JPH03187400A - ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、臨床検査上有用なビリルビンの光学的測定法
および測定用試薬、さらに詳しくは、ビリルビン含有検
体を、緩衝液中、亜鉛化合物、発色剤およびビリルビン
オキシダーゼを反応させることを特徴とするビリルビン
、とくに総ビリルビンおよび直接ビリルビンを光学的に
測定する方法、およびそれに用いる試薬に関する。

従来の技術 ビリルビン（こは抱合（直接）型と非抱合（間接）型が
あり、これら直接ビリルビンと間接ビリルビンを合わせ
て、総ビリルビンと称している。一般に、臨床検査で測
定されるビリルビンは総ビリルビンと直接ビリルビンで
あり、間接ビリルビンはこれらの差として求められてい
る。ビリルビンと病態との関係は例えば急性閉塞性黄痘
では血中に直接ビリルビンが増加する。一方、溶血性貧
血では間接ビリルビンが増加する。従って、総ビリルビ
ン、直接ビリルビンの正確な定量は臨床検査上不可欠で
ある。

このような血清ビリルビンの測定法としては、一般にエ
ベリンーマロイ（Ｅｖｅｌｙｎ−Ｍａｌｌｏｙ）法やミ
ハエルソン（Ｍ　ｆｃｈａｅｌｓｓｏｎ）法によるジア
ゾ試薬による比色法が採用されているが、この方法では
反応の特異性、操作の煩雑性などの欠点がある。

最近、酵素を用いた総ビリルビンの測定が開発されてお
り、例えばアガリカス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ
　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）の由来のビリルビンオキシダーゼ
を用いる測定法（特公昭５Ｂ−１１１９４号）、ミロセ
シウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）由来のビリルビン
オキシダーゼを用いる測定法（特開昭５９１７９９９号
）およびエビタケ（Ｔ　ｒａｃｈｙｄｅｒｍａｔｓｕｎ
ｏｄａｅ）由来のビリルビンオキシダーゼＭ−１を用い
る測定法（特開昭６０−２４９０６０号）などがある。

さらに、この酵素法による直接ビリルビンの測定法も開
発されている（特公昭６１−４４０００号）。この酵素
法は、ビリルビンオキシダーゼをビリルビン含有検体に
作用させて、生じるビリルビンの黄色色調の減少を光学
的に測定する方法であって、反応の特異性により正確な
どリルビンの定量が可能である点で化学的方法より優れ
た方法であるが、盲検を必要とする欠点がある。

また、酵素での反応に際して発色剤を用いてビリルビン
を発色させる発色法による総ビリルビンの測定法も開発
されており、例えば、発色剤として３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノン−ヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を用い、こ
れとビリルビンオキシダーゼＭ−１を作用させて赤色色
素を生成させたのち、塩酸などの強酸を用いて酸性にし
て生成する青色色素を光学的に測定することによりビリ
ルビンを定量する方法（特開昭６１−３１０９６号）、
さらに他のビリルビンオキシダーゼを用いて同様に処理
するビリルビンの定量法（特開昭６２−■１２０６８号
）などが知られている。

さらに上記発色法における酵素の代わりに塩化第二鉄を
用いる化学的発色法によるビリルビンの測定法も提案さ
れている［Ｊ　、　Ｆｏｇ、　Ｎａｔｕｒｅｌ　９５、
　４９０（１９６２）コ。

このような発色法によるビリルビンの測定法においては
検体盲検が不要であるため、この点ではビリルビンの黄
色色調の減少を測るいわゆる酵素法よりは優れているが
、反応後の溶液を酸性にする必要があるため操作が煩雑
となり迅速性に欠け、自動分析に適さない欠点がある。

さらに総ビリルビンを測定するにはコール酸ナトリウム
、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの直接化剤の
使用が必要であるが、酸性にした場合、直接化剤が不溶
となって溶液が白濁するため測定が不能となる。

したがって、実際の患者血清についてかかる発色法が総
ビリルビンを測定することができず、また直接ビリルビ
ンの測定もできない。

発明が解決しようとする課題 上述のとおり、従来知られているビリルビンの測定法に
おいては、化学的方法では反応の非特異性、操作の煩雑
性の欠点があり、酵素法では反応の特異性において化学
的方法よりも優れているが、検体盲検を要する欠点があ
り、さらにＭＢＴＨなどの発色剤を用いる発色法では、
検体盲検を必要をしない点では酵素法よりも優れている
が、これを自動分析で行なうには、試薬の安定性を考慮
すると、第１試薬に発色剤を含む緩衝液、第２試薬にビ
リルビンオキシダーゼ、第３試薬に酸性溶液と分けなけ
ればならず、操作も３工程と煩雑であり迅速性に欠け、
さらに最終反応液を強酸酸性とするためコール酸ナトリ
ウム、ＳＤＳなどの直接化剤が不溶となって用いられず
、したがって総ビリルビン、直接ビリルビンの測定がで
きない。

したがって、上記のような欠点のない、総ビリルビン、
直接ビリルビンが容易に測定し得る方法の開発が望まれ
ている。

課題を解決するための手段 本発明者らは、上記のような欠点のない改良されたビリ
ルビンの測定法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、
前記酵素を用いた発色法において、亜鉛化合物の存在下
に、発色剤およびビリルビンオキシダーゼを反応させる
ことにより、反応液を強酸酸性にすることなく安定な緑
色色素が生成し、きわめて容易に測定が可能であり、し
かも緩衝液のｐａｌを適当な範囲に調節することにより
総ビリルビンおよび直接ビリルビンも測定できることを
知り、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ビリルビンの光学的測定法におい
て、ビリルビン含有検体を適当な緩衝液中で、亜鉛化合
物、発色剤およびビリルビンオキシダーゼと反応させる
ことを特徴とするビリルビンの測定法を提供するもので
ある。本発明の他の目的は、緩衝液としてＰＨ６、０〜
９．０の緩衝液を用いて総ビリルビンを測定する方法を
提供することである。本発明のさらに他の目的は、緩衝
液として、ｐＨ３，０〜４．５の緩衝液を用いて直接ビ
リルビンを測定する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、これらの測定法に用いられ
るビリルビン測定用試薬を提供するものである。

本発明によるビリルビンの測定はビリルビン含有検体に
亜鉛化合物と発色剤を含む緩衝液を加え、予加温後、ビ
リルビンオキシダーゼを加えて反応させ、生じた緑色の
生成物を比色法により測定することにより行なわれる。

この方法では、前記特開昭６２−１１２０６８号に記載
の方法のように、反応後に反応液を強酸酸性にする必要
なしに、分子吸光係数の大きい安定した緑色色素が生成
される。また、公知の発色法におけるように、ビリルビ
ンオキシダーゼと発色剤のみを反応させた場合には、非
特異性反応に基づく妨害吸収が認められるが、本発明方
法におけるように、亜鉛化合物の存在下で反応させれば
、その亜鉛化合物がかかる妨害吸収を消去する作用も示
すため、正確なビリルビンの測定が可能となる。

本発明で用いられる亜鉛化合物としては、亜鉛を含有す
る物質であればいずれも使用でき、例えば、酸化亜鉛、
水酸化亜鉛などの亜鉛酸化物、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛など
の無機酸亜鉛、酢酸亜鉛、乳酸亜鉛などの有機酸亜鉛、
フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛などのハ
ロゲン化亜鉛、シアン化亜鉛などが挙げられる。これら
亜鉛化合物は適当な濃度で用いられるが、分子吸光係数
の大きい緑色色素をうるには、反応系中の濃度として、
総ビリルビン測定用には０．０２〜３．０ｍＭ。

好ましくは０．０５〜２．１ｍＭ、直接ビリルビン測定
用には０．１〜３　、　ＯｔａＭｓ好ましくは０．４〜
２　、１　ｍＭの範囲である。

用いられる発色剤としては、前記ＭＢＴＨのほか、２−
ヒドラジノベンゾチアゾール、ｌ−ヒドラジノビタラジ
ン塩酸塩が挙げられ、いずれも安定な緑色色素を生成す
る。発色剤の使用量は所望の発色効果を達成する範囲で
適宜選択されるが、通常０．３〜３０ｍＭの範囲から遣
ばれる。

緩衝液としては亜鉛化合物に対してキレート作用のない
ものであれば、公知のいずれの緩衝液も使用され得るが
、測定する対象が総ビリルビンか直接ビリルビンかによ
ってｐ）（範囲の異なるものが用いられる。

総ビリルビン測定用には、ｐＨ６，０〜９．０の範囲の
緩衝液が用いられ、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝液、３
−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、３−［Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチルアミノコ−２−ハイドロ
キシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝液などのグ
ツド緩衝液でｐＨ６、０〜９．０の範囲のものが挙げら
れる。

