JP2006034178A - 総ビリルビンの測定法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】
ビリルビンを含有する検体中の総ビリルビンを、簡単に、かつ正確に測定する方法および測定用試薬を提供すること。
【解決手段】
ビリルビンを含有する生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずる変化を光学的に測定する方法において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体から選択される少なくとも１種を共存させて測定することを特徴とする総ビリルビンの測定法および測定用試薬。
【選択図】
なし

Description

本発明は、総ビリルビンを酵素的に測定する方法およびそれに用いる試薬に関するものである。

ビリルビンは、生体中において胆汁中に最も多く存在する色素で、ピロール骨格を持つことから、診断分野においては含窒素成分の項目として捉えられている。老廃赤血球は、骨髄、胸腺、肝臓等で分解、代謝されるが、この時に主要構成成分であるヘモグロビンから非抱合ビリルビンが生成される。このビリルビンは、血中ではアルブミンと結合し、最も多く代謝される胸腺から肝臓に輸送される。肝臓では、非抱合ビリルビンは、構造的に２つのカルボキシル基がグルクロン酸１つまたは２つの抱合を受け、抱合ビリルビンへと変化し、そして胆道に排泄される。

臨床的意義において、溶血性黄疸では、非抱合ビリルビンの上昇が著しいが、特に、肝臓の未発達な新生児黄疸では、非抱合ビリルビンの遊離したビリルビン（遊離ビリルビン）がビリルビン脳症の成立と密接な関係があると考えられている。一方、肝臓で生成された抱合ビリルビンが胆道閉塞等で正常に排泄されない場合、血流中に逆流し、胆道閉塞性黄疸となる。そして、増大した抱合ビリルビンの一部が、非酵素的にアルブミンと共有結合したδビリルビンに変化することが１９８０年代の研究により明らかにされた。このδビリルビンの寿命は、アルブミン代謝速度とほぼ同じ２週間程度で、他のビリルビンよりも非常に長いという特徴がある。

このような種々ビリルビンの体内動態をもとに、新生児においてはビリルビン脳症の予防に、成人においては肝・胆道系疾患の鑑別および病態の把握、先天性ビリルビン代謝異常症の診断や溶血性疾患の発見等にビリルビンの測定が行われている。

ビリルビンの測定法は、１９１６年ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ等によって報告されたジアゾ法が世界的に普及した。血清ビリルビンには、ジアゾ試薬に対して異なった反応をする２種類のアゾ色素の存在が指摘され、その反応性から直接型ビリルビン、間接型ビリルビンとして識別された。そして、両者を合わせたものを総ビリルビンと称している。我が国においても、ジアゾ試薬による比色法等の化学的測定法が主に用いられてきた。しかし、試薬の安定した調製が困難なこと、血清中に含有する薬物代謝産物による測定誤差を受けやすい等の問題で、日常検査ではほとんど使用されなくなった。

その後、ビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素を用いたビリルビンの定量法が発表されている。この方法は、従来のジアゾ法に比べて、いずれも簡便性に優れたものであった。しかしながら、ビリルビンオキシダーゼのみでは、反応が不十分であるため、その反応促進剤としてサルファ剤や界面活性剤を利用した方法が考案された（特許文献１参照）。しかし、それら促進剤はｐＨ６．５よりも低いと沈殿するため、使用できるｐＨ範囲が狭い。また、上記促進剤はミロセシウム属（ Myrothecium ）由来のビリルビンオキシダーゼには効果的であるが、エビタケ属（ Trachyderma ）由来のものにはあまり効果を発揮しないこと、使用できるｐＨではδビリルビンに対する反応促進効果も完全なものでない等の問題があった。

さらにフェリシアン化カリウムを配合した方法も開示されている（特許文献２参照）。この方法では、総ビリルビン測定におけるｐＨの巾が狭く、特にｐＨが酸性域では反応促進効果は不十分であり、フェリシアン化カリウムを用いて十分に反応を促進させようとした場合にはその配合量が多くなるため、有害物質としての排出量が増加し好ましくない。

検体の液性をアルカリ性（ｐＨ１０以上）に保持して、検体中の抱合型ビリルビンを予め脱抱合して非抱合型ビリルビンとした後、検体中に存在する非抱合型ビリルビン量をビリルビンオキシダーゼを作用させて測定する方法が開示されている（特許文献３参照）。この方法では、血清をアルカリ処理するため、蛋白変性により混濁を生じ測定値に影響を与える場合がある。

