: "Current Protocols in Molecular Biology. Passage Text", Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York, Wiley & Sons, EE.UU., Vol. 3, 1995, página A03F12, se hace una referencia general sobre la capacidad de un agente quelante policarboxílico para unirse a la tripsina.

Por consiguiente, el ionograma urinario para el ITU es una importante herramienta diagnóstica. Comúnmente, tales técnicas analíticas suponen poner en contacto la muestra de orina con un sustrato de tripsina unido a un cromoforo bien en arginina o en lisina, pues éstos son los aminoácidos que se escinden por la tripsina. La concentración de los inhibidores de la tripsina urinaria en la muestra de orina es inversamente proporcional a la intensidad de la respuesta coloreada del cromoforo, pues los inhibidores de la tripsina urinaria inhiben la actividad de la tripsina según su concentración en la muestra de fluido. En el boletín nº: 10-70997 de la revelación de la patente pública japonesa publicado el 17 de marzo de 1998, se describe un procedimiento para medir el grado de inhibición de la actividad de la tripsina en la orina mediante la mezcla de una muestra de orina, una muestra enzimática que contiene tripsina y un tampón junto con calcio en la cantidad de 0,15 \mumoles o más por \mug de tripsina en el fluido de reacción hasta un máximo de 100 \mumoles de calcio por cada ml de muestra de orina. Además, se usan tensioactivos para potenciar la disolución del sustrato de tripsina en su disolvente orgánico. Esta técnica está aparentemente diseñada para enmascarar la interferencia causada por el calcio presente en las muestras de orina mediante la adición de un gran exceso de calcio a los reactivos del ensayo.

Esta técnica de ensayo supone una prueba en fase líquida de los inhibidores de la tripsina de la orina usando un exceso de calcio para ocultar la interferencia del calcio, y tensioactivos para disolver el sustrato de tripsina. Esta técnica no es adecuada para los ensayos en fase seca, porque la cantidad de tampón necesaria en tales ensayos para superar el tampón de la orina precipitaría en la orina.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un ensayo para los inhibidores de la tripsina en orina que comprende (a) poner en contacto una muestra de orina con un medio analítico tamponado en el que el pH esté tamponado a un nivel de 6,0 a 8,0, que está comprendido por (i) tripsina en una cantidad de 10 a 750 IU/ml, (ii) un sustrato para la tripsina que producirá una respuesta detectable cuando sea escindido por la tripsina presente a una concentración de 0,2 a 50 mM e (iii) un agente quelante policarboxílico presente en una cantidad de 0,2 a 50 mM, y (b) establecer una correlación entre la concentración del inhibidor de tripsina y la respuesta detectable procedente de la escisión del sustrato, en el que el agente quelante policarboxílico reduce la variación de las cantidades detectadas de inhibidor de tripsina causada por la presencia de los iones de calcio presentes en la orina en referencia con una muestra de control carente de agente quelante policarboxílico.

También se incluye en el alcance de la presente invención un dispositivo de ensayo en seco que tiene tripsina, tampón, un sustrato de tripsina y un agente quelante en un vehículo absorbente para detectar la presencia y la concentración de inhibidor de tripsina en las muestras de orina.

Las reivindicaciones de la presente memoria definen la invención con mayor detalle.

Descripción de la invención

El inhibidor de la tripsina urinaria es una glicoproteína que inhibe la reactividad enzimática de la tripsina, la \alpha-quimotripsina, la hialuronidasa y la creatina fosfoquinasa. Se ha sugerido previamente la actividad del inhibidor de la tripsina como una posible prueba de selección para el diagnóstico de la infección bacteriana. Cuando se producen infecciones bacterianas, se movilizan los glóbulos blancos, activándose la actividad elastasa de los mismos. Durante la respuesta de fase aguda, la interleuquina-1 induce la producción del inhibidor de la inter-\alpha-tripsina, que es descompuesto por la actividad elastasa en inhibidores de la tripsina de bajo peso molecular. Estos inhibidores de la tripsina parecen actuar sobre los sitios inflamados, mostrando actividades antiinflamatorias y anti-choque, antes de ser excretados en la orina. Se ha observado que los cambios cuantitativos del inhibidor de la tripsina son útiles como índice de infección o inflamación. También se ha observado que el inhibidor de la tripsina es elevado bajo otras circunstancias tales como los tumores malignos, las enfermedades del riñón, el infarto de miocardio y los estados post-operatorios. Puede estar presente en cantidades mínimas en la orina de los individuos sanos.

