JPH1172497A - 直接型ビリルビンの測定方法および測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 間接型ビリルビンの干渉を完全に回避し、廃
液による環境汚染等の危険性の少ない直接型ビリルビン
の測定方法及び測定試薬の提供をその目的とする。 【解決手段】 本発明は、試料にビリルビンオキシダー
ゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接
型ビリルビンを測定する方法において、チオシアン酸イ
オン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸、又は１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウム
イオンを共存させておくことを特徴とする直接型ビリル
ビンの測定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に含まれる
直接型ビリルビンの測定方法及びそれに用いる測定用試
薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンは老化赤血球由来のヘモグロ
ビンの代謝産物で胆汁色素の主成分である。血液中に
は、側鎖のプロピオン酸基が肝臓で酵素的に主にグルク
ロン酸とエステル結合し水溶性が増加した画分（抱合
型）と、プロピオン酸基が遊離の状態のままであり水溶
性が低い画分（遊離型）が主に存在する。前者はジアゾ
試薬と容易に反応するために直接型ビリルビンと称さ
れ、後者はアルコールなどの反応促進剤の存在下におい
て初めてジアゾ試薬と反応するため、間接型ビリルビン
として捉らえられている。間接型ビリルビンは、反応促
進剤の存在下全てのビリルビンをジアゾ発色して求めら
れる総ビリルビンから直接型ビリルビンを差し引いて求
めることができる。これらの抱合型（直接型）および遊
離型（間接型）の各ビリルビン濃度を分別定量すること
により各種肝疾患、溶血性疾患などによる黄だんの鑑別
および診断を行うことができるため、ビリルビンの測定
は臨床検査における重要な項目となっている。

【０００３】直接型ビリルビンの定量法としては、以下
に示すように、ジアゾ試薬による方法、ビリルビンオキ
シダーゼによる方法、高速液体クロマトグラフィーによ
る方法、化学的酸化剤による方法などが報告されてい
る。

【０００４】Ａ）ジアゾ試薬による直接型ビリルビンの
測定方法 ジアゾ試薬による方法は、ビリルビンがジアゾ試薬と反
応してアゾビリルビンを生成し、その結果、ビリルビン
本来の可視部極大吸収波長より長波長域にアゾビリルビ
ンの極大吸収が発生するため、この波長における吸光度
変化によりビリルビンを定量するものである。これら
は、間接型ビリルビンの反応促進剤の種類、反応停止条
件、アゾビリルビンの検出条件の違いにより種々のもの
が報告されている（Ｍａｌｌｏｙ，Ｈ．Ｔ．，Ｅｖｅｌ
ｙｎ，Ｋ．Ａ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，
４８１（１９３７）；Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎｏｆ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐ
ｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；Ｊ
ｅｎｄｒａｓｓｉｋ，Ｌ．，Ｇｒｏｆ，Ｐ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｚ．，２９７．８１（１９３８）：Ｖｅｒｅｉ
ｎｆａｃｈｔｅＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｓｃｈｅ Ｍｅｔ
ｈｏｄｅｎ ｚｕｒ Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ ｄｅｓ
Ｂｌｕｔｂｉｌｉｒｕｂｉｎｓ；Ｍｉｃｈａ ｅｌｅｓ
ｓｏｎ，Ｍ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．，１２（Ｓｕｐｐ．５６），１〜８（１９
３７）；Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ）。

【０００５】Ｂ）ビリルビンオキシダーゼによる直接型
ビリルビンの測定方法 ビリルビンオキシダーゼによる方法は、ビリルビンを含
む検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、ビリル
ビンをビリベルジンに酸化させ、この際、ビリルビンの
極大吸収波長域の吸光度が消失するので、この吸光度の
減少量により定量するものである。この測定法では、間
接ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされて
おり、下記のごとく多数の方法が報告されている。

