CN106841078A - 一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法，其包括如下步骤：S1：制备胆红素水溶液，并制作胆红素溶液浓度与吸光度关系的工作曲线；S2：将吸附剂加入所述胆红素溶液中，在避光条件下进行吸附后，取上层清液测量吸光度，计算吸附剂对胆红素的吸附率与吸附量；其中，所述胆红素溶液制备方法为：在避光条件下，将胆红素溶解于有机溶剂中进行初溶后，加入有机溶剂和水的混合液进行稀释，得到所述胆红素溶液，并记录胆红素溶液的浓度。本发明探索出一种新的含水溶剂体系，在不改变胆红素的化学结构的前提下溶解胆红素，并测定它与吸附剂的相互作用，从而为水溶液中胆红素浓度的测定提供一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
胆红素是人体内衰老的红细胞中血红素的正常代谢产物，为红褐色的色素体，不溶于水，难溶于醇、醚、易溶于碱。它是临床医学试验中常规检验项目之一，对肝胆疾病及溶血性疾病的诊断有着重要的意义。当胆红素的某一个或几个代谢环节出现障碍时，导致血清总胆红素浓度超过正常水平，出现高胆红素血症(黄疸)，尤其在新生婴儿中，游离胆红素能透过血脑屏障，进一步引起各种组织的细胞尤其是大脑细胞死亡，导致智障、脑瘫甚至是死亡；同时造成肝或胆管功能紊乱，加重肝损伤，尤其是肝炎病人。
胆红素的检测和清除是治疗胆红素相关疾病的重要手段。采用吸附剂进行血液体外灌注是去除胆红素的临床方法。基础研究中，为了解决胆红素不溶于水溶液，通用的方法是先用少量0.1N NaOH溶液溶解，再用磷酸盐缓冲液(pH＝7.2～7.4)或蒸馏水稀释，配制胆红素溶液，然后用于胆红素与吸附剂的相互作用研究。但是该方法的最大的缺点是在碱的作用下，水不溶的胆红素转变成了水溶的胆红素钠。由于胆红素和胆红素钠具有明显不同的化学结构和官能团，导致其与同一种吸附剂的相互作用机制和吸附能力将出现明显差异。同时这种方法所配置的较高浓度胆红素溶液体系不稳定，静置一段时间后，胆红素易从溶液中析出。因此，从这种方法配置的胆红素溶液中难以准确测定胆红素的浓度，也不能真实反映胆红素在吸附剂上的吸附能力，研究结果存在明显偏差。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法，其包括如下步骤：
S1：制备胆红素溶液，并制作胆红素溶液浓度与吸光度关系的工作曲线；
S2：将吸附剂加入所述胆红素溶液中，在避光条件下进行吸附后，取上层清液测量吸光度，计算吸附剂的对胆红素的吸附率与吸附量；
胆红素不溶于水，醇、醚，易溶于碱，所以人们常用碱性水溶液来配置胆红素溶液。但在碱性水溶液的作用下，水不溶的胆红素转变成了水溶的胆红素钠，由于胆红素和胆红素钠具有明显不同的化学结构和官能团，导致其与吸附剂的相互作用机制和吸附能力将出现明显差异。而胆红素能够溶于二甲亚砜等有机溶剂中，故选用二甲亚砜作为溶剂来溶解胆红素。我们发现二甲亚砜单一溶剂配置出来的胆红素溶液，并不能被壳聚糖或活性炭等吸附剂所吸附，但是加入一定体积的水之后，吸附剂对于胆红素的吸附能力大大提高。而且水所占的体积不同，吸附效果也不同。所以本发明提供一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法具体为：
在避光条件下，将胆红素在有机溶剂中先进行初溶后，再加入有机溶剂和水的混合液进行稀释，得到所述胆红素溶液，并记录胆红素溶液的浓度。
通过一系列实验，我们探索出了步骤S1中所述的用来初溶的有机溶剂的体积优选为2～30mL，所述有机溶剂和水的混合液中，有机溶剂和水的体积比优选为1:1～4:1。
作为优选方案，所述有机溶剂和水的混合液中，有机溶剂和水的体积比最佳为2.5:1。
作为优选方案，步骤S1中所述的有机溶剂为二甲亚砜。
作为优选方案，步骤S2中，吸附是在4～40℃、振荡的条件下进行的。
作为优选方案，所述吸附的最佳温度为37℃。
作为优选方案，步骤S2中所述的吸附剂为壳聚糖或活性炭。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
为了准确检测水溶液中胆红素的浓度以及水溶液中吸附剂对胆红素的吸附能力，如何配置稳定的胆红素水溶液体系是首要问题；本发明的核心内容是找到了一种新的含水溶剂体系，在不改变胆红素的化学结构的前提下溶解胆红素，并测定它与吸附剂的相互作用，从而为水溶液中胆红素浓度的测定提供一种新方法。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1中绘制的胆红素浓度-吸光度工作曲线；
图2为胆红素在二甲亚砜/水溶液中吸光度随时间变化的曲线；
图3为胆红素二甲亚砜/水溶液和胆红素氢氧化钠水溶液分别静置一小时后的表观对比；
图4为胆红素溶于NaOH/D2O时的1H-NMR谱图；
图5为胆红素溶于DMSO-d6/D2O时的1H-NMR谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中使用的仪器：可见光-紫外分光光度计(V-1200)，水浴振荡锅(SHA-C型)。
实施例1
本实施例涉及胆红素浓度-吸光度工作曲线的绘制：
1、分别配制浓度为6mg/L、12mg/L、18mg/L、30mg/L的胆红素溶液；
2、然后分别测定上述各浓度胆红素溶液在438nm处的吸光度，如表1所示，并根据表1中数据绘制浓度-吸光度工作曲线，如图1所示，可以明显看到，吸光度与浓度的关系满足朗伯比尔定律，成线性正比关系，因此，本发明方法可以用于胆红素浓度的测定；
其中，胆红素溶液的配制方法为：在避光条件下，将胆红素溶解于15mL二甲亚砜中进行初溶后，加入二甲亚砜和水按照2.5:1的体积比配制的混合液稀释至50mL，得到胆红素溶液，并记录胆红素溶液的浓度。
表1实施例1中各浓度胆红素溶液的吸光度
| 6 | 12 | 18 | 30 | |
| 吸光度(Abs) | 0.134 | 0.291 | 0.464 | 0.804 |
实施例2
本实施例涉及胆红素在二甲亚砜水溶液中的稳定性研究
按实施例1中制备的任意一种浓度的胆红素溶液的方法，配置200mg/L的胆红素溶液。在37℃的水浴中，避光震荡。每隔一定时间取胆红素溶液1mL，稀释10倍后，测量其在438nm处吸光度，观察随着时间的延长，该溶液的吸光度是否有改变，结果如表2和图2所示，可以明显看出，随着时间的延长，吸光度虽然有所波动，但是波动范围为-1.5％～1.3％，属于误差范围。说明溶液在2.5h内非常稳定。
表2实施例2中不同时间内胆红素在溶液中的吸光度
| 时间/min | 0 | 20 | 30 | 40 | 90 | 150 |
| 吸光度/Abs | 1.883 | 1.884 | 1.845 | 1.868 | 1.859 | 1.898 |
实施例3
本实施例涉及胆红素分别在二甲亚砜水溶液和氢氧化钠水溶液中的稳定性比较
避光条件下，称取0.01g的胆红素，加入15mL二甲亚砜进行初溶，通过搅拌和超声使胆红素完全溶解，然后加入二甲基亚砜和水按照3:1的体积比配制的混合溶液稀释至50mL，记为胆红素二甲亚砜溶液；
同样在避光条件下，利用通用方法制备胆红素溶液，即：称取0.01g的胆红素，先用少量0.1N NaOH水溶液溶解，再用磷酸盐缓冲液(pH＝7.2～7.4)稀释至50mL，记为胆红素氢氧化钠溶液；
将胆红素二甲亚砜水溶液和胆红素氢氧化钠水溶液分别静置一小时后，观察现象并分别进行氢核磁共振谱检测，结果分别如图3a、3b、图4和图5所示，明显可以看到，胆红素氢氧化钠水溶液底部出现了沉淀，而胆红素二甲亚砜水溶液依旧澄清透明；胆红素-NaOH/D2O溶液在10.0ppm附近没有出现羧基氢峰，这是因为NaOH/D2O溶剂与胆红素的羧基发生酸碱中和反应，转变成了羧酸钠结构。而胆红素-DMSO-d6/D2O溶液在10.0ppm出现了羧基氢的峰，说明胆红素的羧基氢在DMSO-d6/D2O溶剂中仍然存在，没有被破坏，因此，DMSO-d6/D2O可认定为胆红素的真溶剂。
实施例4
本实施例涉及利用活性炭对200mg/L的胆红素二甲亚砜溶液进行吸附的实验
避光条件下，称取0.01g的胆红素，加入15mL二甲亚砜进行初溶，通过搅拌和超声使胆红素完全溶解，然后加入二甲基亚砜和水按照3:1的体积比配制的混合溶液稀释至50mL，得到浓度为200mg/L的胆红素二甲亚砜溶液；
称取0.1g活性炭置于试剂瓶中，加入5mL上一步配置的200mg/L的胆红素溶液，并设置空白对照组。避光条件下，在37℃的水浴中振荡吸附2h后，取上层清液稀释10倍后测量各自在438nm处吸光度，结合实施例1中绘制的胆红素浓度-吸光度工作曲线，计算吸附剂的吸附率以及吸附容量，结果如表3所示。
表3
| 样品 | 吸光度(Abs) | 吸附率(％) | 吸附量(ng/g) |
| 空白样 | 2.181 | 0 | 0 |
| 活性炭 | 1.372 | 49.8 | 3.76 |
实施例5
本实施例涉及利用壳聚糖作对100mg/L的胆红素二甲亚砜水溶液进行吸附的实验
避光条件下，称取0.005g的胆红素，加入15mL二甲亚砜进行初溶，通过搅拌和超声使胆红素完全溶解，然后加入二甲基亚砜和水的混合溶液(二甲亚砜：水体积比为2.5:1)稀释至50mL。
配置胆红素的标准溶液，制作胆红素溶液浓度与吸光度的工作曲线。
称取0.1g壳聚糖置于试剂瓶中，加入5mL标准胆红素溶液,并设置空白对照组。避光条件下，在37℃的水浴中振荡吸附2.2h后，取上层清液稀释10倍后测量各自在438nm处吸光度，计算吸附剂的吸附率以及吸附容量。结果如表4所示。
表4
| 样品 | 吸光度(Abs) | 吸附率(％) | 吸附量(ng/g) |
| 空白样 | 1.071 | 0 | 0 |
| 壳聚糖 | 0.589 | 55 | 2.1 |
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (7)
1.一种水溶液中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备胆红素溶液，并制作胆红素溶液浓度与吸光度关系的工作曲线；
S2：将吸附剂加入所述胆红素溶液中，在避光条件下进行吸附后，取上层清液测量吸光度，计算吸附剂对胆红素的吸附率与吸附量；
其中，所述胆红素溶液制备方法为：
在避光条件下，将胆红素溶解于有机溶剂中进行初溶后，加入有机溶剂和水的混合液进行稀释，得到所述胆红素溶液，并记录胆红素溶液的浓度。
2.如权利要求1所述的液相中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，步骤S1中所述的用来初溶的有机溶剂的体积为2～30mL，所述有机溶剂和水的混合液中，有机溶剂和水的体积比为1:1～4:1。
3.如权利要求2所述的液相中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，所述有机溶剂和水的混合液中，有机溶剂和水的体积比为2.5:1。
4.如权利要求1～3中任意一项所述的液相中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，步骤S1中所述的有机溶剂为二甲亚砜。
5.如权利要求1所述的液相中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，步骤S2中，吸附是在4～40℃、振荡的条件下进行的。
6.如权利要求5所述的液相中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，所述吸附的温度为37℃。
7.如权利要求1所述的水溶液中胆红素浓度的定量测定方法，其特征在于，步骤S2中所述的吸附剂为壳聚糖或活性炭。
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