La proteína C reactiva del suero, el ácido siálico y la velocidad de sedimentación eritrocítica han sido utilizados como marcadores de la infección y la inflamación. Sin embargo, todos estos marcadores se basan en el suero, lo que requiere una extracción de sangre y un tiempo para la coagulación, una centrifugación y una separación de la muestra sanguínea antes del ensayo. El ensayo del inhibidor de la tripsina urinaria ofrece un medio fácil, rápido y económico de medir la infección sin la necesidad de una muestra de sangre. Las muestras de orina pueden ser fácilmente recogidas y no requieren un pretratamiento anterior al ensayo. Usados como una prueba prediagnóstica, los ensayos del inhibidor de la tripsina tienen un nivel de utilidad especialmente elevado en el campo de la Pediatría, en el que las muestras de orina son particularmente más fáciles de obtener que las muestras sanguíneas. Además, se ha demostrado que el inhibidor de la tripsina guarda una gran correlación con los cambios en la proteína C reactiva y la velocidad de sedimentación eritrocítica.

El ensayo de la presente invención se basa en el descubrimiento de que la interferencia con el ensayo de la tripsina urinaria causada por la presencia del ión de calcio en la orina puede ser eliminada del ensayo mediante el uso de ciertos agentes quelantes. Esto fue inesperado, porque los agentes quelantes no fueron usados para extraer ni eliminar el calcio, sino sólo para formar complejos salinos. Era de esperar que la tripsina siguiera interactuando con los complejos salinos de un modo perjudicial.

El ensayo puede ser llevado a cabo en fase líquida mediante la disolución de los reactivos de ensayo en un disolvente acuoso o aprótico polar; por ejemplo, en agua, etanol, metanol, isopropanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, acetona, dimetilformamida o metiletilcetona. Como mínimo, la solución contendrá tripsina a una concentración de 10 a 750 UI/ml (preferiblemente, de 100 a 500 UI/ml), un sustrato de tripsina, normalmente, a una concentración de 0,2 a 5,0 mM, siendo preferida una concentración de 0,5 a 2,0 mM, un agente quelante a una concentración de 0,2 a 50 mM (preferiblemente, de 10 a 25 mM) y un tampón tal como fosfato para mantener el pH de la disolución a un nivel de 6,0 a 9,0, siendo preferido un pH de 7,0 a 8,0.

Un aspecto de la presente invención se dirige a una tira de ensayo analítica para la detección del inhibidor de la tripsina en la muestra de orina. La tira comprende un vehículo absorbente a través del cual la muestra de orina puede fluir, impregnándose del sistema reactivo. El vehículo absorbente usado para la tira de ensayo es preferiblemente un papel de filtro. Otros materiales útiles como vehículo absorbente incluyen fieltro, tiras de cerámica porosa y fibras de vidrio fieltrado o tejido. También son adecuados la madera, la tela y el material esponjoso. En la preparación, normalmente, la tira es impregnada de una solución acuosa de tampón, agente quelante, tripsina y, opcionalmente, un tensioactivo, para después realizar un secado. Entonces se impregna la tira de una solución disolvente del sustrato de tripsina y se seca.

Los agentes quelantes preferidos son aquellos ácidos aminocarboxílicos que poseen al menos un complejo que forma grupos de fórmula -N(CH_{2}CO_{2}H)_{2}, incluyendo ácido iminodiacético; ácido nitrilotriacético; ácido dietilenotriamino-pentaacético; ácido trietilenotriamino-hexaacético; ácido 2,3-propilenodiamino-tetraacético y ácido 1,2-diaminociclohexano-tetraacético.

Los sustratos de tripsina adecuados para su uso en la presente invención son aquellos compuestos que contienen enlaces de lisina o arginina que pueden ser escindidos por la tripsina para formar una especie coloreada que pueda ser detectada bien visualmente o mediante medios espectrofotométricos. Tales sustratos incluyen benzoil-L-arginina-p-nitro-anilida. Otros sustratos de tripsina que son adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, derivados tipo amida de arginina o lisina de 7-amino-4-metilcoumarina, 2-aminonaftaleno, 4-metoxi-2-amino-naftaleno, 3-carboxi-4-hidroxi-analina, 2-cloro-4-nitro-analina, 3-aminoindol, 2-aminoacridona, 2-aminobenzotiazol, 2-aminopirimidina, Rhodam-ina 110 y 6-aminoguinolina. También hay diversos ésteres y amidas que han sido usados como sustratos para la detección de proteasas tales como la tripsina. También es adecuada una nueva clase de sustratos que incluye N\alpha,N_{G}-nitro-bloqueado-L-arginina-ésteres de alcoholes aromáticos tales como el 3-(N\alpha-Tosil-N_{G}-nitro-arginiloxi)-5-fenilpirrol según se describe en la solicitud en tramitación junto a la presente con nº de serie (identificado como MSE \alm{1}2609 y presentada en la misma fecha que esta solicitud). Este sustrato de tripsina es particularmente adecuado en el formato reactivo en seco, debido a su grupo protector nitro, que impide la reacción entre la tripsina y el sustrato antes de que la tira sea humedecida con la muestra de orina.

El procedimiento para poner en práctica la presente invención se ilustra más a fondo mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo I

Se llevó a cabo una prueba inicial de un ensayo modificado de líquidos para los inhibidores de la tripsina urinaria, usando el siguiente sistema analítico:

El procedimiento analítico fue llevado a cabo en un espectrofotómetro Cobas-Fara (Roche Diagnostics). Se añadió un alícuota de 10 \mul de orina como muestra de ensayo a 120 \mul de solución acuosa de tampón comprendida por un dihidrógeno fosfato de sodio 50 mM bien con o sin 0,47 g/l de EGTA. Se determinó que la cantidad práctica máxima de calcio en la orina era 80 mg/dl en base a los datos publicados, y se añadió al sistema analítico el doble de la cantidad de EGTA (0,47 g/l) necesaria para formar complejos con esta cantidad de calcio. En segundo lugar, se añadieron
100 \mul de solución acuosa de enzima tripsina 32 mg/l, y se mezclaron las soluciones combinadas durante 2 minutos a 25ºC. Finalmente, se añadieron 100 ml de una solución de sustrato comprendida por 0,70 g/l de benzoil-L arginina-p-nitro-anilida (BAPNA) en DMSO. Se centrifugó la mezcla resultante y se leyó en intervalos de 15 segundos durante 8 minutos a 405 nm.

Se usaron tres muestras de orina carentes de inhibidor para preparar 5 muestras con 50, 150, 250 y 350 de actividad del inhibidor de la tripsina urinaria (ITU) por litro (UI/l), mediante la adición de urinastatina (una glicoproteína con un peso molecular de 67.000 g/mol y un punto isoeléctrico de 2,4, comercializada con el nombre comercial de Miraclid). Se analizaron las muestras de orina usando este sistema analítico en el que se detectaron los cambios de color del sustrato en el analizador clínico Cobas-Fara de Roche. Este estudio de validación fue llevado a cabo con el propósito de demostrar una variación reducida en el ensayo cuando se incluye EGTA. En las siguientes tablas A y B, se exponen los resultados.

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TABLA A Resultados para el sistema de ensayo de líquidos sin EGTA

Datos observados para 3 repeticiones
		0	50	150	250	350
Orina 1	Rep 1	-3,72	30,12	134,69	234,68	307,45
	Rep 2	-5,89	22,71	136,6	229,7	305,19
	Rep 3	-15,5	26,343	142,49	223,8	305,49
Orina 2	Rep 1	-81,51	-13,44	87,25	217,14	302,65
	Rep 2	-79,73	-17,76	104,21	211,66	301,33
	Rep 3	-66,52	1,97	102,44	224,7	302,48
Orina 3	Rep 1	-37,16	19,98	114,31	206,3	294,27
	Rep 2	-36,31	19,61	117,17	212,5	293,53
	Rep 3	-26,43	7,5	110,01	224,77	293,42
Orina 1 = SG de 1,006 y cloruro de calcio: 25 mg/dl
Orina 2 = SG de 1,018 y cloruro de calcio: 11 mg/dl
Orina 3 = SG de 1,032 y cloruro de calcio: 16 mg/dl