なお、総ビリルビン測定に、反応促進のために、コール
酸ナトリウム、ＳＤＳ、ラウリルベンゼン硫酸塩（ＬＢ
Ｓ）などの直接化剤を該緩衝液に添加するのが好ましい
。

直接ビリルビン測定用には、ＰＩ（３、０〜４．５の範
囲のものが用いられ、例えば、乳酸、乳酸ナトリウム緩
衝液、酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩
酸ｍ新液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液または酢酸ナト
リウム−塩酸緩衝液などが挙げられる。クエン酸緩衝液
およびリン酸緩衝液は亜鉛をブロックするので使用でき
ない。

ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいずれも
用いられ、例えば、ミロセシウム属由来ビリルビンオキ
シダーゼ、エビタケ（Ｔｒａｃｈｙｄｅｒｍａｔｓｕｍ
ｏｄａｅ）の産生ずるビリルビンオキシダーゼなどが挙
げられる。ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵
素活性を示す範囲で適宜用いられるが、通常、反応液中
に０．０４〜１０単位／１１２゜好ましくは、総ビリル
ビン測定用には０．０８〜４単位／Ｊｌ＆、直接ビリル
ビン測定用には０．４〜８単位／ｘＱの範囲で用いられ
る。

なお、所望により反応促進剤を用いることができ、この
反応促進剤の併用によりビリルビンオキシダーゼの使用
量を低減することができる。例えば、直接ビリルビン測
定用の反応液に、反応促進剤としてフェリシアン化カリ
ウムｌＯ〜５００μＭを添加すると、ビリルビンオキシ
ダーゼの使用量を０．０４〜１．２単位／ＩＣの範囲ζ
こ低減できる。

かかる反応促進剤としては、上記フェリシアン化カリウ
ムのほか、フェリシアン化ナトリウム、フェロシアン化
カリウム、フェロシアン化ナトリウムなど、さらに硫酸
銅、硝酸銅、酢酸第二銅、臭化第二銅、塩化第二銅など
の二価の銅イオン化合物がいずれも使用され得る。これ
らの反応促進剤は通常１〜７００ｍＭの範囲で用いられ
る。

本発明の方法を実施するには、一般に、ビリルビン含有
検体に、亜鉛化合物および発色剤、所望により直接化剤
を含む緩衝液を加え、２５〜４５℃で３〜１５分間、通
常３７℃で５分間、予加温し、ついでこの混合液にビリ
ルビンオキシダーゼおよび所望により反応促進剤を含む
緩衝液（酵素試薬）を加え、２５〜４５℃で３〜Ｉ５分
間、通常は３７℃で５分間、反応させることにより達成
される。

得られた緑色反応液を比色定量することにより所望のビ
リルビンが測定される。

比色定量は常法によって行なわれ、例えば、市販の分光
光度計（例えば、島津ＬＪＶ−２１００分光光度計）を
用い、波長５８０ｎｎ＋にて、試薬ブランクを対照とし
て光度的密度を測定する。この際、対照として一定量（
既知濃度）のビリルビン含有血清（以下、標準ビリルビ
ンという）を用いて同様に光学的密度を測定し、これら
のデータに基づいて下記式により検体血清中のビリルビ
ン濃度（ｏ／ｄ（２）を算出する。

［式中、ＡＴ：検体血清の光学的密度 ＡｓＴ：標準ビリルビンの光学的密度 Ｘ：標準ビリルビン中のビリルビン 濃度（ｏ／ｄ＆）］ 上記測定操作をさらに具体的に説明すると、総ビリルビ
ン測定の場合、検体血清に亜鉛化合物（例えば、０．１
３＋ｎＭ硫酸亜鉛）と発色剤（例えば、３ｍＭ　　ＭＢ
ＴＨ）、所定量のビリルビンオキシダーゼを含む緩衝液
［例えば、０．３％コール酸ナトリウムを含有する０、
１Ｍ　　ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７。

０）］を加え、例えば３７℃、５分間反応する。また、
上記反応液からビリルビンオキシダーゼをぬいた場合は
検体血清とその反応液をインキュベート（例えば、３７
℃、３分間）し、この溶液に所定量のビリルビンオキシ
ダーゼを添加して、例えば、３７℃、５分間反応しても
よい。これを試薬ブランクを対照にして波長５８０ｎｍ
で光学的密度（Ａ□）を測定する。一方、上記検体血清
に代えて標準ビリルビンを用い、上記と同様に操作を行
ない、光学的密度ＡＳＴを測定する。

