JP3658621B2 - p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット - Google Patents
p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP3658621B2 JP3658621B2 JP2001395178A JP2001395178A JP3658621B2 JP 3658621 B2 JP3658621 B2 JP 3658621B2 JP 2001395178 A JP2001395178 A JP 2001395178A JP 2001395178 A JP2001395178 A JP 2001395178A JP 3658621 B2 JP3658621 B2 JP 3658621B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- lower alkyl
- alkyl group
- formula
- integer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 0 *Nc(cc1)ccc1O* Chemical compound *Nc(cc1)ccc1O* 0.000 description 1
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N Oc1c(cccc2)c2ccc1 Chemical compound Oc1c(cccc2)c2ccc1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
p−アミノフェノール誘導体は、多くの医薬品およびその原料に使用されているとともに化学工業原料としても使用されている。これらの大量服用あるいは暴露によって、通常の解毒機能では対処できないp−アミノフェノール誘導体が体内に蓄積して、肝細胞に障害を与え、重篤な肝障害を引き起こして死に至る危険性があることが知られている。特にp−アミノフェノール誘導体の一種であるアセトアミドフェノール(アセトアミノフェン)については、その血清中の濃度と肝障害の危険性には相関関係のあることも知られている。したがって、血清中のp−アミノフェノール誘導体の濃度を知ることができれば、その危険性を予知し、治療を施すことが可能となる。
【0003】
現在、試料中のp−アミノフェノール誘導体を検査する方法はいくつか知られている。例えば、分析機器を用いる方法が知られているが、これは結果が出るまでに数時間を要するため、緊急時に対処することは困難である。また、o−クレゾールとアンモニアを使用するインドフェノール法が知られているが、o−クレゾールは危険物であると同時に、この方法は反応時に不快な臭いを発するため、安全装置のある施設内での使用に限られている。また、これらの試薬は揮発性であるため、調製後に試薬の濃度が変化する危険性がある。さらに、気散した薬品が他の検査に悪影響を及ぼしたり、検査者の健康を害するなど安全性の面でも問題がある。また、アセトアミノフェンの検出キットとして既にSigma Diagnostics Acetaminophen reagentsがSIGMA社から製品化されているが、インドフェノール法とは異なった発色法であるニトロ化法を使用しており、最終生成物が黄色に発色する。しかしながら、検体が血清等の血液成分である場合には、もとの試料と発色した生成物との色が類似しているために陽性判定が困難であるとともに低濃度の検出が困難である。このように、これらの方法においては、迅速性、操作性および安全性の面で不十分である。よって、緊急を要する医療の現場において、その検査結果を治療行為に有効に反映させるには、迅速かつ簡便に検査試料そのものを発色させられる方法が望まれている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているp−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で迅速かつ確実に検出する方法およびキットを提供することを課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料中のp−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるp−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤で発色させることにより、既存の方法と比較しても迅速にかつ高感度に検出することができることを見出した。本発明はこの知見に基づく。
【0006】
すなわち、本発明によれば、式(I)
【化7】
(ここで、R1は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基を表し、R2は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、R1とR2が同時に水素であることはない。)で示されるp−アミノフェノール誘導体の検出方法であって、
(a)試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を分解して、p−ヒドロキシアニリンを生成させるために試料溶液を酸性条件下に置く工程、
(b)工程(a)からの溶液に式(II)
【化8】
(ここで、Xはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、nは1〜4の整数を表す。ただし、n=1のときXがメチル基であることはない。)で示されるフェノール化合物、および式(III)
【化9】
(ここで、XおよびYはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、aは1〜3の整数を、bは1〜4の整数をそれぞれ表す。)で示されるα−ナフトール化合物からなる群の中から選択される発色剤を添加する工程、
(c)p−ヒドロキシアニリンと発色剤を反応させて発色させるために工程(b)からの溶液をアルカリ条件下に置く工程、および
