ES2201067T3 - Metodo de ensayo para componentes biologicos. - Google Patents
Metodo de ensayo para componentes biologicos.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN METODO DE ANALISIS PARA COMPONENTES BIOLOGICOS EN QUE EL PEROXIDO DE HIDROGENO GENERADO A PARTIR DE UNA REACCION ENZIMATICA ES DETECTADO CON PEROXIDASA Y UN REVELADOR DE COLOR CAPAZ DE OXIDARSE EN PRESENCIA DE UN SURFACTANTE ANFOTERICO Y UNA FERROCIANIDA. INCLUSO CUANDO EL COMPONENTE BIOLOGICO A DETECTAR ESTA PRESENTE EN CANTIDAD MUY PEQUEÑA, LA INTERFERENCIA DE LA BILIRRUBINA PUEDE ELIMINARSE EN ANALISIS DE COMPONENTES BIOLOGICOS EN QUE LA PEROXIDASA GENERADA A PARTIR DE UNA REACCION ENZIMATICA SE DETECTA EMPLEANDO PEROXIDASA Y REVELADOR DE COLOR CAPAZ DE OXIDARSE.
Description
Método de ensayo para componentes biológicos.
La presente invención se refiere a un método de
ensayo para componentes biológicos que no se ve afectado por la
presencia de bilirrubina. Más particularmente, la presente invención
se refiere a un método de ensayo para componentes biológicos que se
lleva a cabo detectando, usando peroxidasa y un revelador del color
capaz de ser oxidado, peróxido de hidrógeno generado a partir de una
reacción enzimática, y que está libre de los errores adscritos a la
bilirrubina.
Los análisis enzimáticos emplean enzimas como
reactivos analíticos. Son superiores a otros métodos de ensayo que
dependen de reacciones químicas con respecto a la especificidad.
Además, las reacciones enzimáticas transcurren en condiciones
suaves. Debido a estas características, los análisis enzimáticos
están fácilmente automatizados, y por lo tanto se usan ampliamente
en el campo de la química clínica.
En algunos casos, sin embargo, los análisis
enzimáticos se ven interferidos con diversos tipos de impurezas en
las muestras biológicas en un grado que no se puede desatender
cuando es necesario un ensayo preciso. En tales casos, la sustancia
objetivo no es necesariamente la única sustancia que se analiza.
Particularmente, se sabe que la bilirrubina en muestras biológicas
afecta a la determinación colorimétrica en la que se hace reaccionar
una enzima oxidante adecuada con una sustancia a analizar, y se pone
en contacto el peróxido de hidrógeno generado con un reactivo para
revelar el color en presencia de peroxidasa ("Japanese Journal of
Clinical Chemistry", vol 8, No. 1, 63-72 (1980)).
Por lo tanto, en la determinación de componentes en trazas de
cuerpos vivos, la interferencia por bilirrubina es un problema que
no se puede ignorar.
A fin de evitar los efectos por la bilirrubina,
se han desarrollado diversos métodos, que incluyen un método con
bilirrubin-oxidasa ("Clinical Chemistry", 30/8,
1389-1392 (1984)), un método aminopirínico
("Clinical Chemistry", 27/11, 1941-1942
(1980)), un método con ferrocianuro potásico ("Clinical
Chemistry", 26(2), 227-231 (1980)), y un
método con albúmina-aminopirina (Publicación de
Patente Japonesa (kokoku) nº 4-61640).
Recientemente, también se ha dado a conocer un método que emplea
ferrocianuro potásico y albúmina en combinación (Solicitud de
Patente Japonesa Abierta al Público (kokai) nº
60-228963).
El documento EP 0.402.094 A2 describe un método
para evitar las influencias de la bilirrubina y la hemoglobina en la
medida de un componente de un fluido corporal mediante un método
enzimático que usa un reactivo de color oxidable.
El procedimiento para medir un sustrato o una
actividad enzimática en un fluido corporal comprende hacer actuar
una oxidasa que corresponde a un analito a medir sobre el analito, o
hacer actuar una oxidasa que corresponde a una sustancia producida
por reacción enzimática sobre la sustancia, en un sistema de medida,
y midir el peróxido de hidrógeno producido, ópticamente mediante el
uso de un reactivo de color oxidable, comprendiendo dicho sistema de
medida al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de
tensioactivos catiónicos y tensioactivos anfóteros a fin de evitar
las influencias de las sustancias que interfieren en la medida
presentes en el fluido corporal.
Sin embargo, ninguno de estos métodos anteriores
tiene éxito eliminando completamente la interferencia por
bilirrubina, particularmente cuando se analizan componentes en
trazas. Además, los propios reactivos tienen problemas; es decir,
tienden a colorearse, o se degradan las proteínas contenidas en
ellos.
En vista de lo anterior, en la presente invención
se han llevado a cabo estudios detallados y se ha encontrado que,
cuando se combina un tensioactivo anfótero con análisis
convencionales para componentes biológicos que usan ferrocianuros,
se puede eliminar notablemente la interferencia por bilirrubina
incluso aunque el componente biológico objetivo a detectar esté
presente sólo en una cantidad muy pequeña, conduciendo a la
realización de la presente invención.
En consecuencia, un objeto de la presente
invención es proporcionar un método de ensayo para componentes
biológicos en el que se detecta peróxido de hidrógeno, generado a
partir de una reacción enzimática, con peroxidasa y un revelador del
color capaz de ser oxidado en presencia de un tensioactivo anfótero
y un ferrocianuro.
El método de ensayo para componentes biológicos
que comprende la adición, a una muestra, de un primer reactivo en el
que está contenido el tensioactivo anfótero, pero no está contenido
el ferrocianuro, y la adición subsiguiente de un segundo reactivo en
el que está contenido sólo el ferrocianuro, o en combinación con el
tensioactivo anfótero, en el que la adición del segundo reactivo
comienza la reacción y ocurre al menos la siguiente primera etapa
(A) y segunda etapa (B):
Etapa
A
(i) una etapa de reacción para generar un
sustrato de oxidasa, cuando sea necesario;
Etapa
B
una etapa de reacción para generar inicialmente
peróxidos de hidrógeno mediante reacción con oxidasa, y detectar
entonces los peróxidos de hidrógeno generados con peroxidasa y un
revelador del color capaz de ser oxidado.
El objeto anterior y otros objetos,
características y ventajas de la presente invención serán
manifiestas a partir de la siguiente descripción.
La Fig. 1 muestra curvas de absorción en el
intervalo de 300 a 700 nm, en las que se añade un tensioactivo
(curva (b)) o no se añade (curva (a)) a bilirrubina.
No hay limitación particular en los tensioactivos
anfóteros que se pueden usar en la presente invención. Por ejemplo,
se pueden usar alquilimidazoliobetaína, alquilbetaína,
alquilamidabetaína, alquilalanina, óxido de alquilamina, y sus
derivados. Los grupos alquilo de estos tensioactivos anfóteros
tienen cada uno preferiblemente 6 a 20 átomos de carbono. Ejemplos
específicos de tensioactivos anfóteros comercialmente disponibles
incluyen Anhitol 24B (derivado de alquilbetaína, de Kao), Anhitol
20Y (derivado de alquilimidazoliobetaína, de Kao), Enagycol
C-40H (derivado de alquilimidazoliobetaína, de
Lion), Lipomin CH (derivado de alquilimidazoliobetaína, de Lion),
Enagycol C-30B (derivado de alquilamidabetaína, de
Lion), y Anhitol 20N (derivado de óxido de alquilamina, de Kao). Se
prefiere que los tensioactivos anfóteros se usen de 0,01 a 10% en
peso, y de forma particularmente preferible de 0,1 a 5% en peso en
el sistema de detección.
Los ferrocianuros usados en la presente invención
son, por ejemplo, ferrocianuros de metales alcalinos tales como
ferrocianuro de potasio y ferrocianuro de sodio. Se prefiere que los
ferrocianuros se usen de 1 a 100 \muM, y particularmente de forma
preferible de 5 a 50 \muM, en el sistema de detección.
Los reveladores del color usados en la presente
invención, que se pueden oxidar, son preferiblemente combinaciones
de 4-aminofenazona (particularmente,
4-aminoantipirina) y dadores de hidrógeno tales
como fenoles o anilinas. Ejemplos de los fenoles dadores de
hidrógeno incluyen fenol y p-clorofenol, y ejemplos
de las anilinas dadoras de hidrógeno incluyen
N-alquil-N-sulfoalquil-m-toluidina
y N,N-dialquilanilina.
El método de ensayo de la presente invención es
aplicable a cualquier ensayo de colorimetría en el que se hace
reaccionar una enzima con un componente biológico para generar
peróxido de hidrógeno, y el peróxido de hidrógeno se hace reaccionar
con un revelador del color capaz de ser oxidado en presencia de
peroxidasa. Los componentes biológicos son componentes que coexisten
con la bilirrubina en organismos vivos, tales como componentes en la
sangre (sangre completa, plasma, y suero) y orina. Ejemplos
específicos de los componentes biológicos incluyen triglicérido,
glucosa, fosfolípidos (lecitina, esfingomielina, y lisolecitina),
colesterol total, ácidos grasos libres, ácido úrico, colinesterasa,
creatinina, y creatina.
Las enzimas que se hacen reaccionar con los
componentes biológicos mencionados anteriormente no están
particularmente limitadas en tanto que en último lugar generen
peróxido de una forma o de otra. Ejemplos específicos de las enzimas
incluyen lipoprotein-lipasa, gliceroquinasa,
glicerol-3-fosfato-oxidasa,
glucosa-oxidasa, fosfolipasa D,
colin-oxidasa, colesterol-esterasa,
colesterol-oxidasa,
acil-CoA-sintetasa,
acil-CoA-oxidasa, uricasa,
colinesterasa, y colinoxidasa.
A continuación se ilustran ejemplos de sistemas
de reacción enzimática en los que se hacen reaccionar las enzimas
anteriores.
Es innecesario decir que, en las reacciones en
las que se hace reaccionar un componente biológico con una enzima
según se muestra mediante los esquemas anteriores, se pueden usar,
según se deseen, coenzimas y sustratos.
Al terminar la reacción enzimática para generar
peróxido de hidrógeno y la reacción subsiguiente para detectar el
peróxido de hidrógeno generado, la cantidad de los colorantes
generada se determina para medir de forma precisa la cantidad del
componente biológico objetivo.
La presente invención se describirá
adicionalmente por medio de ejemplos, que no se deben interpretar
como limitantes de la invención.
Ejemplo 1 de
Referencia
La Fig. 1 muestra una curva de absorción de
bilirrubina (curva (a)), y una curva de absorción de bilirrubina a
la que se añade un tensioactivo anfótero (curva (b)).
En detalle, la curva (a) representa la absorción
cuando se añaden 2,6 ml de un tampón a 70 \mul de una disolución
de bilirrubina, mientras que la curva (b) representa la absorción
cuando se añaden 2,6 ml de un tampón que contiene 0,39% en peso de
laurilbetaína a 70 \mul de una disolución de bilirrubina, ambas en
el intervalo de 300 a 700 nm.
Como es manifiesto a partir de la Fig. 1, la
curva de absorción de bilirrubina (a) se desplaza hasta una curva
(b) de absorción peculiar y diferente cuando se añade laurilbetaína
a la bilirrubina. A partir de esto, se infiere que se altera la
estructura estereoquímica de la bilirrubina por la presencia de un
tensioactivo anfótero, y como resultado se hace difícil que sirva
como un sustrato de peroxidasa, cancelando la competición con un
revelador del color capaz de ser oxidado. En un método de ensayo en
el que se use un tensioactivo anfótero y un ferrocianuro en
combinación, estos dos producen efectos sinérgicos para potenciar
el efecto de la invención.
Las muestras usadas fueron sueros humanos a los
que se añadió bilirrubina a diversas concentraciones
predeterminadas. La cantidad de ácido úrico en las muestras se
determinó usando reactivos para analizar ácido úrico formulado según
se muestra en la Tabla 1, y se investigó el efecto de la
bilirrubina.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Método de
Ensayo
Se añadió un primer reactivo (260 \mul) a una
muestra (70 \mul), y se agitó la mezcla. La mezcla se calentó
entonces a 37ºC durante 5 minutos. Se midió la absorción a una
longitud de onda de 546 nm usando un blanco (no reactivo) como un
control (absorción I).
Después, se añadió posteriormente un segundo
reactivo (130 \mul) a la mezcla, y se calentó a 37ºC durante 5
minutos. Se midió la absorción a una longitud de onda de 546 nm
usando un blanco (no reactivo) como un control (absorción II). Como
blancos, se usó agua pura. A partir de las absorciones I y II así
obtenidas, se calculó la absorción de la muestra según la siguiente
ecuación:
Absorción de la muestra =
absorción II - [absorción I
x
\frac{volumen \ de \ la \
muestra + volumen \ de \ primer \ R}{volumen \ de \ la \ muestra \ +
\ volumen \ de \ primer \ R \ + \ volumen \ de \ segundo \
R}]
(R representa "reactivo").
También se trataron de forma similar a la
descrita anteriormente disoluciones de ácido úrico de
concentraciones conocidas, y se calcularon sus absorciones. Los
resultados se compararon con la absorción de la muestra, y se obtuvo
la concentración de ácido úrico de la muestra.
Los resultados se muestran en la Tabla 2. Como es
manifiesto de la Tabla 2, los métodos convencionales, en los que no
se añadió nada (Ejemplo Comparativo 1), se añadió ferrocianuro
potásico sólo (Ejemplo Comparativo 2), o se añadió ferrocianuro
potásico y albúmina de suero bovino en combinación (Ejemplo
Comparativo 3), presentaron resultados considerablemente bajos de
medidas a medida que aumentaron las cantidades de bilirrubina en
las muestras. Por contra, en los métodos de ensayo de la presente
invención, en los que se usaron en combinación el ferrocianuro
potásico y un tensioactivo anfótero (Ejemplos 1 a 3 de la
Invención), se eliminó con bastante éxito la interferencia por
bilirrubina.
| Concentración de bilirrubina | Medidas de ácido úrico (mg/dl) | |||||
| en las muestras (mg/dl) | Ejemplos Comparativos | Ejemplos de la Invención | ||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| 0 | 4,5 | 4,4 | 4,3 | 4,4 | 4,5 | 4,5 |
| 5 | 2,1 | 4,0 | 4,0 | 4,4 | 4,5 | 4,3 |
| 10 | 1,1 | 3,6 | 3,6 | 4,4 | 4,4 | 4,3 |
| 15 | 0,7 | 3,2 | 3,2 | 4,3 | 4,3 | 4,2 |
| 20 | 0,5 | 2,8 | 2,9 | 4,2 | 4,3 | 4,2 |
| 30 | 0,4 | 2,1 | 2,3 | 4,1 | 4,2 | 4,0 |
| 50 | 0,3 | 1,1 | 1,5 | 4,0 | 4,0 | 3,8 |
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1
(medidas de ácido úrico), excepto que se usaron los diversos
tensioactivos mostrados en la Tabla 3 en lugar de los tensioactivos
en la Tabla 1, y se añadió 0,5% en peso de cada tensioactivo a ambos
reactivos primero y segundo. Se comparó el comportamiento de los
tensioactivos eliminando la interferencia por bilirrubina.
Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los
estándares para la evaluación del efecto mostrado en la Tabla 3
fueron los siguientes.
\newpage
La evaluación se basó en la diferencia entre la
medida de ácido úrico obtenida cuando la concentración de
bilirrubina en la muestra fue 0 mg/dl y la obtenida cuando la
concentración de bilirrubina en la muestra fue 50 mg/dl.
| 0 a 0,5: | A |
| 0,6 a 1,0: | B |
| 1,1 a 3,0: | C |
| 3,1 o más: | B |
Como es manifiesto a partir de la Tabla 3, el
tensioactivo anfótero fue notablemente superior a los otros tipos
de tensioactivos eliminando la interferencia de bilirrubina.