直接ビリルビン測定の場合は、緩衝液をｐＨ３。

０〜４．５の緩衝液を用いて上記と同様１こ処理して測
定する。

本発明のビリルビン測定用試薬は、通常、（１）亜鉛化
合物、発色剤および所望により直接化剤を含む緩衝液（
発色試薬） （２）ビリルビンオキシダーゼおよび所望により反応促
進剤を含有するｔｉｌＬ衡液（酵素試薬）および （３）一定量のビリルビン含有血清（標準ビリルビン） から構成される。その場合、試薬の安定性の点より、 （１）発色剤（凍結乾燥品） （２）亜鉛化合物を含む発色剤溶解用緩衝液（３）ビリ
ルビンオキシダーゼ（凍結乾燥品）（４）酸素溶解用緩
衝液および （５）標準ビリルビン（凍結乾燥品） からなるキットとして構成するのが好ましい。

実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例口 総ビリルビンの測定試薬： 第１試薬：１．３ｍＭ硫酸亜鉛、３ａＭＭＢＴＨを各濃
度になるように、０．３％コール酸ナトリウムを含有す
るＯｉＭ　ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７。

０）に溶解する。

第２試薬：　１０単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセ
シウム属由来）を０．１Ｍ　　ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、全量を１０ｘ（Ｊとする。

測定操作： （１）　　日立７１５０自動分析装置を用いＲ−］ｊこ
第１試薬、Ｒ−２に第２試薬を入れた。測定条件は試料
ＩＯμＱにＲ−１０，３ｘＱを加え、３７℃で５分間予
備加温した後、第２試薬０．０７５ｘＱを加え、同温で
５分間反応させ、試薬ブランクを対照に主波長５８０ｒ
ｕ＋＋、副波長７００ｎｍで測定し、それらのデータか
ら前記式（【）により総ビリルビン濃度を算出した。

なお、吸収曲線の測定は直接ビリルビンも含有している
血清０　、　ｌ　ｘ（ｌに第１試薬２　、０　ｘ（ｌを
加え、３７℃で５分間予加温した後、第２試薬０．５ｘ
Ｑを加え、同温度でｌＯ分反応させた後、精製水を対照
にして３００ｒ＋ｍ〜８００ｎｍの吸収曲線を馬車ＵＶ
−２１００分光光度計を用いて測定した。得られた総ビ
リルビン測定の吸収曲線を第１図に示す。第■図の結果
から明らかなように亜鉛化合物存在下で分子吸光係数の
大きい安定な緑色色素が生成し、総ビリルビン測定での
亜鉛化合物による顕著な効果が得られた。

（２）次に、総ビリルビン測定のｐＨ域を検討した。試
薬は第１試薬をｐＨ６，０，ｐｉ（７，０゜ｐＨ８，０
、ｐＨ９，０、ｐＨｌ　ＯにｐＨ５，５は直接化剤添加
でにごりを生じるためコール酸ナトリウムをぬいた。第
２試薬は上記第２試薬と同じであ測定は日立７１５０自
動分析装置を用い上記測定操作と同じである。測定試料
として、正常ヒト血清（セラクリアＮ；日本商事（株）
製）、粉末ビリルビン（間接ビリルビン：米国ＩＣＮ社
製）を添加したセラクリアＮおよび２例の患者血清を用
いて測定した。また、比較例として市販の総ビリルビン
測定用酵素試薬（ネスコートＴ−Ｂ　ＩＬ−ＶＥ。

日本商事（株）製）を用いて同様に測定した。その結果
を第１表に示す。

第１表の結果から明らかなように、ｐＨ６，０〜ｐＨ９
，０で、患者血清２例の測定値は市販酵素試薬で測定し
た濃度とほぼ同じであることが認められる。総ビリルビ
ン測定ｐＨ５，５の患者血清２例の濃度が低値になって
いるのは直接化剤を添加していないため、本反応５分間
では反応が完結していないためと考えられる。また、ｐ
Ｈｌ０でもそれら血清の濃度が低値になったのはビリル
ビンオキシダーゼが活性を示す領域から外れているもの
と解される。

（３）また、標準血清（総ビリルビン１４．２Ｈ／ｄＱ
、直接ビリルビン９　、２　Ｒ９／ｄＱ）を段階希釈（
ｌ／４．２／４．３／４．４／４）Ｌ、、前記試薬を用
い、日立７１５０自動分析装置で測定した。その結果を
第２図に示す。第２図より明らかなごとくほぼ原点を通
る直線が得られた。

実施例２ 直接ビリルビンの測定試薬： 第１試薬：０．９ｍＭ硫酸亜鉛、ＩＯ＋ＭＭＢＴＨを各
濃度になるように、界面活性剤０．１％ノイゲンＥＡ−
１７０（第一工業製薬（株）製）、００５％エマルゲン
１０８（花王石鹸（株）製）を含有する０、１Ｍ乳酸−
乳酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３。

