CN102016569B

CN102016569B - 乙酰氨基酚的检测

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Publication number: CN102016569B
Application number: CN200980115106.3A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·巴尔杰; 简·霍林斯基
Original assignee: Sekisui Diagnostics LLC
Current assignee: Sekisui Diagnostics LLC
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: CN102016569A; US8236519B2; EP2283352A1; EP2283352A4; WO2009132423A1; US8715952B2; BRPI0911578A2; EP2283352B1; CA2722444A1; BRPI0911578B8; ES2530432T3; MX2010011763A; US20090269792A1; JP2011521622A; BRPI0911578B1; CA2722444C; US20120301969A1; JP5726725B2

Abstract

本发明总体上提供了一种对水性样品中的对氨基苯酚进行定量测定的可靠的检测方法。更具体地说，本发明提供了一种对样品中的乙酰氨基酚进行定量测定的快速的基于酶的检测方法。该检测方法采用了二甲苯酚生色团和催化剂，所述催化剂优选是弱氧化剂。无论是否存在N-乙酰半胱氨酸(NAC)，该检测方法均提供可靠的结果，因此可以被用来监测在NAC治疗过程中的对乙酰氨基酚的水平。本发明还提供了用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的方法和试剂盒。

Description

乙酰氨基酚的检测

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年4月28日提交的美国临时申请No.61/048,406的优先权，其内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及一种对样品中存在的对氨基苯酚的浓度进行测定的检测方法。更具体地说，本发明涉及一种对样品中的乙酰氨基酚的浓度进行测定的基于酶的检测方法。

背景技术

药物毒性是导致急性肝功能衰竭的主要原因。在肝衰竭的评价中，临床实验室在诊断中起着至关重要的作用，使得能够及时启动合适的治疗。

乙酰氨基酚(N-乙酰基-对氨基苯酚)一直在处方上作为解热镇痛药。即使没有处方，它也是广泛可得的，并且在许多常见的治疗制剂(如，感冒和流感的治疗药物)中，它是一种活性成分。这种药物的广泛应用使得它在患有肝脏功能障碍的患者中成为受到关注的可疑的肝毒性药物。

虽然以治疗剂量服用乙酰氨基酚很少引起副作用，但有报道这样的病例：慢性、过度地使用乙酰氨基酚导致了肝毒性和肾毒性。急性过量地摄取大量乙酰氨基酚引起了谷胱甘肽储备的耗竭和毒性代谢产物在肝脏中的积累，这可导致严重甚至致命的肝衰竭。

当过量使用乙酰氨基酚时，高活性中间体N-乙酰基对苯并醌亚胺会在肝脏中积累。该中间体与肝脏中的硫醇(尤其是，谷胱甘肽)发生反应。谷胱甘肽被氧化为谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。肝脏中过量的GSSG水平会导致细胞坏死。通常报道的乙酰氨基酚中毒是在血清浓度超过约20mg/dL(1324μmol/L)。

往往谷胱甘肽前体N-乙酰基半胱氨酸(NAC)是作为治疗乙酰氨基酚过量的解毒剂而给药的。给药的大约70％的NAC是在肝脏中代谢。据信，至少由于以下原因，NAC作为解毒剂：它是谷胱甘肽前体，它是强效的抗氧化剂，并且它提高了肝脏中GSSG还原酶的效率。据信，通过补充谷胱甘肽储备并防止GSSG在肝脏中积累，NAC的给药(至少部分上)将由过量使用乙酰氨基酚造成的损害最小化、或避免由过量使用乙酰氨基酚造成的损害。

往往高浓度的NAC是这样给药的：开始以初始负荷剂量的给药水平，随后在整个疗程中维持NAC的水平。该负荷剂量可导致NAC的血清水平在2000mg/L或更高，并且维持水平通常为约800mg/L至1000mg/L。理想的是，在整个NAC疗程中对乙酰氨基酚水平进行监测以保证维持合适的治疗水平保持而避免不必要地或者过度地暴露于NAC。

偶然以及故意的过量使用乙酰氨基酚的发生率明显增加。对于过量使用乙酰氨基酚的诊断和治疗要求体内药物的早期检测和准确测量。必须迅速、准确地测定原位(on board)的乙酰氨基酚的量，以便临床医师能迅速将合适治疗剂量的NAC给药于患者。非常需要快速、可靠而稳定的测定生物样品中的乙酰氨基酚浓度的临床检测方法。

已知的测定生物样品中的乙酰氨基酚浓度的方法包括(例如)各种色谱技术和分光光度法技术。

气相色谱法和高效液相色谱法已被证明是可靠和准确地测定生物样品中的乙酰氨基酚水平的方法，不过两者均为需要昂贵的仪器和高水平的技术人员来操作的冗长方法。这类方法并不特别适合于需要快速结果的Stat实验室。

差式分光光度法已经被广泛的应用，但这个方法需要耗时的溶剂提取，这在临床检测中是不需要的。更快速的分光光度法通常不能提供所需的特异性。

比色技术包括单纯比色法和基于酶的比色检测法。多种基于免疫的检测法也是可适用的，但是它们往往明显更贵，因此是不需要的，在临床环境中尤其是如此。

虽然与基于免疫的检测方法相比，基于酶的检测方法方便和经济，但是基于酶的检测方法通常是更不可靠的，因为它们容易受到经常出现在患者样品中的生物分子(如，胆红素和血红蛋白)的干扰。患者样品中的这种分子水平提高可引起假阳性结果(参见例如Bertholf等，2003)，这可能潜在导致误诊以及治疗的不合适的选择和剂量。

在治疗水平的NAC存在下，已知的酶检测法也受到干扰。因此，在NAC治疗过程中，由于测量的乙酰氨基酚水平不准确，酶检测法通常不能用于监测乙酰氨基酚水平。这是已知的酶促乙酰氨基酚检测法的显著缺点。

已知的酶检测法利用三个主要成分：芳基酰基酰胺酶、显色(或成色剂)化合物和氧化剂，该氧化剂具有足够的氧化潜力以催化偶合反应。

芳基酰基酰胺酶断开乙酰氨基酚的酰胺键以得到对氨基苯酚和醋酸盐。然后，使对氨基苯酚在氧化催化剂存在下在氧化偶合反应中与显色化合物反应以形成有色的产物。典型的催化剂包括具有反应性氧或官能团的种类的金属盐或金属配合物，如高锰酸盐、高碘酸盐、过硫酸盐、硫酸盐、或者醋酸盐。然后，利用吸光度的变化来测定样品的乙酰氨基酚浓度，所述吸光度通常是在该有色的产物达到最大吸光度的波长处测量的。这可以通过和针对具有已知的乙酰氨基酚浓度并通过同样的方法检测的标准或一组标准而获得的吸光度数值比较来确定。形成的有色的产物的摩尔数通常与样品中最初存在的乙酰氨基酚的摩尔数成正比。