【０００６】Ｂ１）ｐＨ３．５〜４．５でビリルビンオ
キシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリル
ビンの測定方法（特開昭５９−１２５８９９）。 Ｂ２）陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性
緩衝液中で、ビリルビンオキシダーゼを作用させること
を特徴とする直接型ビリルビンの測定方法（Ｓｈｏｇｏ
Ｏｔｓｕｊｉ：Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，
３３〜３８（１９８８）および特開昭６０−１５２９５
５）。 Ｂ３）ｐＨ９〜１０の緩衝液中でビリルビンオキシダー
ゼを作用させ生じた吸光度の変化を測定することを特徴
とする抱合型ビリルビンの定量方法（特開昭６２−５８
９９９）。 Ｂ４）ｐＨ２．０〜３．３のフェロシアン化カリウムお
よび／またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中で
ビリルビンオキシダーゼを作用させ、生じた吸光度変化
を測定することを特徴とする直接型ビリルビンの定量方
法（特開昭６４−５４９９）。 Ｂ５）ビリルビンオキシダーゼとともに、フッ素化合物
または還元剤を共存させることを特徴とする直接型ビリ
ルビンの定量方法（特開平５−２７６９９２）。 Ｂ６）ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロー
ル環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリル
ビンの定量方法（特開平７−２３１７９５）。

【０００７】Ｃ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）による直接型ビリルビンの測定方法 ＨＰＬＣによる直接型ビリルビンの測定法は、逆相カラ
ムに有機溶剤の濃度勾配をかけビリルビンの画分を親水
性／疎水性の序列により分画するものである。ＨＰＬＣ
によると血清中のビリルビンは主にα、β、γ、δの４
画分に分離され、それぞれ、α画分は遊離型ビリルビ
ン、β画分は１分子中に２つある側鎖のプロピオン酸基
の１つのみがグルクロン酸とエステル結合をしているビ
リルビン（ビリルビンモノグルクロナイド）、γ画分は
プロピオン酸基が２つともグルクロン酸とエステル結合
をしているビリルビン（ビリルビンジグルクロナイ
ド）、δ画分はアルブミンとビリルビンが共有結合をし
ているものと同定されている。また、δ画分はγ画分と
アルブミンが非酵素的に反応した結果、生成したものと
推定されている（山本 俊夫：日内会誌７８（１１），
３６〜４１（１９８９））。なお、ＨＰＬＣでのα画分
は上記Ａ）のジアゾ試薬による方法では間接型ビリルビ
ンに相当し、一方、βとγおよびδ画分は直接型ビリル
ビンに相当するとされる（Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｌａｕｆｆ，
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８（４）６２９〜６３７（１
９８２））。ＨＰＬＣ法は、煩雑な検体前処理工程を極
力省略した形で改良が進められており、種々の報告がな
されている（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈ．：Ｂｕｎｓｅｋｉ
ｋａｇａｋｕ，３６，３５２〜３５５（１９８７）；
Ｙｕｋｉｈｉｋｏ Ａｄａｃｈｉ：Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ
ｅｒｏｌｏｇｉａ Ｊａｐｏｎｉｃａ，２３（３），２
６８〜２７２（１９８８）；加藤 裕子：近畿大医誌第
１４巻１号９７〜１１２（１９８９）．）。

【０００８】Ｄ）化学的酸化剤による直接型ビリルビン
の測定方法 化学的酸化剤によるものは、ビリルビンオキシダーゼの
代わりに、低分子量の酸化剤を作用させて、ビリルビン
をビリベルジンに酸化し、この際のビリルビンに基づく
吸光度減少量により定量するものである。これらも、間
接型ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされ
ており、下記のごとく報告されている。 Ｄ１）銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導体を被
検液に作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの
定量方法（特開昭６３−１１８６６２）。 Ｄ２）バナジン酸イオンまたは３価のマンガンイオンを
酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定するこ
とを特徴とするビリルビンの定量方法（特開平５−１８
９７８）。この方法で直接型ビリルビンを測定するため
には、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジ
ン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価
アミン類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢが
１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれ
た１種以上の化合物を使用する。 Ｄ３）亜硝酸を酸化剤として作用させ、試料の光学的変
化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法
（ＷＯ９６−１７２５１）。この方法で直接型ビリルビ
ンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤
として、ＨＬＢが１２〜１５のポリオキシエチレン（ｎ
−アルキルあるいはｉｓｏ−アルキル）エーテル、チオ
尿素、ヒドラジン、ポリビニルピロリドン等を使用す
る。

