CN1687786A - 全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外诊断试剂。它是一种全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒。消除了δ B对结果的干扰。该试剂盒由试剂1(R1)和试剂2(R2)组成。本发明的试剂盒解决了试剂在液态条件下的稳定性，节省制药设备，简化工艺流程，并免除了在临用前加水复溶重组的步骤，提高了试剂盒的实用性和普及性，有较大的临床应用价值。
Description
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断试剂，具体涉及全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒。
背景技术：
人血清(浆)中的胆红素包括游离胆红素(UB)、结合胆红素(CB)和δ-胆红素(δB)，统称为总胆红素。在肝胆分泌障碍的发生、发展和恢复过程中，血清CB浓度随病程进展而迅速升降，血清CB测定因此成为监测肝胆分泌功能的重要指标。以往常规测定血清胆红素的方法，不能区分CB和δB。虽然高效液相层析可以分离CB、δB，但无法常规使用；干化学法崭露了CB测定的应用前景，但还是因为方法的局限性而难以普及。因此长期来，临床上一直以直接胆红素(DB)作为反映CB水平的替代指标。从而在一定程度上出现了DB和CB概念的混淆。实际上DB中还包含了δB的极大部分。对于肝胆分泌功能障碍病人来说，血清中CB迅速升高，δB形成滞后；δB一旦形成后，在血液循环中的潴留时间又远远长于CB；当这些病人的肝胆分泌功能恢复后，血清中CB很快下降，δB下降却相对缓慢。如果用DB代替CB进行临床监护，由于受到δB的干抚，在肝胆分泌障碍的发生、发展和恢复过程中，不能灵敏地反映出血清中真实CB水平的即时改变，不能对病程的进展及时作出判断，降低了实验室检查对疾病诊断、监护的及时性和敏感性。
在这种情况下，迫切需要创建一种能消除δB干扰、反映血清CB真实水平的常规测定方法，也由此成了众多学者关注的热点。目前用胆红素氧化酶(BO)为工具酶的若干测定方法(酶法)已逐渐有报道，但尚无商品试剂盒可供使用。
本发明人曾于2003年研制了酶法结合胆红素测定试剂盒，采用冻干技术，该技术是在临用前加水复溶重组后再使用。
发明内容：
本发明所要解决的问题在于保持冻干型酶法结合胆红素测定的基本技术性能，解决试剂在液态条件下的稳定性，制成全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒，省去制备冻干型试剂盒所需的昂贵的冻干设备，消除由于分装冻干引入的瓶间误差，简化生产工艺流程，减少能源和人力消耗，免除须在临用前加水复溶重组的步骤，提高试剂盒的实用性和可普及性。
本发明人根据下列原则对反应体系进行选择：
1.提高液态条件下试剂的稳定性，使全液体型酶法真实结合胆红素测定试剂盒4℃保存的稳定期达到一年；
2.用浓度约为150μmol/L的CB校准品[用二牛磺酸胆红素(DTB)配制]作样品，在方法规定的反应条件下经BO作用300秒，吸光度的下降值不小于最大下降值的90％，即在此条件下DTB的氧化率≥90％；
3.使UB的干扰尽可能小。
本发明提供了一种全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒。该试剂盒包括试剂1和试剂2组成。
在试剂中的各组份及其浓度范围如下：
试剂1(R1)[由试剂1a(R1a)和试剂1b(R1b)组成]：
R1a：
苯二钾酸氢钾(PHP) 50～200mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 0.05～0.2mmol/L
对甲基苯磺酸(PTS) 10～100mmol/L
氟化钠(NaF) 1～5mmol/L
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 0.5～5mmol/L
R1b：
抗坏血酸氧化酶(ASOD) 20～1000kU/L
甘油 10～50％(V/V)
或乙二醇 10～40％(V/V)
试剂2(R2)：
胆红素氧化酶(BO) 0.5kU～20kU/L
甘油 10～50％(V/V)
或乙二醇 10～40％(V/V)
用本发明的全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒能通过下列方法测定CB(结合胆红素)
温度 37℃ 光径1cm 波长450nm或460nm
样品 132μl R1 3000μl R2 300μl
水校零 吸光度变化方向：下降
样品(校准管以校准品作样品)加R1孵育300秒，加R2再孵育300秒(也可在60～300秒之间选择)；加R2前读取吸光度记为A1，加R2后在达到选定的再孵育时间时读取吸光度记为A2：
计算：
CB(μmol/L)＝[(测定A1-测定A2)/(校准A1-校准A2)]
×校准品浓度
本发明的试剂盒具有下列特点：
1.研制成功了以BO作工具酶的液体型酶法结合胆红素测定试剂盒；通过热稳定性试验，经Arrhenius公式计算，本试剂盒4℃保存的稳定期达一年以上；
