MX2010011763A - Prueba de acetaminofeno. - Google Patents

Abstract

En general, la presente invención proporciona una prueba confiable para la determinación cuantitativa de p-aminofenol en una muestra acuosa; más particularmente, la presente invención proporciona una prueba a base de enzimas rápida para la determinación cuantitativa de acetaminofeno en una muestra; la prueba emplea un cromóforo de xilenol y un catalizador que es preferentemente un oxidante débil; la prueba proporciona resultados confiables en la presencia o ausencia de N-acetilcisteina (NAC) y, por lo tanto, puede usarse para monitorear los niveles de acetaminofeno durante el tratamiento con NAC; también se proporcionan los métodos y kits para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa.

Description

PRUEBA DE ACETAMINOFENO REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/048,406, presentada el 28 de abril de 2008, que se incorpora en la presente invención como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención se relaciona con una prueba para determinar la concentración de p-aminofenol presente en una muestra. Más particularmente, la presente invención se relaciona con una prueba a base de enzimas para determinar la concentración del acetaminofeno presente en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La toxicidad de fármacos es una causa líder de la insuficiencia hepática aguda. En la evaluación de la insuficiencia hepática, el laboratorio clínico juega un papel vital en el diagnóstico, de modo que puede iniciarse un tratamiento apropiado de una manera oportuna.

El acetaminofeno (N-acetil-p-aminofenol) se ha prescrito ampliamente como un analgésico y antipirético. Está ampliamente disponible sin prescripción y es un componente activo en muchas formulaciones terapéuticas comunes, tales como remedios para el resfriado y gripe. El uso amplio de este fármaco se ubica arriba en la lista de agentes hepatóxicos sospechosos en pacientes que presentan un mal funcionamiento hepático.

Mientras que las dosis terapéuticas de acetaminofeno causan raramente efectos adversos, se han reportado casos en donde el uso crónico, excesivo de acetaminofeno ha conducido a hepatoxicidad y nefrotoxicidad. La ingestión de cantidades de sobredosis aguda de acetaminofeno causa un agotamiento de los almacenamientos de glutationa y la acumulación de metabolitos tóxicos en el hígado, que causan insuficiencia hepática grave o incluso fatal.

Cuando el acetaminofeno se ingiere en cantidades excesivas, un intermediario altamente reactivo, N-acetil-p-benzoquinoneimina, se acumula en el hígado. Este intermediario reacciona con tioles en el hígado, particularmente glutationa. La glutationa se oxida a disulfuro de glutationa (GSSG). Los niveles excesivos de GSSG en el hígado causan necrosis. La toxicidad de acetaminofeno se reportan en general a concentraciones séricas mayores de aproximadamente 20 mg/dL ( 324 pmol/L).

El precursor de glutationa, N-acetilcisteína (NAC), a menudo se administra como un antídoto para la sobredosis de acetaminofeno. Aproximadamente 70% de NAC administrada se metaboliza en el hígado. Se cree que la NAC funciona como un antídoto por al menos las siguientes razones: Es un precursor para la glutationa, es un poderoso antioxidante y aumenta la eficiencia de GSSG reductasa en el hígado. La administración de NAC se cree que minimiza o previene el daño causado por una sobredosis de acetaminofeno, por lo menos en parte, reponiendo los almacenamientos de glutationa y previniendo una acumulación de GSSG en el hígado.

Una alta concentración de NAC a menudo se administra en una dosis de carga inicial seguido de niveles de mantenimiento de NAC a través de todo el transcurso del tratamiento. La dosis de carga puede resultar en niveles séricos de NAC de 2000 mg/L o mayores, y niveles de mantenimiento a menudo de aproximadamente 800 mg/L a 1000 mg/L. Es deseable monitorear los niveles de acetaminofeno a través del transcurso del tratamiento de NAC para asegurar que se mantenga un nivel terapéutico apropiado, mientras que se evita la exposición innecesaria o excesiva a NAC.

La incidencia de la sobredosis de acetaminofeno accidental así como intencional, ha aumentado significativamente. El diagnóstico y tratamiento de la sobredosis de acetaminofeno requiere la detección temprana y una medición exacta del fármaco en el cuerpo. La cantidad de acetaminofeno almacenada debe determinarse rápida y precisamente, de modo que los médicos puedan administrar rápidamente una dosis terapéutica apropiada de NAC al paciente. Hay una alta demanda de pruebas clínicas rápidas, confiables y resistentes para determinar la concentración de acetaminofeno en las muestras biológicas.

Los métodos conocidos para determinar los niveles de acetaminofeno en las muestras biológicas incluyen, por ejemplo, diferentes técnicas cromatográficas y espectrofotométricas.

La cromatografía gas-líquido y la cromatografía líquida de alta resolución han probado ser métodos confiables y precisos para determinar los niveles de acetaminofeno en las muestras biológicas, sin embargo, ambos son procedimientos largos que requieren una instrumentación costosa y un alto nivel de experiencia técnica para realizarse. Estos métodos no son particularmente apropiados para laboratorios rápidos, en donde se requieren resultados inmediatos.

La espectrofotometría diferencial se ha usado ampliamente, pero este método requiere extracciones de disolventes que consumen tiempo, las cuales son indeseables en las pruebas clínicas. Los métodos espectrofotométricos más rápidos en general fracasan para ofrecer la especificidad deseada.

Las técnicas colorimétricas incluyen colorimetría simple así como pruebas colorimétricas a base de enzimas. Las diferentes pruebas de base inmunológica también están disponibles, pero éstas tienden a ser significativamente más costosas y, por lo tanto, menos deseables, particularmente en una instalación clínica.

Mientras que las pruebas a base de enzimas son convenientes y económicas comparadas con las pruebas de base inmunológica, en general son menos confiables ya que son propensas a la interferencia con las moléculas biológicas a menudo presentes en las muestras de pacientes, tales como bilirrubina y hemoglobina. Los niveles elevados de tales moléculas en las muestras de pacientes pueden causar resultados positivos falsos (ver, por ejemplo, Bertholf et al., 2003), que pueden conducir potencialmente a un mal diagnóstico y una elección inapropiada o dosis de tratamiento.

Las pruebas enzimáticas conocidas también se someten a interferencia en presencia de niveles terapéuticos de NAC. Por lo tanto, las pruebas enzimáticas en general no pueden usarse para monitorear los niveles de acetaminofeno durante el transcurso del tratamiento de NAC debido a la inexactitud en los niveles de acetaminofeno medidos. Esta es una desventaja significativa de las pruebas de acetaminofeno enzimáticas conocidas.

Las pruebas enzimáticas conocidas emplean tres componentes principales: una enzima de aril acilamidasa, un compuesto cromogénico (o de formación de color) y un agente oxidante de potencial oxidativo suficiente para catalizar la reacción de acoplamiento.

La aril acilamidasa rompe el enlace de amida del acetaminofeno para producir p-aminofenol y acetato. El p-aminofenol después se hace reaccionar con el compuesto cromogénico en una reacción de acoplamiento oxidativa en presencia de un catalizador oxidante para formar un producto coloreado. Los catalizadores típicos incluyen sales metálicas o complejos metálicos de especies que tienen oxígeno reactivo o grupos funcionales, tales como permanganato, periodato, persulfato, sulfato o acetato. El cambio en la absorbancia, medida típicamente a una longitud de onda que captura la absorbancia pico del producto coloreado, después se usa para determinar la concentración de acetaminofeno en la muestra. Esto puede determinarse comparando los valores de absorbancia obtenidos contra un estándar o grupo de estándares que tienen una concentración de acetaminofeno conocida y probada por el mismo método. El número de moles de producto coloreado formado es típicamente proporcional al número de moles de acetaminofeno inicialmente presente en la muestra.

Las pruebas de acetaminofeno a base de enzimas previas requirieron tiempos de incubación muy largos, a menudo mayores de 1 hora para cada una de las reacciones de hidrólisis y acoplamiento oxidativo, haciéndolas de esta manera inapropiadas para el uso en un establecimiento clínico de emergencia.

Hammond et al. (1984) desarrollaron una prueba a base de enzimas rápida para determinar la concentración de acetaminofeno en el suero usando aril acilamidasa para hidrolizar el acetaminofeno a p-aminofenol. El p-aminofenol se hace reaccionar sustancialmente con o-cresol en una reacción de acoplamiento oxidativa catalizada por sulfato de cobre, para formar un colorante de indofenol. El cambio en la absorbancia en la longitud de onda pico del colorante (615 nm) después se usa para determinar los niveles de acetaminofeno. Mientras que este método proporciona una detección rápida de acetaminofeno, se somete a una interferencia significativa de niveles terapéuticos de NAC y no puede usarse confiablemente durante el tratamiento de NAC. Un método similar que usa o-cresol en presencia de un catalizador oxidante es propenso a la interferencia de bilirrubina (Bertholf et al., 2003), que conduce a resultados positivos falsos en los pacientes hiperbilirrubinémicos.

Morris et al., (1990) describen una base a base de enzimas automatizada para medir el acetaminofeno en una muestra. Las pruebas automatizadas en general se prefieren por los laboratorios clínicos. El método usa una aril acilamidasa para la hidrólisis de acetaminofeno a p-aminofenol, seguido del acoplamiento oxidativo con 8-hidroxiquinolina en presencia de iones de manganeso para formar un producto azul. Los reactivos se liofilizan para almacenar estabilidad y deben reconstituirse antes del uso. Las pruebas que involucran una etapa de reconstitución son menos deseables que las pruebas estables a líquidos y son más proclives a error.