【０００９】上記Ａ）〜Ｄ）の各測定法にはそれぞれ一
長一短があり、現在のところ、必ずしも、満足のいく測
定方法は存在しない。以下に各測定法の問題点を列記す
る。

【００１０】ジアゾ試薬による方法Ａ）は、反応促進剤
が共存しない場合での反応をジアゾ直接反応と定義し、
直接型ビリルビンの名称の由来ともなっている。しかし
ながら、このジアゾ直接反応は間接型ビリルビンの一部
に対しても起こり得ることが多数報告がなされている
（例えば、Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｇ．，Ｇａｓｔ
ｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７８，１０１１〜１０１５
（１９８０）；Ｂｌａｎｋａｅｒｔ，Ｎ．，Ｊ．Ｌａ
ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９６，１９８〜２１２（１９
８０）；真鍋幸男：分析化学，３０，７３６〜７４０
（１９８１）；Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，３１，１５６０〜１５６３（１９８５）；高坂
彰：検査と技術１４ ９７１〜９７５（１９８６）；足
立幸彦：生物試料分析 ９ ３３〜４２（１９８
６））。従ってジアゾ直接反応により定義されたビリル
ビン測定値は、正確には“直接型ビリルビン”を測定し
ているとは言い切れない。

【００１１】ビリルビンオキシダーゼによる方法Ｂ）
は、ジアゾ直接反応により定義されたビリルビン測定値
と近似し得るように測定系を開発した結果、間接型ビリ
ルビンの一部に対しても酸化反応が認められ、一般的に
は“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れな
い。その中で、ビリルビンオキシダーゼにフッ素化合物
を共存させる方法（特開平５−２７６９９２）やテトラ
ピロール環化合物を共存させる方法（特開平７−２３１
７９５）は、間接型ビリルビンに対する反応を回避し得
るものである。しかし、フッ素化合物を使用するため環
境汚染に問題を有し、またテトラピロール環化合物を試
薬中に存在させるため安定性に欠け、溶液状態で長時間
使用することに問題を有する。

【００１２】高速液体クロマトグラフィーによる方法
Ｃ）は、高い分析性能を有するが１検体の処理に約１時
間を要するので、多数の検体を処理するには不向きであ
る。また高価で特殊な装置を必要とし汎用性に欠ける。

【００１３】化学的酸化剤による方法Ｄ）は、ビリルビ
ンオキシダーゼによるものと同様にジアゾ直接反応によ
り定義された直接型ビリルビン測定値と近似し得るよう
に測定系を開発した結果、間接型ビリルビンの一部に対
しても酸化反応が認められ、やはり正確には“直接型ビ
リルビン”を測定しているとは言い切れない。

【００１４】以上述べてきたように、間接型ビリルビン
に対する反応を完全に回避し、安定かつ安全な直接型ビ
リルビンの測定方法は現在のところ必ずしも存在せず、
この開発が待ち望まれている。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した現状
に鑑みなされたもので、間接型ビリルビンの干渉を完全
に回避し、廃液による環境汚染等の危険性のない直接型
ビリルビンの測定方法および測定用試薬の提供をその目
的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはビリルビン
オキシダーゼの至適ｐＨ域において、間接型ビリルビン
や直接型ビリルビンの反応性を鋭意検討した結果、ビリ
ルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させる際に、チ
オシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ
Ｈ）、または１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン
を共存させた場合、間接型ビリルビンの酸化が完全に抑
制されると共に、直接型ビリルビンの酸化が定量的に進
行し直接型ビリルビンを正確に測定できることを見いだ
し本発明を完成するに至った。

【００１７】すなわち、本発明は、試料にビリルビンオ
キシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料
中の直接型ビリルビンを測定する方法において、チオシ
アン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び
１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンから選ばれる
間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上を共存させてビ
リルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直
接型ビリルビンの測定方法である。更に本発明は、必須
構成成分として、ｉ）ビリルビンオキシダーゼとii）チ
オシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸及び１００ｍＭ〜８００ｍＭ
のカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑
制剤の１種以上とを含むことを特徴とする直接型ビリル
ビン測定用試薬である。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明では、試料は、直接型ビリ
ルビンまたは間接型ビリルビンを含むものであれば特に
限定しない。通常、試料は、血しょう、血清、尿等の生
態体液試料、またはこれらのモデルサンプルである。