(d)発色に基づいて試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する工程を含むことを特徴とする検出方法が提供される。
【0007】
本発明の方法は、試料溶液が生体由来のものである場合には、工程(a)の前に、試料溶液に除タンパク剤を添加することによりタンパク質を含む不純物を分離する工程を含むことができる。
【0008】
本発明の方法は、好ましくは工程(a)において、マイクロウェーブオーブンを用いて試料溶液を加熱することができる。
【0009】
本発明の方法は、工程(c)において、室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択されるアルカリ化剤を添加することにより工程(b)からの溶液をアルカリ性にすることが好ましい。
【0010】
本発明はまた、本発明のp−アミノフェノール誘導体の検出方法において検出対象とされるp−アミノフェノール誘導体の検出キットであって、p−アミノフェノール誘導体を分解させるための無機酸または有機酸を含む分解試薬、本発明の発色剤を含む発色試薬、およびアルカリ化剤を含むアルカリ化試薬を備えるキットが提供される。
【0011】
本発明のキットは、さらに除タンパク剤を含む除タンパク試薬を備えることができる。
【0012】
本発明のキットにおいて、アルカリ化剤は好ましくは室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択される。
【0013】
本発明において、発色剤は2,6−キシレノールであることが好ましい。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0015】
本発明は、試料中に存在するp−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるp−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤とアルカリ性条件下で反応させて発色させることにより検出するものである。
【0016】
本発明で検出し得るp−アミノフェノール誘導体は、式(I)
【化10】
で示すことができる。式(I)においてR1は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基である。低級アルキル基(カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む)としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、R2は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、R1とR2が同時に水素であることはない。
【0017】
本発明において用いられる検体試料は、血液やその成分(血清、血漿等)、胃液等の体内分泌物、尿等の排泄物、および吐瀉物などの生体由来の試料、並びに飲料水および河川水などの環境由来の試料を含む。
【0018】
本発明に係るp−アミノフェノール誘導体の検出方法においては、試料を酸性条件下に置いて試料中のp−アミノフェノール誘導体を分解させる分解剤、p−アミノフェノール誘導体が分解して生じるp−ヒドロキシアニリンと反応させる発色剤、および発色反応液をアルカリ条件下に置くためのアルカリ化剤を用いる。これらの試薬は好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができる。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、2−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【0019】
分解剤としては無機酸および/または有機酸を用いることができる。好ましくは塩酸、硫酸、または硝酸を用い、1〜10重量%の濃度で使用することが望ましい。
【0020】
発色剤には、式(II)
【化11】
で示されるフェノール化合物が含まれる。式(II)において、Xはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、nは1〜4の整数を表す。ただし、n=1のときXがメチル基であることはない。低級アルキル基(カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む)としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、発色剤には式(III)
【化12】
で示されるα−ナフトール化合物も含まれる。式(III)において、XおよびYはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、aは1〜3の整数を、bは1〜4の整数をそれぞれ表す。低級アルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。発色剤としては、好ましくは悪臭が無く、危険物に指定されていない2,6−キシレノールを用いる。これらの発色剤は、試料1mlあたり0.1mg〜50mgの範囲で使用されることが好ましい。p−アミノフェノールはこれら発色剤と反応してインドフェノール類(青色)を生成する。
【0021】
アルカリ化剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどの室温(20℃)で固体の無機塩基、または式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類を使用し、好ましくは1M水酸化ナトリウム水溶液を用いる。
【0022】
