CN109239354B - 一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有：缓冲液、EDTA、谷胱甘肽还原酶、还原型谷胱甘肽、氯化钾、氯化镁、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；试剂R2中含有：缓冲液、EDTA、NADPH、过氧化氢异丙基苯、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。同时公开了该试剂盒的制备方法和应用。本发明的试剂盒是一种灵敏度高、稳定性好的液体试剂盒。

Description

一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，还涉及所述谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。NADPH的减少量则和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。GSH-Px主要包括4种：分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。胞浆GSH-Px:由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用；血浆GSH-Px：构成与胞浆GSH-Px相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关；磷脂过氧化氢GSH-Px：是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化；胃肠道专属性GSH-Px:是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。
GSH-Px具有非常重要的生物学作用：1.清除脂类氢过氧化物:GSH-Px的主要作用是清除脂类氢过氧化物。GSH-Px可催化LPO分解生成相应的醇,防止LPO均裂和引发脂质过氧化作用的链式支链反应,减少LPO的生成以保护机体免受损害。2.清除H2O2:脑与精子中几乎不含过氧化氢酶，而含较多的GSH-Px，代谢中产生的H2O2可以被GSH-Px清除。即使含过氧化氢酶较多的组织，仍需GSH-Px清除H2O2，因为在细胞中过氧化氢酶多存在于微体，而在胞浆和线粒体中却很少，组织中较多的GSH-Px可及时清除H2O2；如有的病人缺乏产生过氧化氢酶的基因，但GSH-Px可清除H2O2，故H2O2损伤组织不明显。3.减轻有机氢过氧化物对机体的损伤:在病理生理情况下，活性氧如·OH可能诱发脂类过氧化，除了直接造成生物膜损伤外，还可以通过脂类氢过氧化物与蛋白质、核酸反应，使机体发生广泛性损伤。如果GSH-Px清除脂类氢过氧化物能力不受影响，机体的损伤就可减轻。除了脂类氢过氧化物外，还可能出现其他有机氢过氧化物，如核酸氢过氧化物、胸腺嘧啶氢过氧化物，这两者属于致突变剂，GSH-Px清除有机氢过氧化物的作用可降低致突发生率。脂类过氧化也是细胞老化的原因之一，预防脂类过氧化可延缓细胞老化，所以GSH-Px在预防衰老方面起到重要作用。4.参与前列腺素合成的调节:前列腺素在体内分布较广，其合成原料为花生四烯酸。但在环氧酶与脂氧合酶的作用下，花生四烯酸尚可氧化成某些氢过氧化物(ROOH)。这些氢过氧化物显著干扰前列腺素的生物合成。在GSH-Px的作用下，ROOH可转变为无活性物质(ROH)，故GSH-Px对前列腺素的生物合成起到调节作用。5.其他作用:硒和GSH系统在氧化防御反应中起着关键作用。其他含硒蛋白也有抗氧化特性。硒蛋白和有机硒复合物可以催化过亚硝酸盐反应生成NO2，在预防过亚硝酸盐的生成中也起着重要作用，可以保护细胞免受过亚硝酸盐的损害。
目前国内测定谷胱甘肽过氧化物酶的方法主要为Elisa法，需要手工操作，步骤比较繁琐，耗时较长，价格也比较贵。目前国内能在全自动生化分析以上使用的试剂为紫外酶法谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒，为进口干粉试剂，虽然结果准确，但是价格不菲，使用前需要复溶，操作不方便。复溶后需要尽快使用，使用非常不方便并且复溶后使用不完会出现大量的浪费。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种灵敏度高、稳定性好的液体试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分：缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、谷胱甘肽还原酶0.5-2KU/L、还原型谷胱甘肽4-8mmol/L、氯化钾5-10g/L、氯化镁0.1-0.5g/L、表面活性剂1-5ml/L、稳定剂1-20g/L、防腐剂0.5-2g/L；
试剂R2中含有以下成分：缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、NADPH 1-1.5mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.2-0.5mmol/L、表面活性剂1-5ml/L、稳定剂1-20g/L、防腐剂0.5-2g/L。
优选地，试剂R1的pH值为6.5-7.5；试剂R2的pH值为9.0-10.0。
优选地，试剂R1中所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种；试剂R2中所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种。
优选地，试剂R1中所述的表面活性剂为曲拉通100、吐温20、花王709、花王909、花王B66、花王A90、胆酸钠和Brij35中的一种或多种；试剂R2中所述的表面活性剂为曲拉通100、吐温20、花王709、花王909、花王B66、花王A90、胆酸钠和Brij35中的一种或多种。
优选地，试剂R1中所述的稳定剂为海藻糖、蔗糖、乙二醇、酪氨酸中的一种或多种；试剂R2中所述的稳定剂为海藻糖、蔗糖、乙二醇、酪氨酸中的一种或多种。
优选地，试剂R1中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种；试剂R2中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。
更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
上述所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)试剂R1的配制：取适量水，分别加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值6.5-7.5，定容到所需体积。(2)试剂R2的配制：取适量水，分别加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值9.0-10.0，定容到所需体积。
上述所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶的浓度。
本发明谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒原理为谷胱甘肽过氧化物酶GPX通过过氧化氢异丙基苯催化还原性谷胱甘肽(GSH)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在谷胱甘肽转移酶GR和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的存在下，谷胱甘肽氧化产物GSSG被立即还原，同时NADPH氧化生成的辅酶Ⅱ(NADP+)。其氧化的速率与血清中GPX的活性成正比，在340nm处测定NADPH吸光度下降的速率，即可计算出GPX活性。
本发明的有益效果：
1.本发明稳定的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。
2.本发明可以提高酶的反应活性，进而提高测定的灵敏度。
3.本发明保护了酶和其他原料成分，提高了试剂的稳定性，2-8℃开瓶保存可稳定30天，2-8℃未开封试剂可稳定12个月，完全满足临床检验的需要。
附图说明
图1为本发明实施例1谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒与对比例2、3、4试剂盒的热稳定性浓度变化。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本发明试剂盒测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶的测试条件为：方法：速率法；主/副波长：340nm/405nm；温度：37℃；校正类型：线性；校准方法：两点定标；反应方向：向下。
具体操作如表1所示。
表1谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂操作步骤
计算结果：
样本要求：
1.不溶血血清。
2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。
实施例1
试剂R1的组分为：Tris缓冲液100mmol/L、EDTA 0.5mmol/L、谷胱甘肽还原酶1KU/L、还原型谷胱甘肽5mmol/L、氯化钾6g/L、氯化镁0.3g/L、吐温20 1ml/L、酪氨酸1g/L、叠氮钠0.5g/L；
试剂R2中的组分为：Tris缓冲液100mmol/L、EDTA 0.5mmol/L、NADPH 1mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.3mmol/L、曲拉通100 1ml/L、蔗糖5g/L、叠氮钠0.5g/L。
试剂R1的pH值为7.0；试剂R2的pH值为9.5；
制备方法:(1)试剂R1的配制：取适量水，分别加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需PH值，定容到所需体积。(2)试剂R2的配制：取适量水，分别加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到所需PH值，定容到所需体积。
实施例2
试剂R1的组分为：Tris缓冲液80mmol/L、EDTA 0.8mmol/L、谷胱甘肽还原酶1.2KU/L、还原型谷胱甘肽6mmol/L、氯化钾8g/L、氯化镁0.4g/L、吐温20 1ml/L、蔗糖8g/L、叠氮钠1g/L；
试剂R2中的组分为：Tris缓冲液80mmol/L、EDTA 0.9mmol/L、NADPH 1mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.3mmol/L、吐温20 1ml/L、蔗糖8g/L、叠氮钠1g/L。
试剂R1的pH值为7.0；试剂R2的pH值为9.8；
实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例3
试剂R1的组分为：磷酸盐缓冲液50mmol/L、EDTA 1mmol/L、谷胱甘肽还原酶2KU/L、还原型谷胱甘肽5mmol/L、氯化钾6g/L、氯化镁0.3g/L、花王B66 1ml/L、酪氨酸1g/L、叠氮钠0.5g/L；
试剂R2中的组分为：Tris缓冲液50mmol/L、EDTA 1mmol/L、NADPH 1mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.5mmol/L、花王B66 1ml/L、蔗糖5g/L、叠氮钠0.5g/L。
试剂R1的pH值为7.5；试剂R2的pH值为10.0；
实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例4
试剂R1的组分为：甘氨酸缓冲液100mmol/L、EDTA 0.9mmol/L、谷胱甘肽还原酶1.1KU/L、还原型谷胱甘肽6mmol/L、氯化钾6g/L、氯化镁0.3g/L、吐温20 1ml/L、酪氨酸1g/L、硫酸庆大霉素0.5g/L；
试剂R2中的组分为：三乙醇胺缓冲液100mmol/L、EDTA 0.9mmol/L、NADPH1.2mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.4mmol/L、吐温20 1ml/L、蔗糖5g/L、硫酸庆大霉素0.5g/L。
试剂R1的pH值为7.2；试剂R2的pH值为9.8；
实施例4试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例5
试剂R1的组分为：磷酸盐缓冲液50mmol/L、EDTA 1mmol/L、谷胱甘肽还原酶1.8KU/L、还原型谷胱甘肽5.5mmol/L、氯化钾6.5g/L、氯化镁0.3g/L、花王B66 1ml/L、酪氨酸1g/L、叠氮钠0.6g/L；
试剂R2中的组分为：Tris缓冲液80mmol/L、EDTA 0.9mmol/L、NADPH 1.3mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.35mmol/L、吐温20 1ml/L、蔗糖7g/L、叠氮钠0.6g/L。
试剂R1的pH值为7.5；试剂R2的pH值为9.7；
实施例5试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例6
试剂R1的组分为：Tris缓冲液100mmol/L、EDTA 0.5mmol/L、谷胱甘肽还原酶1.5KU/L、还原型谷胱甘肽6mmol/L、氯化钾6.5g/L、氯化镁0.4g/L、吐温20 1ml/L、酪氨酸1.5g/L、叠氮钠0.5g/L；
试剂R2中的组分为：三乙醇胺缓冲液100mmol/L、EDTA 0.8mmol/L、NADPH1.2mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.45mmol/L、吐温20 1ml/L、蔗糖6g/L、硫酸庆大霉素0.5g/L。
试剂R1的pH值为7.0；试剂R2的pH值为9.8；
实施例6试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例7
试剂R1的组分为：甘氨酸缓冲液90mmol/L、EDTA 1.1mmol/L、谷胱甘肽还原酶1.1KU/L、还原型谷胱甘肽6mmol/L、氯化钾6.5g/L、氯化镁0.35g/L、花王709 1ml/L、酪氨酸1g/L、叠氮钠0.5g/L；
试剂R2中的组分为：Tris缓冲液85mmol/L、EDTA 1.1mmol/L、NADPH 1mmol/L、过氧化氢异丙基苯0.33mmol/L、花王709 1ml/L、蔗糖8g/L、叠氮钠1g/L。
试剂R1的pH值为7.1；试剂R2的pH值为9.7；
实施例7试剂盒的制备方法同实施例1。
对比实施例1
市售的进口谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒
对比实施例2
与实施例1中谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含吐温20，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例3
与实施例1中谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含酪氨酸，其他与实施例1相同，此处不再累述。
对比实施例4
与实施例1中谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中不含叠氮钠，其他与实施例1相同，此处不再累述。
性能检测
试验一
取40份在检测浓度范围内不同浓度的人源血清样品，以对实施例1(此处以实施例1为例，也可以为本发明的其他实施例)作为比对试剂，分别测定40个样本，每个样本测定一次。对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对实施例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。见表2
表2实施例1与对比实施例1的相对偏差和相关系数
结论：从表2可知：实施例1和对比实施例1的相对偏差最大值为-4.71％，相关系数r为0.9991，说明实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1与进口试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂。
实验二 灵敏度试验：
用本发明实施例1(此处以实施例1为例，也可以为本发明的其他实施例)测定浓度为65U/L的样品。应符合技术要求中分析灵敏度要求(用本试剂测试谷胱甘肽过氧化物酶时，1单位浓度引起的吸光度变化率(ΔA/min)不小于0.6×10-4)。见表3
表3灵敏度实验
结论：从表3可知：实施例1测定的分析灵敏度为4×10-4，远大于技术要求的数值，说明实施例1的灵敏度高。
实验三 稳定性检测：
将本发明实施例(此处以实施例1为例，也可以为本发明的其他实施例)和对比例2、3、4中的试剂一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为65±6.5U/L的质控品，监测质控品的变化。见表4
表4实施例1和对比实施例2、实施例3、实施例4的质控品浓度变化。
时间 实施例1 对比实施例2 对比实施例3 对比实施例4
1天 65.5 65.5 65.5 65.5
2天 65.2 64.5 64.6 63.6
3天 65.2 63.4 63.0 62.1
4天 64.9 62.3 62.1 60.8
5天 64.7 61.0 60.7 60.0
6天 64.6 60.2 59.8 58.2
7天 64.3 59.2 57.9 57.0
8天 64.1 57.7 56.4 56.2
9天 64.1 56.5 55.8 55.4
10天 64.1 55.2 53.8 52.1
结论：从表4和图1可以看出实施例1的试剂盒稳定性优于对比例2、3、4试剂盒的稳定性，说明本发明加入吐温20、酪氨酸、叠氮钠等，对试剂稳定性起到的很好的协同作用，可以显著提高谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的稳定性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；
试剂R1中含有以下成分： 缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、谷胱甘肽还原酶0.5-2KU/L、还原型谷胱甘肽4-8mmol/L、氯化钾5-10g/L、氯化镁0.1-0.5g/L、表面活性剂1-5ml/L、稳定剂1-20g/L、防腐剂0.5-2g/L；
试剂R2中含有以下成分：缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、NADPH 1-1.5mmol/L 、过氧化氢异丙基苯 0.2-0.5mmol/L、表面活性剂 1-5ml/L、稳定剂1-20g/L、防腐剂0.5-2g/L。
2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1的pH值为 6.5-7.5；试剂R2的pH 值为 9.0-10.0。
3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种；试剂R2中所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种。
4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述的表面活性剂为曲拉通100、吐温20、花王709、花王909、花王B66、花王A90、胆酸钠和Brij35中的一种或多种；试剂R2中所述的表面活性剂为曲拉通100、吐温20、花王709、花王909、花王B66、花王A90、胆酸钠和Brij35中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述的稳定剂为酪氨酸；试剂R2中所述的稳定剂为海藻糖、蔗糖、乙二醇、酪氨酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300 、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种；试剂R2中所述的防腐剂为叠氮钠、PC300 、MIT和硫酸庆大霉素中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 1~5:1。
8.根据权利要求7所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 4:1。
9.一种权利要求1-8之一所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）试剂 R1的配制：取适量水，分别加入R1中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值6.5-7.5，定容到所需体积；
（2）试剂R2的配制：取适量水，分别加入R2中所示原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到PH值9.0-10.0，定容到所需体积。
10.一种权利要求1-8之一所述的谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶的浓度。
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Homocysteine effects on cellular glutathione peroxidase (GPx-1) activity under in vitro conditions;Ayşen Durmaz et al;《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》;20071231;第22卷(第6期);第734页

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