【００１９】本発明の方法においては、間接型ビリルビ
ン反応抑制剤として用いるチオシアン酸イオンとして
は、特に限定されないが、チオシアン酸アルカリ金属、
チオシアン酸アルカリ土類金属、チオシアン酸アンモニ
ウム等が挙げられるが、チオシアン酸ナトリウム、チオ
シアン酸カリウム等が好ましい。

【００２０】ヒドラジド類としては、アセチルヒドラジ
ド、フタルヒドラジド、イソフタロイルジヒドラジド、
テレフタリックジヒドラジド、ベンゼンスルフォニルヒ
ドラジド等を例示できる。

【００２１】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、直接、反応試
薬中に共存させてもよく、あるいはアルコールデヒドロ
ゲナーゼ、グルコール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等
の酵素反応により酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドから誘導したものを用いても本発明の目的を達
することができる。

【００２２】カリウムイオンとしては、塩化カリウム、
臭化カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、酒石
酸カリウム、乳酸カリウム、フタル酸カリウム、硫酸カ
リウム等が限定されずに使用しうる。

【００２３】本発明においては、試料中のビリルビンに
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、その酵素反応
液中に共存させる間接型ビリルビン反応抑制剤は、低濃
度に過ぎると間接型ビリルビンの反応抑制効果が充分に
得にくく、また高濃度に過ぎるとビリルビンオキシダー
ゼの阻害性が昂進し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害
されやすい。従って、間接型ビリルビン反応抑制剤とし
て、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を用いる場合
には酵素反応液中において、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの
濃度が好ましく、０．２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度がさらに
好ましい。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合に
は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜５
ｍＭの濃度範囲である。

【００２４】カリウムイオンを用いる場合には、酵素反
応液中で、カリウムイオン濃度は、１００ｍＭ〜８００
ｍＭが好ましく、１１０ｍＭ〜６００ｍＭがさらに好ま
しく、１２０〜４００ｍＭが特に好ましい。カリウムイ
オン濃度が１００ｍＭを超えないと、間接型ビリルビン
の反応抑制効果が弱くなる。カリウムイオン濃度が８０
０ｍＭを越えるビリルビンオキシダーゼの阻害性が昂進
し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害されやすい。

【００２５】本発明の方法においては、間接型ビリルビ
ン反応抑制剤は、２種以上を用いてもよい。例えば、チ
オシアン酸イオン、ヒドラジド類、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ
ＰＨから選ばれる２種以上の反応抑制剤を併用すること
ができる。また、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種以
上の反応抑制剤とカリウムイオンとを併用することもで
きる。

【００２６】本発明の方法において、ビリルビンオキシ
ダーゼは、特に限定されないが、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕ
ｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ 由来のビリルビンオキシダ
ーゼ（天野製薬（株）から入手可能）あるいはＴｒａｃ
ｈｙｄｅｒｍａ ｔｓｕｎｏｄａｅ 由来のビリルビン
オキシダーゼ（宝酒造（株）から入手可能）あるいはＰ
ｌｅｕｒｏｔｕｓ 属由来のビリルビンオキシダーゼ
（株式会社盛進から入手可能）等が挙げられ、その必要
量は最終反応液中において、それぞれ０．００１〜１０
Ｕ／ｍｌの濃度にて使用するのが好ましい。より好まし
くは０．０１〜１Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは０．０２〜
０．５Ｕ／ｍｌの濃度範囲である。

【００２７】ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、
ｐＨ範囲は、酵素活性が至適状態で発現しうる範囲であ
れば限定されないが、ｐＨ４．５〜６．５が好ましく、
ｐＨ５．０〜６．０が特に好ましい。使用する緩衝液は
このｐＨ範囲において緩衝能を有するものであれば特に
限定されないが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリ
ウム緩衝液、クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩
衝液、リンゴ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を含むもの
が挙げられる。特に緩衝液の成分として、フタル酸水素
カリウム等のカリウム塩を含む場合、カリウムイオン
が、間接型ビリルビン反応抑制効果を有する点から好ま
しい。