Las pruebas de acetaminofeno conocidas que usan 8-hidroxiquinolina o un derivado de la misma como un cromóforo se someten a interferencia en presencia de niveles terapéuticos de NAC (es decir >800 mg/L). Los presentes inventores probaron dos pruebas de acetaminofeno comercialmente disponibles (Genzyme Diagnostics P.E.I. Inc., PEI, Canadá) que contienen ya sea el ácido 8-hidroxiquinolin-5-sulfónico (8-HQ5SA) o hemisulfato de 8-hidroxiquinolina (8-HQHS) como un cromóforo. Aunque se observaron las mediciones de acetaminofeno exactas en ausencia en ausencia de NAC, hubo una disminución significativa (es decir, aproximadamente 10%) en la recuperación de acetaminofeno en presencia de niveles terapéuticos de NAC. Se descubrió que la presencia de NAC afectó la reacción de acoplamiento oxidativa en la prueba en lugar de la conversión enzimática de acetaminofeno a p-aminofenol. Hubo un diferencia considerable en la recuperación entre las pruebas de 8-HQ5SA y 8-HQHS, siendo la prueba 8-HQ5SA significativamente más susceptible a la interferencia de NAC, lo que indica que aun una ligera diferencia en la estructura química del cromóforo puede ser crucial para la reacción de acoplamiento cuando está presente NAC.

Chen et al. (2004) describen una prueba para cuantificar p-aminofenol en orina para valorar la exposición a anilina en el sitio de trabajo. Los niveles de p-aminofenol en orina sirven como un marcador biológico de la toxicidad de anilina dado que aproximadamente 15 a 60% de la anilina absorbida se oxida a p-aminofenol in vivo. La orina debe acidificarse y pre-tratarse para liberar el p-aminofenol libre de las formas conjugadas excretadas en la orina. La prueba involucra una reacción de acoplamiento oxidativa usando 2,5-dimetilfenol (p-xilenol) como el cromóforo para formar un producto coloreado. La reacción de acoplamiento se cataliza por periodato de sodio, un oxidante fuerte, para formar un producto coloreado. Se especuló que cuantificando los niveles de p-aminofenol en la orina puede ser útil para verificar la sobredosis de acetaminofeno, aunque esto ni se exploró ni se demostró.

Afshari y Lui (2001 ) describen un método no enzimático para la cuantificación de acetaminofeno en suero. El acetaminofeno no conjugado libre se separa primero de los interferentes endógenos mediante una etapa de extracción seguido de hidrólisis a p-aminofenol usando calor (es decir, ebullendo durante 10 minutos) y ácido. Esta es una reacción de hidrólisis no selectiva comparado con una reacción enzimática. La reacción de hidrólisis se sigue por acoplamiento oxidativo de p-aminofenol a 2,5-dimetilfenol (p-xilenol) en presencia de periodato de sodio, un oxidante fuerte, para formar un producto coloreado. La necesidad de extraer el acetaminofeno de la muestra y ebullir las muestras hace a este método indeseable para el uso en un establecimiento clínico de emergencia y también inapropiado para automatización.

Aunque las pruebas de acetaminofeno enzimáticas son convenientes y más asequibles que las pruebas de base inmunológica, muchos laboratorios clínicos favorecen las pruebas de base inmunológica dado que no son afectadas por la presencia de NAC en una muestra. Es deseable medir confiablemente los niveles de acetaminofeno durante el transcurso del tratamiento de NAC. Las pruebas de base inmunológica también son menos susceptibles de interferencia en presencia de las moléculas biológicas, tales como bilirrubina y hemoglobina, a menudo presentes en las muestras de pacientes. Dado que los niveles de suero de la bilirrubina y hemoglobina no son predecibles de paciente a paciente, una prueba que es más proclive a la interferencia con estas moléculas no proporcionará una prueba clínica fuerte que sea confiable para todos los pacientes.

Por lo tanto, es deseable proporcionar una prueba de acetaminofeno rápida qué sea exacta y confiable en presencia o ausencia de NAC, y que sea menos costosa que las pruebas de base inmunológica convencionales. También es deseable proporcionar tal prueba que sea menos susceptible a la interferencia con las moléculas biológicas presentes en las muestras de pacientes comparadas con las pruebas conocidas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las modalidades de la invención se describirán ahora, sólo a manera de ejemplo, con referencia a las figuras anexas, en donde: La Figura 1 muestra los resultados de una prueba de acetaminofeno de la técnica anterior llevada a cabo en presencia o ausencia de niveles terapéuticos de NAC, con ácido 8-hidroxiqu¡nolin-5-sulfónico (8-HQ5SA) como el cromóforo, en donde los resultados demuestran que 8-HQ5SA muestra una interferencia significativa en presencia de niveles terapéuticos de NAC; La Figura 2 muestra los resultados de una prueba de acetaminofeno llevada a cabo como anteriormente en la Figura 1 , siendo la única diferencia que 8-HQ5SA se reemplaza con p-xilenol como el cromóforo, en donde los resultados demuestran que p-xilenol no se afecta relativamente por la presencia de niveles terapéuticos de NAC.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención se relaciona con una prueba confiable para la determinación cuantitativa de p-aminofenol en una muestra. Más particularmente, la presente invención se relaciona con una prueba a base enzimática para la determinación cuantitativa de acetaminofeno en una muestra. La prueba tiene una ventaja sobre la técnica anterior de que proporciona resultados precisos y confiables en presencia o ausencia de NAC y, por lo tanto, puede usarse para medir los niveles de acetaminofeno durante el tratamiento de NAC. En algunas modalidades, la prueba tiene la ventaja adicional de un desempeño mejorado y una interferencia reducida con las moléculas biológicas, comparado con las pruebas conocidas.

Se ha descubierto sorprendentemente que la elección de un compuesto de xilenol como un cromóforo en una reacción de acoplamiento oxidativa con p-aminofenol resulta en una exactitud mejorada y una interferencia reducida en presencia de NAC, comparado con los otros cromóforos conocidos.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa. El método comprende las etapas de hidrolizar el acetaminofeno a p-aminofenol; acoplar oxidativamente el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol en presencia de un catalizador apropiado para formar un producto coloreado y determinar la cantidad del producto coloreado formado. La cantidad del producto coloreado formado es proporcional a la cantidad de acetaminofeno presente inicialmente en la muestra acuosa. El método es apropiado para el uso en presencia o ausencia de niveles terapéuticos de N-acetilcisteina (NAC) en la muestra acuosa.

En otro aspecto, la invención proporciona una prueba para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa, comprendiendo la prueba las etapas de poner en contacto la muestra acuosa con un primer reactivo (R1) que comprende la enzima aril acilamidasa y un diluyente apropiado para formar una solución de hidrólisis y diluir opcionalmente la solución de hidrólisis; incubar la solución de hidrólisis para permitir una reacción de hidrólisis, en donde el acetaminofeno se convierte a p-aminofenol; poner en contacto la solución de hidrólisis con un segundo reactivo (R2) que contiene un cromóforo de xilenol y un diluyente apropiado para formar una solución de acoplamiento oxidativa; incubar la solución de acoplamiento oxidativa para permitir una reacción de acoplamiento oxidativa, en donde el cromóforo de xilenol se acopla al p-aminofenol en presencia de un catalizador apropiado para formar un producto coloreado y determinar la cantidad del producto coloreado formad, siendo la cantidad del producto coloreado formado proporcional a la cantidad de acetaminofeno presente inicialmente en la muestra acuosa, en donde la muestra es apropiada para el uso en presencia o ausencia de niveles terapéuticos de N-acetilcisteína (NAC) en la muestra acuosa.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa, comprendiendo el método las etapas de poner en contacto la muestra con una aril acilamidasa, resultando en la conversión del acetaminofeno en la muestra en p-aminofenol; acoplar oxidativamente el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol en presencia de un catalizador para formar un colorante y determinar la concentración del colorante, en donde la cantidad de acetaminofeno en la muestra original es proporcional a la cantidad del colorante formado.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra de sangre, comprendiendo el kit una aril acilamidasa, un xilenol y un catalizador.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa en presencia o ausencia de NAC, comprendiendo el kit: un primer recipiente que contiene un primer reactivo (R1) que comprende una aril acilamidasa para hidrolizar acetaminofeno a p-aminofenol y un segundo recipiente que contiene un segundo reactivo (R2) que comprende un cromóforo de xilenol para el acoplamiento oxidativo al p-aminofenol, en donde R1 o R2 comprende además un catalizador apropiado para catalizar el acoplamiento del cromóforo de xilenol al p-aminofenol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención se relaciona con una prueba confiable para la determinación cuantitativa de p-aminofenol en una muestra. Más particularmente, la presente invención se relaciona con una prueba de base enzimática para la determinación cuantitativa de acetaminofeno en una muestra. La prueba tiene una ventaja sobre la técnica anterior en que proporciona resultados precisos y confiables en presencia o ausencia de NAC. En algunas modalidades, la prueba tiene la ventaja adicional de una interferencia reducida con las moléculas biológicas comparado con las muestras conocidas.