また、検体試料が生体由来のものである場合には、前述した試薬に加えてさらに、試料中のタンパク質を予め分離・除去するための除タンパク剤を用いる。除タンパク剤には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、およびジメチルスルホキシドのような有機溶剤、塩酸、硫酸、過塩素酸、タングステン酸、メタリン酸、およびモリブデン酸のような無機酸、スルホサリチル酸、トリクロロ酢酸、およびピクリン酸のような有機酸、並びに硫酸アンモニウム、スルホン酸銅、タングステン酸ナトリウム、および水酸化亜鉛などの塩類が含まれ、好ましくはトリクロロ酢酸を用いる。これらの除タンパク剤は、好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができ、1〜10重量%の濃度で使用することが好ましい。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、2−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【0023】
より具体的には、本発明に係る検出方法は、次のように行うことができる。まず、検体試料が生体由来のものである場合には、ガラスおよびポリプロピレンなどの試験管に検体試料を入れ、除タンパク剤を加えて充分に撹拌し、好ましくは遠心分離器を用いて(3,000rpm,5分間)タンパク質などの不純物を除去する。不純物を分離後、上清を別の試験管に移し、これを検査試料として用いる。試料溶液に分解剤を添加して溶液を酸性にし、p−アミノフェノール誘導体を分解させる。反応は室温から100℃の温度で5〜30分間で行うことができ、100℃で20分間加熱することが好ましい。反応時間を短縮するためにはマイクロウェーブオーブンを用いて加熱することが好ましい。この場合出力350〜500Wにて30秒〜2分間加熱することで充分である。マイクロウェーブオーブンに関しては、市販の電子レンジで代用することも可能である。放冷後、発色剤とアルカリ化剤を順次加えて撹拌する。このとき得られる反応溶液はpH8〜14であることが好ましく、pH10以上であることがより好ましい。反応は室温から100℃の温度で行うことができるが、室温でも十分に反応は進行するため、室温で行うことが望ましい。この反応後、発色に基づいて試料中のp−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する。p−アミノフェノール誘導体の存在の有無は目視による着色(青色)の有無で判定できる(定性的検出)。p−アミノフェノール誘導体を定量的に検出するためには、分光光度計を用いて波長600〜620nmにおける吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線と比較することによって濃度を決定する。また、色彩表を用いた目視検査により判定することもできる。
【0024】
本発明に係るp−アミノフェノール誘導体の検出キットには、上述した検出方法において用いられる各試薬が備えられる。各試薬は、通常、個別にパッケージされている。
【0025】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0026】
実施例1
血清0.5mlに5重量%のトリクロロ酢酸0.5mlを加えて良く撹拌した。この混合液を3,000rpmで5分間遠心分離した。得られた上清0.65mlをネジ口付の試験管に移し、塩酸20μlを加えて蓋をした。試験管を100℃で20分間加温した(あるいは、350W出力のマイクロウェーブオーブンで2分間、マイクロウェーブを照射した)。放冷後、1重量%の2,6−キシレノール0.5mlと1M水酸化ナトリウム水溶液0.5mlを加えて撹拌した。5分後に分光光度計を使用して620nmでの吸収を測定した。種々の濃度のp−アミノフェノール誘導体を含む血清試料について同検査を行った結果を表1に示す。
【0027】
【表1】
【0028】
本方法での血清中p−アミノフェノール誘導体の検出下限は10μg/mlであり、200μg/mlまで定量性が確認された。また、この方法によれば、肝障害の治療域(10〜20μg/ml)においても十分に目視的に着色を確認することができた。よって、本方法は、救急の場において利用可能であるといえる。
【0029】
実施例2
p−アセトアミドフェノールを大量に服用して急性中毒を起こした患者より得られた血清を使用して、実施例1と同じ方法で試料を調製し、吸光度を測定した。測定値をあらかじめ作成しておいた検量線と比較することによって血清中のp−アミノフェノール誘導体の濃度を決定した。なお、定量精度を高めるために、比較対照として、事前にp−アセトアミドフェノールが200μg/mlの濃度となるように調製した血清試料も同時に検査し、その吸収度を基に検量線を補正した。この補正した検量線に基づいて、患者由来の血清中のp−アセトアミドフェノールの濃度は13.0μg/mlと決定された。なお本発明の方法ではp−アセトアミドフェノールとその代謝物を含めてそれらの濃度が測定される。参考として、p−アミノフェノール誘導体自体の濃度のみが測定される機器分析法により同じ試料を測定したところ、9.6μg/mlであった。本発明の方法は簡便で精度の高い検査法であることが確認された。
【0030】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているp−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で、迅速かつ確実に検出することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
p−アミノフェノール誘導体は、多くの医薬品およびその原料に使用されているとともに化学工業原料としても使用されている。これらの大量服用あるいは暴露によって、通常の解毒機能では対処できないp−アミノフェノール誘導体が体内に蓄積して、肝細胞に障害を与え、重篤な肝障害を引き起こして死に至る危険性があることが知られている。特にp−アミノフェノール誘導体の一種であるアセトアミドフェノール(アセトアミノフェン)については、その血清中の濃度と肝障害の危険性には相関関係のあることも知られている。したがって、血清中のp−アミノフェノール誘導体の濃度を知ることができれば、その危険性を予知し、治療を施すことが可能となる。
【0003】