【００２８】本発明では、試料中の直接型ビリルビン
を、例えば、ビリルビンオキシダーゼおよび間接型ビリ
ルビン反応抑制剤の１種以上を含む直接型ビリルビン測
定用試薬を用いて測定することができる。

【００２９】直接型ビリルビン測定用試薬としては、例
えば、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を含む液を
第１試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼを含む
液を第２試薬液とし、これら２つの試薬から構成される
キットとすることが好ましい。第１試薬液には、さらに
カリウムイオンを含むことが好ましい。

【００３０】あるいは、例えば、ｐＨ４．５〜６．５の
緩衝液、好ましくはｐＨ５．０〜６．０の緩衝液を第１
試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼとＮＡＤ
Ｈ、ＮＡＤＰＨまたはカリウムイオンとを含む液を第２
試薬液とし、これら２つの試薬から構成されるキットと
することがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはビリルビンオキ
シダーゼの安定性から好ましい。ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨを用いる場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの溶液状
態での安定性から、第２試薬液のｐＨは、９以上が好ま
しく、９〜１１．０がさらに好ましい。さらにカリウム
イオンを含むことが好ましい。間接型ビリルビンオキシ
ダーゼの反応抑制剤としてカリウムイオンを単独で用い
る場合、ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液のｐ
Ｈは、７〜１１がビリルビンオキシダーゼの安定性から
好ましい。緩衝液の組成としては、前記したように、フ
タル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン
酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸／水
酸化ナトリウム緩衝液等を含むものを例示できる。第１
試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好まし
い。

【００３１】本発明の方法は、例えば、上記したキット
により、以下のように実施できる。試料と上記の第１試
薬液とを混合し、この混合液中のビリルビンに基づく波
長域（４３０〜４６０ｎｍ）の特定の波長、好ましくは
波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する（吸光度
１）。ついで、得られる液にビリルビンオキシダーゼを
含む第２試薬液を添加して２５〜４０℃で、３〜１５分
間、ビリルビンの酸化反応を行った後、再度溶液中のビ
リルビンに基づく特定の波長における吸光度を測定する
（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に
液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度変化量
を求める。この値と、予め濃度既知の標準液を用いて上
記と同様の操作により得られた吸光度変化量に基づいて
作成した検量線から、試料中の直接型ビリルビン濃度を
求めることができる。このようなキットによる直接型ビ
リルビンの測定方法は、日立７０７０型自動分析装置等
の汎用型の自動分析装置に適用可能である。なお、試料
は、０．００５〜２ｍｌが好ましい。

【００３２】直接型ビリルビン測定用試薬に含まれるチ
オシアン酸イオン、ヒドラジド類、カリウムイオンは水
溶液中でとくに不安定ではなく、またＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤＰＨおよびビリルビンオキシダーゼは、ｐＨ９以上
では水溶液中でとくに不安定ではないので、この試薬
は、水溶液の状態で液状試薬として使用することも可能
である。また、直接型ビリルビン測定用試薬には、他の
試薬類、例えば防腐剤、キレート化剤、界面活性剤等の
通常の試薬やキットに使用し得るものであれば公知の方
法に準じて適宜選択して使用することができる。

【００３３】

【実施例】

実施例１〜６および比較例１間接型ビリルビンの抑制効果 ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、１００ｍＭ〜
８００ｍＭのカリウムイオン（実施例１）、チオシアン
酸イオン（実施例２）、ヒドラジド類（実施例３及び実
施例４）、ＮＡＤＨ（実施例５）、ＮＡＤＰＨ（実施例
６）を共存させると、間接型ビリルビンの酸化反応が抑
制されるかどうかを観察するため以下の実験を行った。
なお、比較例１では、これらチオシアン酸イオン等を含
まない条件で行った。それらの試薬、試料、測定、結果
を以下に示す。