Las muestras a ser probadas son de preferencia muestras acuosas, lo que significa que tienen un componente de base acuosa. Las muestras acuosas ejemplares que pueden probarse en la prueba incluyen, pero no se limitan a, agua, sangre completa, plasma, suero, linfa, bilis, orina, fluido espinal, esputo, saliva, transpiración, secreciones de deyecciones y similares. También es posible probar las preparaciones de fluidos del tejido humano o animal, tales como músculo esquelético, corazón, riñon, pulmón, cerebro, médula ósea, piel y similares. Los ejemplos de las preparaciones de fluidos incluyen homogeneizados de tejido y sobrenadantes de los mismos.

En una modalidad, la muestra acuosa a ser probada es plasma, suero u orina. En otra modalidad, la muestra acuosa es plasma o suero. En una modalidad, la muestra acuosa es suero.

Mientras que se entiende que la prueba de la presente invención puede llevarse a cabo sin la etapa de hidrólisis inicial, es decir, si el p-aminofenol se va a medir directamente en una muestra, la prueba se usará más típicamente para medir los niveles de acetaminofeno en una muestra y, por lo tanto, requerirá hidrólisis de acetaminofeno a p-aminofenol antes del acoplamiento oxidativo de p-aminofenol con un cromóforo seleccionado. De acuerdo con la presente invención, el cromóforo seleccionado es un cromóforo de xilenol. Aunque es posible una reacción de hidrólisis no enzimática, la reacción preferida es una conversión enzimática de acetaminofeno a p-aminofenol.

La prueba de la presente invención se lleva a cabo típicamente en dos partes. La primera parte involucra la hidrólisis enzimática de acetaminofeno a p-aminofenol. La segunda parte involucra el acoplamiento oxidativo de p-aminofenol a un cromóforo de xilenol en presencia de un catalizador apropiado para formar un producto coloreado. En algunas modalidades, el catalizador preferido se selecciona de oxidantes débiles. La concentración de acetaminofeno en la muestra después puede determinarse, por ejemplo, midiendo el cambio en la absorbancia a una longitud de onda dada y comparando el valor obtenido contra un estándar o grupo de estándares que tienen una concentración de acetaminofeno conocida.

En una modalidad, la prueba es una prueba de dos partes llevada a cabo como sigue.

En la primera parte, una alícuota de muestra se pone en contacto con un primer reactivo (R1) que contiene la enzima para formar una solución de hidrólisis. Este primer reactivo pude referirse como el reactivo enzimático. La solución de hidrólisis que contiene la muestra en R1 se mezcla y se diluye opcionalmente. En una modalidad, la etapa de dilución opcional involucra una dilución 1 :1 de R1 con un diluyente apropiado, tal como agua desionizada. La solución se mezcla y la reacción de hidrólisis se continúa hasta completa a una temperatura apropiada para permitir la hidrólisis del acetaminofeno en la muestra a p-aminofenol. Se obtiene un valor de la absorbancia a una longitud de onda dada.

En la segunda parte, una vez que se completa la hidrólisis, un segundo reactivo (R2) que contiene el cromóforo de xilenol, se adiciona a la solución de hidrólisis y la mezcla resultante se combina brevemente. El segundo reactivo (R2) puede referirse como el reactivo de cromóforo. El acoplamiento oxidativo del cromóforo de xilenol con p-aminofenol requiere la presencia de un catalizador apropiado. En una modalidad, el catalizador para la reacción de acoplamiento oxidativa es un componente de R1 de modo que el catalizador y el cromóforo no se asocian hasta que se combinan R1 y R2. De manera alternativa, el catalizador puede ser un componente de R2, o puede agregarse a la mezcla de R1 y R2 para activar la etapa de acoplamiento oxidativa. La reacción de acoplamiento oxidativa se continúa hasta completarse a una temperatura apropiada. Una vez que se completa, la absorbancia se mide a una longitud de onda dada y se calcula el cambio en la absorbancia entre la primera parte y la segunda parte.

Para determinar la cantidad de acetaminofeno presente inicialmente en la muestra, el cambio en la absorbancia se compara contra un estándar, o un grupo de estándares, preparados por el mismo método y usando las concentraciones conocidas del acetaminofeno. Los factores de dilución deben tomarse en cuenta. Estos cálculos son de rutina para los experimentados en la técnica.

Esta prueba de dos partes es apropiada para la automatización dado que no se requieren etapas de extracción o separación y sólo se usan dos reactivos. Las etapas de dilución y mezclado alojadas también pueden llevarse a cabo de una manera automatizada. Los instrumentos automatizados para llevar a cabo estas pruebas son bien conocidos en la técnica. De manera alternativa, la prueba puede llevarse a cabo manualmente.

La enzima preferida para la reacción de hidrólisis es una enzima de aril acilamidasa. Las enzimas de aril acilamidasa catalizan la hidrólisis de anilidas a anilinas y se identifican por IUB (International Union of Biochemistry) número E.C.3.5.1.13. El número de registro CAS para esta clase de enzimas es 9025-18-7. Las enzimas de aril acilamidasa se producen típicamente y se aislan de microorganismos, tales como bacterias. Los ejemplos no limitantes de las enzimas de aril acilamidasa y los métodos para producirlas de microorganismos se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,430,433 a Hammond et al.

Cualquier enzima de aril acilamidasa apropiada puede usarse de acuerdo con la presente invención con la condición de que sea capaz de catalizar efectivamente la hidrólisis de acetaminofeno a p-aminofenol bajo condiciones de reacción apropiadas. Las condiciones de reacción pueden optimizarse por una persona experta en la técnica desde el punto de vista de la enzima particular seleccionada sin apartarse de la presente invención.

La aril acilamidasa puede estar presente en cualquier cantidad apropiada. La aril acilamidasa está presente de preferencia en una concentración suficiente de modo que sustancialmente todo el acetaminofeno presente en una muestra será convertido a p-aminofenol. En una modalidad, R1 comprende aril acilamidasa a una concentración de aproximadamente 0 U/L a aproximadamente 5000 U/L o aproximadamente 600 U/L a aproximadamente 1200 U/L o aproximadamente 800 U/L a aproximadamente 1000 U/L. En una modalidad, R1 comprende aril acilamidasa a una concentración de aproximadamente 932.7 U/L.

El disolvente o diluyente para R1 puede ser cualquier disolvente o diluyente de base acuosa apropiado que no impacta negativamente la prueba. En una modalidad, el disolvente o diluyente es agua, de preferencia agua destilada, agua desionizada o agua de osmosis inversa. En una modalidad, el diluyente es agua desionizada. El disolvente o diluyente puede comprender diferentes aditivos y componentes.

Además de la aril acilamidasa, R1 puede comprender además uno o más de un catalizador, un cofactor, un solubilizador proteínico, un estabilizador proteínico, un estabilizador enzimático, un quelante metálico, un amortiguador, un agente tensoactivo, un ajustador de pH, un conservador, un diluyente, un disolvente, un excipiente o similares.

En una modalidad, R1 comprende el catalizador para la reacción de acoplamiento oxidativa. Puede usarse cualquier catalizador apropiado de acuerdo con la invención, en cualquier concentración apropiada, si es capaz de catalizar suficientemente la reacción de acoplamiento oxidativa. Ejemplos de los catalizadores incluyen, pero no se limitan a, permanganatos, periodatos, persulfatos, acetatos y otras sales metálicas. En una modalidad, el catalizador es una sal metálica seleccionada de FeC , MnCI2, CuS04, KI04 o un derivado de la misma. En una modalidad preferida, el catalizador es un oxidante débil. En una modalidad, el catalizador oxidante débil es cloruro de manganeso (II), MnC . En una modalidad, el catalizador es cloruro de manganeso (II) tetrahidratado, MnCI2-4H20.

En algunas modalidades, el catalizador está presente en una concentración de aproximadamente 0.0005 g/L a aproximadamente 1.000 g/L o aproximadamente 0.005 g/L a aproximadamente 1.000 g/L o aproximadamente 0.010 g/L a aproximadamente 0.100 g/L, o aproximadamente 0.025 g/L a aproximadamente 0.075 g/L o aproximadamente 0.040 g/L a aproximadamente 0.060 g/L. En una modalidad, R1 comprende MnCI24H2O como un catalizador en una concentración de aproximadamente 0.0525 g/L. El MnCI2-4H20 puede tener funciones adicionales más allá de sus propiedades catalíticas, por ejemplo, se cree que MnCI2-4H20 también puede actuar como un estabilizador enzimático para mejorar adicionalmente la vida de almacenamiento del reactivo enzimático (R1).

En una modalidad, R1 comprende por lo menos un estabilizador proteínico. Un estabilizador proteínico ayudará en la estabilización de la enzima presente en el reactivo, por lo que mejora la vida de almacenamiento del reactivo. Puede usarse cualquier estabilizador proteínico apropiado o una combinación del mismo de acuerdo con la invención.

Un estabilizador proteínico preferido es PVP-40, que también puede servir como un estabilizador proteínico en el reactivo. Los presentes inventores han encontrado que PVP-40 puede reducir o eliminar los errores de medición en la prueba causados por la presencia de proteínas en el reactivo y pueden prevenir la precipitación de proteínas en el reactivo, por lo que se mejora la vida de almacenamiento del reactivo y el desempeño global de la prueba. En una modalidad, R1 comprende PVP-40 en una concentración de aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 10 g/L, o aproximadamente 0.5 g/L a aproximadamente 5 g/L o aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 3 g/L. En una modalidad, R1 comprende PVP-40 en una concentración de aproximadamente 2 g/L.