現在、試料中のp−アミノフェノール誘導体を検査する方法はいくつか知られている。例えば、分析機器を用いる方法が知られているが、これは結果が出るまでに数時間を要するため、緊急時に対処することは困難である。また、o−クレゾールとアンモニアを使用するインドフェノール法が知られているが、o−クレゾールは危険物であると同時に、この方法は反応時に不快な臭いを発するため、安全装置のある施設内での使用に限られている。また、これらの試薬は揮発性であるため、調製後に試薬の濃度が変化する危険性がある。さらに、気散した薬品が他の検査に悪影響を及ぼしたり、検査者の健康を害するなど安全性の面でも問題がある。また、アセトアミノフェンの検出キットとして既にSigma Diagnostics Acetaminophen reagentsがSIGMA社から製品化されているが、インドフェノール法とは異なった発色法であるニトロ化法を使用しており、最終生成物が黄色に発色する。しかしながら、検体が血清等の血液成分である場合には、もとの試料と発色した生成物との色が類似しているために陽性判定が困難であるとともに低濃度の検出が困難である。このように、これらの方法においては、迅速性、操作性および安全性の面で不十分である。よって、緊急を要する医療の現場において、その検査結果を治療行為に有効に反映させるには、迅速かつ簡便に検査試料そのものを発色させられる方法が望まれている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているp−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で迅速かつ確実に検出する方法およびキットを提供することを課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料中のp−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるp−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤で発色させることにより、既存の方法と比較しても迅速にかつ高感度に検出することができることを見出した。本発明はこの知見に基づく。
【0006】
すなわち、本発明によれば、式(I)
【化7】
(ここで、R1は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基を表し、R2は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、R1とR2が同時に水素であることはない。)で示されるp−アミノフェノール誘導体の検出方法であって、
(a)試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を分解して、p−ヒドロキシアニリンを生成させるために試料溶液を酸性条件下に置く工程、
(b)工程(a)からの溶液に式(II)
【化8】
(ここで、Xはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、nは1〜4の整数を表す。ただし、n=1のときXがメチル基であることはない。)で示されるフェノール化合物、および式(III)
【化9】
(ここで、XおよびYはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、aは1〜3の整数を、bは1〜4の整数をそれぞれ表す。)で示されるα−ナフトール化合物からなる群の中から選択される発色剤を添加する工程、
(c)p−ヒドロキシアニリンと発色剤を反応させて発色させるために工程(b)からの溶液をアルカリ条件下に置く工程、および
(d)発色に基づいて試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する工程を含むことを特徴とする検出方法が提供される。
【0007】
本発明の方法は、試料溶液が生体由来のものである場合には、工程(a)の前に、試料溶液に除タンパク剤を添加することによりタンパク質を含む不純物を分離する工程を含むことができる。
【0008】
本発明の方法は、好ましくは工程(a)において、マイクロウェーブオーブンを用いて試料溶液を加熱することができる。
【0009】
本発明の方法は、工程(c)において、室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択されるアルカリ化剤を添加することにより工程(b)からの溶液をアルカリ性にすることが好ましい。
【0010】
本発明はまた、本発明のp−アミノフェノール誘導体の検出方法において検出対象とされるp−アミノフェノール誘導体の検出キットであって、p−アミノフェノール誘導体を分解させるための無機酸または有機酸を含む分解試薬、本発明の発色剤を含む発色試薬、およびアルカリ化剤を含むアルカリ化試薬を備えるキットが提供される。
【0011】
本発明のキットは、さらに除タンパク剤を含む除タンパク試薬を備えることができる。
【0012】
本発明のキットにおいて、アルカリ化剤は好ましくは室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択される。
【0013】
本発明において、発色剤は2,6−キシレノールであることが好ましい。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0015】
本発明は、試料中に存在するp−アミノフェノール誘導体を、酸性条件下で分解し、生じるp−ヒドロキシアニリンを特定の発色剤とアルカリ性条件下で反応させて発色させることにより検出するものである。
【0016】
本発明で検出し得るp−アミノフェノール誘導体は、式(I)
【化10】
で示すことができる。式(I)においてR1は水素、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基である。低級アルキル基(カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む)としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、R2は水素、硫酸残基、またはグルクロン酸残基を表す。ただし、R1とR2が同時に水素であることはない。