最早的基于酶的乙酰氨基酚检测方法需要很长的温育时间，对于水解和氧化偶合反应中的每种而言往往大于1小时，因此使其不适用于紧急临床环境。

Hammond等(1984)开发了一种用于测定血清中的乙酰氨基酚浓度的快速的基于酶的检测方法，该方法使用芳基酰基酰胺酶来使乙酰氨基酚水解成对氨基苯酚。随后，使对氨基苯酚在由硫酸铜催化的氧化偶合反应中与邻甲酚反应，以形成靛酚染料。然后，使用在染料的峰波长(615nm)处的吸光度的变化来测定乙酰氨基酚的水平。虽然这种方法提供了对于乙酰氨基酚的快速检测，但在治疗水平的NAC存在下，这种方法会受到严重干扰，因此在NAC治疗中不能可靠地使用。类似的方法(在氧化催化剂存在下利用邻甲酚)容易受到胆红素干扰(Bertholf等，2003年)，从而导致在高胆红素血症患者中得到假阳性结果。

Morris等(1990)披露了测量样品中的乙酰氨基酚的自动的基于酶的检测方法。自动的检测方法通常为临床实验室所优选。该方法使用芳基酰基酰胺酶来将乙酰氨基酚水解成对氨基苯酚，随后，在锰离子存在下与8-羟基喹啉氧化偶合而形成蓝色产物。为保持贮存稳定性，试剂被冻干，并且必须在使用前复原。与液体稳定的检测方法相比，涉及复原步骤的检测方法更不期望且更易出错。

在治疗水平的NAC(即，＞800mg/L)存在下，已知的使用8-羟基喹啉或其衍生物作为发色团的乙酰氨基酚检测方法受到干扰。本发明人测试了两种市售乙酰氨基酚检测方法(Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)，其中包含8-羟基喹啉-5-磺酸(8-HQ5SA)或8-羟基喹啉半硫酸盐(8-HQHS)作为发色团。尽管观察到在NAC不存在下准确的乙酰氨基酚测量，但在治疗水平的NAC存在下，乙酰氨基酚的回收率显著(即，＞大约10％)下降。发现NAC的存在影响检测中的氧化偶合反应，而不是影响乙酰氨基酚到对氨基苯酚的酶转化。在8-HQ5SA检测和8-HQHS检测之间的回收率有相当大的差异，8-HQ5SA检测方法明显更容易受到NAC干扰，这表明当NAC存在时，即使发色团的化学结构有轻微不同，这可能对于偶合反应都是很关键的的。

Chen等(2004)描述了一种检测方法，该检测方法用于对尿液中的对氨基苯酚进行量化以评价工作场所中暴露于苯胺的情况。尿液对氨基苯酚水平作为苯胺毒性的生物指标，因为约15％至60％的吸收的苯胺在体内被氧化成对氨基苯酚。尿液必须经酸化和预处理，以从排泄在尿液中的共轭形式中释放游离的对氨基苯酚。该检测方法包括使用2，5-二甲苯酚(对二甲苯酚)作为发色团以形成有色的产物的氧化偶合反应。该偶合反应由高碘酸钠(强氧化剂)催化以形成有色的产物。据推测，对尿液中的对氨基苯酚水平进行量化可用于评价乙酰氨基酚的过量，尽管这即没有经考察，也未被证明。

Afshari和Lui(2001)描述了一种用于对血清中的对氨基苯酚进行量化的非酶法。首先通过提取步骤将游离的非共轭的乙酰氨基酚从内生干扰物中分离，随后利用热(即，煮沸10分钟)和酸使对氨基苯酚水解。与酶促反应相比，这是非选择性水解反应。水解反应之后使对氨基苯酚与2，5-二甲苯酚(对二甲苯酚)在高碘酸钠(强氧化剂)存在下氧化偶合，以形成有色的产物。由于需要从样品中提取乙酰氨基酚并将样品沸腾，因此这使得该方法不适用于紧急临床环境，也不适用于自动化。

与基于免疫的检测方法相比，虽然酶促乙酰氨基酚检测方法方便和更容易负担得起，但是许多临床实验室喜欢适用基于免疫的检测方法，因为该方法不受样品中NAC存在的影响。需要在NAC的治疗过程中可靠地测量酰氨基酚的水平。基于免疫的检测方法也不容易受到经常存在在患者样品中的生物分子(如，胆红素和血红蛋白)存在的干扰。由于胆红素和血红蛋白的血清水平对于不同患者是不可预测的，因此容易受到这些分子干扰的检测方法不会提供对于所有的患者均可靠的稳定的临床测试。

因此需要提供一种快速的乙酰氨基酚检测方法，无论是否存在NAC，该检测方法均是准确和可靠的，并且与常规的基于免疫的检测方法相比，该检测方法费用较低。还需要提供这样一种检测方法，与已知的检测方法相比，该检测方法也更不容易受到患者样品中存在的生物分子的干扰。

附图简述

现在将仅通过例子、并参照附图来描述本发明的实施方案，其中：

图1示出在存在或不存在治疗水平的NAC的情况下进行现有技术的乙酰氨基酚检测的结果，其中8-羟基喹啉-5-磺酸(8-HQ5SA)作为发色团，其中结果证明在治疗水平的NAC存在下，8-HQ5SA示出显著的干扰；

图2示出如以上图1进行的乙酰氨基酚检测的结果，不同之处仅在于，使用对二甲苯酚代替8-HQ5SA作为发色团，其中结果证明对二甲苯酚相对不易受到治疗水平的NAC的存在的影响。

发明内容

本发明总体上涉及用于对样品中的对氨基苯酚的进行定量测定的可靠的检测方法。更具体地说，本发明涉及对样品中的乙酰氨基酚进行定量测定的基于酶的检测方法。相对于现有技术，该检测方法的优点在于，无论是否存在NAC，该检测方法均提供准确和可靠的结果，因此，可用于在NAC治疗中测量乙酰氨基酚的水平。与已知的检测方法相比，在某些实施方案中，该检测方法具有提高性能和减少生物分子的干扰的附加优点。

令人惊讶地发现，在NAC存在下，与其他已知的发色团相比，选择二甲苯酚化合物作为与对氨基苯酚的氧化偶合反应的发色团导致准确性提高和干扰降低。

在一个方面，本发明提供了一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的方法。该方法包括以下步骤：使乙酰氨基酚水解为对氨基苯酚；在合适的催化剂存在下，使对氨基苯酚与二甲苯酚发色团氧化偶合，以形成有色的产物；以及测定形成的有色的产物的量。形成的有色的产物的量与水性样品中最初存在的乙酰氨基酚的量成正比。该方法对于水性样品中存在或不存在治疗水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情况均适用。

在另一方面，本发明提供了一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的检测方法，该检测方法包括以下步骤：使该水性样品与第一试剂(R1)接触以形成水解溶液，所述第一试剂包含芳基酰基酰胺酶和合适的稀释剂，并可任选地稀释该水解溶液；温育该水解溶液以允许发生水解反应，其中乙酰氨基酚被转化为对氨基苯酚；使该水解溶液与第二试剂(R2)接触以形成氧化偶合溶液，所述第二试剂包含二甲苯酚发色团和合适的稀释剂；温育该氧化偶合溶液以允许发生氧化偶合反应，其中在合适的催化剂存在下，二甲苯酚发色团与对氨基苯酚偶合，以形成有色的产物；以及测定形成的有色的产物的量，形成的有色的产物的量与水性样品中最初存在的乙酰氨基酚的量成正比，其中该检测方法对于水性样品中存在或不存在治疗水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情况均适用。