また、ビリルビンオキシダーゼ以外の酸化酵素として安定性の高いアスコルビン酸オキシダーゼを用いた方法が開示されている（特許文献４参照）。アスコルビン酸オキシダーゼは、ビリルビンを酸化する活性が非常に低く、ビリルビン酸化酵素としては特異的ではない。そこで、種々の反応促進剤を共存させると確かに活性は高くなるものの、非常に高単位の酵素を用いるため、あまり実用的でないと言えよう。

一方、本出願人は、ビリルビンオキシダーゼの反応促進剤として、フェノール類やアニリン誘導体を使用する方法を開示している（特許文献５参照）。

特開昭６２−２８２５９８号 特開昭５９−１３０１９８号 特開平５−３２２９０３号 特開平９−１７８７５５号 特開平３−１７５９９７号

本発明はこのような従来の課題に着目してなされたものであって、検体中の総ビリルビンを、簡単に、かつ正確に測定する方法および試薬を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、検体中の総ビリルビン測定において、ビリルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずる変化を光学的に測定する方法において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体から選択される少なくとも１種を共存させると精度良く測定できることを見出し、本発明に至った。

本発明の検体中の総ビリルビン測定法は、ビリルビンを含有する検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずる変化を光学的に測定する方法において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体から選択される少なくとも１種を共存させて測定することを特徴とする。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）ビリルビンを含有する生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずる変化を光学的に測定する方法において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を共存させることを特徴とする総ビリルビンの測定法。
（２）ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体が、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイドおよび２−メルカプトピリジン−Ｎ−オキサイドから選ばれる少なくとも１種である（１）記載の測定法。
（３）ｐＨ５．０〜８．０の範囲でビリルビンオキシダーゼを作用させる（１）〜（２）記載の測定法。
（４）ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種とビリルビンオキシダーゼを含むことを特徴とする総ビリルビン測定用試薬。

本発明は、ｐＨ５．０〜８．０におけるビリルビンオキシダーゼ反応において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を共存させることによって、ビリルビンを含有する検体中の総ビリルビンを正確に、安価に測定する方法および試薬を提供することができる。したがって、肝機能、胆道系疾患や造血機能系疾患をより精度良く診断することができる。また、本発明はｐＨが５．０〜８．０という穏やかな条件下において、精度良く測定できるので分析装置への適用が容易で、その測定効率はＨＰＬＣ法よりも良く、コスト的にも非常に安価である。以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

酵素法によるビリルビンの測定法において、使用するビリルビンオキシダーゼ酵素由来により各種ビリルビンに対する反応性は、ｐＨや使用する緩衝液等で異なることが知られている。現在容易に入手できるミロセシウム属（ Myrothecium ）由来のビリルビンオキシダーゼでは、δビリルビンは、ｐＨ４．８付近において最も反応性が高いが、６．０以上では反応性が低くなる。一方、抱合ビリルビンは、６．０〜６．５付近において最大の反応性を有するが、５．０〜１１．０まではほぼ一定の反応性がある。非抱合ビリルビンは、ｐＨ６．５付近で最も反応性は高いが、クエン酸緩衝液や２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液よりも２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液の方が反応性は高い、というように緩衝剤の種類によっても、反応性が異なってくる。また、エビタケ属（ Trachyderma ）由来のビリルビンオキシダーゼに関しては、δビリルビンは、ｐＨ４．８付近において最も反応性が高いが、６．０以上では反応性が非常に低くなる。一方、抱合ビリルビンは、６．０〜６．５付近において最大の反応性を有し、９．２以上では反応性がほとんどない。非抱合ビリルビンは、ｐＨ５．５〜６．０で最も反応するが、ｐＨ９．０以上ではほとんど反応しない。また、上記緩衝液により反応性にほとんど差はない。

このように、上記酵素を用いた方法においては、ｐＨや使用する緩衝液を選択することだけで、血清中の総ビリルビンを正確に測定することは困難であるため、酵素の反応促進剤が必要となってくる。

本発明は、ビリルビンオキシダーゼを用いた総ビリルビンの測定において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体から選択される少なくとも１種を共存させて測定することにより、上記問題点を解決したものである。すなわち、これらの反応促進剤は、δビリルビンがほとんど反応しないｐＨ６．０以上でその反応性を向上させるだけではなく、非抱合ビリルビンに対する反応性が低いｐＨ５．０〜５．５または７．５〜８．０の領域での反応性を向上させる効果を有している。その結果、ｐＨ５．０〜８．０と広いｐＨ領域での使用が可能となる。また、異なる由来のビリルビンオキシダーゼにおいても、促進効果を有す。

本発明で、総ビリルビンを測定する添加物として使用するヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体である限り、公知の中から適宜選択することができる。その具体例としては、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド、２−メルカプトピリジン−Ｎ−オキサイドからなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。これら、添加物の濃度は、１〜２００ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは、２０〜１００ｍＭの範囲である。ここで、濃度が１ｍＭより低いときは、δビリルビンおよび非抱合ビリルビンが充分反応せず、濃度が２００ｍＭを越えたときは、ビリルビンオキシダーゼの非存在下でも、僅かにビリルビンが分解されてしまう。

本発明で使用される反応ｐＨは、５．０〜８．０の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜７．５の範囲である。ｐＨが５．０よりも低いと、ビリルビンオキシダーゼの非存在下でも、ビリルビンの分解が惹起される。ｐＨが８．０よりも高いと、δビリルビンおよび非抱合ビリルビンの反応性が低下し、反応終点に達するまでの時間が長くなる。そのため、自動分析装置への適用は困難となる。

本発明で使用できる緩衝液としては、ｐＨを上記範囲内に維持できるものであれば、特に制限されず、公知の緩衝液の中から適宜選択することができるが、特にグッド緩衝液やリン酸緩衝液が好ましい。

本発明において、総ビリルビンの測定を行う検体としては、一般にビリルビンを含有する水性検体であり、例えば、血清、血漿、胆汁等が挙げられる。これら検体は、必要に応じて希釈、または前処理されていても良い。

また、本発明で用いられるビリルビンオキシダーゼとしては、一般に、ビリルビンオキシダーゼとして用いられている酵素であればいずれも良いが、入手し易さを考慮すると、ミロセシウム属（ Myrothecium ）由来またはエビタケ属（ Trachyderma ）由来の酵素が好ましい。このビリルビンオキシダーゼの濃度は、０．０２〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは、０．１〜８Ｕ／ｍＬである。

本発明は、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む緩衝液 （試薬−１）と、ビリルビンオキシダーゼ溶液 （試薬−２）からなる２試薬系の総ビリルビン測定用試薬として提供することができる。ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体としては、上述したものの中から適宜選択すれば良い。

本発明による総ビリルビンの測定は、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体から選択される少なくとも１種を含む緩衝液 （試薬−１）を加え、予備加温後、ビリルビンオキシダーゼ溶液 （試薬−２）を加えて反応させ 、その結果生ずる総ビリルビンの減少を光学的に測定することにより行われる。すなわち、ビリルビンがビルベルジンに酸化されることに伴うビリルビンの量的変化を、４２０〜４８０ｎｍの吸光度の減少として捉えることで達成される。

本発明においては、特に必要とされないが、必要に応じて胆汁酸類、フェノール誘導体、アニリン誘導体、サルファ剤、安息香酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の反応促進剤、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アルブミン等の蛋白質等を適宜添加することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

実施例１．各種ビリルビンに対する反応性
５０ｍＭヒドロキシピリジン誘導体（またはメルカプトピリジン誘導体）および０．０５％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（非イオン性界面活性剤）を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（試薬−１ : ｐＨ７．２）０．２４ｍＬに、各種ビリルビン、すなわち合成δビリルビン（５ｍｇ／ｄＬ；渭原博 医学検査 ４３ １２５３〜５５ （１９９４）による）、ジタウロビリルビン（３５ｍｇ／ｄＬ；抱合ビリルビンの一種）または非抱合ビリルビン（３５ｍｇ／ｄＬ）を各々０．００８ｍＬ添加し、３７℃にて５分間加温し、ミロセシウム属由来ビリルビンオキシダーゼ１Ｕ／ｍＬを含む１０ｍＭのＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液（試薬−２:ｐＨ９．０）０．０６ｍＬを加えて、３７℃で日立７１７０形自動分析装置を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品の吸光度を対照としてビリルビン値を算出し、検体中の理論ビリルビン値に対する割合（％）を比較した。

その結果を表１に示す。ヒドロキシピリジン誘導体を添加した試薬は、δビリルビンに対して７５〜１００％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては８３〜１００％の反応性を示した。一方、メルカプトピリジン誘導体を添加した試薬は、δビリルビンに対しては７８％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては９３〜９８％の反応性を示した。これらのことから、人工的に調製した試料において全てのビリルビン種が、ほぼ測定されることが分かった。

実施例２．反応ｐＨと各種ビリルビンに対する反応性
実施例１の試薬−１におけるヒドロキシピリジン誘導体として２−ヒドロキシピリジンＮ−オキサイドを選択し、クエン酸またはリン酸緩衝液１００ｍＭにてｐＨを４．５〜９．０に調製した試薬−１ ０．２４ｍＬに、実施例１で用いた各種ビリルビン試料０．００８ｍＬを加え、３７℃で５分間予備加温した後、実施例１と同様の試薬−２またはエビタケ属由来ビリルビンオキシダーゼ１Ｕ／ｍＬを含む試薬−２（ｐＨ９．０）を０．０６ｍＬを加えて、３７℃で日立７１７０形自動分析装置を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品の吸光度を対照としてビリルビン値を算出し、検体中の理論ビリルビン値に対する割合（％）を比較した。

