JPS59130198A - ビリルビン測定試薬および測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素およびフェリシアン化カリウムを併用し
た総ビリルビンおよび直接ビリルビンの測定用試薬なら
びに測定法に関する。

血清中のビリルビンの測定は、肝胆道系疾患等の診断の
指標として臨床上極めて古くから行なわれておシ、臨床
検査の最も普ｉ扇的かつ不可欠な測定項目の１つとなっ
ている。

ビリルビンは生体内邑素の代表的なものであって、主と
して老廃赤血球の崩壊により生成された血色素より生ず
る。この遊ｔＳｔ型ビリルビンは蛋白結合型となったり
、または肝臓のミクロソームでビリルビンの抱合酵素に
よって抱合（直接）型ビリルビンとなシ肝細胞より胆汁
中に排泄される。

腸管内に排泄されたビリルビンは一部吸収されて腸肝循
環をするが、大部分はウロビリン体となって体外に排泄
される。血清ビリルビンの上昇はこの生成から排泄への
流れが障害により、または愛化したことにより生ずるも
のであって、これらが著しくなると黄遁となる。

ビリルビンには前記の抱合（直接）型と非抱合（間接）
型があるが、直接ビリルビンは間接ビリルピンの側鎖の
プロピオン基に１まだは２のグルクロン酸が結合したも
のであって、これら直接ビリルビンと間接ビリルビンを
合わせて総ビリルヒパンと称している。

コノような血清ビリルビンの測定法として１ｄ、一般に
、エベリンーマロイ（Ｅｖｅｌｙｎ−Ｍａｌｌｏｙ）ら
によるジアゾ試薬による比色法が採用されている。

こめ方法では直接ビリルビンのうちのジグルりｌフナイ
ドについてはジアゾ反応が速やかに進行しくそのだめ、
このものを１分ビリルビンとも称す）、一方モノグルク
ロナイドについては反応が遅く（そのだめ遅延直接反応
ビリルビンとも呼ばれる）、そのためジアゾ反応時間を
正確に規定しないと直接ビリルビンの正確かつ精密な測
定かできない欠点を有している。

最近、酵素を用いたビリルビンの測定法が開発され、例
えば、ヤコブソンらによる過酸化水素とパーオキシダー
ゼによる方法［Ｊａｃｏｂｓｏｎ、　Ｇ、ＩｋＷｅｎｎ
ｂｅｒｇ、ＲｌＰ、；Ｃ１ｉｎ、ＣＣ１１ｅ、　、　２
０　、７８３　（１９７４）”ｉ参照〕、タイ−ウィン
・つらによるきのこ由来のビリルビンオキシダーゼを用
いるビリルビンの黄色色調の減少を測定する方法（特開
昭５６−２７６５６号）があり、さらに材用らはビリル
ビンオキシダーゼがミロセシウム属（Ｍｙ　ｒ　ｏ　−
ｔｈｅｃｉｕｍ）の微生物より得られることを報告して
いる［Ｍｕｒａｏ、別＆　Ｔａｎａｋａ　、Ｎ−；Ａｇ
ｒ　１ｃａ１．１３ｉｏ１　。

Ｃｈｅｍ、、旦、２３８３　（１９８１年）および特開
昭５７−１５９４８７号を参照〕。

このような酵素法はビリルビン測定の正確性、分析精度
などの点で優れたものではあるが、通常、１単位／テス
ト以上の酵素を必要とするので試薬の価格が高く、この
点で満足できるものではない。

ここに本発明石らは前記問題点に鑑み、低部で正確かつ
迅速にビリルビンを定量する方法について鋭意検討を行
なった結果、ビリルビンオキシダーゼにフェリシアン化
カリウムを併用するときにより、オキシダーゼの用量を
著しく減少しうろことを見出し本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明はビリルビンオキシダーゼ、特にミロ
セシウム属微生物由来のビリルビンオキシダーゼと共に
フェリシアン化カリウムを酸化剤として用い、た併用法
による総ビリルビンおよび直接ビリルビンの測定法なら
びにその測定用試薬を提供するものである。

本発明によるビリルビンの測定は、ビリルビン含有検体
に緩衝液を加え、予加温後、フェリシアン化カリウムを
含むビリルビンオキシダーゼ液を加え黄色のビリルビン
を酸化１〜で緑色のビリベルジンに変え、これによる黄
色の減少を比色法によって測定することによｌ）行なわ
れる。なお、木発明者らの研究によれば、反応液のｐＩ
−１を′Ａ節することによシ聡ビリルビンのみならず直
接ビリルビンも測定し得ることがわかった。すなわち、
ｐＨ６〜９において１途ビリルビンが、またｐＨ３，５
〜４．５において直接ビリルビンが測定され得る。

ここで用いられる緩衝液としては、総ビリルビン測定用
には、例えば０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝（ｇｔ、−ｉ、
たはｏ、　ＩＭ　トＩＪスー塩酸緩術液に直接化剤とし
てコール酸ナトリウム、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、ＬＢＳ　（ラウリルベンゼン硫酸塩）などを含
有させたものが挙げられる。また直接ビリルビン測定用
としては、０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．ＩＭ酒石酸Ｒ
衝ｅなどが用いられる。

検体に緩１衡液を加えた後の予加温は、２５〜４５°Ｃ
で１〜１０分、好ましくは３７°Ｃで３分間行ない、次
にビリルビンオキシダーゼ及びフェリシアン化カリウム
を含む酵素試薬を加えて２５〜４５°Ｃで５〜２０分、
好ましくは３７°Ｃで１０分間酸化反応を行う。

本発明によれば、ビリルビンオキシダーゼの用量は、フ
ェリシアン化カリウムの併用により、公知法における用
量よりも犬きく低減することができ、０００５〜１単位
／テスト、好ましくは０．０］〜０．５単位／テストの
範囲である。寸だフェリシアン化カリウムの川石は０．
　Ｏ０５〜ｌ　ｍＭ　／テスト、好ましくは０．０１〜
０．２　ｍＭ　／テストの範囲である。ビリルビンオキ
シダーゼの用量が０．００５単位／テストよシ少ないと
反応完結に長時間を要するとともにフェリシアン化カリ
ウムの用量が増大し、一方１彫位／テストを超えても効
果が飽和し経済的でない。まだフェリシアン化カリウム
の用量が０．００５ｍＭ／テストよυ少ないと反応回度
が遅く実用的でなくなシ、一方ｌ　ｍＭ　／テストを超
えると色調か濃くなシ、ブランクの光学的密度が上昇し
好ましくない。

比色定量は常法によって行なわれ、例えば、市販の分光
）を度肝（例えば島原２２０型ダフルビーム分光光度計
）を用い、波長４６０　ｎｍにて試薬ブランクを対照に
して光度的密度を測定する。なお、この際、対照として
一定量（既知濃度）のビリルビン含有血清（以下、標準
ビリルビンという）を用いて同様に光学的密度を測定し
、さらに盲検としてこれら検体血清および標準ビリルビ
ンにビリルビンオキシダーゼを含まない緩衝液を添加し
たものについて同様に光学的密度を測定し、これらのデ
ータに基づいて下記式により検体血清中のビリルビン濃
度（〃ｒｇ／　ｄ　ｌ　）を算出する１゜（ｙｔｔｇ／
ｒＪｌ）　　　　　ＳＢ　　ＳＴ式中、ＡＢ　：検体血
清の光学的密度（盲検）ＡＴ：検体血清の光学的密度（
酵素反応したもの） ＡｓＢ：標準ビリルビンの光学的密度（盲検）ＡｓＴ：
標準ビリルビンの光学的密度（酵素反応したもの） Ｘ　：標準ビリルビン中のビリルビン濃度（ｙｔｔｙ　
／　ｄ　ｌ　） 上記測定操作をさらに具体的に説明すると、検体血清に
緩衝液〔例えば０．２５％コール酸ナトリウム含有０．
１．　Ｍリン酸緩衝ｇｌｆ（ｐＨ７，０））を加え、こ
れをインキュベート（例えば３７°Ｃ１３分間）し、こ
の溶液に所定量のフェリシアン化カリウムとビリルビン
オキシダーゼを含む酵素試薬（例えばフェリシアン化カ
リウムＱ、　ｌ　ｍ　Ｍ　／テスト、ビリルビンオキシ
ダーゼ０．０２５単位／テスト）を添加して、例えば３
７°Ｃで１０分間酸化する。

これを試薬ブランクを対照にして波長４６００ｍで光学
的密度（ＡＴ）を測定する。一方、上記酵素試薬を加え
ない以外は同様の操作を行ない光学的密度（Ａ１３）を
測定する。

さらに、上記検体血清に代えて標準ビリルビンを用い、
上記と同様に操作をイ１ない光学的密度ＡＳ’ｌ−およ
びＡｓ１３を」り定する。

本発明のビリルビン測定用試薬は、通常、（ｉ）ビリル
ビンオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムを含ま
ない緩衝液、 （ｉｉ）ビリルビンオキシダー、ゼおよびフェリシアン
化カリウムを含有する酵素試薬、および （ＩＮ）一定量のビリルビン含有血清（標イイとビリル
ビン）からなるキットとして構成される。

