CN101622359A - 胆红素测定方法以及用于胆红素测定的分析用具 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用可促进胆红素氧化酶的反应的干燥试剂的胆红素测定方法以及用于该胆红素测定方法的分析用具。本发明的胆红素测定方法的特征在于，在生物试样与含有胆红素氧化酶的干燥试剂的混合之后，将上述混合物与含有表面活性剂的干燥试剂混合。而且，本发明的用于胆红素测定的分析用具(1)的特征在于，胆红素氧化酶以及表面活性剂按照下述方式配置在试样供给部(11)、上述流路(12、13、14)、检测部(15)的任意一个中：使上述胆红素氧化酶位于比上述表面活性剂更靠近试样供给部(11)的位置。

Description

胆红素测定方法以及用于胆红素测定的分析用具
技术领域
本发明涉及胆红素测定方法以及用于胆红素测定的分析用具。
背景技术
胆红素是在生物体的胆汁中存在最多的色素，主要是由衰老红细胞在骨髓、胸腺、肝脏等中被分解和代谢时作为红细胞主要成分的血红蛋白生成的。由血红蛋白生成的胆红素在血液中与白蛋白结合，被称为非结合(间接)型胆红素。该非结合型胆红素被摄入肝脏中，与葡萄糖醛酸结合而形成结合(直接)型胆红素，并被排泄到胆道中。将所述非结合(间接)型胆红素和结合(直接)型胆红素合称为总胆红素。一般间接型胆红素占总胆红素的大部分。
测定生物试样中的胆红素的临床学意义如以往公知的那样。例如，可以根据直接型胆红素的增加来预测肝细胞障碍、肝内胆汁淤积、肝外胆汁淤积等，可以根据间接型胆红素的增加来预测胆红素生成量的增加、肝处理功能异常等。如上所述，总胆红素量为直接型胆红素量与间接型胆红素量合计得到的量，因此，例如如果知道总胆红素量和直接型胆红素量，则可以求出间接型胆红素量。
作为胆红素的测定方法，已知以往有重氮法、钒酸法、酶法、HPLC法等。所述酶法是指下述的方法：使胆红素氧化酶等酶作用于含胆红素的试样，从而使胆红素氧化成胆绿素，使胆红素引起的吸光(最大吸收波长在450nm附近)消失，根据该吸光度的减少量来对胆红素的浓度进行定量。
在通过酶法测定总胆红素的情况下，由于间接型胆红素与白蛋白结合，因此存在着与胆红素氧化酶的反应耗费时间的问题或反应不充分的问题。为此，公开了添加表面活性剂或其它物质来作为反应促进剂的技术方案(参照专利文献1～3)。
专利文献1公开了一种液体体系的胆红素测定方法，其中，首先将含有胆红素的待测物与含有作为直接化剂的胆酸钠或十二烷基硫酸钠(SDS)等的缓冲液混合，然后在该混合物中添加含有胆红素氧化酶的酶试剂。专利文献2公开了一种液体体系的胆红素测定方法，其中，在含有作为反应促进剂的胆酸钠或SDS等的胆红素氧化酶溶液中添加含有胆红素的待测物。专利文献3公开了一种液体体系的胆红素测定方法，其中，为了促进反应，在羟基吡啶衍生物或巯基吡啶衍生物的存在下使胆红素氧化酶与含有胆红素的待测物发生反应。
专利文献1：日本特开昭59-130198
专利文献2：日本特开昭62-282598
专利文献3：日本特开2006-34178
发明内容
本发明的目的在于提供在使用干燥试剂的胆红素测定中可促进胆红素氧化酶的反应的胆红素测定方法以及用于胆红素测定的分析用具。
为了达到上述目的，本发明的胆红素测定方法的特征在于，其包含：将生物试样、含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂进行混合；以及对由该混合产生的变化进行光学测定，其中，所述生物试样与所述含有胆红素氧化酶的干燥试剂的混合在与所述含有表面活性剂的干燥试剂的混合之前进行。
而且，为了达到上述目的，本发明的用于胆红素测定的分析用具的特征在于，其具备：生物试样的试样供给部、检测部、以及与所述试样供给部和所述检测部连接的流路，其中，胆红素氧化酶和表面活性剂按照下述方式配置在所述试样供给部、所述流路、所述检测部的任意一个中：使所述胆红素氧化酶位于比所述表面活性剂更靠近所述试样供给部的位置。