【0017】
本発明において用いられる検体試料は、血液やその成分(血清、血漿等)、胃液等の体内分泌物、尿等の排泄物、および吐瀉物などの生体由来の試料、並びに飲料水および河川水などの環境由来の試料を含む。
【0018】
本発明に係るp−アミノフェノール誘導体の検出方法においては、試料を酸性条件下に置いて試料中のp−アミノフェノール誘導体を分解させる分解剤、p−アミノフェノール誘導体が分解して生じるp−ヒドロキシアニリンと反応させる発色剤、および発色反応液をアルカリ条件下に置くためのアルカリ化剤を用いる。これらの試薬は好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができる。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、2−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【0019】
分解剤としては無機酸および/または有機酸を用いることができる。好ましくは塩酸、硫酸、または硝酸を用い、1〜10重量%の濃度で使用することが望ましい。
【0020】
発色剤には、式(II)
【化11】
で示されるフェノール化合物が含まれる。式(II)において、Xはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、低級アルキル基、または低級アルキル基の結合したカルボニル基であり、nは1〜4の整数を表す。ただし、n=1のときXがメチル基であることはない。低級アルキル基(カルボニル基に結合した低級アルキル基も含む)としては直鎖であっても分枝鎖であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。また、発色剤には式(III)
【化12】
で示されるα−ナフトール化合物も含まれる。式(III)において、XおよびYはそれぞれ独立に水素、ハロゲン原子、ニトロ基、または低級アルキル基であり、aは1〜3の整数を、bは1〜4の整数をそれぞれ表す。低級アルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、およびブチル基等のC1〜C10の直鎖または分枝鎖のアルキル基を例示することができる。発色剤としては、好ましくは悪臭が無く、危険物に指定されていない2,6−キシレノールを用いる。これらの発色剤は、試料1mlあたり0.1mg〜50mgの範囲で使用されることが好ましい。p−アミノフェノールはこれら発色剤と反応してインドフェノール類(青色)を生成する。
【0021】
アルカリ化剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウムなどの室温(20℃)で固体の無機塩基、または式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類を使用し、好ましくは1M水酸化ナトリウム水溶液を用いる。
【0022】
また、検体試料が生体由来のものである場合には、前述した試薬に加えてさらに、試料中のタンパク質を予め分離・除去するための除タンパク剤を用いる。除タンパク剤には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、およびジメチルスルホキシドのような有機溶剤、塩酸、硫酸、過塩素酸、タングステン酸、メタリン酸、およびモリブデン酸のような無機酸、スルホサリチル酸、トリクロロ酢酸、およびピクリン酸のような有機酸、並びに硫酸アンモニウム、スルホン酸銅、タングステン酸ナトリウム、および水酸化亜鉛などの塩類が含まれ、好ましくはトリクロロ酢酸を用いる。これらの除タンパク剤は、好適な溶媒に溶解させた溶液としても使用することができ、1〜10重量%の濃度で使用することが好ましい。好ましい溶媒は、水、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、プロパノール、2−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの水に溶解性のある溶媒である。
【0023】
より具体的には、本発明に係る検出方法は、次のように行うことができる。まず、検体試料が生体由来のものである場合には、ガラスおよびポリプロピレンなどの試験管に検体試料を入れ、除タンパク剤を加えて充分に撹拌し、好ましくは遠心分離器を用いて(3,000rpm,5分間)タンパク質などの不純物を除去する。不純物を分離後、上清を別の試験管に移し、これを検査試料として用いる。試料溶液に分解剤を添加して溶液を酸性にし、p−アミノフェノール誘導体を分解させる。反応は室温から100℃の温度で5〜30分間で行うことができ、100℃で20分間加熱することが好ましい。反応時間を短縮するためにはマイクロウェーブオーブンを用いて加熱することが好ましい。この場合出力350〜500Wにて30秒〜2分間加熱することで充分である。マイクロウェーブオーブンに関しては、市販の電子レンジで代用することも可能である。放冷後、発色剤とアルカリ化剤を順次加えて撹拌する。このとき得られる反応溶液はpH8〜14であることが好ましく、pH10以上であることがより好ましい。反応は室温から100℃の温度で行うことができるが、室温でも十分に反応は進行するため、室温で行うことが望ましい。この反応後、発色に基づいて試料中のp−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する。p−アミノフェノール誘導体の存在の有無は目視による着色(青色)の有無で判定できる(定性的検出)。p−アミノフェノール誘導体を定量的に検出するためには、分光光度計を用いて波長600〜620nmにおける吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線と比較することによって濃度を決定する。また、色彩表を用いた目視検査により判定することもできる。