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TABLA B Resultados para el sistema de ensayo de líquidos con EGTA

Datos observados para 3 repeticiones
		0	50	150	250	350
Orina 1	Rep 1	11,159	49,07	147,403	250,993	303,859
	Rep 2	14,453	52,505	152,336	251,909	302,132
	Rep 3	5,188	51,244	147,269	253,333	301,423
Orina 2	Rep 1	11,711	64,09	154,956	246,452	300,167
	Rep 2	13,969	64,112	153,48	242,246	300,547
	Rep 3	28,846	69,656	150,433	240,892	300,405
Orina 3	Rep 1	36,406	76,775	162,92	258,598	305,314
	Rep 2	31,243	76,924	170,404	261,391	303,783
	Rep 3	32,565	80,051	168,073	254,707	303,637

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A partir de las tabla A y B, se puede determinar que hubo una gran variabilidad en los resultados entre las diversas muestras de orina cuando no había EGTA en la solución de ensayo. El error típico para la tabla A es 19,02 UI/l, mientras que el error típico para la tabla B (con EGTA incluido) es de 10,53 UI/l. Por lo tanto, el EGTA reduce la variación entre las muestras de orina que tienen cantidades crecientes de calcio. Las tres muestras de orina tenían cantidades variables de calcio; cuanto mayor era el nivel de calcio, más se alejaba el resultado observado del resultado esperado. Esto coincide con otras soluciones patrón que mostraron que el calcio era inhibidor de la tripsina. El análisis de otros componentes urinarios tales como otras sales, la gravedad específica y el pH no demostraron una correlación entre los resultados esperados y los observados. Se llevó a cabo la prueba de un número de combinaciones de activadores e inhibidores potenciales de la tripsina urinaria con el resultado de que se determinó que el calcio aumentaba su actividad, mientras que el cloruro, el sodio y el magnesio tenían poco efecto. Se determinó además que el calcio tenía que estar bien anegado o en forma de complejos para poder ser eliminado del sistema de ensayo. Como el objetivo a largo plazo consiste en producir una prueba en fase seca para los inhibidores de la tripsina urinaria, y el calcio hace precipitar la mayoría de los tampones, se decidió intentar eliminar el calcio mediante la formación de complejos.

Se necesitan tampones, pues la enzima tripsina depende del pH, y es deseable un pH constante de aproximadamente 7,0 a 8,0 para obtener una actividad fija. Los grupos fosfato y carboxilo son comunes como los grupos ionizables cargados de los agentes de tamponamiento, y las sales de calcio de estos grupos no son muy hidrosolubles (el fosfato de calcio es relativamente insoluble), por lo que tienden a precipitar de la solución.

Ejemplo II

En este experimento, se usó un ensayo modificado en fase líquida. Los líquidos de ensayo usados:

i.: 0,1 ml de tensioactivo al 10% (como se muestra en la tabla C).

ii.: 3 ml de tampón.

iii.: 0,5 ml de H_{2}O (con y sin NaCl añadido).

iv.: 0,9 ml de diazonio de MMBD (125 mg/25 ml).

v.: 0,2 ml de enzima (10 mg de tripsina/100 ml)

vi.: 0,3 ml de sustrato 3-(N\alpha-tosil-N_{G}-nitro-L-arginiloxi)-5-fenilpirrol (20 mg/50 ml de acetona).

Los ensayos para el inhibidor de la tripsina en 3 muestras de orina fueron llevados a cabo como en los ejemplos anteriores, estando los resultados de absorbancia expuestos en la tabla C. Las 3 muestras de orina analizadas fueron:

muestra 1 = orina normal carente de inhibidor de la tripsina;

muestra 2 = la misma orina normal que contenía 250 UI/l de inhibidor de la tripsina y

muestra 3 = la misma orina normal que contenía 250 UI/l de inhibidor de la tripsina más urea, calcio, magnesio, sodio y potasio a 10 veces el límite fisiológico.