本发明的发明人对使用酶(胆红素氧化酶)的胆红素测定方法进行了反复深入的研究，并着眼于下述情况：在使用干燥试剂的胆红素测定中，间接型胆红素与胆红素氧化酶的反应需要时间，如果间接型胆红素的浓度增高，则有时反应不会在规定时间内结束。而且发现，如果在将作为干燥试剂的胆红素氧化酶与测定试样混合后再混合作为干燥试剂的表面活性剂，则能够提高间接型胆红素与胆红素氧化酶的反应效率，能够在短时间内测定胆红素，从而完成了本发明。另外，以往在液体体系的胆红素测定方法中，如上所述，通常是将表面活性剂等胆红素氧化酶反应的促进剂在与胆红素氧化酶的混合之前或同时地与试样混合的方法(参照上述专利文献1～3)。
根据本发明，例如能够充分有效地进行测定对象试样中的胆红素与胆红素氧化酶的反应，因此优选地能缩短胆红素测定的时间、和/或能提高胆红素测定的准确性以及重现性。
附图说明
图1是表示本发明的分析用具的一个例子的图，图1A是俯视图，图1B是在图1A的I-I方向观察的剖面图。
图2是本发明的分析用具的另一例子的俯视图。
图3是表示胆红素测定结果的一个例子的曲线图。
图4是表示胆红素测定结果的另一例子的曲线图。
图5是表示胆红素测定结果的又一例子的曲线图。
图6是表示胆红素测定结果的再一例子的曲线图。
符号说明
1、2分析用具                11试样供给部
12试样供给用流路            13第1试剂配置部
14试剂配置部连结用流路      15检测部/第2试剂配置部
16第1试剂配置部用排气孔     17含有胆红素氧化酶的干燥试剂
18磁性粒子                  19第2试剂配置部用排气流路
20第2试剂配置部用排气孔     21第1试剂配置部用排气流路
22含有表面活性剂的干燥试剂  111基板
112盖子
具体实施方式
如上所述，本发明基于下述见解：在至少使用了含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂的干燥体系的胆红素测定方法中，若将使测定对象试样与上述2种干燥试剂接触的顺序设定为与含有胆红素氧化酶的干燥试剂的接触先于与含有表面活性剂的干燥试剂的接触，则能够提高胆红素、优选间接型胆红素与胆红素氧化酶的反应效率，能够缩短测定时间。通过将与试样的接触顺序设定为酶在先而表面活性剂在后，从而能够缩短间接型胆红素与酶的反应时间，该机理的详细情况并不清楚，但可以认为，如果使测定对象试样先与含有表面活性剂的干燥试剂接触，则表面活性剂与间接型胆红素即胆红素-白蛋白复合体结合，从而会阻碍胆红素与酶的反应。而且可以认为，通过使测定对象试样先与含有胆红素氧化酶的干燥试剂接触，酶与胆红素-白蛋白复合体结合，然后，通过所添加的表面活性剂使胆红素与白蛋白解离，其结果是，胆红素与酶变得容易反应。但是，本发明并不限定于这些机理。
在本发明的胆红素测定方法中，上述表面活性剂优选为阴离子表面活性剂。而且，上述阴离子表面活性剂优选为选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、脱氧胆酸钠以及胆酸钠中的一种以上的表面活性剂。
本发明的分析用具优选的是：具备与同一个上述试样供给部连接的2个以上的上述流路，上述流路各自具备上述检测部，上述胆红素氧化酶和上述表面活性剂按照下述方式配置在至少1条上述流路以及该流路的检测部的任意一个中：使上述胆红素氧化酶位于比上述表面活性剂更靠近上述试样供给部的位置。
在本发明的分析用具中，上述表面活性剂优选为阴离子表面活性剂。而且，上述阴离子表面活性剂优选为选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、脱氧胆酸钠以及胆酸钠中的一种以上的表面活性剂。