【0024】
本発明に係るp−アミノフェノール誘導体の検出キットには、上述した検出方法において用いられる各試薬が備えられる。各試薬は、通常、個別にパッケージされている。
【0025】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0026】
実施例1
血清0.5mlに5重量%のトリクロロ酢酸0.5mlを加えて良く撹拌した。この混合液を3,000rpmで5分間遠心分離した。得られた上清0.65mlをネジ口付の試験管に移し、塩酸20μlを加えて蓋をした。試験管を100℃で20分間加温した(あるいは、350W出力のマイクロウェーブオーブンで2分間、マイクロウェーブを照射した)。放冷後、1重量%の2,6−キシレノール0.5mlと1M水酸化ナトリウム水溶液0.5mlを加えて撹拌した。5分後に分光光度計を使用して620nmでの吸収を測定した。種々の濃度のp−アミノフェノール誘導体を含む血清試料について同検査を行った結果を表1に示す。
【0027】
【表1】
【0028】
本方法での血清中p−アミノフェノール誘導体の検出下限は10μg/mlであり、200μg/mlまで定量性が確認された。また、この方法によれば、肝障害の治療域(10〜20μg/ml)においても十分に目視的に着色を確認することができた。よって、本方法は、救急の場において利用可能であるといえる。
【0029】
実施例2
p−アセトアミドフェノールを大量に服用して急性中毒を起こした患者より得られた血清を使用して、実施例1と同じ方法で試料を調製し、吸光度を測定した。測定値をあらかじめ作成しておいた検量線と比較することによって血清中のp−アミノフェノール誘導体の濃度を決定した。なお、定量精度を高めるために、比較対照として、事前にp−アセトアミドフェノールが200μg/mlの濃度となるように調製した血清試料も同時に検査し、その吸収度を基に検量線を補正した。この補正した検量線に基づいて、患者由来の血清中のp−アセトアミドフェノールの濃度は13.0μg/mlと決定された。なお本発明の方法ではp−アセトアミドフェノールとその代謝物を含めてそれらの濃度が測定される。参考として、p−アミノフェノール誘導体自体の濃度のみが測定される機器分析法により同じ試料を測定したところ、9.6μg/mlであった。本発明の方法は簡便で精度の高い検査法であることが確認された。
【0030】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、操作性に優れかつ安全性の高い薬品を使用して試料溶液中に含まれているp−アミノフェノール誘導体を簡便な操作で、迅速かつ確実に検出することができる。
Claims (9)
- 式(I)
(a)試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を分解してp−ヒドロキシアニリンを生成させるために試料溶液を酸性条件下に置く工程、
(b)前記工程(a)からの溶液に式(II)
(c)前記p−ヒドロキシアニリンと発色剤を反応させて発色させるために前記工程(b)からの溶液をアルカリ条件下に置く工程、および
(d)前記発色に基づいて前記試料溶液中のp−アミノフェノール誘導体を定性的または定量的に検出する工程
を含むことを特徴とする検出方法。 - 前記試料溶液が生体由来のものであり、前記工程(a)の前に、該試料溶液に除タンパク剤を添加することによりタンパク質を含む不純物を分離する工程を含む請求項1記載の方法。
- 前記工程(a)において、マイクロウェーブオーブンを用いて前記反応溶液を加熱することを特徴とする請求項1または2記載の方法。
- 前記工程(c)において、室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択されるアルカリ化剤を添加することにより前記工程(b)からの溶液をアルカリ性にすることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項記載の方法。
- 前記発色剤が2,6−キシレノールである請求項1ないし4のいずれか1項記載の方法。
- 式(I)
前記p−アミノフェノール誘導体を分解させるための無機酸または有機酸を含む分解試薬、
式(II)
アルカリ化剤を含むアルカリ化試薬
を備えるキット。 - 前記キットがさらに除タンパク剤を含む除タンパク試薬を備える請求項6記載のキット。
- 前記アルカリ化剤が室温(20℃)で固体の無機塩基および式Ra−NH(3−a)(ここで、aは1〜3の整数を表す)で示される有機アミン類からなる群の中から選択されることを特徴とする請求項6または7記載のキット。
- 前記発色剤が2,6−キシレノールである請求項6ないし8のいずれか1項記載のキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001395178A JP3658621B2 (ja) | 2001-12-26 | 2001-12-26 | p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001395178A JP3658621B2 (ja) | 2001-12-26 | 2001-12-26 | p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003194801A JP2003194801A (ja) | 2003-07-09 |
JP3658621B2 true JP3658621B2 (ja) | 2005-06-08 |
Family
ID=27601673
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001395178A Expired - Lifetime JP3658621B2 (ja) | 2001-12-26 | 2001-12-26 | p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3658621B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8236519B2 (en) * | 2008-04-28 | 2012-08-07 | Sekisui Diagnostics, Llc | Acetaminophen assay kit |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7330516B2 (ja) * | 2018-03-21 | 2023-08-22 | 池田食研株式会社 | 2-アミノフェノール類の測定方法 |
-
2001
- 2001-12-26 JP JP2001395178A patent/JP3658621B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8236519B2 (en) * | 2008-04-28 | 2012-08-07 | Sekisui Diagnostics, Llc | Acetaminophen assay kit |
US8715952B2 (en) | 2008-04-28 | 2014-05-06 | Sekisui Diagnostics Llc | Acetaminophen assay |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2003194801A (ja) | 2003-07-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hawkins et al. | Quantification of protein modification by oxidants | |
JPH05223825A (ja) | メロシアニンタンパク質誤差指示薬 | |
JP3658621B2 (ja) | p−アミノフェノール誘導体の検出方法および検出キット | |
JP3955911B2 (ja) | 尿中のアルブミン測定方法、尿中のアルブミン測定用指示薬、および尿中のアルブミン測定用試験片 | |
WO1999004258A1 (en) | Assay for total and direct bilirubin | |
JP5938713B2 (ja) | ヘモグロビンの高感度測定法と試薬 | |
CN111304282A (zh) | 一种尿液酪氨酸的检测试剂盒 | |
US4074972A (en) | Urea assay | |
Knight et al. | Improved colorimetry of urinary 3-methoxy-4-hydroxyphenylacetic acid (homovanillic acid). | |
RU2589845C2 (ru) | Способ количественного определения метилкарбаматных производных бензимидазола | |
CN108801993A (zh) | 一种快速高选择性分析次氯酸的试剂盒 | |
Stevens | Electrothermal atomic absorption determination of aluminum in tissues dissolved in tetramethyl ammonium hydroxide. | |
JP2002131232A (ja) | ヒドロキシプロリンの検出方法および検出用キット | |
JP4916003B2 (ja) | アクロレイン及び/又はアクロレイン付加物を検出するための試薬及び方法 | |
EP1664771A2 (en) | A method for qualitative and/or quantitative detection of polyethylene glycols in biological fluids | |
US5736408A (en) | Method for the detection of urobilinogen in urine on an automated analyzer | |
US3348920A (en) | Reagent and method for the quantitative determination of bilirubin | |
SU1721481A1 (ru) | Способ количественного определени ремантадина | |
Bieniek et al. | Thin-layer chromatography of hippuric and m-methylhippuric acid in urine after mixed exposure to toluene and xylene. | |
GR20160100569A (el) | Μεθοδος για τη φθορισμομετρικη ανιχνευση και/ή ποροστικοποιηση των πρωτεϊνικων καρβονυλομαδων | |
JP7372145B2 (ja) | 表面に結合されたアミノ基の定量方法 | |
SU1506338A1 (ru) | Способ количественного определени тропафена | |
JP3733704B2 (ja) | 直接型ビリルビンの測定方法及び測定用キット | |
RU2090865C1 (ru) | Способ определения изопропилнитрата в сточной воде | |
RU1806350C (ru) | Способ количественного определени трисамина |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20040712 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3658621 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |