CN103529141A - 一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法。该方法使用二甲基亚砜为溶剂，对包合人工牛黄样品进行超声提取一定时间后能够溶解样品中的全部胆红素，再以胆红素对照品为对照，用高效液相色谱法对其进行含量测定。本发明操作简单，测定结果准确，本发明可用于对包合人工牛黄及含有包合人工牛黄的制剂中的胆红素进行含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，属于医药技术领域。
背景技术
牛黄，是指牛科动物黄牛或水牛的胆囊结石。牛黄（Calculus bovis），别名丑宝。本品为牛科动物牛（Bos taurus domesticus Gmelin）干燥的胆结石。但由于牛黄产量较少，市场用量较大，现在除特殊规定外，多以人工牛黄代替天然牛黄进行药物的生产。人工牛黄中主要成分为胆酸及胆红素，性质不稳定。通过包合技术，能使人工牛黄稳定性明显增加，掩盖其特有的腥臭味，同时也可使人工牛黄的水溶性得到改善。
对于人工牛黄的含量测定，现有技术有很多，包括紫外分光光度法、高效液相色谱法等。如2010年版《中国药典》一部，使用紫外分光光度法，使用60%的冰醋酸对胆酸进行测定，使用三氯甲烷对胆红素测定，供试品的前处理方法为定量的三氯甲烷超声处理。近几年，常常以高效液相色谱法测定其中的胆红素含量来对人工牛黄进行含量标定，将胆红素的含量标定为人工牛黄的含量。对于样品的前处理，现有技术中主要有三氯甲烷超声提取和二氯甲烷超声提取两种。如《HPLC法测定磺啶冰黄片中胆红素的含量》（湖南中医药大学学报，2007年27卷5期），供试品的前处理方法为使用定量三氯甲烷超声提取。文献《一种安宫牛黄栓的质量控制方法》（申请号：CN201210490729.2）还提供了另外一种前处理方法，即样品与乙二胺四醋酸二钠溶液进行混合，加热完全溶解后，放冷混匀后加入水饱和的二氯甲烷，超声处理后冰水浴处理，然后摇匀后离心，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得胆红素。
上述文献方法适用于未包合状态的人工牛黄，对于包合后的人工牛黄，由于包合物的阻碍，通过上述常规的方法和技术无法准确检测出其含量。经过检索，现有技术中也未发现能对包合状态的人工牛黄进行前处理及进行含量测定的方法。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法。
本发明的技术方案如下：
一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，步骤如下：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.02-3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜10-25mL，密塞，称定重量，超声2-10min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，步骤如下：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm，理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜20mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述的包合人工牛黄为采用β-环糊精或聚乙二醇类包合的人工牛黄，所述的全部胆红素包括游离胆红素和包合后胆红素。其中超声条件为分析试验常用超声频率40kHz。
本发明中所述的重量份与体积份的单位对应关系为g/mL或kg/L。
本发明使用二甲基亚砜为溶剂对包合后人工牛黄进行处理，能够对包合人工牛黄的全部胆红素进行提取而不破坏，进而测定其含量，本发明操作简单，测定结果准确，相对标准偏差1.543%，重复性较好，在3.979μg/mL～15.918μg/mL范围内胆红素的峰面积(A)与浓度(C)线性关系良好。本发明可用于对包合人工牛黄及含有包合人工牛黄的制剂中的胆红素进行含量测定。
附图说明
图1是供试品处理方式折线图；
图2是供试品溶剂选择折线图；
图3是胆红素对照品溶液高效液相色谱图；
图4是胆红素线性关系图；
图5是二甲基亚砜处理人工牛黄供试品溶液高效液相色谱图。
具体实施方法
下述实验例用于进一步说明但不限于本发明，所用的包合人工牛黄为山东阿如拉药物研究开发有限公司自制。
实验例1：对包合人工牛黄中胆红素进行含量测定的条件选择
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：包合后人工牛黄（山东阿如拉药物研究开发有限公司）批号：20130501（β-环糊精包合）、20130502（聚乙二醇6000包合）、20130503（聚乙二醇4000包合）。
2）流动相选择
研究发现人工牛黄成分复杂，胆红素存在同分异构体，单纯使用甲醇‐水、乙醇‐水体系均无法达到很好的色谱分离，使用体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液为流动相配合供试品的制备，能满足胆红素检查的需要。
3）对照品制备
胆红素对照品储备液：精密称取胆红素对照品适量，加二氯甲烷制成每1mL含19.897μg的溶液，即得。
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品制备
以理论提取率为考核指标，以二甲基亚砜为试剂，选择了多种处理方式对包合人工牛黄进行了处理，结果表明：使用浸泡的方式很难达到良好的提取过程，使用回流提取的方法对人工牛黄造成破坏，使用超声处理较为合适，见附图1。
以理论提取率为考核指标，选择多种溶剂在超声2-10分钟情况下，对供试品进行处理，结果表明：一般溶剂，如：氯仿、甲醇、乙醇等，很难达到提取完全的效果，理论提取率低于30%，而二甲基亚砜的提取率较为理想，试验结果如下表。
表1供试品溶剂选择（提取率）
结果表明：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷等一般常用溶剂很难提取完全，而二甲基亚砜提取率较高，能使包合人工牛黄中的胆红素全部溶解，在控制超声时间2-10分钟情况下，能够不破坏胆红素的稳定性，超声时间超过10分钟后，由于二甲基亚砜的极性较强，可能会造成人工牛黄中胆红素的破坏，见附图2。
5）线性试验
精密量取胆红素对照品溶液(19.897μg/mL)2mL、3mL、5mL、7mL、8mL，分别置10mL容量瓶中，二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，各精密进样10μL，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。回归方程：A=53324C+3641，相关系数：R=0.9998，结果表明：在3.979μg/mL～15.918μg/mL范围内，胆红素的峰面积(A)与浓度(C)线性关系良好，见附图3、附图4。
6）精密度试验
分别精密吸取胆红素对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差为RSD%=1.543%。结果表明，仪器精密度良好。
7）重复性试验
取本品，重复测定6次，计算样品中胆红素的含量，平均含量分别为0.220%，RSD%=0.90%。表明分析方法重复性良好。
实验例2：优选超声时间处理实验例
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：包合后人工牛黄（山东阿如拉药物研究开发有限公司）批号：20130501（β-环糊精包合）、20130502（聚乙二醇6000包合）、20130503（聚乙二醇4000包合）。
2）流动相
体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液。
3）对照品制备
胆红素对照品储备液：精密称取胆红素对照品适量，加二氯甲烷制成每1mL含19.897μg的溶液，即得。
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品溶液的制备
取样品粉末50mg，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜15mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
5）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得，见附图5。
6）测定结果：
表2样品含量测定结果
| 批号 | 全部胆红素% |
| 20130501 | 0.223 |
| 20130502 | 0.231 |
| 20130503 | 0.229 |
实验例3：较短时间超声处理实验例
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：包合后人工牛黄（山东阿如拉药物研究开发有限公司）批号：20130501（β-环糊精包合）、20130502（聚乙二醇6000包合）、20130503（聚乙二醇4000包合）。
2）流动相
体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液。
3）对照品制备
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品溶液的制备
取样品粉末50mg，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜20mL，密塞，称定重量，超声2min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
5）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6）测定结果：
表3样品含量测定结果
| 批号 | 全部胆红素% |
| 20130501 | 0.211 |
| 20130502 | 0.217 |
| 20130503 | 0.214 |
实验例4：较长超声时间实验例
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：包合后人工牛黄（山东阿如拉药物研究开发有限公司）批号：20130501（β-环糊精包合）、20130502（聚乙二醇6000包合）、20130503（聚乙二醇4000包合）。
2）流动相
体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液。
3）对照品制备
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品溶液的制备
取样品粉末50mg，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜15mL，密塞，称定重量，超声10min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
5）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6）测定结果：
表4样品含量测定结果
| 批号 | 全部胆红素% |
| 20130501 | 0.218 |
| 20130502 | 0.224 |
| 20130503 | 0.221 |
实验例5：对聚乙二醇8000包合人工牛黄进行含量测定
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：包合后人工牛黄（山东阿如拉药物研究开发有限公司）批号：20130606（聚乙二醇8000包合）。
2）流动相
体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液。
3）对照品制备
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品溶液的制备
取样品粉末50mg，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜15mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
5）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6）测定结果：
表5样品含量测定结果
| 批号 | 全部胆红素% |
| 20130606 | 0.222 |
实验例6：安儿宁颗粒中包合后胆红素的含量检测方法
1）仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立L-7110泵，日立-7420检测器；岛津AUW220D，电子天平，昆山舒美KQ-300B超声仪（300W，40KHz）
对照品：胆红素对照品（批号：100077-200805）
样品：安儿宁颗粒（使用β-环糊精包合人工牛黄替代人工牛黄，山东阿如拉药物研究开发有限公司自制，批号20121213、20121218、20130109）。
2）流动相
体积分数比80：10：10的甲醇‐四氢呋喃‐0.5%醋酸溶液。
3）对照品制备
胆红素对照品溶液：精密量取胆红素对照品储备液，加二氯甲烷制成每1mL含9.949μg的溶液，即得。
4）供试品溶液的制备
取安儿宁颗粒粉末1g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜25mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5）测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6）测定结果：
表6样品含量测定结果
| 批号 | 全部胆红素% |
| 20121213 | 0.0264 |
| 20121218 | 0.0273 |
| 20130109 | 0.0271 |
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
具体实施方式
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明，所用的包合人工牛黄为山东阿如拉药物研究开发有限公司自制。
实施例1：
一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，步骤如下：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.5g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜20mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2：
一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，步骤如下：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜20mL，密塞，称定重量，超声2min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3：
一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，步骤如下：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末1g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜25mL，密塞，称定重量，超声10min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
Claims (3)
1.一种包合后人工牛黄中胆红素的含量测定方法，其特征是，包括如下步骤：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.02-3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜10-25mL，密塞，称定重量，超声2-10min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，包括如下步骤：
a）色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积分数比80：10：10的甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液为流动相；检测波长为450nm；理论板数按胆红素峰计算应不低于2000；
b）对照品溶液的制备：精密称取胆红素对照品，加二氯甲烷制成每1mL含10μg的溶液，即得；
c）供试品溶液的制备：取包合人工牛黄粉末0.3g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜20mL，密塞，称定重量，超声5min，放冷，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
d）测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述制备好的供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的包合人工牛黄为采用β-环糊精或聚乙二醇类包合的人工牛黄。
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