En una modalidad, R1 comprende por lo menos un estabilizador proteínico seleccionado de PVP-40, Fracción V de BSA, trehalosa, p-hidroxibenzoato de sodio, ácido p-hidroxibenzó¡co y una combinación de los mismos. En una modalidad, por lo menos un estabilizador enzimático comprende una combinación de ácido p-hidroxibenzóico. La Fracción V de BSA puede estar presente en una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 10 g/L, o aproximadamente 0.5 g/L a aproximadamente 5 g/L o aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 2.5 g/L.

En una modalidad, R1 comprende la Fracción V de BSA en una concentración de aproximadamente 1 g/L. La trehalosa puede estar presente en una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 10 g/L o aproximadamente 0.5 g/L a aproximadamente 5 g/L o aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 2.5 g/L. En una modalidad, R1 comprende trehalosa en una concentración de aproximadamente 4.04 g/L. El ácido p-hidroxibenzóico o p-hidroxibenzóico puede estar presente en una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 10 g/L o aproximadamente 0.5 g/L a aproximadamente 5 g/L o aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 2.5 g/L. En una modalidad, R1 comprende p-hidroxibenzoato de sodio en una concentración de aproximadamente 1 g/L. En una modalidad, R1 comprende ácido p-hidroxibenzóico en una concentración de aproximadamente 1 g/L.

En una modalidad, R1 comprende aproximadamente 2 g/L de PVP-40; aproximadamente 1 g/L de Fracción V de BSA; aproximadamente 4.04 g/L de trehalosa y aproximadamente 1 g/L de ácido p-hidroxibenzóico sódico.

R1 puede comprender opcionalmente un amortiguador. Puede usarse cualquier amortiguador apropiado de acuerdo con la invención. Los amortiguadores apropiados incluyen, pero no se limitan a, fosfato, pirofosfato, fosfato de potasio, CAPS (ácido N-ciclohexil-3-aminopropan sulfónico), CAPS/metaborato, CAPS/carbonato, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 2{[tris(hidroximetil)metil]amino}-1-etansulfónico (TES), TRIS/carbonato, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico (HEPES), 3-[4-(2-hidroxiet¡l)-1-piperazinil]propansulfónico (EPPES), ácido 2-hidroxi-3-{N- [tris(hidroximetil)metil]amino}-propansulfónico (TAPSO) y combinaciones de los mismos.

El amortiguador puede estar presente, por ejemplo, en una concentración de aproximadamente 1 a 10 g/L o de aproximadamente 5 a 8 g/L. En una modalidad, R1 comprende el amortiguador CAPS. En una modalidad, R1 comprende el amortiguador CAPS en una concentración de aproximadamente 6.4 g/L.

R1 puede comprender opcionalmente un conservador. Cualquier conservador apropiado puede usarse de acuerdo con la invención. Los conservadores apropiados incluyen, pero no se limitan a, sulfato de gentamicina, azida de sodio y benzoato de sodio. En una modalidad, R1 comprende sulfato de gentamicina en una concentración de aproximadamente 0.001 g/L a aproximadamente 0.1 g/L o de aproximadamente 0.01 g/L a aproximadamente 0.05 g/L. En una modalidad, R1 comprende aproximadamente 0.01 g/L de sulfato de gentamicina. En una modalidad, R1 comprende azida de sodio en una concentración de aproximadamente 0.001 g/L a aproximadamente 0.1 g/L o de aproximadamente 0.01 g/L a aproximadamente 0.05 g/L. En una modalidad, R1 comprende aproximadamente 0.05 g/L de azida de sodio. En una modalidad, R1 comprende aproximadamente 0.01 g/L de sulfato de gentamicina y aproximadamente 0.05 g/L de azida de sodio.

R1 puede comprender opcionalmente un quelante metálico.

Puede usarse cualquier quelante metálico de acuerdo con la invención. Los quelantes metálicos apropiados incluyen, pero no se limitan a, EDTA. En una modalidad, R1 comprende EDTA en una concentración de aproximadamente 0.001 g/L a aproximadamente 0.1 g/L o aproximadamente 0.01 g/L a aproximadamente 0.05 g/L. En una modalidad, R1 comprende EDTA en una concentración de aproximadamente 0.025 g/L.

R1 puede comprender opcionalmente un agente tensoactivo. Puede usarse cualquier agente tensoactivo apropiado de acuerdo con la invención. Los ejemplos de agentes tensoactivos incluyen, pero no se limitan a, Brij™-35, Tritón™ X-100, Olin-10G™, TX™-102, TX-405™, Zonyl FSN™, TX-100™y TX-165™.

La reacción de hidrólisis se lleva a cabo de preferencia a un pH en el intervalo de aproximadamente 5.9 a aproximadamente 12.0 o aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.0 o aproximadamente 7.5 a aproximadamente 9.4, de preferencia de aproximadamente 8 a 9. En una modalidad, el pH es de aproximadamente 8.6.

El pH de R1 puede ajustarse por cualquier medio apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, NaOH o cualquier otra base apropiada puede usarse para aumentar el pH. HCI o cualquier otro ácido apropiado puede usarse para disminuir el pH. En una modalidad, el pH de R1 se ajusta usando NaOH. En una modalidad, R1 comprende NaOH 2N en una cantidad de aproximadamente 500 pL/L a aproximadamente 1000 pIJL. En una modalidad, R1 comprende aproximadamente 833 µ?_/?_ de NaOH 2N.

Un ejemplo de formulación de R1 se proporciona en el siguiente Cuadro 1. De acuerdo con esta modalidad ejemplar, R1 puede prepararse adicionando cada uno de los componentes, con la excepción de la enzima y (} azida de sodio, a menos de un volumen total de 100% de un diluyente apropiado, de preferencia agua destilada, agua desionizada o agua de osmosis inversa. El pH después se ajusta al intervalo deseado con NaOH, seguido de la adición de la azida de sodio. La enzima se adiciona al final. La formulación después se forma hasta un volumen de 100% con el diluyente.

En una modalidad de una prueba automatizada de la presente invención, 10 pL de muestra (o control o estándar) se adiciona a 100 pL de R1 en una cubeta. R1 después se somete a una dilución ajustada 1 :1 con 100 pL de agua, de preferencia agua desionizada, agua destilada o agua de osmosis inversa y la solución se mezcla brevemente. La reacción de hidrólisis se lleva a cabo en una cubeta. Los volúmenes pueden ajustarse dependiendo del tamaño de la cubeta requerida para un instrumento automatizado particular (es decir, analizador químico). En una modalidad, el analizador químico es un Hitachi 717® Chemical Analyzer (Roche Diagnostics).

La reacción de hidrólisis se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 60°C, o aproximadamente 30°C a aproximadamente 50°C o aproximadamente 35°C a aproximadamente 40°C. En una modalidad, la reacción de hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 37°C.

La reacción de hidrólisis se deja proceder durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la hidrólisis de sustancialmente todo el acetaminofeno presente en la muestra (o estándar), típicamente entre aproximadamente 2 a 20 minutos o entre aproximadamente 3 a 10 minutos. En una modalidad, la reacción de hidrólisis se continúa durante aproximadamente 5 minutos. La duración de la reacción puede optimizarse para la temperatura seleccionada dado que tiempos de reacción mayores en general son necesarios para menores temperaturas.

Después de completar la reacción de hidrólisis y que sustancialmente todo el acetaminofeno en la muestra (o estándar) se ha convertido a p-aminofenol, se lleva a cabo la etapa de acoplamiento oxidativo.

En una modalidad de una prueba automatizada de la presente invención, la etapa de acoplamiento oxidativo se inicia adicionando el segundo reactivo (R2) que contiene el cromóforo directamente a la cubeta que contiene la solución de hidrólisis. De acuerdo con la modalidad descrita anteriormente, 200 pL de R2 se adicionan a la solución de hidrólisis, y se mezcla brevemente, para un volumen de reacción de acoplamiento oxidativo final de 410 pL (10 pL de muestra + 100 pL de R1 + 100 pL de agua + 200 pL de R2) en la cubeta.

De acuerdo con la presente invención, el cromóforo preferido es un cromóforo de xilenol. Los presentes inventores han descubierto sorpresivamente que la elección de un cromóforo de xilenol en la presente prueba redujo significativamente la interferencia en presencia de NAC. Este resultado sorprendente proporciona una ventaja sobre las pruebas de la técnica anterior en que la presente prueba puede recomendarse para el uso durante el tratamiento de NAC. Los presentes inventores han mostrado mediciones de acetaminofeno confiables en presencia de niveles terapéuticos de NAC hasta por lo menos 2000 mg/L, un resultado no demostrado previamente en ninguna prueba de acetaminofeno enzimática de la técnica anterior.

En un experimento, los presentes inventores también han encontrado sorprendentemente que el reemplazamiento de un cromóforo de 8-HQ5SA con 2,5-dimetilfenol en una prueba de acetaminofeno comercialmente disponible (disponible en Genzyme Diagnostics P.E.I. Inc., PEI, Canadá) resultó en una interferencia de bilirrubina significativamente disminuida en la prueba, que demuestra además que la elección del cromóforo puede impactar significativamente los niveles de interferencia en la prueba.