以１ｉホベだととく、本発明によれば、酵素とフェリシ
アン化カリウムの併用効果により高価な酵素の使用量を
従来の方法に比し著しく減少することができるとともに
、反応完了が迅速となり自動分析機への適用が可能とな
つ２’ｌ　。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１（総ビリルビンの測定） 測定方法： 検体血清１００μ４にコール酸すＩ−ＩＪウム０．２５
％を含有する。、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ−Ｉ　７．０
　）約３　ｍｌを加え３７°Ｃで２〜３分間予加温後、
これに上記と同じ緩衝液に０．０１ｍＭ／テストまだば
Ｑ、１ｍＭ／テストフェリシアン化カリウムおよびビリ
ルビンオキシダーゼ０．０２５単位／テストを溶かした
酵素試液７０μｌを加え、３７°Ｃで１０分間反応させ
る。つぎにこの反応液を試薬ブランク（前記緩衝液と酵
素試薬との混合液を検体と同様に処理）を対照に波長４
６０１ｍで光学的密度を測定する。同時に検体ブランク
（前記検体と緩衝液との混合液を同様に処理したもの）
を該緩衝ｉ液を対照として同様に光学的密度を７測定す
る。

実験１（再現性） 患者血清（検体１．２）および標準血清（ＤＡＤＥ７４
二製ヒ゛リルビ゛ンコントロール、２０’Ｊ’！／ｄβ
）につき、耐Ｊ記測定方法に記載の試薬（酵素試薬中の
フェリシアン化カリウム濃度はＱ、Ｑ１ｍＭ／テストお
よびＱ、　１　ｍ　Ｍ　／テスト）並びに操作により光
学的密度を測定した。１０回くり返した結果を＠１表に
示す。

第１表 これから明らかなごとく、いずれも良好な再現性を示し
ており、本発明方法の精度の高いことが確認された。

実＠２（検量線） Ｆ）ｉＪ記と同じ標準血清（２０＋’ｌｙ／ｄβ）を段
階希釈２ （／４．／４，３／４，４／４）し、前記測定か法に記
載の試薬（酵素試薬中のフェリシアン化カリ’）ム？ｍ
６ｔｄ：、０．０１　＋ＯＭ／７スト、Ｑ、　ｌ　ｔｎ
　Ｍ　／テスト）並びに操作により光学的密度を測定し
た。この結果を第１図（フェリシアン化カリウム００１
ｍ　Ｍ　／　７　スト）および第２図（同０．１ｍＭ／
テスト）に示す。図より明らかなごとく、はぼ原点を通
る直線が得られた。

実験３（相関関係） 前記測定方法に記載の試薬（酵素試薬中のフェリシアン
化カリウム濃度は０．０１ｍＭ／テスト、Ｑ、　］　ｍ
　Ｍ　／テスト）並びに操作により、患者血清２１検体
につき実験１と同様の操作を行なって光学的密度を求め
た。一方、同じ血清検体につき、本発明の、試薬の代わ
シに従来より一般に使用のビリルビンキット−Ｎ（日本
商事（株）製）を用いて同様の操作を行ない光学的密度
を得だ。本方法の標準血清としてはＤＡＤＥ社製ビリル
ビンコントロール（２０Ｔｎｙ／ｄｌ）を用いた。これ
らよシ、各測定値を求め本発明方法と従来法の間の相関
図を作成した。これをグ５３図（フェリシアン化カリウ
ム０．０１ｍＭ／テスト）および第４図（同０．１ｍ　
Ｍ　／テスト）に示す。

実施例２　（直接ビリルビンの測定） ０．１Ｍクエン酸−ＩＪ　ン酸緩衝ｉＺ　（Ｐ’−１４
，０）　ヲコール酸ナトリウム０．２５％を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の代りに用いて実施例１
の測定方法に従って血清３検体につき直接ビリルビン；
・濃度欠測定した。尚フェリシアン化カリ１クムの濃度
はＱ、１ｍＭ／テストと用い、標準ビリルビンとしては
、直接ビリルビン７、５　ｍＷ／　ｄ　ｌ含有の血清を
用いた。

一方、同じ血清検体の１面接ビリルビンｍ度をビリルビ
ンキラ）−Ｎを用いて定量した。

その結果を第２表に示す。

第　２　表　　　　　　　（単位：　＋ｒｔｙ／ｄ　７
！　）

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、標準血清を段階希釈した場合の
光学的密度との間の直線性を示すグラフ、第３図および
第４図は本発明方法と従来法の間の相関関係を示すグラ
フである。 特許出願人日本商事株式会社 代理人弁理士青山　葆はが２名 第１図 希耘餞饋 第２図 ４耘饋饋 第３図 ： ヒ゛′リルビ゛ンキットＮ＋＝よるｉ＋＋定４直　（ｍ
ｇ／ｄｉ　）第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ケ）ビリルビンオキシダーゼにフェリシアン化カリウム
   を配介したことを特徴とするビリルビン測定用試薬。 （２１ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属菌生物
   由来のビリルビンオキシダーゼである前記第（１）項の
   試薬。 （３）ビリルビンオキシダーゼを０．００５〜１単位／
   テスト、フェリシアン化カリウムを０．００５〜１ｍＭ
   ／　テスト配介した前記第（１）項または第（２）項の
   試薬。 （４）比色定邪法によるビリルビンの測定方法にお、い
   て、検体にビリルビンオキシダーゼおよび７エリシアン
   化カリウムを作用させてビリルビンを酸ｆヒすることを
   特徴とするビリルビンの定量法。