その結果を表２に示す。ミロセシウム属ビリルビンオキシダーゼを用いたときは、ｐＨ５．０〜８．０でδビリルビンに対しては８５〜１００%、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては８６〜１００％の反応性を示した。また、ｐＨ５．０未満ではδビリルビンに対して７７％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては３１〜８８％の反応性を示し、ｐＨ８．０より高いときは、δビリルビンに対して１０〜５０%、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては９３〜９８％の反応性を示した。一方、エビタケ属ビリルビンオキシダーゼを用いた場合は、ｐＨ５．０〜８．０でδビリルビンに対して８０〜９９％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては８６〜９９％の反応性を示した。また、ｐＨ５．０未満ではδビリルビンに対して７５％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては３０〜８５％の反応性を示し。ｐＨ８．０より高いときは、δビリルビンに対して１０〜３０％、ジタウロビリルビンおよび非抱合ビリルビンに対しては６０〜９０％の反応性を示した。これらの結果から、人工的試料では、ｐＨ５．０〜８．０の範囲内では、全てのビリルビン種が８０〜１００％とほぼ完全な反応性を示すことが確認された。

実施例３．人血清ビリルビンに対する反応性のＨＰＬＣによる分析
実施例１で、ヒドロキシピリジン誘導体として２−ヒドロキシピリジンＮ−オキサイドを用いた試薬−１ ０．４５ｍＬに、血清検体０．０１５ｍＬを添加し、３７℃で５分間予備加温した後、実施例１と同様の試薬−２を０．１１２ｍＬを加えて、更に３７℃で５分間予備加温し、３ｇ／ｄＬ のフッ化ナトリウム水溶液０．０３ｍＬおよび１０ｇ／ｄＬのアスコルビン酸水溶液０．０１ｍＬを加え、その反応液０．１ｍＬをＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの測定条件は、溶離液−１に０．０５ｇ／ｄＬのフッ化ナトリウムおよび０．２ｇ／ｄＬのアスコルビン酸を添加したこと、そして装置として東ソー社製８０２０分析装置を用いたこと以外、ラウフ等（ Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｌａｕｆｆ、 Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、２２６、ｐ３９１〜４０２（１９８１） ）の実験条件に準じて行った。なお、試薬−１と血清検体を３７℃で５分間予備加温した後、フッ化ナトリウム水溶液およびアスコルビン酸水溶液を添加した試薬−２を加え、ビリルビンオキシダーゼ反応を抑制した溶液中の各種ビリルビンを対照とした。

その結果を図１に示す。本試薬におけるビリルビンオキシダーゼ反応により、δビリルビン、ジグルクロナイドビリルビン、モノグルクロナイドビリルビンおよび非抱合ビリビンに相当するピークがほぼ消失していることが判った。このことから、本発明による試薬において、人血清中の総ビリルビン（全ビリルビン）を測定していることが示された。

実施例４．人血清ビリルビンにおける相関性
実施例３の試薬を用いて、市販されている酵素法による総ビリルビン試薬との人血清１２０例における相関性を評価した。

その結果を図２に示す。相関係数ｒ＝０．９９９９、一次回帰式Ｙ＝０．９９９Ｘ−０．１１と良好な相関関係にあることが判った。

本発明は、以上のように、ビリルビンを含有する検体中の総ビリルビンを正確に測定する方法および試薬を提供することができる。

人血清ビリルビンの反応性についてＨＰＬＣ分析した結果を示すグラフである。 本発明法による総ビリルビン測定値と従来酵素法測定値の相関を示すグラフである。

Claims (4)

1. ビリルビンを含有する生体試料にビリルビンオキシダーゼを作用させて、それにより生ずる変化を光学的に測定する方法において、ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を共存させることを特徴とする総ビリルビンの測定法。
2. ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体が、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイドおよび２−メルカプトピリジン−Ｎ−オキサイドから選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の測定法。
3. ｐＨ５．０〜８．０の範囲でビリルビンオキシダーゼを作用させる請求項１〜２記載の測定法。
4. ヒドロキシピリジン誘導体またはメルカプトピリジン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種およびビリルビンオキシダーゼを含むことを特徴とする総ビリルビン測定用試薬。
   

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