2.用146.04μmol/L的CB校准品作样品，37℃与R1作用300秒，加R2再孵育300秒时吸光度的下降值达最大下降值的95％以上，即DTB的氧化率已达到≥90％的预期效果；
3.消除了δB对结果的干扰；UB对结果的干扰＜5％～＜10％；对溶血、脂浊以及样品中抗坏血酸具有较好的抗干扰能力。
4.最低检测限：0.07μmol/L
批内精密度：CV＝1.23％(x＝146.04μmol/L；s＝1.80；n＝10)
天间精密度：CV＝4.45％(
x＝146.04μmol/L；s＝6.50；n＝8)
线性范围： 0～342μmol/L
参考范围： 0～3.42mol/L；
5.比较试验：本试剂盒测定结果与Doumas报道的CB测定法的结果进行比较，两者显著相关：r＝0.987；y＝0.985X+3.1
y为本试剂盒测定结果，x为Doumas法结果，均以μmol/L计算。
6.本试剂盒可用于有恒温装置的分光光度计和自动生化分析仪，或类似仪器。
7、本试剂盒筒化了生产工艺流程，降低了成本，并免除了在临用前加水复溶重组的步骤，提高试剂盒的实用性和普及性。
七.实施例：
例一
试剂1(R1)[临用前由R1a∶R1b以100∶1混合组成]：
R1a：
苯二钾酸氢钾(PHP) 80mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 0.1mmol/L
对甲基苯磺酸(PTS) 20mmol/L
氟化钠(NaF) 1.5mmol/L
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 3.5mmol/L
R1b：
抗坏血酸氧化酶(ASOD) 1000kU/L
甘油 500ml/L(V/V)
试剂2(R2)：
胆红素氧化酶(BO) 5kU/L
甘油 500ml/L(V/V)
例二
试剂1(R1)[临用前由R1a∶R1b以20∶1混合组成]：
R1a：
苯二钾酸氢钾(PHP) 80mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 0.1mmol/L
对甲基苯磺酸(PTS) 20mmol/L
氟化钠(NaF) 1.5mmol/L
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 3.5mmol/L
R1b：
抗坏血酸氧化酶(ASOD) 40kU/L
乙二醇 200ml/L
试剂2(R2)：
胆红素氧化酶(BO) 10kU/L
乙二醇 200ml/L
例三
试剂1(R1)[临用前由R1a∶R1b以100∶1混合组成]：
R1a：
苯二钾酸氢钾(PHP) 120mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 0.15mmol/L
对甲基苯磺酸(PTS) 100mmol/L
氟化钠(NaF) 3mmol/L
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 2mmol/L
R1b：
抗坏血酸氧化酶(ASOD) 500kU/L
甘油 400ml/L
试剂2(R2)：
胆红素氧化酶(BO) 12kU/L
甘油 400ml/L
例四
试剂1(R1)[临用前由R1a∶R1b以20∶1混合组成]：
R1a：
苯二钾酸氢钾(PHP) 120mmol/L
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2) 0.15mmol/L
对甲基苯磺酸(PTS) 50mmol/L
氟化钠(NaF) 3mmol/L
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 2mmol/L
R1b：
抗坏血酸氧化酶(ASOD) 40kU/L
乙二醇 300ml/L
试剂2(R2)：
胆红素氧化酶(BO) 10kU/L
乙二醇 300ml/L
Claims (3)
1、一种全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒，其特征在于该试剂盒由试剂1和试剂2组成，它们的各组份和浓度为：
试剂1由试剂1a和试剂1b组成：
试剂1a：
苯二钾酸氢钾 50～200mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.05～0.2mmol/L
对甲基苯磺酸 10～100mmol/L
氟化钠 1～5mmol/L
N-乙酰半胱氨酸 0.5～5mmol/L
试剂1b：
抗坏血酸氧化酶 20～1000kU/L
甘油 10～50％(V/V)
或 乙二醇 10～40％(V/V)
试剂2：
胆红素氧化酶 0.5kU～20kU/L
甘油 10～50％(V/V)
或 乙二醇 10～40％(V/V)。
2、根据权利要求1所述的一种全液体型酶法结合胆红素测定试剂盒，其特征在于试剂盒中所述的试剂1由试剂1a和试剂1b混合而组成的，它们的混合配比为20～100∶1。
3、根据权利要求2所述由试剂1a和试剂1b混合而组成的试剂1，其特征在于其中所述试剂1a和试剂1b的混合是在测定临用前进行的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |