JP4609012B2 - 生体成分測定用試薬及び測定方法 - Google Patents
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Description
第一試薬R1:クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、
第二試薬R2: クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体。
本発明の前処理工程とは、生体試料と前処理液を混合した状態でインキュベーションされる工程を意味し、測定対象物質はそのまま維持されるかまたは検出物質の前段階まで変換され、ビリルビンなどの還元物質はこの工程で分解等されて、測定対象物質の測定に対する影響を低減される。本前処理工程においては試料中の還元物質以外の妨害物質を除去する工程を含んでいてもよい。例えば妨害物質であるアスコルビン酸をアスコルビン酸オキシダーゼを用いて分解する工程が挙げられる。
該前処理液には、過酸化物を含む。過酸化物の量はビリルビン、溶血の還元性、色調変化を低減する濃度であればよく、通常、前処理工程において0.4nmol/L以上あればよいが、試薬ブランク反応を低減することを考慮すると0.4nmol/L〜5nmol/L以下が好ましく、更には0.5〜2nmol/Lとすることがより好ましい。測定対象物質の濃度により試薬ブランクの上昇が懸念される場合は、抗酸化剤を試薬に共存させることで、前処理工程における還元物質(ビリルビン、溶血など)との未反応の過酸化物を不活化することができ、試薬ブランクの上昇を抑制することができる。還元物質(ビリルビン、溶血など)と未反応の残存過酸化物の不活化は、検出開始試薬の添加までに実施されることが好ましく、また検出開始試薬中には過酸化物を含まないことが試薬ブランクの上昇を抑制する観点において望ましい。検出開始試薬中の過酸化物濃度は通常1.5nmol/L以下であり、好ましくは1.0nmol/L以下である。
Fresenius J Anal Chem 365巻、448−451ページ(1999) あるいは、市販の過酸化物測定試薬を使用することにより行なうことができる。(例えば、非特許文献2を参照。) 体外診断用医薬品 デタミナーLPO(協和メデックス社、承認番号(62AM)0669)の添付文書、平成14年3月改訂 本発明に用いられる抗酸化剤は、特に限定されないが、測定原理の特性により選択される必要があり、例えばα-トコフェロール、チオグリセロール、ブチルヒドロキシトルエン、メチオニン、酸化酵素として、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、NADHオキシダーゼ、アルキルハイドロペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどが挙げられる。
(実施例1〜4および比較例5〜6)
下記のクレアチニン測定試薬に、過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物はトリトンX−100 10gを透明試験管に入れ密封し、500ルクスの光を10℃、2週間照射して生成させた。トリトンX−100中の過酸化物濃度は、本操作前に0.07μmol/gであったが操作後には5μmol/gとなった。操作前後のトリトンX−100を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記クレアチニン測定試薬の第一試薬または第二試薬にトリトンX−100濃度として1g/Lになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。尚、過酸化物濃度は市販の過酸化脂質測定試薬「デタミナーLPO」(協和メデックス社製)を用い測定は本キットの用法用量のとおり実施した。
(試薬の調製)
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES−NaOH 80mM pH7.5
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製ASO−311) 5U/mL
ザルコシンオキシダーゼ(東洋紡社製SAO−351) 10U/mL
クレアチンアミジノヒドロラーゼ(東洋紡社製CRH−221) 30U/mL
カタラーゼ(東洋紡社製CAO−509) 100U/mL
TOOS 0.2g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 80mM pH7.5
クレアチニンアミドヒドロラーゼ(東洋紡社製CNH−311) 300U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 10U/mL
フェロシアン化カリウム 50mg/L
(測定法)
日立7170形自動分析機を用いた。試料4μLに第一試薬 180μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を60μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で546nmにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および5mg/dLクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
(実施例7〜10および比較例11〜12)
下記の中性脂肪測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、エマルゲン108を用い、実施例1の手順で生成させた。その結果、エマルゲン108中の過酸化物濃度は、本操作前に0.06μmol/gであったが操作後には3.4μmol/gとなった。操作前後のエマルゲン108を混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記中性脂肪測定試薬の第一試薬または第二試薬にエマルゲン108濃度として1g/Lになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
(試薬の調製)
下記組成からなる中性脂肪測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES 50mM pH7.0
MgCl2 0.2g/L
アデノシン3リン酸2Na塩 1.2g/L
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
フラビンアデニンジヌクレオチド2Na塩 8μmol/L
グリセロールキナーゼ(東洋紡社製GYK−311) 3U/mL
グリセロリン酸オキシダーゼ(東洋紡社製G3O−311) 5U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製ASO−311) 3U/mL
カタラーゼ(東洋紡社製) 200U/mL
第二試薬
HEPES−NaOH 50mM pH7.5
塩化マグネシウム・6水和物 0.2g/L
塩化カルシウム 0.1g/L
ADPS 0.3g/L
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 2.9U/mL
リパーゼ(東洋紡社製LPL−314) 2U/mL
フェロシアン化カリウム 5mg/L
(測定法)
日立7170形自動分析機を用いた。試料2.1μLに第一試薬 180μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を90μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で600nmにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および200mg/dLトリオレイン水溶液の測定吸光度より算出し中性脂肪濃度として求めた。
実施例13〜16及び比較例17〜18
下記のカルシウム測定試薬に過酸化物を濃度を変えて添加した。過酸化物は、ポリオキシエチレンオレイルエーテルを用い、実施例1の手順で生成させた。その結果、ポリオキシエチレンオレイルエーテル中の過酸化物濃度は、本操作前に0.0μmol/gであったが操作後には2.2μmol/gとなった。操作前後のポリオキシエチレンオレイルエーテルを混合調製して過酸化物濃度水準を作製し、下記カルシウム測定試薬の第一試薬または第二試薬にポリオキシエチレンオレイルエーテル濃度として1g/Lになるように添加した。調製後、各試薬の第一試薬、第二試薬の過酸化物の終濃度を測定した。
このようにして調製されたカルシウム測定試薬を用い、実施例1と同様の試料を測定し、試薬ブランク、ビリルビンC、ビリルビンF、溶血の影響を検討した。
第一試薬
トリス塩酸バッファー(pH7.1) 50mM
NaCl 200mM
1,2−ビス(o−アミノフェノキシ)エタン四酢酸 0.8mM
ガラクトシルマルトース 2.3mM
2−クロロ−4−ニトロフェニル−4−o−β−D−ガラクトピラノシル-α-マルトシド 0.9mM
第二試薬
グッド緩衝液(pH6.0) 300mM
NaCl 200mM
ガラクトシルマルトース 2.3mM
不活性化型α−アミラーゼ(ヒト唾液由来) 20IU/mL
(測定法)
日立7170形自動分析機を用いた。試料量3.5μlに第一試薬180μl加え、5分間予備加温した後、さらに第二試薬90μlを加えて反応を開始させ、該基質試液添加後2分後からの3分間における1分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム10mg/dl標準液での2点検量線に基づき試料中のカルシウム量を求めた。測定波長は、主波長405nm、副波長546nmとし、測定温度は37℃で実施した。
Claims (4)
- 中性脂肪、クレアチニン、カルシウム、クレアチン、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、無機リン、アミラーゼ、GOT、GPT、シアル酸、及びグアナーゼから選択される少なくとも1種の生体試料中の成分を測定する方法において、
(1)生体試料を前処理する工程であって、前処理液に含まれる総過酸化物濃度が0.4nmol/L〜5nmol/Lであり、かつ前処理液にポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含むことを特徴とする工程;及び
(2)0nmol/L〜1.5nmol/Lの過酸化物の存在下に工程(1)で前処理された生体試料中の成分を測定する工程
を包含する方法。 - 前処理液がさらに抗酸化剤を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 総過酸化物濃度が0.4nmol/L〜5nmol/Lであり、かつポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを含む生体試料の前処理液と、0nmol/L〜1.5nmol/Lの過酸化物を含む生体成分の検出開始液を含む、生体成分中の中性脂肪、クレアチニン、カルシウム、クレアチン、遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、無機リン、アミラーゼ、GOT、GPT、シアル酸、グアナーゼの測定試薬。
- 前処理液がさらに抗酸化剤を含むことを特徴とする、請求項3に記載の測定試薬。
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