在另一方面，本发明提供了一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的方法，该方法包括以下步骤：使该样品与芳基酰基酰胺酶接触，从而使样品中的乙酰氨基酚转化为对氨基苯酚；在催化剂存在下，使对氨基苯酚与二甲苯酚发色团氧化偶合，以形成染料；以及测定该染料的浓度，其中初始样品中乙酰氨基酚的量与形成的染料的量成正比。

在另一方面，本发明提供了一种用于测定血液样品中的乙酰氨基酚浓度的试剂盒，该试剂盒包含芳基酰基酰胺酶、二甲苯酚和催化剂。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒用于在存在或不存在NAC的情况下测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度，该试剂盒包含：含有第一试剂(R1)的第一容器，所述第一试剂包含用于将乙酰氨基酚水解为对氨基苯酚的芳基酰基酰胺酶；和含有第二试剂(R2)的第二容器，所述第二试剂包含用于与对氨基苯酚氧化偶合的二甲苯酚发色团，其中R1或者R2还包含适于对二甲苯酚发色团与对氨基苯酚的偶合进行催化的催化剂。

发明详述

本发明总体上涉及用于对样品中的对氨基苯酚的进行定量测定的可靠的检测方法。更具体地说，本发明涉及对样品中的乙酰氨基酚进行定量测定的基于酶的检测方法。相对于现有技术，该检测方法的优点在于，无论是否存在NAC，该检测方法均提供准确和可靠的结果。与已知的检测方法相比，在一些实施方案中，该检测方法具有提高性能和减少生物分子的干扰的附加优点。

待测试的样品优选为水性样品，这是指它们具有水基成分。可以在该检测方法中进行测试的示例性水性样品包括但不限于水、全血、血浆、血清、淋巴、胆汁、尿液、脊髓液、痰、唾液、汗、大便分泌物等。也可以检测人类或动物组织(如，骨骼肌、心脏、肾脏、肺、脑、骨髓、皮肤等)的流体制剂。示例性流体制剂包括组织匀浆及其上清液。

在一个实施方案中，待测试的水性样品是血浆、血清或尿液。在另一个实施方案，水性样品是血浆或血清。在一个实施方案中，水性样品是血清。

虽然可以理解到，可以不进行最初的水解步骤(即，如果直接测量样品中的对氨基苯酚)来实施本发明的检测方法，但是，最典型的是，使用该检测方法来测量样品中的乙酰氨基酚水平，因而在对氨基苯酚与选定的发色团进行氧化偶合之前，需要将乙酰氨基酚水解为对氨基苯酚。根据本发明，选定的发色团是二甲苯酚发色团。虽然非酶促水解反应是可能的，但优选反应是乙酰氨基酚到对氨基苯酚的酶促转化。

本发明的检测方法通常分两部分实施。第一部分包括乙酰氨基酚到对氨基苯酚的酶促水解。第二部分包括在合适的催化剂存在下，使对氨基苯酚与二甲苯酚发色团氧化偶合，以形成有色的产物。在一些实施方案，优选的催化剂选自弱氧化剂。然后，可以通过(例如)测量给定波长处的吸光度的变化、并将所得到的数值与具有已知的乙酰氨基酚浓度的标准或一组标准相比较，来测量样品中的乙酰氨基酚浓度。

在一个实施方案中，该检测方法是按照如下步骤实施的两部分的检测方法。

在第一部分中，将样品的等分试样与含有酶的第一试剂(R1)接触以形成水解溶液。所述第一试剂可以被称为酶试剂。将含有样品的水解溶液在R1中混合并可任选地稀释。在一个实施方案中，所述可任选的稀释步骤包括使用诸如去离子水之类的合适的稀释剂将R1按1∶1稀释。将溶液混合并在合适的温度下继续水解反应至完成，以使样品中的乙酰氨基酚水解为对氨基苯酚。在特定波长处获得吸光度值。

在第二部分中，水解完成后，将含有二甲苯酚发色团的第二试剂(R2)添加到水解溶液并对得到的混合物进行简单混合。所述第二试剂(R2)可以被称为发色团试剂。二甲苯酚发色团与对氨基苯酚的氧化偶合需要存在合适的催化剂。在一个实施方案中，氧化偶合反应的催化剂是R1的成分，使得直到R1和R2组合时，催化剂和发色团才缔合。或者，催化剂可以是R2的成分，或可以添加到R1和R2的混合物中以驱动氧化偶合步骤。在合适的温度下继续氧化偶合反应至完成。完成后，在给定波长处测量吸光度，并计算第一部分和第二部分之间的吸光度变化。

为测定样品中最初存在的乙酰氨基酚的量，将该吸光度的变化与按照相同方法、使用已知浓度的乙酰氨基酚制备的标准或一组标准相比较。必须考虑稀释因素。对于本领域的技术人员这样的计算都是常规的。

由于不需要提取和分离步骤、并且仅利用两种试剂，因此，这种两部分的检测方法适合于自动化。也可以以自动方式实施原位的稀释和混合步骤。用于实施这样的检测的自动化仪器是本领域熟知的。或者，也可以进行手动操作该检测。

用于该水解反应的优选的酶是芳基酰基酰胺酶。芳基酰基酰胺酶对酰替苯胺到苯胺的水解进行催化，并以IUB(国际生物化学联合会)号E.C.3.5.1.13标识。这类酶的CAS登记号为9025-18-7。通常芳基酰基酰胺酶产生并分离自微生物(如，细菌)。例如Hammond等的美国专利No.4,430,433中对芳基酰基酰胺酶和从微生物制备芳基酰基酰胺酶的方法的非限定性例子进行了描述。

根据本发明可以使用任何合适的芳基酰基酰胺酶，只要它能在合适的反应条件下有效地对乙酰氨基酚到对氨基苯酚的水解进行催化即可。本领域的技术人员可以结合选择的特定的酶在不脱离本发明的基础上对反应条件进行优化。

芳基酰基酰胺酶可以以任何合适的量存在。优选的是，芳基酰基酰胺酶以充分的浓度存在，使得基本上样品中存在的所有乙酰氨基酚均被转化为对氨基苯酚。在一个实施方案中，R1包含的芳基酰基酰胺酶的浓度为约10U/L至约5000U/L、或约600U/L至约1200U/L、或约800U/L至约1000U/L。在一个实施方案中，R1包含的芳基酰基酰胺酶的浓度为约932.7U/L。

用于R1的溶剂或稀释剂可以为不对检测造成不利影响的任何合适的水基溶剂或稀释剂。在一个实施方案中，所述溶剂或稀释剂为水，优选为蒸馏水、去离子水、或反渗透水。在一个实施方案，稀释剂为去离子水。溶剂或稀释剂可以包含各种添加剂和成分。

除了芳基酰基酰胺酶，R1还可以包含催化剂、辅因子、蛋白质增溶剂、蛋白质稳定剂、酶稳定剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、稀释剂、溶剂、赋形剂等中的一种或多种。

在一个实施方案中，R1包含用于氧化偶合反应的催化剂。根据本发明，如果能够充分地催化氧化偶合反应，可以以任何合适的浓度使用任何合适的催化剂。示例性催化剂包括但不限于高锰酸盐、高碘酸盐、过硫酸盐、醋酸盐以及其他金属盐。在一个实施方案中，催化剂是选自FeCl₃、MnCl₂、CuSO₄、KIO₄或它们的衍生物的金属盐。在优选的实施方案中，催化剂是弱氧化剂。在一个实施方案中，弱氧化催化剂是二氯化锰(MnCl₂)。在一个实施方案中，催化剂是四水合二氯化锰(MnCl₂·4H₂O)。

在某些实施方案中，催化剂存在的浓度为约0.0005g/L至约1.000g/L、或约0.005g/L至约1.000g/L、或约0.010g/L至约0.100g/L、或约0.025g/L至约0.075g/L、或约0.040g/L至约0.060g/L。在一个实施方案中，R1包含浓度为约0.0525g/L的MnCl₂·4H₂O作为催化剂。除催化性能外，MnCl₂·4H₂O还可以起到其他作用，例如，据信，MnCl₂·4H₂O还可以作为酶稳定剂，从而提高酶试剂(R1)的贮存期限。

在一个实施方案中，R1包含至少一种蛋白质稳定剂。蛋白质稳定剂将帮助试剂中存在的酶的稳定，从而提高试剂的贮存期限。根据本发明，可以利用任何合适的蛋白质稳定剂或其组合。

一种优选的蛋白质稳定剂是PVP-40，它也可以作为试剂中的蛋白质增溶剂。本发明人已经发现PVP-40可以减少或消除检测中由试剂中的蛋白质的存在而造成的测量误差，并且可以防止试剂中的蛋白质沉淀，从而改善试剂的贮存期限和检测的整体性能。在一个实施方案中，R1包含的PVP-40的浓度为约0.1g/L至约10g/L、或约0.5g/L至约5g/L、或约1g/L至约3g/L。在一个实施方案中，R1包含的PVP-40的浓度为约2g/L。

在一个实施方案中，R1包含至少一种选自PVP-40、BSA Fraction V、海藻糖、对羟基苯甲酸钠、对羟基苯甲酸或其组合的蛋白质稳定剂。在一个实施方案中，所述至少一种酶稳定剂包含PVP-40、BSA Fraction V、海藻糖与对羟基苯甲酸钠或对羟基苯甲酸的组合。BSA Fraction V存在的浓度可以为(例如)约0.1g/L至约10g/L、或约0.5g/L至约5g/L、或约1g/L至约2.5g/L。

在一个实施方案中，R1包含的BSA Fraction V的浓度为约1g/L。海藻糖存在的浓度可以为(例如)约0.1g/L至约10g/L、或约0.5g/L至约5g/L、或约1g/L至约2.5g/L。在一个实施方案中，R1包含的海藻糖的浓度为约4.04g/L。对羟基苯甲酸钠或对羟基苯甲酸的存在的浓度可以为(例如)约0.1g/L至约10g/L、或约0.5g/L至约5g/L、或约1g/L至约2.5g/L。在一个实施方案中，R1包含的对羟基苯甲酸钠的浓度为约1g/L。在一个实施方案中，R1包含的对羟基苯甲酸的浓度为约1g/L。

在一个实施方案中，R1包含约2g/L的PVP-40、约1g/L的BSA FractionV、约4.04g/L的海藻糖和约1g/l的对羟基苯甲酸钠。

R1可以可任选地包含缓冲剂。根据本发明可以使用任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸钾、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、CAPS/偏硼酸盐、CAPS/碳酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、2{[三(羟甲基)甲基]氨基}-1-乙磺酸(TES)、TRIS/碳酸盐、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPES)、2-羟基-3-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}-丙磺酸(TAPSO)、及其组合。

缓冲剂存在的浓度可以为(例如)约1至10g/L或约5至8g/L。在一个实施方案中，R1包含CAPS缓冲剂。在一个实施方案中，R1包含的CAPS缓冲剂的浓度为约6.4g/L。

R1可以可任选地包含防腐剂。根据本发明可以使用任何合适的防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于硫酸庆大霉素、叠氮化钠、和苯甲酸钠。在一个实施方案中，R1包含的硫酸庆大霉素的浓度为约0.001g/L至约0.1g/L、或约0.01g/L至约0.05g/L。在一个实施方案中，R1包含约0.01g/L的硫酸庆大霉素。在一个实施方案中，R1包含的叠氮化钠的浓度为约0.001g/L至约0.1g/L、或约0.01g/L至约0.05g/L。在一个实施方案中，R1包含约0.05g/L的叠氮化钠。在一个实施方案中，R1包含约0.01g/L的硫酸庆大霉素和约0.05g/L的叠氮化钠。

R1可以可任选地包含金属螯合剂。根据本发明可以使用任何合适的金属螯合剂。合适的金属螯合剂包括但不限于EDTA。在一个实施方案中，R1包含的EDTA的浓度为约0.001g/L至约0.1g/L、或约0.01g/L至约0.05g/L。在一个实施方案中，R1包含的EDTA的浓度为约0.025g/L。

R1可以可任选地包含表面活性剂。根据本发明可以使用任何合适的表面活性剂。示例性表面活性剂包括但不限于Brij^TM-35、Triton^TM X-100、Olin-10G^TM、TX^TM-102、TX-405^TM、Zonyl FSN^TM、TX-100^TM、和TX-165^TM。

优选水解反应发生的pH范围为约5.9至约12.0、或约6.5至约9.0、或约7.5至约9.4、优选为约8至9。在一个实施方案中，pH为约8.6。

可以通过本领域已知的任何合适的方式来调节R1的pH。例如，可以使用氢氧化钠或任何其他合适的碱来提高pH。可以使用HCI或其他合适的酸来降低pH。在一个实施方案中，使用氢氧化钠来调节R1的pH。在一个实施方案中，R1包含约500μL/L至约1000μL/L的量的2N的氢氧化钠。在一个实施方案中，R1包含约833μL/L的2N的氢氧化钠。

下表1示出示例性R1配方。按照这种示例性实施方案，可以通过向小于100％总体积的合适的稀释剂(优选的是，蒸馏水、去离子水、或反渗透水)中添加除酶和叠氮化钠外的各种成分来制备R1。然后使用氢氧化钠来调节pH至所需的范围，随后添加叠氮化钠。最后添加酶。然后，使用稀释剂使配方达到100％体积。

在本发明的自动检测的一个实施方案中，将10μL样品(或对照品或标准样品)添加到比色皿中的100μL的R1中。然后用100μL的水(优选蒸馏水、去离子水、或反渗透水)将R1按1∶1原位稀释，并将溶液简单混合。在比色皿中发生水解反应。可以根据特定的自动化仪器(即，化学分析仪)所要求的比色皿尺寸来调节体积。在一个实施方案中，化学分析仪是HitachiChemical Analyzer(Roche Dignostics)。

水解反应可发生的温度在约10℃至约60℃、或约30℃至约50℃、或约35℃至约40℃。在一个实施方案中，水解反应发生在约37℃的温度。

允许水解反应进行足够的时间以使得基本上样品(或标准样品)中存在的所有乙酰氨基酚均被水解，通常在约2至20分钟之间或者是约3至10分钟之间。在一个实施方案中，将水解反应持续约5分钟。由于对于较低的温度通常需要更长的反应时间，所以对于选定的温度可以优化反应时长。

在水解反应完成并且基本上样品(或标准样品)中存在的所有乙酰氨基酚均被转化为对氨基苯酚后，实施氧化偶合步骤。

在本发明的自动检测的一个实施方案中，通过向含有水解溶液的比色皿中直接添加含有发色团的第二试剂(R2)来引发氧化偶合步骤。根据上面描述的实施方案，将200μL的R2添加到水解溶液中，简单混合，至最终比色皿中氧化偶合反应体积达410μL(10μL的样品+100μL的R1+100μL的水+200μL的R2)。

根据本发明，优选的发色团是二甲苯酚发色团。本发明人已经惊讶地发现，在本检测方法中选择二甲苯酚发色团显著降低了NAC存在的干扰。相对于现有技术的检测方法，这个惊讶的结果提供下列优点：可以在NAC的治疗中推荐使用本检测方法。本发明人已经证明，在高达至少2000mg/L的治疗水平的NAC存在的情况下，乙酰氨基酚测量是可靠的，这一结果是之前现有技术的酶促乙酰氨基酚检测方法所没有证实的。

在实验中，本发明人也惊讶地发现，使用2，5-二甲苯酚代替市售乙酰氨基酚检测方法(得自Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)中的8-HQ5SA发色团，导致检测中胆红素的干扰显著降低，这进一步证实了发色团的选择可显著影响检测中的干扰水平。

根据本发明可以使用任何合适的二甲苯酚发色团，例如，2，5-二甲苯酚、3，4-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚、2，4-二甲苯酚、3，5-二甲苯酚或2，3-二甲苯酚。在存在治疗水平的NAC的检测中，优选的二甲苯酚发色团导致最小的干扰。在实验中，2，5-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚或2，3-二甲苯酚在干涉检测中显示出不受1471mg/L的NAC的显著干扰。在一个实施方案中，二甲苯酚发色团是2，5-二甲苯酚(对二甲苯酚)。

在氧化偶合反应中，二甲苯酚发色团可以以任何合适的浓度存在。然而，为了准确计算初始样品中存在的乙酰氨基酚的浓度，发色团应理想地以达到或超过水解溶液的对氨基苯酚的最大摩尔浓度(其与初始样品中的乙酰氨基酚的量成正比)的摩尔浓度存在。

在一个实施方案中，R2包含的二甲苯酚发色团的浓度为约0.075g/L至约115g/L、或约2.5g/L至约20g/L、或约5g/L至约10g/L。在一个实施方案中，二甲苯酚发色团是2，5-二甲苯酚，并且存在于R2中的浓度为约7.5g/L。

为了使氧化偶合反应发生在合适的时间范围内，必须存在合适的催化剂。催化剂可以是R1或者R2的成分，或者可以被添加到R1与R2的混合物中。根据本发明可以使用各种催化剂，如高锰酸盐、高碘酸盐、过硫酸盐、及各种金属盐。在一个实施方案中，催化剂是金属盐，如FeCl₃、MnCl₂、CuSO₄或KIO₄。在一个实施方案中，催化剂包括无水或水合的MnCl₂。惊讶地发现，相对于其他测试的金属盐，MnCl₂(弱氧化剂)对于与二甲苯酚的氧化偶合步骤的催化尤其有效。

典型地，对于乙酰氨基酚检测中的氧化偶合步骤，选择强氧化潜力的催化剂以确保提供足够的能量来驱动偶合反应至完成。通常采用的催化剂是具有反应性氧或官能团的种类的金属盐，如高碘酸钠、硫酸铜和醋酸锰。例如，已知的乙酰氨基酚检测方法利用由醋酸锰催化的羟基喹啉或其衍生物(即，Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)、由高碘酸盐催化的邻甲酚(GDSDiagnostics)或硫酸铜(Hammond等，1984)、或由高碘酸钠催化的对二甲苯酚(Afshari和Lui，2001)。已知这些乙酰氨基酚检测方法均显示干扰。例如，在生物样品中存在高水平的胆红素的干扰会在这样的样品中产生错误的结果。

本发明人推测，使用强氧化性催化剂可以成为常规的乙酰氨基酚检测中所见的胆红素干扰的起作用的因素。例如，某些试剂制造商使用高碘酸盐通过选择性破坏胆红素以形成胆腺素来测量胆红素。当胆红素被氧化成胆腺素或更高氧化程度的产物时，吸光度有显著变化，这可能会对常规的检测中所见的干扰起作用。因此，本发明人由此出发来确定：(a)弱氧化剂是否能够成功地驱动二甲苯酚发色团(如，2，5-二甲苯酚)与对氨基苯酚之间的氧化偶合反应；(b)使用弱氧化剂是否会对检测中的胆红素干扰起到积极作用。

惊讶地证实，选择弱氧化剂(如，MnCl₂)作为示例性催化剂(与含有反应性氧种类的高碘酸钠或者其他强氧化剂相比，其具有低的氧化潜力)提供了足够的能量来催化反应中对氨基苯酚与2，5-二甲苯酚的偶合。此外，已成功地证实，选择弱氧化剂作为催化剂显著降低了检测中的胆红素干扰，从临床角度看，这是十分需要的发现。还惊讶地地发现，与测试的其他催化剂相比，需要较低浓度的MnCl₂以驱动反应，并且在检测中出现更强的显色。试剂中使用较少的催化剂降低了催化剂与其他试剂成分或与患者样品中的生物或化学成分反应的几率，从而改善了检测。

因此选择弱氧化剂作为催化剂可以减少随着时间的推移二甲苯酚发色团的自然氧化反应的可能、以及与检测试剂中的其他成分反应的可能，从而改善试剂的稳定性并延长了液体稳定试剂的贮存期限。本领域的技术人员将能够区分出强氧化剂和弱氧化剂，并能够根据发明的实施方案选择合适的弱氧化剂作为催化剂。

据推测，向发色团试剂添加抗氧化剂能进一步提高发色团试剂的颜色的经时稳定性。令人惊讶的是，已证明，添加还原型谷胱甘肽(显色检测法中不常见的成分)成功地防止发色团试剂随着时间的推移的显色，可能部分原因是防止二甲苯酚的自动氧化，从而改善试剂的稳定性。谷胱甘肽还作为清除剂，从而可以去除试剂中可能影响氧化偶合反应的自由基。

使用羟胺、3，3′-硫代二丙酸、硫脲或还原型谷胱甘肽进行了研究。定性与定量监测了这些试剂的颜色随时间的变化。向试剂中添加还原型谷胱甘肽最有效地防止随时间而显色。

因此，R2可以可任选地含有抗氧化剂。根据本发明可以利用任何合适的抗氧化剂。在一个实施方案中，R2包含的抗氧化剂的浓度为约0.005g/L至约5.00g/L、或约0.05g/L至约5g/L、或约0.1g/L至约1g/L。在一个实施方案中，抗氧化剂是谷胱甘肽。尤其优选的是还原型谷胱甘肽。在一个实施方案中，R2包含的还原型谷胱甘肽的浓度为约0.5g/L。

R2可以可任选地含有一种或多种缓冲剂或表面活性剂或它们的组合。根据本发明可以利用任何合适的缓冲剂或表面活性剂，例如，上面涉及水解溶液时所提到的那些。试剂中存在表面活性剂可以抑制检测中的脂血干涉，尤其是在低乙酰氨基酚水平(即，＜200μmol/L)时。

在一个实施方案中，R2包含的TRIS的浓度为约10至50g/L、或约15至30g/L、或约20至30g/L。在一个实施方案中，R2包含约24.2g/L的TRIS。在一个实施方案中，R2包含的碳酸钠的浓度为约5至20g/L、或约10至15g/L。在一个实施方案中，R2包含约10.6g/L的碳酸钠。在一个实施方案中，R2包含约24.2g/L的TRIS和约10.6g/L的碳酸钠。

在一些实施方案中，偶合反应是在约37℃下、在约9至12之间、或约9.5至11.5之间、或优选的是约10至11之间的碱性pH下实施的。在一个实施方案中，pH大于约10。在一个实施方案中，pH为约10.8。

可以通过本领域任何合适的方式来调节试剂的pH。在一个实施方案中，向R2添加氢氧化钠小球至浓度为约1g/L至约4g/L、或约2g/L至约3g/L。在一个实施方案中，R2包含约2.5g/L的氢氧化钠小球。

下表2示出示例性R2配方。当按照这种示例性的实施方案制备R2时，建议最后并按照谷胱甘肽和2，5-二甲苯酚的顺序将其添加。

制备后可以检查检测试剂的pH，如果需要，可以进一步调节。

氧化偶合反应可发生的温度在约10℃至约60℃、或约30℃至约50℃、或约35℃至约40℃。在一个实施方案中，氧化偶合反应发生在约37℃的温度。

允许氧化偶合反应进行足够的时间以使得二甲苯酚发色团基本上与反应混合物中存在的所有对氨基苯酚均发生偶合，通常在约2至20分钟之间或者是约3至10分钟之间。在一个实施方案中，氧化偶合反应持续约5分钟。由于对于较低的温度通常需要更长的反应时间，所以对于选定的温度可以优化反应时长。

二甲苯酚发色团与对氨基苯酚的氧化偶合导致蓝色产物(即，染料)的形成，这可以通过在合适的波长处测量检测混合物的吸光度的变化来检测。从氧化偶合反应结束时的吸光度减去水解反应结束时的吸光度。初始样品中存在的乙酰氨基酚的化学计量的量基本上与形成的染料的化学计量的量相等。

可以在一定波长范围内测量所得染料的吸光度。该染料的最大吸收发生在约610-615nm。典型地，用于在比色检测中的测量而选择的波长是出现峰吸光时的波长。如果利用双色分析仪，在可选择的波长(如约700nm至约850nm)处进行双色空白测量，其从主测量中减去，以使检测中的背景噪音最小化。也可以使用其他已知的减少检测中的背景噪音的方法。

本发明人惊讶地发现，测量在非峰值波长(即，在吸光度曲线的肩上而不是峰上)处的吸光度明显降低了检测中的生物分子胆红素和血红蛋白的干扰。发现在约640nm至约680nm、或约650nm至670nm、优选约660nm的波长处测量吸光度显著提高了在胆红素或血红蛋白存在下的乙酰氨基酚测量精确度。胆红素和血红蛋白干扰是和已知的乙酰氨基酚检测方法有关的常见缺点。因此，为了减少检测中的干扰，可以在约660nm处测量吸光度。

在一个实施方案中，在约610nm和665nm之间测量吸光度。

本领域的技术人员将理解，可以不脱离本发明而改变试剂溶液的成分及其相对比例，避免独立和组合溶液中的浑浊、沉淀和其他污染因素。当检测是液体稳定的检测时，应仔细评估可能对试剂或其成分的稳定性(如，酶或发色团稳定性)造成负面影响的任何改变。

在一个示例性实施方案中，按照以下概述的步骤实施根据本发明的两部分的乙酰氨基酚检测。

第一部分包括向比色皿中的患者血清或者血浆样品中以一定的样品与试剂的比例添加酶试剂(R1)。例如，在Hitachi 717上样品体积是10μL、R1体积是100μL，使用100μL去离子水对R1进行原位稀释，以形成水解溶液。将该溶液在自动分析仪中在37℃下温育设置的持续时间(如，5分钟)。在这段时间里，试剂中存在的芳基酰基酰胺酶断开样品中的乙酰氨基酚分子的酰胺键，从而得到对氨基苯酚和醋酸盐。在引入发色团试剂之前，在建立的波长处、以某些时间间隔监测吸光度读数。

在第二部分中，以设定的时间间隔和一定的体积向水解溶液(样品+R1，稀释过的)加入隔发色团试剂(R2)。例如，在Hitachi 717上加入200μL R2，以设定的时间间隔监测反应直到测试的时间期间结束。R2中的二甲苯酚发色团(优选2，5-二甲苯酚)在催化剂存在和碱性pH下与第一部分中产生的对氨基苯酚氧化偶合。在一个优选的实施方案中，在锰阳离子存在下实施氧化偶合步骤。反应产生有色的络合物，该络合物的最大吸收峰在约610nm。

分析仪测量添加R2之前的吸光度和反应结束时的吸光度之间的差，为了背景噪音进行校正。光密度差是样品产生的吸光度的量。可以将吸光度的变化与标准曲线相比较，以计算初始样品中的乙酰氨基酚浓度。

在一个优选的实施方案中，在660nm处测量吸光度以使检测中某些生物分子的干扰最小化。

虽然不希望受任何具体理论的约束，但据信根据朗伯-比耳的原理，乙酰氨基酚的浓度与吸光度的强度直接成正比，A＝εcl，其中：

A＝吸光度(在给定波长处)；

ε＝摩尔消光系数(对于每个化学物质均为常数)；

l＝光路长度(即，1厘米)；以及

c＝溶质浓度。

因此，在摩尔消光系数和光路长度为常数的情况下，溶质(在这种情况下为乙酰氨基酚)浓度与吸光度直接成正比。

在一个实施方案中，最终反应混合物的浓度是：

1)227.5U/L芳基酰基酰胺酶

2)0.0128g/L MnCl₂

3)3.66g/L 2，5-二甲苯酚

4)0.244g/L谷胱甘肽

本发明的检测方法可以以由各部分组成的试剂盒的形式生产和销售。试剂盒中的试剂可以是需要复原的粉状或冻干试剂。制备这种粉状或冻干试剂的方法是本领域已知的。优选的是，该试剂为液体稳定试剂。液体稳定试剂使用方便，并且不易于在复原时引入错误。

在一个实施方案中，试剂盒包括：含有酶试剂(R1)的容器；含有发色团试剂(R2)的容器；以及可任选的实施该检测的指导书。该试剂盒还可以包含乙酰氨基酚标准样品和制备线性组(linear set)的标准样品的指导书。

实施例

实施例1

示例性酶和发色团试剂

表1示例性酶试剂(R1)的组成(以去离子水作为稀释剂)

表2示例性发色团试剂(R2)的组成(以去离子水作为稀释剂)

可以在合适的稀释剂(如去离子水)中制备试剂。

实施例2在不存在和存在NAC的情况下的检测性能

在去离子水中制备一组具有已知浓度的乙酰氨基酚的标准样品(即，250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1500μmol/L、2000μmol/L和2500μmol/L)。将每个标准样品的10μL的等分试样加入到HitachiAnalyzer(RocheDiagnostics)的比色皿中的100μL R1中，接着使用100μL去离子水原位稀释。将各混合物在37℃下温育5分钟。获取各初始吸光度值。将R2的200μL等分试样添加到各比色皿中。使氧化偶合反应进行5分钟。获取最终吸光度值。基于660nm处的最终吸光度和初始吸光度之间的差来计算乙酰氨基酚浓度，通过减去在800nm处的吸光度来校正背景噪音。各已知浓度的结果示于下表3中。

表3在不存在NAC的情况下使用对二甲苯酚作为发色团测得的乙酰氨基酚浓度

所述检测证实了在较大的乙酰氨基酚浓度范围内的对乙酰氨基酚浓度的精确测量。

为评价在存在NAC的情况下的性能，通过将75mg的NAC溶解在1000μL去离子水中来制备母液。这形成NAC浓度为75g/L或75000mg/L的母液。

向试管中加入已知浓度的乙酰氨基酚水溶液的2.5毫升等分试样，使用50μL的NAC母液向其中掺料，以制备一组具有已知浓度的乙酰氨基酚的掺料标准样品(即245μmol/L、490μmol/L、980μmol/L、1470μmol/L、1960μmol/L和2450μmol/L)。每个掺料的乙酰氨基酚标准样品的NAC浓度为1471mg/L(该值是在NAC治疗中在患者血清可以发现的值)。由于NAC会随着时间的推移而降解，在掺料1小时内对样品进行分析。

如上所述进行该检测。将每个掺料的标准样品的10μL的等分试样加入到Analyzer(Roche Diagnostics)的比色皿中的100μL R1中，接着使用100μL去离子水原位稀释。将各混合物在37℃培养5分钟。获取每个混合物的初始吸光度值。将R2的200μL等分试样添加到每个比色皿中。进行氧化偶合反应5分钟。获取最终吸光度值。基于660nm处的吸光度的差来计算乙酰氨基酚浓度，校正背景噪音。以使用8-HQ衍生物作为发色团的已知的检测方法作为比较例，使用1650进行了方法比较。各个浓度已知的掺料的样品的结果示于下表4中。

表4在存在NAC的情况下使用8-HQ5SA或对二甲苯酚作为发色团测得的乙酰氨基酚浓度。

在存在NAC的情况下，与使用8-HQ5SA作为发色团的检测方法相比，使用对二甲苯酚作为发色团的检测方法抵抗干扰。临床检测中用于干扰的截止值(cut off)通常为10％的差，优选为低于5％。

实施例3对二甲苯酚发色团之间的比较

通过替换R2配方中的发色团对二甲苯酚发色团进行了比较。所有其他参数都相同。制备包含R2缓冲剂和谷胱甘肽的母液，并将其分成六批。将7.5g/L的各异构体分别溶解在各批中，由此形成六种“不同”发色团试剂，每个发色团试剂含有一种不同的异构体。R1保持不变，因此，分析中唯一的变量就是R2中的发色团。酶试剂(R1)在25℃的pH为8.6，而六种含有异构体的二甲苯酚试剂在25℃的pH均为11.5。含有各种已知异构体的样品的结果示于下表5中。

结果证实，2，5-二甲苯酚、2，6-二甲苯酚和2，3-二甲苯酚在存在NAC的情况下产生可接受的线性结果。观察到使用2，5-二甲苯酚、和2，6-二甲苯酚具有最佳的性能。

表5在存在和不存在NAC的情况下使用不同的二甲苯酚发色团测得的乙酰氨基酚浓度。

实施例4在存在的情况下对2，5-二甲苯酚进行的评价

使用含有已知浓度的乙酰氨基酚的掺料的血清对2，5-二甲苯酚进行评价。结果显示，在治疗水平的乙酰氨基酚(＜200μmol/L)下，2，5-二甲苯酚发色团在可接受的限度(±10％，在200mg/dL下)恢复。测试使用Siemens1650。

首先，将10毫升血清灌入大的测试管中并混合。然后使用2.1毫克的试剂级乙酰氨基酚对血清进行掺料，并混合直到溶解。用移液管将一份4.75ml的等分试样从掺料池中移出并置于标记为对比池的大的测试管中。用移液管将第二份4.75ml的等分试样从掺料池中移出并置于标记为测试池的第二个大的测试管中。在对比池中，加入250μL的盐水，并充分混合。在测试池中，加入250μL的20％溶液，并充分混合。通过将对比池与测试池以各种水平混合，制备了干扰组，由此产生不同的浓度而维持乙酰氨基酚浓度。2，5-二甲苯酚显示至少达到200mg/dL的满意结果。

实施例5在存在NAC的情况下不同的发色团的性能

在治疗水平的NAC(即，＞800mg/L)存在下，已知的使用8-羟基喹啉或其衍生物作为发色团的乙酰氨基酚检测方法均受到干扰。本发明人测试了两种市售乙酰氨基酚检测方法(Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)，其中包含8-羟基喹啉-5-磺酸(8-HQ5SA)或8-羟基喹啉半硫酸盐(8-HQHS)作为发色团。尽管已看到在没有NAC存在下提供了对于乙酰氨基酚的准确的测量，但在治疗水平的NAC存在下，乙酰氨基酚的恢复有显著的(＞大约10％)下降。已发现，NAC的存在影响检测中的氧化偶合反应，而不是乙酰氨基酚到对氨基苯酚的酶转化。在8-HQ5SA检测和8-HQHS检测之间，在恢复方面有相当大的差异，8-HQ5SA检测方法明显更容易受到NAC干扰，这表明，在NAC存在下，即使发色团的化学结构有轻微不同，对于偶合反应都是很重要的。

通过使用对二甲苯酚代替商品试剂盒(Genzyme Diagnostics P.E.I.Inc.，PEI，加拿大)中的8HQ5SA，对对二甲苯酚和8-羟基喹啉-5-磺酸进行了比较。试剂和检测中的所有其他的参数都是一样的。使用1000μmol/L的乙酰氨基酚标准样品进行手动检测。对比例以水掺料，测试样品以1000mg/L的NAC掺料。在整个波谱范围内测量吸光度。

图1示出了使用8HQ5SA作为发色团的检测的结果，图2示出了使用对二甲苯酚作为发色团的检测的结果。结果表明，对二甲苯酚检测相对不受NAC存在的影响，证实了检测方法的稳定，而使用8HQ5SA的检测受NAC存在的显著影响。

实施例6参数修正减少血红蛋白和胆红素干扰

血红蛋白干扰是已知的乙酰氨基酚检测的缺点。对掺料有1000mg/dL的血红蛋白的100μmol/L的乙酰氨基酚样品使用Ultrospec^TM 3300进行扫描，产生了有趣的观察。在600nm处的100μmol/L的乙酰氨基酚样品和100μmol/L+1000mg/dL的血红蛋白的样品之间的OD转变比在660nm处的所述OD转变大得多，虽然在吸收峰的肩部，但仍提供了主波长和次波长间的好的OD转变。因此，以660nm作为主波长、并保持80nm作为次波长来进行进一步测试。