Puede usarse cualquier cromóforo de xilenol apropiado de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, 2,5-dimetilfenol, 3,4-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol, 2,4-dimetilfenol, 3,5-dimetilfenol ó 2,3-dimetilfenol. Los cromóforos de xilenol preferidos resultan en una interferencia mínima en la prueba en presencia de niveles terapéuticos de NAC. En los experimentos, 2,5-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol ó 2,3-dimetilfenol no mostraron una interferencia significativa con 1471 mg/L de NAC en una prueba de interferencia. En una modalidad, el cromóforo de xilenol es 2,5-dimetilfenol (p-xilenol).

El cromóforo de xilenol puede estar presente durante la reacción de acoplamiento oxidativa en cualquier concentración apropiada. Para calcular exactamente la concentración de acetaminofeno presente en una muestra inicial, sin embargo, el cromóforo debería estar presente idealmente en una concentración molar que satisface o excede la concentración molar de p-aminofenol máxima en la solución de hidrólisis, que es proporcional a la cantidad de acetaminofeno en la muestra inicial.

En una modalidad, R2 comprende el cromóforo de xilenol en una concentración de aproximadamente 0.075 g/L a aproximadamente 115 g/L o aproximadamente 2.5 g/L a aproximadamente 20 g/L, o aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 10 g/L. En una modalidad, el cromóforo de xilenol es 2,5-dimetilfenol y está presente en R2 en una concentración de aproximadamente 7.5 g/L.

Para que la reacción de acoplamiento oxidativa se lleve a cabo en un tiempo apropiado, debe estar presente un catalizador apropiado. El catalizador puede ser un componente de R1 o R2 o puede adicionarse a la mezcla de R1 y R2. Puede usarse una variedad de catalizadores de acuerdo con la presente invención, tales como permanganatos, periodatos, persulfatos y diferentes sales metálicas. En una modalidad, el catalizador es una sal metálica, tal como FeCI3, MnC , CuS04 o KI04. En una modalidad, el catalizador comprende MnC anhidro o hidratado. Se encontró sorprendentemente que MnCb, que es un oxidante débil, fue particularmente efectivo para catalizar la etapa de acoplamiento oxidativa con p-xilenol comparado con otras sales metálicas probadas.

Típicamente, para la etapa de acoplamiento oxidativa en una prueba de acetaminofeno, un catalizador que tiene un potencial oxidante fuerte se selecciona para asegurar que se proporcione una energía suficiente para activar la reacción de acoplamiento hasta completarse. En general, los catalizadores empleados son sales metálicas de especies que contienen oxígeno reactivo o grupos funcionales, tales como periodato de sodio, sulfato de cobre y acetato de manganeso. Por ejemplo, las pruebas de acetaminofeno conocidas han usado hidroxiquinolina o sus derivados catalizados por acetato de manganeso (es decir, Genzyme Diagnostics P.E.I. Inc., PEI, Canadá); o-cresol catalizado por periodato (GDS Diagnostics) o sulfato de cobre (Hammond et al., 1984) o p-xilenol catalizado por periodato de sodio (Afshari y Lui, 2001). Tales pruebas de acetaminofeno se conoce que muestran interferencia. Por ejemplo, la interferencia en presencia de niveles elevados de bilirrubina en las muestras biológicas produce resultados erróneos en tales muestras.

Los presentes inventores postularon que el uso de un catalizador oxidante fuerte podría ser un factor contribuyente en la interferencia de bilirrubina que se observa con las pruebas de acetaminofeno convencionales. Por ejemplo, se ha usado periodato por algunos fabricantes de reactivos para medir la bilirrubina por la destrucción selectiva de la bilirrubina para formar bilverdina. Hay un cambio significativo en la absorbencia ya que la bilirrubina se oxida a bilverdina o productos oxidantes superiores, que podría contribuir a la interferencia observada en las pruebas convencionales. De esta manera, los presentes inventores establecen determinar si (a) un oxidante débil podría activar exitosamente una reacción de acoplamiento oxidante entre un cromóforo de xilenol, tal como 2,5-dimetilfenol y p-aminofenol y (b) el uso de un oxidante débil tendría un efecto positivo sobre la interferencia de bilirrubina en la prueba.

Se ha demostrado ahora sorprendentemente que la elección de un oxidante débil, tal como MnCI2 como un catalizador ejemplar que tiene un potencial oxidante bajo comparado con el periodato de sodio u otros oxidantes fuertes que contienen las especies reactivas de oxígeno, proporcionó una energía suficiente para catalizar el acoplamiento de p-aminofenol a 2,5-dimetilfenol en la reacción. Además, se demostró exitosamente que la elección de un oxidante débil como el catalizador redujo significativamente la interferencia de bilirrubina en la prueba, lo cual es un descubrimiento altamente deseable desde una perspectiva clínica. Sorprendentemente, se descubrió además que una concentración menor de MnC fue necesaria para activar la reacción en comparación con los otros catalizadores probados y aún se presentó un revelado de color más fuerte en la prueba. El uso de menos catalizador en el reactivo reduce la oportunidad del catalizador de reaccionar con otros componentes reactivos o con componentes biológicos o químicos presentes en las muestras de pacientes, por lo que se mejora la prueba.

Por lo tanto, la elección de un oxidante débil como un catalizador puede reducir el potencial para la oxidación espontánea del cromóforo de xilenoi y la reactividad con otros componentes presentes en el reactivo de prueba con el tiempo, por lo que se mejora la estabilidad del reactivo y se prolonga la vida de almacenamiento de los reactivos estables a líquidos. Una persona experta en la técnica será capaz de distinguir un oxidante fuerte de un oxidante débil y será capaz de seleccionar un oxidante débil apropiado para el uso como un catalizador de acuerdo con las modalidades de la invención.

Se postuló que la adición de un antioxidante al reactivo de cromóforo podría mejorar adicionalmente la estabilidad de color del reactivo con el tiempo. Sorprendentemente, se demostró que la adición de glutationa reducida, un componente no encontrado comúnmente en las pruebas cromogénicas, previno exitosamente el revelado del color en reactivo de cromóforo con el tiempo, probablemente debido en parte a la prevención de la auto-oxidación de xilenoi, por lo que se mejora la estabilidad del reactivo. La glutationa también funciona como un secuestrante y, de esta manera, puede remover los radicales en el reactivo que interfiere potencialmente en la reacción de acoplamiento oxidativa.

Los estudios se llevaron a cabo usando hidroxilamina, ácido 3,3'- tiodipropiónico, tioureas o glutationa reducida. Los reactivos se monitorearon cualitativa y cuantitativamente para el cambio de color con el tiempo. La adición de glutationa reducida al reactivo fue la más efectiva en la prevención del revelado de color con el tiempo.

De esta manera, R2 puede contener opcionalmente un antioxidante. Puede usarse cualquier antioxidante apropiado de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, R2 comprende un antioxidante en una concentración de aproximadamente 0.005 g/L a aproximadamente 5.00 g/L o aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 5 g/L o aproximadamente 0.1 g/L a aproximadamente 1 g/L. En una modalidad, el antioxidante es glutationa. La glutationa reducida se prefiere particularmente. En una modalidad, R2 comprende glutationa reducida en una concentración de aproximadamente 0.5 g/L.

R2 puede contener opcionalmente uno o más de un amortiguador o un agente tensoactivo o una combinación de los mismos. Puede usarse cualquier amortiguador o agente tensoactivo apropiado de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, los mencionados anteriormente con respecto a la solución de hidrólisis. La presencia de un agente tensoactivo en el reactivo puede inhibir la interferencia lipémica en la prueba, particularmente a niveles bajos de acetaminofeno (es decir, <200 pmol/L).

En una modalidad, R2 comprende TRIS en una concentración de aproximadamente 10 a 50 g/L o aproximadamente 15 a 30 g/L o aproximadamente 20 a 30 g/L. En una modalidad, R2 comprende aproximadamente 24.2 g/L de TRIS. En una modalidad, R2 comprende carbonato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 a 20 g/L o aproximadamente 10 a 15 g/L. En una modalidad, R2 comprende aproximadamente 10.6 g/L de carbonato de sodio. En una modalidad, R2 comprende aproximadamente 24.2 g/L de TRIS y aproximadamente 10.6 g/L de carbonato de sodio.

En algunas modalidades, la reacción de acoplamiento se lleva a cabo a aproximadamente 37°C con un pH básico entre aproximadamente 9 y 12 o entre aproximadamente 9.5 y 1 1.5 o de preferencia entre aproximadamente 10 y 11. En una modalidad, el pH es mayor de aproximadamente 10. En una modalidad, el pH es de aproximadamente 10.8.

El pH del reactivo puede ajustarse por cualquier medio apropiado conocido en la técnica. En una modalidad, se adicionan gránulos de NaOH a R2 en una concentración de aproximadamente 1 g/L a aproximadamente 4 g/L o aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 3 g/L. En una modalidad, R2 comprende aproximadamente 2.5 g/L de gránulos de NaOH.

Una formulación ejemplar de R2 se muestra en la siguiente Cuadro 2. En la preparación de R2 de acuerdo con esta modalidad ejemplar, se recomienda que la glutationa y 2,5-dimetilfenol se adicionen al final y en tal orden.