【００３４】 （１）第１及び第２試薬液 比較例１に用いた第１試薬液 ：フタル酸 １５０ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整） 実施例１に用いた第１試薬液 ：フタル酸 １５０ ｍＭ 塩化カリウム ２００ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整） 実施例２に用いた第１試薬液 ：フタル酸水素カリウム １５０ ｍＭ チオシアン酸ナトリウム １０ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整） 実施例３に用いた第１試薬液 ：フタル酸水素カリウム １５０ ｍＭ ベンゼンスルフォニルヒドラジド １０ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整） 実施例４に用いた第１試薬液 ：フタル酸水素カリウム １５０ ｍＭ イソフタロイルジヒドラジド １０ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整） 実施例５および実施例６に用いた第１試薬液 ：フタル酸水素カリウム １５０ ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．０５％ ｐＨ５．５０ 比較例１及び実施例１〜４に用いた第２試薬液 ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン １０ ｍＭ ビリルビンオキシダーゼ ０．２４Ｕ／ｍｌ （Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属由来） ｐＨ１０．２ 実施例５に用いた第２試薬液 ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン １０ ｍＭ ＮＡＤＨ ５ ｍＭ ビリルビンオキシダーゼ ０．２４Ｕ／ｍｌ ｐＨ１０．２ 実施例６に用いた第２試薬液 ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン １０ ｍＭ ＮＡＤＰＨ ５ ｍＭ ビリルビンオキシダーゼ ０．２４Ｕ／ｍｌ ｐＨ１０．２

【００３５】（２）試料 試料は、間接型ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌでありか
つヒト血清アルブミン濃度６．０ｇ／ｌのものを用い
た。その試料は、以下のようにして調整した。間接型ビ
リルビン５ｍｇを秤量し０．４ｍｌのジメチルスルホキ
シドに分散させる。この分散した液に、０．４ｍｌの１
００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え間接型ビリルビンを
溶解させた直後、ヒト血清アルブミンを含む１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）９．２ｍｌにて希釈
して試料を調製した。

【００３６】（３）比較例１及び実施例１〜６での測定 日立７０７０型自動分析装置において、試料１０μｌ、
第１試薬液３００μｌ、第２試薬液７５μｌの条件で、
主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍにおける吸光度変
化を２Ｐｏｉｎｔ Ｅｎｄ法にて求めた。即ち、自動分
析装置上で第１試薬液と試料とを混合し、３７℃で５分
間インキュベーションした後、この溶液中のビリルビン
に基づく吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍ
にて測定する（吸光度１）。ついで、得られる溶液に、
ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液を添加して３
７℃で、５分間ビリルビンの酸化反応を行った後、再
度、溶液中のビリルビンに基づく吸光度を前記の波長で
測定する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２
の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度
減少量を求める。これらの測定及び計算は、自動分析装
置で自動的に行われる。

【００３７】（４）比較例１及び実施例１〜６の結果 比較例１及び実施例１〜６における間接型ビリルビンで
の吸光度減少量の結果を表１に示す。また、比較例１及
び実施例１〜６における自動分析装置上における反応経
過過程（反応タイムコース）を図１〜６に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表１及び図１〜図６から明らかなように、
本発明に基づく方法（実施例１〜６）では、間接型ビリ
ルビンの酸化に基づく吸光度減少量は、自動分析装置の
測定誤差程度であり、反応タイムコースにおいても吸光
度の減少は認められない。これに対して、比較例１では
明らかな間接型ビリルビンの酸化に伴う吸光度の減少が
認められる。これにより、チオシアン酸イオン、ヒドラ
ジド類、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン、Ｎ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ共存下では、いずれも、ビリルビン
オキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応が抑制され
ることが明らかにされた。

【００４０】実施例７〜１２直接型及び間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビ
リルビンの測定 （１）試料の調製 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）中に合成
抱合型ビリルビンであるジタウロビリルビンを５ｍｇ／
ｄｌ（ビリルビン相当濃度）とヒト血清アルブミンを
６．０ｇ／ｌ含む溶液を直接型ビリルビン溶液として調
整した。また、それとは別に、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ７．００）中に非抱合型ビリルビンを５ｍｇ
／ｄｌとヒト血清アルブミンを６．０ｇ／ｌ含む溶液を
間接型ビリルビン溶液として調製した。次いで、直接型
ビリルビン溶液を間接型ビリルビン溶液にて希釈し、総
ビリルビン濃度が同一（５ｍｇ／ｄｌ）でかつ直接型ビ
リルビン濃度が異なる種々の試料を調整した。なお、試
料は、総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比が
０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０の６
種のものを調製した。

【００４１】（２）測定条件 この試料を用いた以外は、実施例１〜６記載の測定試
薬、測定条件で、吸光度減少量を測定し、それぞれ、実
施例７（カリウムイオン使用）、実施例８（チオシアン
酸イオン使用）、実施例９（ヒドラジド類使用）、実施
例１０（ヒドラジド類使用）、実施例１１（ＮＡＤ
Ｈ）、実施例１２（ＮＡＤＰＨ）とした。

【００４２】（３）結果 結果を図７〜１２に示す。図７〜１２では、横軸に総ビ
リルビンに対する直接ビリルビンの比、縦軸に吸光度減
少量を表わしている。本発明の方法（実施例７〜１２）
では、直接型ビリルビンの量に比例して吸光度が大きく
なり、原点回帰の良好な希釈直線性が得られた。これ
は、実施例７〜１２では、間接型ビリルビンの干渉な
く、直接型ビリルビンを選択的に測定していることを示
している。

【００４３】比較例２従来法による直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとを
含む試料中の直接型ビリルビンの測定 一方、実施例７〜１２に用いた試料を用いて、従来法で
直接型ビリルビンを測定した。従来法は、ｐＨ３．５〜
４．５の条件でビリルビンオキシダーゼを作用させる測
定法（特開昭５９−１２５８９９；Ｓｈｏｇｏ ｏｔｓ
ｕｊｉ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，３３〜３
８（１９８８））で行った。即ち、以下の組成の試薬条
件によるものである。

【００４４】 （１）第１及び第２試薬液 従来法の第１試薬液 クエン酸三ナトリウム・三水和物 １７．６５ ｇ／ｌ 乳酸 ３０．０ ｇ／ｌ トリトンＸ−１００ １．０ ｇ／ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ₂ Ｏ １８．６ ｍｇ／ｌ ｐＨ３．７０ 従来法の第２試薬液 クエン酸三ナトリウム・三水和物 ３．０５ ｇ／ｌ 乳酸 １６０ ｍｇ／ｌ トリトンＸ−１００ １．０ ｇ／ｌ ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ １．２５ ｇ／ｌ ビリルビンオキシダーゼ ０．２ Ｕ／ｍｌ ｐＨ６．５０

【００４５】（２）測定法 従来法の測定条件は、試薬液以外は、実施例１記載の測
定条件と同一とした。

【００４６】（３）結果 結果を図７〜１２に示す。従来法（比較例２）では、試
料中の直接型ビリルビン濃度と測定された吸光度との間
に直線性が得られないことが判明した。従来法では、試
料中の間接型ビリルビンの干渉を大きく受け、試料中の
直接型ビリルビンを正確に測定していないことを示す。

【００４７】実施例１３〜１８及び比較例３本発明の測定方法条件下でビリルビン高値患者検体中の
間接型ビリルビンが反応しないことをＨＰＬＣで確認し
た例 （１）試料 試料としてビリルビン高値の患者プール血清検体を用い
た。血清検体に対しては、硫酸ナトリウムによる塩析を
行わず、未処理のまま分析に処した。試料中のグロブリ
ンがカラムに吸着し劣化を早める結果となるが、ビリル
ビン画分の変性を防止することを目的とした為である。

【００４８】（２）試薬 実施例１３（カリウムイオン使用）、実施例１４（チオ
シアン酸イオン使用）、実施例１５（ヒドラジド類使
用）、実施例１６（ヒドラジド類使用）、実施例１７
（ＮＡＤＨ使用）、実施例１８（ＮＡＤＰＨ使用）で
は、それぞれ、実施例１〜６で用いた試薬を使用した。
比較例３では、比較例２で用いた試薬を使用した。

【００４９】（３）ビリルビンオキシダーゼによる試料
中のビリルビンの酸化反応 試料１６μｌに対して第１試薬液４８０μｌを添加し、
３７℃で５分間加温した。さらに、得られる液に、１２
０μｌの第２試薬液を添加し、３７℃で５分間加温後、
１２０μｌの２％アスコルビン酸水溶液を添加してビリ
ルビンオキシダーゼの反応を停止させた。