结果表明，将主波长从600nm改变至660nm明显降低了检测中的血红蛋白和胆红素的存在的干扰。即使用Hitachi 717进行分析，也使用Siemens1650进行分析。使用乙酰氨基酚以固定的浓度对血清进行掺料，然后使用不同浓度的干扰物质对血清进行掺料。该改进的检测方法示出在NAC、胆红素、和血红蛋白的存在下的可接受的水平的干扰(即，＜10％)。

实施例7

发色团对胆红素干扰的影响

进行胆红素干扰研究，其中用于乙酰氨基酚检测的除发色团外的所有的试剂均相同。检测的样品含有约100μmol/L或330μmol/L的乙酰氨基酚。分析的发色团为8-HQ5SA和对二甲苯酚。使用Siemens1650进行分析了反应。

表6在约100μmol/L的乙酰氨基酚下的胆红素干扰

表7在约330μmol/L的乙酰氨基酚下的胆红素干扰

结果表明，发色团的选择可显著影响检测中的胆红素干扰。利用对二甲苯酚的检测方法明显更能抵抗胆红素干扰。

本发明的上述实施方案均仅为示例用途。在不脱离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可对特定实施方案进行改变、改进和变化，本发明的范围仅由所附权利要求所限定。

对于本文所引用的所有参考文献，其全部内容以引用方式并入本文。

参考文献

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Claims

1.一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的方法，该方法包括以下步骤：

通过使乙酰氨基酚与芳基酰基酰胺酶接触而使乙酰氨基酚水解以形成对氨基苯酚；

在合适的催化剂存在下，使所述对氨基苯酚与二甲苯酚发色团氧化偶合，以形成有色的产物，其中所述催化剂为无水或水合的MnCl₂；以及

测定形成的所述有色的产物的量，形成的所述有色的产物的量与所述水性样品中最初存在的所述乙酰氨基酚的量成正比，

其中，无论所述水性样品中是否存在治疗水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，该方法均是可靠的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述二甲苯酚发色团选自由2,5-二甲苯酚、2,6-二甲苯酚和2,3-二甲苯酚构成的组。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述二甲苯酚发色团为2,5-二甲苯酚，并且所述催化剂为无水或水合的MnCl₂。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述水性样品为血清或者血浆。

5.一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

使所述水性样品与第一试剂(R1)接触以形成水解溶液，所述第一试剂包含芳基酰基酰胺酶和合适的稀释剂；

温育所述水解溶液以允许发生水解反应，其中所述乙酰氨基酚被转化为所述对氨基苯酚；

使所述水解溶液与第二试剂(R2)接触以形成氧化偶合溶液，所述第二试剂包含二甲苯酚发色团和合适的稀释剂；

温育所述氧化偶合溶液以允许发生氧化偶合反应，其中，在合适的催化剂存在下，使所述二甲苯酚发色团与所述对氨基苯酚偶合，以形成有色的产物，其中所述催化剂为无水或水合的MnCl₂，并且其中所述催化剂在R1中存在的浓度为0.0005g/L至1.000g/L；以及

其中，无论所述水性样品中是否存在治疗水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，该方法均是可靠的，或

使所述水性样品与第一试剂(R1)接触以形成水解溶液，所述第一试剂包含芳基酰基酰胺酶和合适的稀释剂，

稀释所述水解溶液；

6.根据权利要求5所述的检测方法，其中R1包含浓度为10U/L至5000U/L的芳基酰基酰胺酶。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其中所述二甲苯酚发色团选自由2,5-二甲苯酚、2,6-二甲苯酚和2,3-二甲苯酚构成的组。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的检测方法，其中R2包含浓度为0.075g/L至115g/L的2,5-二甲苯酚，和/或其中所述催化剂为MnCl₂·4H₂O并且在R1中存在的浓度为0.0005g/L至1.000g/L。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的检测方法，其中R2还包含浓度为0.005g/L至5.000g/L的还原型谷胱甘肽。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的检测方法，其中R1还包含蛋白质增溶剂、蛋白质稳定剂、酶稳定剂、金属螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、或赋形剂中的一种或多种。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的检测方法，其中所述酶稳定剂选自由PVP-40、BSA Fraction V、海藻糖、对羟基苯甲酸钠、对羟基苯甲酸、及其组合构成的组。

12.根据权利要求5至11中任一项所述的检测方法，其中R2还包含缓冲剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、或赋形剂中的一种或多种。

13.根据权利要求5至12中任一项所述的检测方法，其中所述稀释剂为去离子水，并且在所述水解反应之前使用所述稀释剂将所述水解溶液按照1:1的比例稀释。

14.根据权利要求5至13中任一项所述的检测方法，其中R1包含932.7U/L的芳基酰基酰胺酶和0.0525g/L的MnCl₂·4H₂O；并且其中R2包含7.5g/L的2,5-二甲苯酚和0.500g/L的还原型谷胱甘肽。

15.根据权利要求5至14中任一项所述的检测方法，其中所述水解反应和氧化偶合反应均在37℃的温度下进行3到10分钟，并且其中所述水解反应在pH8.6下发生，和所述氧化偶合反应在pH10.8下发生。

16.根据权利要求5至15中任一项所述的检测方法，其中，通过获得所述水解反应结束时的吸光度与所述氧化偶合反应结束时的吸光度的差、并将该差与标准或一组标准来比较，从而确定所述乙酰氨基酚的浓度，其中所述吸光度是在610nm和665nm之间的波长处测量的。

17.根据权利要求16所述的检测方法，其中，所述吸光度是在660nm的波长处测量的。

18.根据权利要求5至17中任一项所述的检测方法，其中所述水性样品为血清或者血浆。

19.一种用于测定水性样品中的乙酰氨基酚浓度的试剂盒，该试剂盒包含：

第一试剂(R1)，所述第一试剂包含用于使乙酰氨基酚水解为对氨基苯酚的芳基酰基酰胺酶；

第二试剂(R2)，所述第二试剂包含用于与所述对氨基苯酚氧化偶合的二甲苯酚发色团；以及

用于对所述二甲苯酚发色团和所述对氨基苯酚的氧化偶合进行催化的合适的催化剂，其中所述催化剂为无水或水合的MnCl₂。

20.一种用于测定水性样品中的对氨基苯酚浓度的方法，该方法包括以下步骤：

在催化剂存在下，使对氨基苯酚与二甲苯酚发色团氧化偶合，以形成有色的产物，所述二甲苯酚发色团选自由2,5-二甲苯酚、2,6-二甲苯酚和2,3-二甲苯酚构成的组，所述催化剂为无水或水合的MnCl₂；以及

测定形成的所述有色的产物的量，形成的所述有色的产物的量与所述水性样品中最初存在的所述对氨基苯酚的量成正比。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述催化剂为水合MnCl₂，并且所述二甲苯酚发色团为2,5-二甲苯酚。

22.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述二甲苯酚发色团选自由2,5-二甲苯酚、2,6-二甲苯酚和2,3-二甲苯酚构成的组。

23.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述水性样品是血清或血浆。

24.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述二甲苯酚发色团是2,5-二甲苯酚，并且所述催化剂是水合的MnCl₂。

25.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂是液体稳定的。

26.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂还包含实施乙酰氨基酚测定检测的说明书。