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TABLA C Resultados del ensayo de líquidos para el ITU con tensioactivos

Tensioactivo	Muestra 1 negativa*	Muestra 2 positiva	Muestra 3 positiva con sales	Clase
Ninguno	117	541	438	1
Aerosol OT (Gelificado)	40	253	324 turbio	2
Tween-80	1	201	102	3
Triton X-100	15	177	81	3
Surfynol	107	627	469	1
Ninate 411	13	19	78	4
Cl de benzalconio	143	269	7	5
Standopol ESL	23	214	245	2
Bio-Terge AS-40	22	81	211	2
Colato de sodio	128	492	421	1
Zonyl 100	48	408	225	3

TABLA C (continuación)

Tensioactivo	Muestra 1 negativa*	Muestra 2 positiva	Muestra 3 positiva con sales	Clase
Tetronic 1307	109	652	336	3
SDS	15	6	20	4
Span 60	115	199	439	2
			Precipitado
Igepal CA-210	-271	281	114	3
			V turbio
Pluronic L64	71	501	294	3
Chremophor EL	11	166	77	3
Silwet L7600	32	358	188	3
Tensioactivo 10G	45	451	258	3
Brij 35	13	206	88	3
Rhodasurf ON-870	1	141	56	3
Geropon T-77	5	22	32	4

El cálculo del resultado de la absorbancia es 1000* ((máximo a 2 min - 700 nm a 2 min) - (máximo a 0 min - 700 nm a 0 min)) *(Sin tensioactivo).

A partir de la tabla C, se puede determinar que fueron posibles una buena reactividad y un discernimiento del nivel de mezcla con las soluciones acuosas de inhibidor de tripsina, pero que la presencia de cualquier tensioactivo en el ensayo produce variaciones significativas. No sólo se ve afectada la muestra negativa, sino que aumentan las diferencias entre las dos muestras positivas y dependen de la naturaleza del tensioactivo.

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Ejemplo III

Se analizaron veintidós tensioactivos distintos como se describe en el ejemplo II y en la tabla C. Esta prueba demostró que existían las 5 siguientes clases de tensioactivos:

i.: aquéllos que no tenían ningún efecto en el blanco ni en la reactividad;

ii.: aquéllos que aumentaban tanto el blanco como la reactividad;

iii.: aquéllos que disminuían tanto el blanco como la reactividad;

iv.: aquéllos que aumentaban la reactividad con una sal añadida; y

v.: aquéllos que disminuían la reactividad con una sal añadida.

Se hicieron tiras con un tensioactivo de cada clase, preparando la primera y la segunda solución según el siguiente procedimiento: se saturó papel de filtro (calidad 240 C de Alstrom Inc.) con la primera solución de inmersión, y se secó durante 15 minutos a 90ºC. Se saturó el reactivo resultante con la segunda solución de inmersión, y se secó durante 10 minutos a 90ºC para formar la tira de ensayo completa. Se aplicó adhesivo (Y9494 de 3M Inc.) a la tira de ensayo y se fijó ésta a un asa de poliestireno en forma de lechos cuadrados de 0,86 cm x 0,86 cm.

A. Componentes para la primera inmersión

a.: 50 ml de agua.

b.: Tampón monobásico de fosfato (5,00 g).

c.: Tensioactivo (Ninate 411, Aerosol OT, Tween 80, BioTergr AS-40 o ninguno).

d.: 5,1 mM (0,119 g) de ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA).

e.: Plasdone al 1,75% (0,877 g) (PVP K30 de Sigma-Aldrich).

f.: 340 U/ml de enzima tripsina.

g.: MgSO_{4} 175 mM (2,16 g).

h.: Cloruro de 2-Metoxi-4-morfolin-benceno-diazonio 2,70 mM (43,7 mg), cloruro de cinc (MMBD) (agente de acoplamiento de diazonio).

i.: Ajustar hasta un pH 7,80 \pm 0,02 con NaOH 1N.

B. Componentes para la segunda inmersión

a.: 19,3 mg o 0,75 mM de 3-(N\alpha-tosil-N_{G}-nitro-L-arginiloxi)-5-fenilpirrol.

b.: 50 ml de Acetona.

Los datos fueron recogidos sumergiendo las tiras en las formulaciones de orina expuestas en la tabla D, y luego colocándolas en un espectrómetro CLINITEK® 50 de Bayer Diagnostics para recoger los datos a los 15 y 60 segundos de haberlas sumergido y para calcular una cifra de descodificación, usando la ecuación de descodificación = {[(B15 + G15) - (B60 + G60)] / (B15 + G15)} * 1000.

En la que:

: B15 es la reflectancia de la longitud de onda azul a los 15 segundos;

: B60 es la reflectancia de la longitud de onda azul a los 60 segundos;

: G15 es la reflectancia de la longitud de onda verde a los 15 segundos y

: G60 es la reflectancia de la longitud de onda verde a los 60 segundos.

El valor de descodificación es directamente proporcional a la concentración del ITU. Un resultado de >180 se asigna a 0 UI/ml, mientras que un resultado de <120 se asigna a un valor de 250 UI/ml.

En la tabla D, se presentan los resultados de este experimento.

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TABLA D Sin tensioactivo en el ensayo con tira para el ITU

Resultado de descodificación
Tensioactivo	Muestra 1 negativa	Muestra 2 positiva	Muestra 3 positiva
Ninguno	193	107	95
Ninate 411	179	92	87
Aerosol OT	182	109	82
Tween 80	185	97	81
Bioterge AS-40	197	85	94
Muestra 1 = orina.
Muestra 2 = orina con 250 UI/l de inhibidor de la tripsina.
Muestra 3 = orina con 250 UI/l de inhibidor de la tripsina con sales.

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La tabla D demuestra que la presencia o la ausencia de tensioactivo en el reactivo seco no tiene ningún efecto ni ningún beneficio en la reducción de la interferencia, pues se encontró una gran respuesta al inhibidor de la tripsina sin tensioactivo.

Los resultados, como se presentan en la tabla D, no fueron como se esperaban, pues se observó un fuerte efecto tensioactivo en ausencia de EGTA, como se informa en la tabla C. Se ajustó el pH de la orina hasta 7,5-8,0, el pH óptimo de la tira para eliminar cualquier efecto de tamponamiento. Ninguno de los ensayos que incluían un tensioactivo mostraron alguna mejora frente al agua. Este estudio lleva a la conclusión de que la fórmula con EGTA es menos susceptible a los efectos del tensioactivo que la que carece del mismo. Debido a la variabilidad analítica causada por los tensioactivos, éstos pueden ser omitidos de la formulación de ensayo. Sin embargo, en aquellas formulaciones en las que se encuentra dificultad en introducir el sustrato en la solución, se puede usar un tensioactivo no iónico de polioxialquilo, por ejemplo, uno que contenga unidades de etilenglicol. Esta clase de tensioactivo incluye aerosol OT, Ninate 411 y Bioterge A-40. Se descubrió que estos tensioactivos no tienen un efecto negativo sobre la reproducibilidad del ensayo.

Ejemplo IV

En otro desarrollo de la tira, no se usó tensioactivo, centrándose en mejorar la capacidad tampón de la tira. Se elaboró una serie de formulaciones para la tira con niveles crecientes de tampón. Se determinó que no era posible disolver en la solución de inmersión el suficiente tampón de fosfato (>1M) como para superar el efecto del pH de la orina. Sólo es posible disolver en agua unos cuantos tampones orgánicos en un grado tal como para superar la capacidad tampón de la orina; el Tris [Tris(hidroximetil)aminometano] es uno de ellos. En este ejemplo, se usó Tris a un nivel de 1,5 M para proporcionar un pH de 7,8. La formulación y el procedimiento para preparar las tiras fueron iguales que los usados en el ejemplo III, a excepción de que el tampón fue Tris 1,3M (7,87 g en 50 ml de agua) y no se añadió tensioactivo a la formulación.

El objetivo del estudio descrito en este ejemplo IV consistía en demostrar la correlación entre un ensayo de tira y el procedimiento de referencia del ensayo de líquidos inmunológico descrito por T. Noad en Osaka-stii Igakkai Zasshi, vol. 44, nº: 2 de junio de 1992; 485-500. Se evaluaron las 911 muestras clínicas de orina, usando el procedimiento inmunológico de referencia desarrollado como se muestra en el ejemplo II, usando un autoanalizador 7070 de Hitachi y un kit basado en anticuerpos de Eiken Japan. Los parámetros analíticos son como se describen a continuación:

1): Procedimiento: extremo de dos puntos.

2): Tiempos de medida: 1^{er} tiempo: 355,35 s; 2º tiempo: 590,94 s;

3): Longitud de onda: 660 nm.

4): Dilución de las muestras: 100 veces con tampón de pH 7,4 (patrón) / 50 veces con tampón de pH 7,4 (en muestra a baja concentración).

5): Valor de las muestras: 5 \mul.

6): Valor del reactivo: 1^{er} reactivo: 150 \mul; 2º reactivo: 50 \mul.

7): Punto patrón: 7 puntos (0; 7,8; 15,6; 31,3; 62,5; 125; 250 UI/ml).

8): Curva patrón: Spline.

La tabla E, es una tabla de verdad que muestra la correlación entre el ensayo con la tira de este ejemplo y el ensayo de referencia de líquidos inmunológico. En términos generales, la correlación entre los dos procedimientos es buena según lo observado en la tabla E mediante la comparación de la concordancia entre los resultados 0, 100 y 200 de la tira con los resultados del inmunoanálisis a <50, 50-150 y \geq 150 UI/ml. Los intervalos y las ecuaciones de descodificación usadas para obtener los valores para 0, 100 y 200 en los que una descodificación de \geq275 es un "0", 200-275 es un "100" y una descodificación de <200 es un resultado de tira de "200". Las concordancias positiva y negativa fueron del 66,7% y 88,5% para el procedimiento inmunológico en un umbral de 50 UI/ml y dentro del intervalo razonable para un ensayo de tira. Se descubrió que los individuos normales tienen <50 UI/ml en el 99% de los casos.

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TABLA E Tabla de verdad para el resultado de IT con el procedimiento de referencia de inmunoanálisis frente al resultado de IT con la tira de ensayo

Resultado del IT con la tira (U/ml)	Resultado del IT con el inmunoanálisis (U/ml)	Total
<50	50-150	>150
0	639 (89,5%)	\, 66 (36,4%)		705
100	74 (10,4%)	108 (39,7%)	\, 2 (11,8%)	184
200	1 (0,1%)	\, 7 (3,9%)	15 (88,2%)	\, 23

Total	714 (78,2%)	181 (19,9%)	17 (1,9%)	912

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De las muestras clínicas de orina, se analizaron adicionalmente 898 usando una tira de creatinina según lo descrito en la patente estadounidense 5.733.787 y el ensayo cuantitativo de creatina de Jaffe en un analizador Cobas-Fara. En la tabla G, se muestra una tabla de verdad que muestra la correlación entre la proporción del ensayo con la tira del ejemplo IV proporcional a la tira de creatinina en comparación con el ensayo del inhibidor de la tripsina en líquidos inmunológicos proporcional al procedimiento de referencia de la creatinina. El procedimiento de referencia de la creatinina fue el ensayo comercialmente disponible para el instrumento COBAS-FARA de Roche Dignostics. En términos generales, la correlación entre los dos procedimientos fue buena, según lo determinado mediante la comparación de los resultados de la tira con los resultados del inmunoanálisis a los tres niveles, es decir, <50 UI /g; 50-150 UI/g y >150 UI/g, que representan muestras clínicamente normales, anormales y muy anormales. Se obtiene un resultado de la proporción de descodificación dividiendo la descodificación del reactivo de IT entre la descodificación del reactivo de creatina. La descodificación de la creatinina es la reflectancia en la longitud de onda roja / reflectancia en la longitud de onda verde. El resultado de la proporción de descodificación de \geq85 es un resultado de la tira de "0"; de 84,9 a 50 es un resultado de la tira de "100" y <50 es un resultado de la tira de "200". La concordancia de los resultados positivos y negativos con el inmunoanálisis en un umbral de <50 UI/g fue del 85,2% y 86,4%, que está dentro del intervalo razonable para el ensayo de tira.

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TABLA F Tabla de verdad para la proporción de IT/CRE mediante Inmunoanálisis y procedimientos de Jaffe frente a la proporción de IT/CRE mediante la tira

IT con la tira / CRE con la tira	IT con inmunoanálisis / CRE según Jaffe (UI/g)
(UI/ g) <50	50-150	>150
0	729 (86,4%)	\, 8 (16,3%)		737
100	111 (13,4%)	40 (81,6%)	1 (20%)	154
200	\, 2 (0,3%)	1 (2,1%)	4 (80%)	\; 7

Total	844 (94,0%)	49 (5,5%)	5 (0,5%)	898

Claims

1. Un ensayo para los inhibidores de la tripsina en la orina que comprende (a) poner en contacto una muestra de orina con un medio analítico tamponado, en el que el pH está tamponado a un nivel de 6,0 a 8,0, que está compuesto de (i) tripsina en una cantidad de 10 a 750 UI/ml, (ii) un sustrato de tripsina que producirá una respuesta detectable cuando se escinda por la tripsina presente a una concentración de 0,2 a 50 mM e (iii) una agente quelante policarboxílico presente en una cantidad de 0,2 a 50 mM; y (b) correlacionar la concentración del inhibidor de la tripsina con la respuesta detectable procedente de la escisión del sustrato, en el que el agente quelante policarboxílico reduce la variación en las cantidades detectadas de inhibidor de la tripsina causada por la presencia de iones de calcio presentes en la orina en referencia con una muestra de control carente de agente quelante policarboxílico.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en el que los reactivos de ensayo están en disolución.

3. El ensayo de la reivindicación 2, en el que el disolvente usado para formar la solución es un disolvente acuoso o aprótico polar.

4. El ensayo de la reivindicación 3, en el que el disolvente es agua, etanol, metanol, isopropanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, acetona, dimetilformamida o metiletilcetona.

5. El ensayo de la reivindicación 1, en el que los reactivos de ensayo están en una fase seca.

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que los reactivos de ensayo están impregnados en un dispositivo de prueba en seco de un material a través del cual la muestra de orina puede fluir mediante la inmersión del dispositivo de prueba en seco en un medio de ensayo tamponado con el posterior secado del disolvente.

7. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el agente quelante es ácido etilenglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',
N'-tetraacético (EGTA); ácido etilendiaminotretraacético (EDTA); ácido iminodiacético (IDA); ácido nitrilotriacético (NTA); ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido trietilentriamino-hexaacético (TTHA); ácido 2,3-propilendiamino-tetraacético (UEDTA) y ácido 1,2-diaminociclohexanotetraacético.

8. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la concentración de tripsina es de 100 a 500 UI/ml, el agente quelante está presente a una concentración de 10 a 25 mM y el pH está a un nivel de 7,0 a 8,0.

9. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el sustrato para la tripsina se selecciona del grupo constituido por derivados de arginina o lisina de 7-amino-4-metilcoumarina, 2-aminonaftaleno, 4-metoxi-2-amino-naftaleno, 3-carboxi-4-hidroxi-analina, 2-cloro-4-nitro-analina, 3-aminoindol, 2-aminoacridona, 2-aminobenzotiazol, 2-aminopirimidina, Rhodamina 110 y 6-aminoquinolina.

10. Un procedimiento para preparar un dispositivo de prueba para la determinación del inhibidor de la tripsina en la orina, que comprende poner en contacto un lecho de un material absorbente con una solución acuosa de tripsina y un agente quelante policarboxílico, seguido por el secado de la tira y la puesta en contacto de la misma con una solución disolvente de un sustrato para la tripsina con el posterior secado.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la solución disolvente de la reivindicación 11 contiene un tensioactivo no iónico de polioxialquilo.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el tensioactivo contiene unidades de etilenglicol.

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el sustrato de tripsina es 3-(N\alpha-tosil-N_{G}-nitro-L-arginiloxi)-5-fenilpirrol.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tampón es seleccionado del grupo que comprende (a) tampones que contienen grupos fosfato, (b) tampones que contienen grupos carboxilo y (c) tampones de Tris.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tampón se selecciona del grupo que comprende (a) tampones que contienen grupos fosfato y (b) tampones que contienen grupos carboxilo.