在另一实施方式中，本发明为一种胆红素测定用试验片，其是用于胆红素测定的试验片，其中，从试样供给面开始依次层叠有含有胆红素氧化酶的层和含有表面活性剂的层。
在本说明书中，仅记为“胆红素”的情况下，可以包括总胆红素、直接型胆红素、间接型胆红素。这里，所谓的“直接型胆红素”是指与葡萄糖醛酸结合的结合型胆红素，所谓的“间接型胆红素”是指未与葡萄糖醛酸结合的非结合型胆红素。将直接型胆红素与间接型胆红素合称为总胆红素。
在本发明中，“胆红素氧化酶”没有特别的限定，可以使用能够将胆红素氧化成胆绿素的酶。作为胆红素氧化酶，优选对直接型胆红素和间接型胆红素双方均有活性的胆红素氧化酶。作为胆红素氧化酶的来源，没有特别的限定，例如可以举出作为微生物的漆斑菌属(Myrothecium)、粗皮灵芝亚属(Trachyderma)等。胆红素氧化酶也可以使用市售品，例如可以使用商品名(BILIRUBIN OXIDASE Amano3，Amano Enzyme公司制)、商品名(BILIRUBIN OXIDASE TAKARA，宝酒造公司制)等。此外，在本发明中，关于胆红素氧化酶的酶单位(U)，如果为市售品，是指制造商所标示的值，或者是指在37℃、pH7.0的条件下能够用1分钟将1μmol的底物(白蛋白结合型胆红素)氧化的胆红素氧化酶的酶量。
在本发明中，“表面活性剂”可以是以往公知的表面活性剂，例如可以包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阳离子表面活性剂等。这些表面活性剂可以使用一种，也可以将多种组合使用。
作为所述阴离子表面活性剂，可以使用以往公知的阴离子表面活性剂，例如可以举出十二烷基硫酸钠(SDS)等烷基硫酸酯钠、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)等直链烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠等烷基醚硫酸酯钠、脱氧胆酸钠、以及胆酸钠等。作为本发明中使用的阴离子表面活性剂，优选SDS或胆酸钠，还优选组合使用SDS和胆酸钠。作为上述非离子表面活性剂，可以使用以往公知的非离子表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚、聚氧化烯羧酸酯、聚氧化烯羧酸二酯、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(例如Pluronic(注册商标，BASF公司)F-88等)、聚氧乙烯聚氧化烯共聚物、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等。作为上述两性离子表面活性剂，可以使用以往公知的两性离子表面活性剂，例如可以举出烷基氨基脂肪酸钠、烷基甜菜碱、烷基胺氧化物等。作为上述阳离子表面活性剂，可以使用以往公知的阳离子表面活性剂，例如可以举出十六烷基三甲基溴化铵等烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡啶鎓、氯化月桂基吡啶鎓等烷基吡啶鎓盐等。
在本发明中，“生物试样”是指来自于含有胆红素的生物体的试样，优选为液体状，更优选含有间接型胆红素。作为这样的生物试样，没有特别的限定，例如可以举出全血、血清、血浆、尿等体液试样。此外，本发明中的生物试样也可以是根据需要经过了稀释、前处理等的试样。
本发明的胆红素测定方法当然也可以将上述“生物试样”以外的试样作为测定对象。例如可以将胆红素的标准试样等作为测定对象。因此，在另一实施方式中，本发明为一种胆红素测定方法，其特征在于，该方法包含：将测定对象试样与含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂接触；以及对由该接触产生的变化进行光学测定，其中，测定对象试样与含有胆红素氧化酶的干燥试剂的接触比测定对象试样与含有表面活性剂的干燥试剂的接触先进行。在该实施方式的本发明中，测定对象试样可以含有上述“生物试样”，优选为液体状，更优选含有间接型胆红素。
接着，对本发明的胆红素测定方法进行说明。
首先，准备含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂。在本发明的胆红素测定方法中，“含有胆红素氧化酶的干燥试剂”是指将含有胆红素氧化酶的试剂溶液进行干燥处理而得到的试剂。作为上述干燥处理，只要是不损害胆红素氧化酶的酶活性的方法即可，没有特别的限定，可以是冷冻干燥、加热干燥、风干、减压干燥等以往的干燥处理。从维持酶活性的观点出发，优选冷冻干燥处理。干燥处理前的含有胆红素氧化酶的试剂溶液除了胆红素氧化酶之外，也可以含有缓冲剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂等。在含有胆红素氧化酶的干燥试剂中优选不含表面活性剂。这是因为，如后所述，表面活性剂另外地以含有表面活性剂的干燥试剂的形式与上述生物试样混合。
作为在干燥处理前的含有胆红素氧化酶的试剂溶液中所含的缓冲剂，例如可以使用在pH为6.0～8.0的范围内发挥缓冲作用的以往公知的缓冲剂。作为上述缓冲剂，例如可以举出磷酸缓冲剂、Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPSO(2-羟基-3-吗啉基丙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸))、ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、MES(2-吗啉基乙磺酸)等，其中，优选胆红素氧化酶BES、MOPSO、MOPS、ACES。干燥处理前的含有胆红素氧化酶的试剂溶液也可以根据需要调节pH。作为上述试剂溶液的pH，例如为pH5.5～8.0，优选为pH6.0～7.5。
在上述含有胆红素氧化酶的干燥试剂中，优选含有在溶解于生物试样中时足以与生物试样中的胆红素反应的量的胆红素氧化酶。上述酶的含量对于本领域技术人员来说能够容易地设定。例如，生物试样为血液时，作为溶解于生物试样中后的胆红素氧化酶的最终浓度，例如为1～100U/ml，优选为3～10U/ml。在上述含有胆红素氧化酶的干燥试剂中含有缓冲剂的情况下，上述缓冲剂优选为下述的浓度：在以该浓度溶解于生物试样中时，发挥足以维持胆红素氧化酶的活性的缓冲作用。
在本发明的胆红素测定方法中，“含有表面活性剂的干燥试剂”是指将含有表面活性剂的试剂溶液进行干燥处理后得到的试剂。作为上述干燥处理，没有特别的限定，可以是冷冻干燥、加热干燥、风干、减压干燥等以往的干燥处理。上述试剂溶液中所含的表面活性剂的种类如上所述。试剂溶液也可以根据需要含有胆红素氧化酶、缓冲剂、pH调节剂、稳定剂等。作为缓冲剂，可以使用与含有胆红素氧化酶的干燥试剂中所含的缓冲剂相同的缓冲剂。
在上述含有表面活性剂的干燥试剂中，优选含有在溶解于生物试样中时足以促进胆红素氧化酶的反应的量的表面活性剂。作为溶解于生物试样中后的表面活性剂的最终浓度，例如为0.3～2质量％，优选为0.5～2质量％，更优选为1.0～1.5质量％。如上所述，在上述含有表面活性剂的干燥试剂中，也可以两种以上的表面活性剂以各自为上述最终浓度的量来含有。
然后，进行上述生物试样与上述含有胆红素氧化酶的干燥试剂的混合(第1混合)，接着，进行上述第1混合物与上述含有表面活性剂的干燥试剂的混合(第2混合)。混合的方法没有特别的限定，例如可以通过配置磁性搅拌棒或磁性粒子并从外部施加适当的磁场来进行混合。第1混合可以在上述含有胆红素氧化酶的干燥试剂溶解完的时间点结束。第2混合可以与第1混合的结束相连续地进行，也可以有间隔地进行。从缩短胆红素测定时间的观点出发，优选上述第1混合与第2混合之间的间隔短。
在本发明的胆绿素测定方法中，通过上述第1混合和第2混合“所产生的变化”是指胆红素氧化成胆绿素的变化。对上述变化进行“光学测定”是指对在450nm附近显示最大吸收的胆红素消失的情况进行光学测定。例如包括对上述第1混合前的生物试样在450nm处的吸光度和上述第2混合后在450nm处的吸光度进行测定。可以从这些吸光度的差对胆红素浓度进行定量。此外，本发明的胆绿素测定方法中的光学测定方法可以举出利用了透射光的吸光度测定，但并不限定于此，例如也可以利用反射光或散射光。
下面，对本发明的分析用具进行说明。
本发明的分析用具是用于胆红素测定方法中的分析用具，其具备上述生物试样的试样供给部、检测部、以及与上述试样供给部和上述检测部连接的流路，其中，胆红素氧化酶和表面活性剂按照下述方式配置在上述试样供给部、上述流路以及上述检测部的任意一个中：使上述胆红素氧化酶位于比上述表面活性剂更靠近上述试样供给部的位置。本发明的分析用具的结构和形态只要是按照上述胆红素氧化酶位于比上述表面活性剂更靠近上述试样供给部的位置的方式来配置的构成即可，没有特别的限定。此外，本发明的分析用具优选用于本发明的胆红素测定方法中。
上述流路优选为能够利用毛细管现象使上述生物试样移动的流路。所配置的胆红素氧化酶和表面活性剂优选为各自是上述的含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂的形态。
在上述流路中也可以根据需要形成试剂配置部。在形成两个上述试剂配置部的情况下，可以分别配置胆红素氧化酶和表面活性剂。或者，形成一个试剂配置部来配置胆红素氧化酶，表面活性剂可以配置在上述检测部中。试剂的配置方法没有特别的限定，例如可以举出如下方法：制备上述的含有胆红素氧化酶的试剂溶液和含有表面活性剂的试剂溶液，通过喷墨法等进行涂布并进行干燥处理。作为上述干燥处理，可以举出冷冻干燥、加热干燥、风干、减压干燥等以往的干燥处理，在酶的情况下，优选为冷冻干燥处理。为了有助于与生物试样的混合，也可以在上述试剂配置部中配置磁性搅拌棒或磁性粒子。
用图1对本发明的分析用具的一个实施方式进行说明。图1A是本发明的分析用具1的俯视图，图1B是在图1A的I-I方向观察的剖面图。
如图所示，分析用具1通过在基板111上配置盖子112而构成。在上述基板111的内部形成有第1试剂配置部13和兼作检测部的第2试剂配置部15(以下也称为“检测部/第2试剂配置部”)，上述两者通过试剂配置部连结用流路14来连结。此外，盖子112上形成有开口，上述开口为试剂供给部11，试剂供给部11与第1试剂配置部13通过试样供给用流路12来连结。第1试剂配置部13与第1试剂配置部用排气孔16通过从试剂配置部连结用流路14分支的第1试剂配置部用排气流路21来连结。检测部/第2试剂配置部15与第2试剂配置部用排气孔20通过第2试剂配置部用排气流路19进行连结。第1试剂配置部用排气孔16和第2试剂配置部用排气孔20最初是闭口的。在第1试剂配置部13中配置有含有胆红素氧化酶的干燥试剂17和一个磁性粒子18。在检测部/第2试剂配置部15中配置有含有表面活性剂的干燥试剂22。另外，检测部/第2试剂配置部15中也可以配置磁性粒子。
在本发明中，构成分析用具的部件的材质没有特别的限定。上述基板和盖子的材质例如有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃等。例如，在检测部15中，为了能够进行光学测定、例如利用透射光测定进行的分光测定等，优选使用透光性材料。本发明的分析用具的大小没有特别的限定，本领域技术人员可以适当设定。此外，本发明的分析用具的制造方法没有特别的限定，可以使用以往公知的技术来制造。
使用图1所示的分析用具的胆红素测定例如如下进行。即，首先，向试样供给部11供给生物试样。然后，使第1试剂配置部用排气孔16开口。通过上述开口产生毛细管现象，由此，上述试样流经试样供给用流路12而被导入到第1试剂配置部13中，将含有胆红素氧化酶的干燥试剂17溶解。然后，通过磁性体(未图示)使上述磁性粒子18移动，对上述生物试样进行搅拌，使上述干燥试剂均匀地混合并溶解。接着，使第2试剂配置部用排气孔20开口，产生毛细管现象，从而使上述生物试样流经试剂配置部用连结流路14而导入到检测部/第2试剂配置部15中。此时，也可以在包含上述磁性粒子18的状态下导入上述生物试样。然后，在检测部/第2试剂配置部15中，根据需要通过上述磁性粒子18进行搅拌，将含有表面活性剂的干燥试剂22均匀地混合并溶解，从而促进胆红素氧化酶的反应。这里，根据需要，优选将上述磁性粒子18导出到检测部/第2试剂配置部15外。然后，在检测部/第2试剂配置部15中，通过光学手段(例如分光光度计)来测定反应后的吸光度(450nm)等。
在另一实施方式中，本发明为一种分析用具(以下也称为“分析用具集合体”)，其具备与同一个上述试样供给部连接的2个以上的上述流路，上述流路各自具备上述检测部，上述胆红素氧化酶和上述表面活性剂按照下述方式配置在至少1条上述流路以及该流路的检测部的任意一个中：使上述胆红素氧化酶位于比上述表面活性剂更靠近上述试样供给部的位置。即，同一个生物试样流入多个流路中，通过与各种试剂反应，还可以对一个生物试样进行除了胆红素之外的其它多种项目的测定。另外，在具备2个以上的流路的本发明的分析用具集合体中，优选在至少一条流路和检测部中不配置胆红素氧化酶，而是提供胆红素测定中的对照。通过这样的构成，可以不必另外使用其它的分析用具对反应前的生物试样的吸光度等进行测定，仅通过一个本发明的分析用具集合体就可以进行胆红素测定。此外，本发明的分析用具集合体也可以是图2所示形态的分析用具。
图2所示的分析用具集合体是图1所示的流路为1条的分析用具呈放射状集合而成的形态的分析用具集合体。在图2中，与图1相同的部分用相同的符号表示。如图所示，分析用具集合体2为形成12个图1所示的分析用具并使它们集合而成的集合体。各分析用具具备：试样供给部11、试样供给用流路12、第1试剂配置部13、第1试剂配置部用排气流路21、第1试剂配置部用排气孔16、试剂配置部连结用流路14、第2试剂配置部15、第2试剂配置部用排气流路19以及第2试剂配置部用排气孔20。各分析用具的上述试样供给部整合为一个试样供给部11，此外，各第2试剂配置部用排气孔整合为一个第2试剂配置部用排气孔20。在分析用具集合体2的至少一个分析用具中配置有含有胆红素氧化酶的干燥试剂17、上述磁性粒子18以及含有表面活性剂的干燥试剂22。本发明的分析用具集合体的材料、制造方法、以及使用方法与上述图1的分析用具的情况相同。
在另一种实施方式中，本发明为一种胆红素测定用试验片，其是用于胆红素测定的试验片，其中依次层叠有试样保持层、含有胆红素氧化酶的层和含有表面活性剂的层。构成各层的材料没有特别的限定，例如可以使用滤纸、玻璃纤维滤纸、编织品、织物、无纺布、膜滤器、多孔质树脂片、塑料薄膜等以往公知的材料。此外，上述试样保持层也可以具备例如血细胞分离膜(层)等。本发明的试验片可以优选地用于本发明的胆红素测定方法。
本发明的试验片中，也可以省去上述试样保持层。因此，在另一实施方式中，本发明为一种胆红素测定用试验片，其包含含有胆红素氧化酶的干燥试剂层和含有表面活性剂的干燥试剂层，其中从试样供给面开始依次层叠有含有胆红素氧化酶的干燥试剂层和含有表面活性剂的干燥试剂层。在上述试样供给面上也可以具备例如血细胞分离膜(层)等。本发明的试验片可以优选地用于本发明的胆红素测定方法。
下面，用实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
(对由试剂的混合顺序引起的反应速度的变化进行确认)
确认了在使用了胆红素氧化酶(干燥试剂)和表面活性剂(干燥试剂)的胆红素测定中，混合测定试样的顺序会对胆红素氧化酶的反应速度产生影响。
<干燥试剂的制备>
在微孔板的孔内分别制备干燥试剂R1和R2。将干燥试剂R1和R2溶解于测定试样中时的各组成的最终浓度如下述表1所示。
(表1)
R1
100mM BES pH7.0
5mM EDTA
100U/ml BOD
R2
100mM BES pH7.0
0.5％SDS
干燥试剂R1如下进行制备。首先，将2.1325g的BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，同仁化学公司制)和0.0931g的EDTA·2Na·2H2O溶解在蒸馏水中，一边用NaOH调节pH达到7，一边使总量达到50ml(以下称为“BOD缓冲液”)。将0.8163g的胆红素氧化酶(BOD，Amano Enzyme公司制)用上述BOD缓冲液溶解，按照使总量达到20ml的方式进行制备。将该胆红素氧化酶溶液中的70μl添加到微孔板的各孔中，在-80℃下冻结后，进行冷冻干燥处理，从而制成干燥试剂R1。
干燥试剂R2如下进行制备。首先，将0.25g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在上述BOD缓冲液中，一边用HCl调节pH达到7，一边使总量达到50ml。将该SDS溶液中的50μl添加到微孔板的各孔中，在-80℃下冻结后，进行冷冻干燥处理，从而制成干燥试剂R2。
<测定试样的制备>
将50mg的间接型胆红素(商品名：胆红素，和光纯药公司制)溶解在2.5ml的DMSO中，并添加5ml的0.1M的Na2CO3。将该间接型胆红素溶液中的7.5ml添加到150ml的正常血清中，再添加3ml的0.1N的HCl，从而准备好间接型胆红素试样。通过以往公知的液体体系的定量法来测定该试样的浓度，结果为27.3mg/dl。
<R1→R2的测定>
将上述测定试样70μl添加到制备有干燥试剂R1的孔中，将干燥试剂R1溶解，然后迅速地将该溶解的70μl中的50μl添加到制备有干燥试剂R2的孔中，将干燥试剂R2溶解。利用酶标仪(microplate reader)，在主波长为450nm、副波长为630nm下对反应后的吸光度变化进行测定(R1→R2的测定)。测定是从将上述测定试剂添加到干燥试剂R1中经过120秒后开始的。R2→R1测定除了将干燥试剂R1与R2调换之外其它均同样地进行。
<结果>
R1→R2的测定和R2→R1的测定的结果的一个例子如图3的曲线图所示。如该图所示，在R1→R2测定、也就是使胆红素氧化酶先起作用、然后再使表面活性剂起作用的情况下，开始2分钟后吸光度的曲线图达到几乎平台，由此可知胆红素与胆红素氧化酶的反应迅速完成(该图左侧的曲线图)。另一方面，在R2→R1测定、也就是使表面活性剂先起作用、然后使胆红素氧化酶起作用的情况下，反应开始8分钟后仍未达到平台，由此可知胆红素与胆红素氧化酶的反应还未完成(该图右侧的曲线图)。因此，可以确认，在使用了胆红素氧化酶(干燥试剂)和表面活性剂(干燥试剂)的胆红素测定中，将胆红素氧化酶先与测定试样混合和将表面活性剂先与测定试样混合相比，能够缩短测定时间。
实施例2
(对由试剂的混合顺序引起的反应速度的变化进行确认)
除了实施例1中使用的测定试样(间接型胆红素试样：27.3mg/dl)之外，还制备了浓度为6.0mg/dl、12.1mg/dl以及24.4mg/dl的直接型胆红素试样、浓度为8.1mg/dl和16.1mg/dl的间接型胆红素试样、以及浓度为0.0mg/dl的胆红素试样，与实施例1同样地操作，进行R1→R2测定和R2→R1测定。上述直接型胆红素试样使用直接型胆红素(商品名：Ditaurobilirubin，Promega公司制)来作为胆红素，除此之外，与实施例1的间接型胆红素试样的制备方法同样地进行制备。此外，各试样的浓度通过使用正常血清的稀释来调节。
其结果的一个例子如图4所示。在该图的图例中，D表示直接型胆红素，I表示间接型胆红素。如图4所示，可以确认：通过按照R1→R2的顺序进行混合而产生的胆红素氧化酶反应的促进效果在测定试样中的间接型胆红素的浓度高时显著。
实施例3
(对能使用胆酸钠的情况进行确认)
除了将干燥试剂R1中的BOD的最终浓度设为10U/ml和3U/ml、将干燥试剂R2中的表面活性剂设为胆酸钠(最终浓度为0.5wt％和1.5wt％)之外，与实施例1同样地制备干燥试剂R1和R2，使用各种浓度的直接型/间接型胆红素试样，按照R1→R2的顺序进行混合来测定胆红素。
其结果的一个例子如图5所示。如该图所示，可以确认即使使用胆酸钠也能够测定胆红素。此外，启示了通过提高表面活性剂的浓度，能够减少胆红素氧化酶的酶使用量。
实施例4
(表面活性剂的组合)
除了将干燥试剂R1中的BOD的最终浓度设为1U/ml、将干燥试剂R2中的表面活性剂设为SDS与胆酸钠的组合(最终浓度分别为0.5wt％和分别为1.0wt％)之外，与实施例1同样地制备干燥试剂R1和R2，使用各种浓度的直接型/间接型胆红素试样，按照R1→R2的顺序进行混合来测定胆红素。
其结果的一个例子如图6所示。如该图所示，可知通过将表面活性剂组合，可配置的总量增加，从而即使BOD为1U/ml也能迅速地测定。
如上所述，本发明在干燥体系的胆红素测定中是有用的，例如在检查、诊断等医疗领域中是有用的。

Claims (8)

1、一种胆红素测定方法，其对生物试样中的胆红素进行测定，其特征在于，该方法包含：将所述生物试样、含有胆红素氧化酶的干燥试剂和含有表面活性剂的干燥试剂进行混合；以及对由该混合产生的变化进行光学测定，
其中，所述生物试样与所述含有胆红素氧化酶的干燥试剂的混合在与所述含有表面活性剂的干燥试剂的混合之前进行。
2、根据权利要求1所述的胆红素测定方法，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
3、根据权利要求2所述的胆红素测定方法，其中，所述阴离子表面活性剂为选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、脱氧胆酸钠以及胆酸钠中的一种以上的表面活性剂。
4、一种分析用具，其用于胆红素测定方法，其特征在于，该分析用具具备所述生物试样的试样供给部、检测部、以及与所述试样供给部和所述检测部连接的流路，
胆红素氧化酶和表面活性剂按照下述方式配置在所述试样供给部、所述流路、所述检测部的任意一个中：使所述胆红素氧化酶位于比所述表面活性剂更靠近所述试样供给部的位置。
5、根据权利要求4所述的分析用具，其中，该分析用具具备与同一个所述试样供给部连接的2个以上的所述流路，
所述流路分别具备所述检测部，
所述胆红素氧化酶和所述表面活性剂按照下述方式配置在至少1条所述流路以及该流路的检测部的任意一个中：使所述胆红素氧化酶位于比所述表面活性剂更靠近所述试样供给部的位置。
6、根据权利要求4或5所述的分析用具，其中，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。
7、根据权利要求6所述的分析用具，其中，所述阴离子表面活性剂为选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、脱氧胆酸钠以及胆酸钠中的一种以上的表面活性剂。
8、一种胆红素测定用试验片，其是用于胆红素测定的试验片，其中，从试样供给面开始依次层叠有含有胆红素氧化酶的层和含有表面活性剂的层。
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