【００５０】（４）ＨＰＬＣによる分析 ＨＰＬＣの分析は、文献（Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｌａｕｆ
ｆ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，２８（４），６２９〜６３７
（１９８２））記載の方法により行い、反応前後におけ
る間接型ビリルビンに基づくピーク面積の変化を調べ
た。反応前のデータは、第２試薬液として生理食塩水を
用いた以外は、上記した酸化反応と同様の操作を行い、
間接型ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。ＨＰＬ
Ｃは、日立ＨＰＬＣシステム（Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ
Ｌ−７３００、ＵＶ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４０
０、Ｐｕｍｐ Ｌ−７１００、Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
Ｄ−７５００）に関東化学（株）製の逆相系カラムＬｉ
ｃｈｒｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ−１８（１０μｍ）を
接続して使用した。すなわち、上記の酸化反応で得られ
る液を、０．４５μｍのメンブランフィルターにてろ過
し、ろ液１５０μｌをＨＰＬＣのカラムに注入して反応
後の間接ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。溶出
は、ビリルビン画分を、Ａ液：（精製水９５０容／２−
メトキシエタノール５０容／りん酸にてｐＨ２．１に調
製）とＢ液：（イソプロパノール９５０容／２−メトキ
シエタノール５０容／りん酸２．５容）の２液間におけ
るイソプロパノールの直線勾配により行い、４５０ｎｍ
の波長により検出した。

【００５１】（５）結果 反応前のデータを１００とし、そのデータと反応後の間
接型ビリルビンに基づくピーク面積のデータとの比較に
より、間接型ビリルビンの残存比率を求めた。結果を表
２に示す。反応前後で間接型ビリルビンに基づくピーク
面積がほとんど変わらず、本発明の測定条件下では、間
接型ビリルビンが反応しないことが確認された。一方、
比較例３（従来法）では、間接型ビリルビンが１６．５
％減少していた。従来法の条件下では、間接型ビリルビ
ンの一部が反応したことを示している。

【００５２】

【表２】

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、試料中の直接型ビリル
ビンを間接ビリルビンの影響なく選択的に測定すること
ができ、臨床検査の分野において有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１及び比較例１での反応タイムコースを
示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、
縦軸には、吸光度×１００００を示す。

【図２】実施例２及び比較例１での反応タイムコースを
示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、
縦軸には、吸光度×１００００を示す。

【図３】実施例３及び比較例１での反応タイムコースを
示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、
縦軸には、吸光度×１００００を示す。

【図４】実施例４及び比較例１での反応タイムコースを
示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、
縦軸には、吸光度×１００００を示す。

【図５】実施例５及び比較例１でのビリルビンオキシダ
ーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示
す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦
軸には、吸光度×１００００を示す。

【図６】実施例６及び比較例１でのビリルビンオキシダ
ーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示
す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦
軸には、吸光度×１００００を示す。

【図７】実施例７及び比較例２での結果を示す。横軸に
総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸
光度減少量を示す。

【図８】実施例８及び比較例２での結果を示す。横軸に
総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸
光度減少量を示す。

【図９】実施例９及び比較例２での結果を示す。横軸に
総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸
光度減少量を示す。

【図１０】実施例１０及び比較例２での結果を示す。横
軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸
に吸光度減少量を示す。

【図１１】実施例１１及び比較例２での結果を示す。横
軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸
に吸光度減少量を示す。

【図１２】実施例１２及び比較例２での結果を示す。横
軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸
に吸光度減少量を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビリルビンを含む試料にビリルビンオキ
   シダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中
   の直接型ビリルビンを測定する方法において、チオシア
   ン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドリン酸及び１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリ
   ウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の
   １種以上を共存させてビリルビンオキシダーゼを作用さ
   せることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法。
2. 【請求項２】 ビリルビンオキシダーゼを作用させると
   きのｐＨが５．０〜６．０である請求項１の直接型ビリ
   ルビンの測定方法。
3. 【請求項３】 必須構成成分として、ｉ）ビリルビンオ
   キシダーゼとii）チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び１０
   ０ｍＭ〜８００ｍＭカリウムイオンから選ばれる間接型
   ビリルビン反応抑制剤の１種以上とを含むことを特徴と
   する直接型ビリルビン測定用試薬。