El pH del reactivo de prueba puede verificarse después de la preparación y puede ajustarse adicionalmente si es necesario.

La reacción de acoplamiento oxidativa se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 10°C a aproximadamente 60°C o aproximadamente 30°C a aproximadamente 50°C o aproximadamente 35°C a aproximadamente 40°C. En una modalidad preferida, la reacción de acoplamiento oxidativa se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 37°C.

La reacción de acoplamiento oxidativa se deja proceder durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir el acoplamiento del cromóforo de xilenol con sustancialmente todo el p-aminofenol presente en la mezcla de reacción, típicamente entre aproximadamente 2 a 20 minutos o entre aproximadamente 3 a 10 minutos. En una modalidad, la reacción de acoplamiento oxidativa se continúa durante aproximadamente 5 minutos. La duración de la reacción puede optimizarse para la temperatura seleccionada dado que, en general, se necesitan tiempos de reacción mayores para menores temperaturas.

El acoplamiento oxidativo del cromóforo de xilenol con p-aminofenol resulta en la formación de un producto azul (es decir, un colorante) que puede detectarse midiendo el cambio en la absorbancia de la mezcla de prueba a una longitud de onda apropiada. La absorbancia al final de la reacción de hidrólisis se sustrae de la absorbancia al final de la reacción de acoplamiento oxidativa. La cantidad estequiométrica del acetaminofeno presente en la muestra original es sustancialmente equivalente a la cantidad estequiométrica del colorante formado.

La absorbancia del colorante resultante puede medirse sobre una gama de longitudes de onda. La absorbancia máxima del colorante se presenta a aproximadamente 610-615 nm. Típicamente, la longitud de onda seleccionada para la medición en una prueba colorimétrica es la longitud de onda a la que se presenta la absorbancia pico. Si se usa un analizador bicromático, se toma una medición en blanco bicromática a una longitud de onda alternada, tal como aproximadamente 700 nm a aproximadamente 850 nm, que se sustrae de la medición primaria para minimizar el ruido de fondo en la prueba. También pueden usarse otros métodos conocidos para minimizar el ruido de fondo en una prueba.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la medición de la absorbancia a una longitud de onda fuera de pico (es decir, en el hombro de la curva de absorbancia en lugar del pico) disminuyó significativamente la interferencia con las moléculas biológicas de bilirrubina y hemoglobina en la prueba. Se encontró que la medición de la absorbancia a una longitud de onda de aproximadamente 640 nm a aproximadamente 680 nm o aproximadamente 650 nm a 670 nm, de preferencia de aproximadamente 660 nm, mejoró significativamente la exactitud de la medición de acetaminofeno en presencia de bilirrubina o hemoglobina. La interferencia de bilirrubina y hemoglobina son desventajas comunes asociadas con las pruebas de acetaminofeno conocidas. De esta manera, para minimizar la interferencia con la prueba, la absorbancia puede medirse a aproximadamente 660 nm.

En una modalidad, la absorbancia se mide entre aproximadamente 610 nm y 665 nm.

Una persona experta en la técnica apreciará que mientras que los componentes y sus proporciones relativas en las soluciones de reactivos pueden variarse sin apartarse de la presente invención, se evitará la presencia de turbidez, precipitados y otros factores contaminantes, en las soluciones individuales y combinadas. Cuando la prueba es una prueba estable a líquidos, deberían verificarse cuidadosamente cualesquiera alteraciones que podrían impactar negativamente la estabilidad de los reactivos o los componentes de los mismos, tales como estabilidad de la enzima o cromóforo.

En una modalidad ejemplar, se lleva a cabo una prueba de acetaminofeno de dos partes de acuerdo con la presente invención como se resume brevemente a continuación.

La primera parte consiste de la adición de un reactivo de enzima (R1) a una muestra de suero o plasma del paciente a una cierta relación de muestra a reactivo en una cubeta. En el Hitachi 717, por ejemplo, el volumen de la muestra es de 10 pL y el volumen de R1 es de 100 pL con una dilución ajusta de 100 pL de R1 con agua desionizada para formar una solución de hidrólisis. La solución se deja incubar a 37°C durante la duración del tiempo establecido, tal como 5 minutos, en el analizador automatizado. Durante este tiempo, la enzima de aril acilamidasa presente en el reactivo corta el enlace de amida de la molécula de acetaminofeno en la muestra dejando el p- aminofenol y acetato. Las lecturas de la absorbancia se monitorean a una longitud de onda establecida y a ciertos intervalos de tiempo antes de la introducción de un reactivo de cromóforo.

En la segunda parte, el reactivo de cromóforo (R2) se introduce a un intervalo de tiempo establecido y un cierto volumen para la solución de hidrólisis (muestra + R1 , diluida). En el Hitachi 717, por ejemplo, 200 µ? de R2 se introduce y la reacción se monitorea a intervalos de tiempo establecidos hasta completar el tiempo de duración de la prueba. El cromóforo de xilenol en R2, de preferencia 2,5-dimetilfenol, se acopla oxidativamente a un pH alcalino, en presencia de un catalizador, con el p-aminofenol producido en la primera parte. En una modalidad, la etapa de acoplamiento oxidativa se lleva a cabo en presencia de cationes de manganeso. La reacción produce un complejo coloreado que tiene un pico de absorción máxima a aproximadamente 610 nm.

El analizador toma la diferencia entre la absorbancia antes de la adición de R2 y la absorbancia al final de la reacción, correlacionada con el ruido de fondo. La diferencia en la densidad óptica es la cantidad de absorbancia producida de tal muestra. El cambio en la absorbancia puede compararse contra una curva estándar para calcular la concentración de acetaminofeno en la muestra original.

En una modalidad preferida, la absorbancia se mide a 660 nm para minimizar la interferencia con algunas moléculas biológicas en la prueba.

Aunque no se desea relacionarse con ninguna teoría particular, se cree que la concentración de acetaminofeno es directamente proporcional a la intensidad de la absorbancia de acuerdo con el principio conocido como Ley de Beer-Lambert, A = zc\, en donde: A = absorbancia (a una longitud de onda dada); e = coeficiente de extinción molar (una constante para cada químico); I = longitud de la ruta de luz (es decir, 1 cm); y c = concentración del soluto.

Por lo tanto, la concentración del soluto (en este caso acetaminofeno) es directamente proporcional a la absorbancia dado que el coeficiente de extinción molar y la longitud de la ruta son constantes.

En una modalidad, las concentraciones en la mezcla de reacción final son: 1 ) 227.5 U/L de aril acilamidasa 2) 0.0128 g/L de MnCI2 3) 3.66 g/L de 2,5-dimetilfenol 4) 0.244 g/L de glutationa.

La prueba de la presente invención puede producirse y venderse como un kit de partes. Los reactivos en el kit pueden ser reactivos pulverizados o liofilizados que requieren métodos de reconstitución para elaborar tales reactivos pulverizados o liofilizados que son conocidos en la técnica. De preferencia, los reactivos son reactivos estables a líquidos. Los reactivos estables a líquidos son convenientes para usarse y son menos propensos a errores que pueden introducirse durante la reconstitución.

En una modalidad, el kit comprende: un recipiente que comprende un reactivo de enzima (R1); un recipiente que comprende un reactivo de cromóforo (R2) y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo la prueba. El kit puede comprender además un estándar de acetaminofeno e instrucciones para preparar un grupo lineal de estándares.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Ejemplos de reactivos de enzimas y cromóforos CUADRO 1 Ejemplo de una composición de reactivo de enzima (R1) con agua desionizada como diluyente CUADRO 2 Ejemplo de una composición de reactivo de cromoforo (R2) con agua desionizada como diluyente Los reactivos pueden prepararse en un diluyente apropiado, tal como agua desionizada.

EJEMPLO 2 Desempeño de la prueba en ausencia y presencia de NAC Se preparó un grupo de estándares que tiene una concentración conocida de acetaminofeno en agua desionizada (es decir, 250 pmol/L, 500 pmol/L, 1000 pmol/L, 1500 pmol/L, 2000 pmol/L y 2500 pmol/L). Se adicionó una alícuota de 10 pL de cada estándar a 100 pL de R1 en una cubeta en un Analizador Hitachi 717® (Roche Diagnostics) seguido de una dilución ajustada con 100 pl de agua desionizada. Cada mezcla se dejó incubar a 37°C durante 5 minutos. Se obtuvo un valor de absorbancia inicial para cada una. Se adicionó una alícuota de 200 pL de R2 a cada cubeta. La reacción de acoplamiento oxidativo se dejó proceder durante 5 minutos. Se obtuvo un valor de absorbancia final. La concentración de acetaminofeno se calculó con base en la diferencia en la absorbancia a 660 nm entre la absorbancia final e inicial, correlacionado con el ruido de fondo sustrayendo la absorbancia a 800 nm. Los resultados de las diferentes concentraciones conocidas se muestran en el siguiente Cuadro 3.

CUADRO 3 Concentración de acetaminofeno medida en ausencia de NAC usando p xilenol como cromóforo La prueba demostró una medición precisa de la concentración de acetaminofeno a través de un amplio intervalo de concentraciones de acetaminofeno.

Para valorar el desempeño en presencia de NAC, se realizó una solución patrón disolviendo 75 mg de NAC en 1000 pL de agua desionizada. Esto produjo 75 g/L o 75000 mg/L de solución patrón concentrada de NAC.

Una alícuota de 2.5 mL de una concentración conocida de acetaminofeno en agua se adicionó a un tubo de prueba y éste se fijó con 50 pL de la solución patrón de NAC para preparar un grupo de estándares fijados que tienen una concentración conocida de acetaminofeno (es decir, 245 pgmol/L, 490 pgmol/L, 980 pgmol/L, 1470 Mgmol/L, 1960 pgmol/L y 2450 pgmol/L). Cada estándar de acetaminofeno fijado tuvo una concentración de NAC de 1471 mg/L, que es el valor que podría encontrarse en el suero de pacientes durante el tratamiento de NAC. Las muestras se analizaron dentro de una hora de fijación dado que NAC se degrada con el tiempo.

La prueba se llevó a cabo como se describió anteriormente. Una alícuota de 10 pL de estándar fijado se adicionó a 100 µ?_ de R1 en una cubeta en un Hitachi 717® seguido de una dilución ajustada. Cada mezcla se dejó incubar a 37°C durante 5 minutos. Se obtuvo un valor de la absorbancia inicial. Se adicionó una alícuota de 200 µ?_ de R2 a las cubetas respectivas. La reacción de acoplamiento oxidativo se dejó proceder durante 5 minutos. Con base en la diferencia en la absorbancia a 660 nm, corregida para el fondo, se calcularon las concentraciones de acetaminofeno. La comparación del método se realizó en Advia® 1650 d Siemens para comparar una prueba conocida usando un derivado de 8-HQ como el cromóforo. Los resultados para las diferentes concentraciones conocidas del acetaminofeno se muestran en el siguiente Cuadro 4.

CUADRO 4 Concentración de acetaminofeno medida en presencia de NAC usando 8 HQ5SA o p-xilenol como cromóforo La prueba con p-xilenol como el cromóforo fue resistente a la interferencia en presencia de NAC comparado con una prueba usando un derivado de 8-HQ como el cromóforo. El corte para la interferencia en una prueba clínica en general es una diferencia de 10%, de preferencia menor de 5%.

EJEMPLO 3 Comparación de los cromóforos de xilenol La comparación de los cromóforos de xilenol se llevó a cabo sustituyendo el cromóforo en la formulación de R2. Todos los otros parámetros fueron los mismos. Se elaboró una solución patrón del amortiguador R2 y glutationa y después se dividió en seis lotes. 7.5 g/L de cada isómero respectivo se disolvieron en cada lote respectivo, por lo que se crean seis "diferentes" reactivos de cromóforo con un isómero diferente en cada una. R1 se mantuvo constante, por lo tanto, la única variable en el análisis fue el cromóforo en R2. El reactivo enzimático (R1) tuvo un pH de 8.6 @ 25°C, mientras que los seis reactivos de xilenol isoméricos tuvieron cada uno un pH de 1 1.5 @ 25°C. Los resultados de los diferentes isómeros conocidos se muestran en el siguiente Cuadro 5.

Los resultados demuestran que 2,5-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol y 2,3-dimetilfenol produjeron resultados de linealidad aceptable en presencia de NAC. El mejor desempeño se observó con 2,5-dimetilfenol y 2,6-dimetilfenol.

CUADRO 5 Concentración de acetaminofeno medida usando diferentes cromoforos de xilenol en presencia y ausencia de NAC EJEMPLO 4 Evaluación de 2,5-dimetilfenol en presencia de Intralipid® Una evaluación de 2,5-dimetilfenol se llevó a cabo usando suero fijado de Intralipid® que contiene una concentración conocida de acetaminofeno. Se mostró que, a un nivel terapéutico de acetaminofeno (<200 pmol/L), el cromóforo de 2,5-dimetilfenol se recuperó dentro del límite aceptable de ±10% a 200 mg/dL de Intralipid®. La prueba se llevó a cabo en Advia® 1650 de Siemens.

Primero, 10 mL de suero se reunieron en un tubo de prueba grande y se mezclaron. El suero después se fijó con 2.1 mg de acetaminofeno grado reactivo y se mezcló hasta disolverse. Del fondo fijado, se tomó con la pipeta una alícuota de 4.75 ml_ y se colocaron en un tubo de prueba grande marcado como el fondo de control. Se tomó con la pipeta una segunda alícuota de 4.75 ml_ y se colocó en un segundo tubo grande marcado con el fondo de prueba. En el fondo de control, 250 µ?_ de solución salina se adicionaron al fondo y se mezclaron completamente. En el fondo de prueba, se adicionaron 250 µ?_ de solución de Intralipid® al 20% y se mezclaron completamente. Un grupo de interferencia se realizó mezclando los fondos de control y prueba a diferentes niveles, por lo que se crean diferentes concentraciones de Intralipid®, pero manteniendo la concentración de acetaminofeno. El 2,5-dimetilfenol demostró resultados aceptables a por lo menos 200 mg/dL de Intralipid®.

EJEMPLO 5 Desempeño de los diferentes cromóforos en presencia de NAC Las pruebas de acetaminofeno conocidas usando 8-hidroxiquinolina o un derivado de la misma como un cromóforo se sometieron a interferencia en presencia de niveles terapéuticos de NAC (es decir, >800 mg/L). Los presentes inventores realizaron dos pruebas de acetaminofeno comercialmente disponibles (Genzyme Diagnostics P.E.I. Inc., PEI, Canadá) conteniendo ya sea el ácido 8-hidroxiquinolin-5-sulfónico (8-HQ5SA) o hemisulfato de 8-hidroxiquinolina (8-HQHS) como el cromóforo. Mientras que todas las mediciones de acetaminofeno exactas proporcionadas en ausencia de NAC, todas mostraron una disminución significativa (es decir, >10%) en la recuperación de acetaminofeno en presencia de niveles terapéuticos de NAC. Se descubrió que la presencia de NAC afectó la reacción de acoplamiento oxidativa en la prueba en lugar de la conversión enzimática de acetaminofeno a p-aminofenol. Hubo una diferencia considerable en la recuperación entre la prueba de 8-HQ5SA y la prueba de 8-HQHS, siendo la prueba de 8-HQ5SA más susceptible a la interferencia de NAC, lo que sugiere que incluso una diferencia ligera en la estructura química del cromóforo puede ser crucial para la reacción de acoplamiento cuando está presente NAC.

Se llevó a cabo una comparación de p-xilenol y ácido 8-hidroxiquinolin-5-sulfónico (8HQ5SA) reemplazando el 8HQ5SA en un kit comercial (Genzyme Diagnostics P.E.I. Inc., PEI, Canadá) con p-xilenol. Todos los otros parámetros de los reactivos y pruebas fueron los mismos. Se llevó a cabo una prueba manual usando un estándar de acetaminofeno de 1000 umol/L. El control se fijó con agua y la muestra de prueba se fijó con 1000 mg/L de NAC. La absorbancia se midió a través de un espectro de longitudes de onda.

La Figura 1 muestra los resultados para la prueba llevada a cabo con 8HQ5SA como el cromóforo y la Figura 2 muestra los resultados para el p-xilenol. Los resultados indican que la prueba de p-xilenol no fue afectada relativamente por la presencia de NAC, lo que demuestra una prueba fuerte, mientras que la prueba con 8HQ5SA se afectó significativamente por la presencia de NAC.

EJEMPLO 6 Las modificaciones del parámetro reducen la interferencia de hemoglobina y bilirrubina La interferencia de hemoglobina es una desventaja de las pruebas de acetaminofeno conocidas. Se llevó a cabo una exploración Ultrospec™ 3300 de una muestra de acetaminofeno de 100 pmol/L fijada con 1000 mg/dL de hemoglobina se llevó a cabo y produjo una observación interesante. El cambio OD entre una muestra de acetaminofeno de 100 pmol/L y la muestra de hemoglobina 100 pmol/L + 1000 mg/dL fue mucho mayor a 600 nm que a 660 nm, que estuvo en el hombro del pico de absorbancia, aún proporcionó un buen cambio OD entre las longitudes de onda primaria y secundaria. Por lo tanto, la prueba adicional se llevó a cabo usando 660 nm como la longitud de onda primaria y manteniendo 800 nm como la longitud de onda secundaria.

Los resultados demostraron que el cambio en la longitud de onda de 600 nm a 660 nm redujo significativamente la interferencia en presencia de hemoglobina y bilirrubina en la prueba. El análisis se llevó a cabo en Hitachi 717 y Advia® 1650 de Siemens. El suero se fijó con acetaminofeno a una concentración establecida y luego con el material de interferencia a concentraciones variadas. La prueba modificada mostró niveles aceptables de interferencia (es decir <10%) en presencia de NAC, bilirrubina y hemoglobina.

EJEMPLO 7 Efecto del cromóforo en la interferencia de bilirrubina Se llevó a cabo un estudio de interferencia de bilirrubina en el que todos los reactivos usados en la prueba de acetaminofeno fueron idénticos, con la excepción del cromóforo. Las muestras probadas contuvieron aproximadamente 100 pmol/L ó 330 prnol/L de acetaminofeno. Los cromóforos analizados fueron 8-HQ5SA y p-xilenol. Las reacciones se analizaron en un Advia® 1650 de Siemens.

CUADRO 6 Interferencia de bilirrubina a aproximadamente 100 umol/L de acetaminofeno.

Derivado de 8-HQ p-xilenol Conc. de Conc. de Conc. de Diferencia de bilirrubina (mg/dL) acetaminofeno Diferencia de valor acetaminofeno valor de control medida (pmol/L) de control (µ????/L) medida (pmol/L) (pmol/L) 0 102 (control) (grupo) 105 (control) (grupo) 4 117 15 97 -8 8 131 29 98 -7 16 158 56 102 -3 24 186 84 103 -2 32 212 110 104 -1 40 237 135 104 -1 CUADRO 7 Interferencia de bilirrubina a aproximadamente 330 umol/L de acetaminofeno Los resultados demuestran que la elección del cromóforo puede impactar significativamente la interferencia de bilirrubina en la prueba. La prueba usando p-xilenol fue significativamente más resistente a la interferencia de bilirrubina.

Las modalidades descritas anteriormente de la invención se pretende que sólo sean ejemplos. Las alteraciones, modificaciones y variaciones pueden efectuarse para las modalidades particulares por aquellos expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones anexas.

Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan como referencia en su totalidad.

Referencias: Afshari, J.T. y Liu, T-Z. Rapid spectrophotometric method for the quantitation of acetaminophen in serum. Analítica Chimica Acta 2001 ; 443: 165-169.

Bertholf, R.L; Johannsen, L.M.; Bazooband, A y Mansouri, V.

False-positive acetaminophen results in a hyperbilirubinemic patient. Clinical Chemistry 2003; 49(4): 695-698.

Chen, C-F; Tseng, Y-T; Tseng, H-K y Liu T-Z. Automated spectrophotometric assay for uriñe p-aminophenol by an oxidative coupling reaction. Annals of Clinical and Laborator Science 2004; 324(3): 336-340.

Hammond, P.M.; Scawen, M.D.; Atkinson, T.; Campbell, RS. y Price, CP. Development of an enzyme-based assay for acetaminophen. Analytical Biochemistry 1984; 143: 152-157.

Morris, H.C.; Overton, P.O.; Ramsey, J.R; Campbell, RS.; Hammond, P.M.; Atkinson, T. y Price, CP. Development and validation of an automated enzyme assay for paracetamol (acetaminophen). Clínica Chimica Acta 1990; 187: 95-104.

Weeks, J.L. y Rabini, J. The Pulse Radiolysis of Deaerated Aqueous Carbonate Solutions. I. Transient Optical Spectrum and Mechanism II. pK for OH Radicáis. The Journal of Physical Chemistry 1966; vol. 70(7}: 2100-2106.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Un método para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa, el método comprendiendo las etapas de: hidrolizar el acetaminofeno para formar p-aminofenol; acoplar oxidativamente el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol en la presencia de un catalizador apropiado para formar un producto coloreado; y determinar la cantidad del producto coloreado formado, siendo la cantidad de producto coloreado proporcional a la cantidad de acetaminofeno presente inicialmente en la muestra acuosa, en donde el método es confiable en la presencia o ausencia de niveles terapéuticos de N-acetilcisteína (NAC) en la muestra acuosa.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la etapa de hidrolizar el acetaminofeno a p-aminofenol comprende poner en contacto el acetaminofeno con una aril acilamidasa. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el cromóforo de xilenol se selecciona del grupo que consiste de 2,5-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol y 2,

3-dimetilfenol.

4. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el catalizador es un oxidante débil. 5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el cromóforo de xilenol es 2,

5- dimetilfenol y el catalizador es MnC anhidro o hidratado. 6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la muestra acuosa es suero o plasma. 7.- Una prueba para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa, la prueba comprendiendo las etapas de: poner en contacto la muestra acuosa con un primer reactivo (R1 ) que comprende una enzima de aril acilamidasa y un diluyente apropiado para formar una solución de hidrólisis; opcionalmente, diluir la solución de hidrólisis; incubar la solución de hidrólisis para permitir una reacción de hidrólisis, en donde el acetaminofeno se convierte a p-aminofenol; poner en contacto la solución de hidrólisis con un segundo reactivo (R2) que comprende un cromóforo de xilenol y un diluyente apropiado, para formar una solución de acoplamiento oxidativo; incubar la solución de acoplamiento oxidativo para permitir una reacción de acoplamiento oxidativo, en donde el cromóforo de xilenol se acopla al p-aminofenol en la presencia de un catalizador apropiado para formar un producto coloreado; y determinar la cantidad del producto coloreado formado, siendo la cantidad del producto coloreado proporcional a la cantidad de acetaminofeno presente inicialmente en la muestra acuosa, en donde la prueba es confiable en presencia o ausencia de niveles terapéuticos de N-acetilcisteína (NAC) en la muestra acuosa. 8.- La prueba de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque R1 comprende aril acilamidasa a una concentración de aproximadamente 10 U/L a aproximadamente 5000 U/L. 9.- La prueba de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizada además porque el cromóforo de xilenol se selecciona del grupo que consiste de 2,5-dimetilfenol, 2,

6-dimetilfenol y 2,3-dimetilfenol. 10. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada además porque el catalizador es un catalizador oxidante débil y en donde el catalizador está presente en R1 en una concentración de aproximadamente 0.0005 g/L a aproximadamente 1.000 g/L. 1 1. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada además porque R2 comprende 2,5-dimetilfenol en una concentración de aproximadamente 0.075 g/L a aproximadamente 1 15 g/L y/o en donde el catalizador es MnCI2-4H20 y está presente en R1 en una concentración de aproximadamente 2.5 g/L a aproximadamente 20 g/L. 12. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 1 , caracterizada además porque R2 además comprende glutationa reducida en una concentración de aproximadamente 0.005 g/L a aproximadamente 5.000 g/L. 13. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizada además porque R1 comprende adicionalmente uno o más de un solubilizador proteínico, un estabilizador proteínico, un estabilizador enzimático, un quelante metálico, un amortiguador, un agente tensoactivo, un ajustador de pH, un conservador o un excipiente. 14.- La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizada además porque el estabilizador enzimático se selecciona del grupo que consiste de PVP-40, Fracción V de BSA, trehalosa, p-hidroxibenzoato de sodio, ácido p-hidroxibenzóico y combinaciones de los mismos. 15.- La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, caracterizada además porque R2 comprende además uno o más de un amortiguador, un agente tensoactivo, un ajustador de pH, un conservador, un antioxidante o un excipiente. 16. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, caracterizada además porque el diluyente es agua desionizada y la solución de hidrólisis se diluye aproximadamente 1 :1 con el diluyente antes de la reacción de hidrólisis. 17. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, caracterizada además porque R1 comprende aproximadamente 932.7 U/L de aril acilamidasa y aproximadamente 0.0525 g/L de MnCI2-4H20¡ y en donde R2 comprende aproximadamente 7.5 g/L de 2,5-dimetilfenol y aproximadamente 0.500 g/L de glutationa reducida. 18. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, caracterizada además porque las reacciones de hidrólisis y acoplamiento oxidativo se llevan cada una a una temperatura de aproximadamente 37°C durante aproximadamente 3 a 10 minutos y en donde la reacción de hidrólisis se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 8.6 y la reacción de acoplamiento oxidativo se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 10.8. 19. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18, caracterizada porque la concentración de acetaminofeno se determina obteniendo la diferencia en la absorbancia al final de la reacción de hidrólisis y al final de la reacción de acoplamiento oxidativa; y combinando la diferencia contra un estándar o grupo de estándares, en donde la absorbancia se mide a una longitud de onda entre aproximadamente 610 nm y 665 nm. 20. - La prueba de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la absorbancia se mide a una longitud de onda de aproximadamente 660 nm. 21. - La prueba de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 20, caracterizada además porque la muestra acuosa es suero o plasma. 22.- Un kit para determinar la concentración de acetaminofeno en una muestra acuosa, el kit comprendiendo: un primer recipiente que contiene un primer reactivo (R1) que comprende una aril acilamidasa para hidrolizar acetaminofeno a p-aminofenol; un segundo recipiente que contiene un segundo reactivo (R2) que comprende un cromóforo de xilenol seleccionado del grupo que consiste de 2,5-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol y 2,3-dimetilfenol para el acoplamiento oxidativo a p-aminofenol; opcionalmente, un estándar de acetaminofeno; e instrucciones para llevar a cabo una prueba de determinación de acetaminofeno de conformidad con la reivindicación 7, en donde R1 comprende además un catalizador apropiado para catalizar el acoplamiento oxidativo del cromóforo de xilenol y p-aminofenol. 23. - El kit de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el cromóforo de xilenol es 2,5-dimetilfenol y el catalizador es un oxidante débil, y en donde los reactivos son estables a líquidos. 24. - Un método para determinar la concentración de p-aminofenol en una muestra acuosa, el método comprendiendo las etapas de: acoplar oxidativamente el p-aminofenol a un cromóforo de xilenol seleccionado del grupo que consiste de 2,5-dimetilfenol, 2,6-dimetilfenol y 2,3-dimetilfenol, en la presencia de un catalizador para formar un producto coloreado, siendo el catalizador un oxidante débil; y determinar la cantidad del producto coloreado formado, siendo la cantidad del producto coloreado formado proporcional a la cantidad de p-aminofenol presente inicialmente en la muestra acuosa. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el catalizador es MnC hidratado y el cromóforo de xilenol es 2,5-dimetilfenol.