| Tensioactivos | Medidas de ácido úrico (mg/dl) | Evaluación | |
| conc. de bilirrubina = 0 | conc. de bilirrubina | del | |
| mg/dl | = 50 mg/dl | efecto | |
| (no añadido) | 4,4 | 1,5 | D |
| Tensioactivo anfótero: | |||
| laurilbetaína | 4,7 | 4,3 | A |
| Tensioactivos aniónicos: | |||
| laurilsulfato de trietanolamina | 3931,1 | 1378,3 | D |
| laurilsulfato de amonio | -no se pudo medir- | D | |
| alquilnaftalensulfonato de sodio | 3055,4 | 1528,9 | D |
| polioxietilenlauriletersulfato de sodio | 21,4 | 4,5 | D |
| polioxietilenalquiletersulfato de sodio | 4,5 | 1,7 | D |
| polioxietilenalquiletersulfato de trietanolamina | 14,7 | 0,5 | D |
| polioxietilenalquilfeniletersulfato de sodio | 30,0 | 5,4 | D |
| Tensioactivo catiónico: | |||
| cloruro de cetiltrimetilamonio | -5,1 | -6,7 | D |
| Tensioactivos no iónicos: | |||
| polioxietilenlauriléter | 4,4 | 3,2 | C |
| polioxietilenoleiléter | 4,3 | 1,0 | D |
| polioxietilen-alcohol superior-éter | 50,3 | 45,2 | D |
| polioxietilen-nonilfeniléter | 4,5 | 3,4 | C |
| derivado polioxietilénico | 4,4 | 3,2 | C |
| ácido tetraoleico polioxietilensorbitol | 4,5 | 2,0 | C |
Las muestras usadas fueron sueros humanos a los
que se añadió bilirrubina a diversas concentraciones
predeterminadas. De manera similar a la descrita en el Ejemplo 2,
se analizó el triglicérido usando los reactivos formulados como se
muestran en la Tabla 4, y se investigó el efecto de la
bilirrubina.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
| Ejemplo | Ejemplos de la Invención | ||
| Comparativo | |||
| 4 | 4 | 5 | |
| Reactivo Primero | |||
| Acido 2-(N-morfolino)etanosulfónico | 200 mM | 200 mM | 200 mM |
| Gliceroquinasa | 0,9 u/ml | 0,9 u/ml | 0,9 u/ml |
| Glicero-3-fosfato-oxidasa | 3,75 u/ml | 3,75 u/ml | 3,75 u/ml |
| Peroxidasa | 1,95 u/ml | 1,95 u/ml | 1,95 u/ml |
| 3,5-dimetoxi-N-etil-N-(2-hidroxi-3- | 1,75 mM | 1,75 mM | 1,75 mM |
| sulfopropil)anilina sódica | |||
| Alquilbetaína^{1)} | - | 0,26% en peso | - |
| Alquilimidazoliobetaína^{2)} | - | - | 0,29% en peso |
| Reactivo Segundo | |||
| Acido 2-(N-morfolino)etanosulfónico | 200 mM | 200 mM | 200 mM |
| 4-Aminoantipirina | 1,5 mM | 1,5 mM | 1,5 mM |
| Lipoproteína lipasa | 900 u/ml | 900 u/ml | 900 u/ml |
| Alquilbetaína^{1)} | - | 0,26% en peso | - |
| Alquilimidazoliobetaína^{2)} | - | - | 0,29% en peso |
| Ferrocianuro Potásico | 7,5 \muM | 7,5 \muM | 7,5 \muM |
En la Tabla 4, los números son concentraciones en
reactivos.
1) Anhitol 24B (Kao)
2) Anhitol 20Y (Kao)
| Concentración de | Medidas de triglicérido (mg/dl) | ||
| bilirrubina en las muestras | Ej. Comp. | Ej. Invención | Ej. Invención |
| (mg/dl) | 4 | 4 | 5 |
| 0 | 93 | 93 | 93 |
| 10 | 87 | 92 | 92 |
| 20 | 71 | 92 | 92 |
| 30 | 59 | 91 | 93 |
| 50 | 46 | 92 | 90 |
Como es manifiesto a partir de la Tabla 5, el
método convencional (Ejemplo Comparativo 4) dio valores bajos de las
medidas a medida que aumentó la cantidad de bilirrubina en la
muestra, mientras que los métodos de la presente invención
(Ejemplos 4 y 5 de la Invención), en los que se usó ferrocianuro
potásico y un tensioactivo anfótero, eliminaron de forma exitosa la
interferencia de bilirrubina.
Las muestras usadas fueron sueros humanos a los
que se añadió bilirrubina a diversas concentraciones
predeterminadas. De forma similar a la descrita en el Ejemplo 2, se
analizó el colesterol total usando los reactivos formulados como se
muestran en la Tabla 6, y se investigó el efecto de la
bilirrubina.
Los resultados se muestran en la Tabla 7.
| Ejemplo | Ejemplos de la Invención | ||
| Comparativo | |||
| 5 | 6 | 7 | |
| Reactivo Primero | |||
| Hidrogenonaftalato de potasio | 60 mM | 60 mM | 60 mM |
| 4-Aminoantipirina | 2,3 mM | 2,3 mM | 2,3 mM |
| Colesterol-oxidasa | 0,3 u/ml | 0,3 u/ml | 0,3 u/ml |
| Peroxidasa | 4,5 u/ml | 4,5 u/ml | 4,5 u/ml |
| Alquilbetaína^{1)} | - | 0,26% en peso | - |
| Óxido de alquilamina^{2)} | - | - | 0,53% en peso |
| Reactivo Segundo | |||
| Hidrogenoftalato de potasio | 60 mM | 60 mM | 60 mM |
| 3,5-dimetoxi-N-etil-N-(2-hidroxi- | 0,6 mM | 0,6 mM | 0,6 mM |
| -3-sulfopropil)anilina sódica | |||
| Colesterol-esterasa | 0,7 u/ml | 0,7 u/ml | 0,7 u/ml |
| Alquilbetaína^{1)} | - | 0,26% en peso | - |
| Óxido de alquilamina^{2)} | - | - | 0,53% en peso |
| Ferrocianuro potásico | 7,5 \muM | 7,5 \muM | 7,5 \muM |
En la Tabla 6, los números son concentraciones en
reactivos.
1) Anhitol 24B (Kao)
2) Anhitol 20N (Kao)
| Concentración de | Medidas de colesterol total (mg/dl) | ||
| bilirrubina en las muestras | Ej. Comp. | Ej. Invención | Ej. Invención |
| (mg/dl) | 5 | 6 | 7 |
| 0 | 169 | 168 | 168 |
| 10 | 154 | 165 | 166 |
| 15 | 148 | 167 | 169 |
| 20 | 142 | 166 | 165 |
| 30 | 132 | 166 | 169 |
| 50 | 110 | 166 | 166 |
Como es manifiesto a partir de la Tabla 7, el
método convencional (Ejemplo Comparativo 5) dio valores bajos de las
medidas a medida que aumentó la cantidad de bilirrubina en la
muestra, mientras que los métodos de la presente invención
(Ejemplos 6 y 7 de la Invención), en los que se usó ferrocianuro
potásico y un tensioactivo anfótero, eliminaron de forma exitosa la
interferencia de bilirrubina.
Según el método de ensayo de la presente
invención, incluso cuando el componente biológico a detectar está
presente en una cantidad en trazas, se puede eliminar efectivamente
la interferencia de bilirrubina en los ensayos de componentes
biológicos en los que se detecta peroxidasa generada a partir de una
reacción enzimática usando peroxidasa y un revelador del color
capaz de ser oxidado.
Claims (19)
1. Un método de ensayo para componentes
biológicos que comprende la adición, a una muestra, de un primer
reactivo en el que está contenido un tensioactivo anfótero, pero no
está contenido el ferrocianuro, y la adición subsiguiente de un
segundo reactivo en el que está contenido sólo el ferrocianuro o en
combinación con tensioactivo anfótero, en el que la adición del
segundo reactivo comienza la reacción y ocurre al menos la siguiente
primera etapa (A) y segunda etapa (B):
Etapa
A
(i) una etapa de reacción para generar un
sustrato de oxidasa, cuando sea necesario;
Etapa
B
una etapa de reacción para generar inicialmente
peróxidos de hidrógeno mediante reacción con oxidasa, y entonces
detectar los peróxidos de hidrógeno generados, con peroxidasa y un
revelador del color capaz de ser oxidado.
2. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que el tensioactivo anfótero se selecciona del grupo que
consta de alquilimidazoliobetaínas, alquilbetaínas,
alquilamidabetaínas, alquilalaninas, y óxidos de alquilamina, y sus
mezclas.
3. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que el revelador del color es 4-aminofenazona
y un dador de hidrógeno en combinación.
4. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que el componente biológico es un componente de sangre u
orina.
5. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que están presentes el tensioactivo anfótero y el
ferrocianuro, durante la detección del componente biológico, en una
cantidad de 0,01 a 10% en peso y de 1 a 100 \muM, respectivamente,
en el sistema sometido a detección.
6. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que los componentes biológicos en la muestra biológica son
componentes en trazas.
7. El método de ensayo según la reivindicación 1,
en el que los componentes biológicos se seleccionan del grupo que
consta de triglicérido, glucosa, fosfolípidos, colesterol total,
ácidos grasos libres, ácido úrico, colinesterasa, creatinina y
creatina.
8. El método de ensayo según la reivindicación 7,
en el que los fosfolípidos se seleccionan del grupo que consta de
lecitina, esfingomielina y lisolecitina.
9. El método de ensayo según la reivindicación 5,
en el que el ferrocianuro está presente en la cantidad de 5 a 50
\muM.
10. El método de ensayo según la reivindicación
5, en el que están presentes el tensioactivo anfótero y el
ferrocianuro, durante la detección del componente biológico, en una
cantidad de 0,1 a 5% en peso y de 5 a 50 \muM,
respectivamente.
11. Un método de ensayo colorimétrico según la
reivindicación 1, en el que los componentes biológicos coexisten con
bilirrubina en una muestra biológica.
12. Un método de ensayo para triglicéridos según
la reivindicación 11, en el que los triglicéridos en una muestra
biológica se hacen reaccionar con lipoprotein-lipasa
para formar glicerol, que se hace reaccionar con gliceroquinasa para
formar glicerol-3-fosfato, que se
hace reaccionar con
glicerol-3-fosfato-oxidasa
para generar peróxido de hidrógeno.
13. Un método de ensayo para glucosa según la
reivindicación 11, en el que la glucosa en una muestra biológica se
hace reaccionar con glucosa-oxidasa para generar
peróxido de hidrógeno.
14. Un método de ensayo para fosfolípidos según
la reivindicación 11, en el que los fosfolípidos en la muestra
biológica se hacen reaccionar con fosfolipasa D para formar colina,
que se hace reaccionar con colina-oxidasa para
generar peróxido de hidrógeno.
15. Un método de ensayo para colesterol total
según la reivindicación 11, en el que el colesterol de tipo éster en
una muestra biológica se hace reaccionar con
colesterol-esterasa para formar colesterol libre,
que se hace reaccionar con colesterol-oxidasa para
generar peróxido de hidrógeno.
16. Un método de ensayo para ácido graso libre
según la reivindicación 11, en el que el ácido graso libre en la
muestra biológica y CoA se hacen reaccionar con
acil-CoA-sintetasa para formar
acil-CoA, que se hace reaccionar con
acil-CoA-oxidasa para generar
peróxido de hidrógeno.
17. Un método de ensayo para ácido úrico según la
reivindicación 11, en el que el ácido úrico en una muestra biológica
se hace reaccionar con uricasa para generar peróxido de
hidrógeno.
18. Un método de ensayo para colinesterasa según
la reivindicación 11, en el que se hace reaccionar benzoilcolina en
una muestra biológica con colinesterasa para formar colina, que se
hace reaccionar con colina-oxidasa para generar
peróxido de hidrógeno.
19. Un método de ensayo para creatinina según la
reivindicación 11, en el que la creatinina en una muestra biológica
se hace reaccionar con creatininasa para formar creatina, que se
hace reaccionar con creatinasa para formar sarcosina, que se hace
reaccionar con sarcosin-oxidasa para generar
peróxido de hidrógeno.
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