７）に溶解する。

第２試薬：４０単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセシ
ウム属由来）を０．５１１ＩＭフェリシアン化カリウム
溶液で溶解し、全量をＬＯｗＱとする。

測定操作： ０）日立７１５０自動分析装置による測定および吸収曲
線の測定は、実施鉤目こしたがった。

得られた直接ビリルビンの吸収曲線を第３図に示す。第
３図の結果から明らかなように亜鉛化合物存在下で分子
吸光係数の大きい安定な緑色色素が生成し、直接ビリル
ビン測定での亜鉛化合物による顕著な効果が得られた。

（２）次に直接ビリルビン測定のｐ）（域を検討した。

第１試薬の０．１Ｍ乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液の代わ
りに０．１Ｍ酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液を用い、
第１試薬をｐＨ２，５，３，０，３，７，４，０，４，
５，５，０に調製した。第２試薬は上記第２試薬と同じ
である。前記実施例１の測定操作（２）と同様にして、
正常ヒト血清（セラクリアＮ：日本商事（株）製）、粉
末ビリルビン（間接ビリルビン；米国ＩＣＮ社製）を添
加したセラクリアＮおよび２例の患者血清について行な
い、比較例として市販の直接ビリルビン測定用酵素試薬
（ネスコートＤ−Ｂ　ＩＬ−ＶＢ： 日本商事（株）製）を用いた。その結果を第２表に示す
。

第２表から明らかなように、直接ビリルビンはｐＨ１，
０〜４．５で患者血清２例の測定値は市販の酵素試薬で
測定した濃度とほぼ同じであることが認められた。粉末
ビリルビン（間接ビリルビン）添加セラクリアＮはｐＨ
２、５〜４．５までセラクリアＮの濃度と同じであり、
間接ビリルビンは全く反応が起こっていないことが認め
られた。患者血清２例のｐＨ２，５の測定値でも市販酵
素試薬の測定値とほぼ同じであるが、ｐＨ２、５の酸性
液では青色色素になり、亜鉛化合物の効果のｐ）（域か
ら外れている。なお、ｐＨ２，５で反応したのはビリル
ビンオキシダーゼと併用したフェリシアン化カリウムの
効果であると解される。

（３）また、前記の標準血清をセラクリアＮで段階希釈
（１／４．２／４．３／４．４／４）Ｌ、前記直接ビリ
ルビン試薬を用い日立７１５０自動分析装置で測定した
。その結果を第４図に示す。第４図より明らかなごとく
ほぼ原点を通る直線が得られた。

実施例３ 総ビリルビン測定は実施例１の第１試薬のＭＢＴＨの代
わりに２−ヒドラジノベンゾチアゾールを用い、直接ビ
リルビン測定は実施例２の第１試薬のＭＢＴＨの代わり
に２−ヒドラジノベンゾチアゾールを用い、以下同様に
反応後の吸収曲線を測定した。総ビリルビン測定および
直接ビリルビン測定共に安定な緑色色素（λ＝６００ｎ
ｍ）を得た。

実施例４ 総ビリルビン測定は実施例１の第２試薬の代わりに、エ
ビタケ由来のビリルビンオキシダーゼＩＯ単位／ＭＱを
用い、直接ビリルビン測定は実施例２の第２試薬の代わ
りにエビタケ由来のビリルビンオキシダーゼ０．３単位
／ｙｉＱを用い、５８０ｎｍで１０分間タイムコースを
測定した。

５．５％のヒトアルブミンに添加した粉末ビリルビン（
間接ビリルビン）は総ビリルビン測定では反応するが、
直接ビリルビン測定ではほとんど反応しなかった。直接
ビリルビンも含有する血清は総ビリルビン測定および直
接ビリルビン測定共に反応した。

実施例５ （１）　　実施例１の総ビリルビン測定と一般に使用の
ジアゾ法（ネスコートビリルビンキットーＮ）（日本商
事（株）製）を用い日立７１５０自動分析装置により総
ビリルビンを定量した。その結果を第５図に示す。第５
図において、ジアゾ法の測定値をＸ１本発明法の測定値
をＹとすると相関係数γ＝０．９９８であり、回帰直線
の式はＹ＝１．０４４Ｘ＋０．００５と良好であった。

（２）次に実施例２の直接ビリルビン測定の第１試薬の
０．１Ｍ乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，７）の
代わりに０．１Ｍ酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ３、７）を用い、以下同様に測定し、その結果を第６
図に示す。第６図において、ジアゾ法との相関係数はγ
−０，９８８であり、回帰直線の式はＹ＝０．９６３Ｘ
＋０．０６１と良好であった。

以上の結果より、本発明法の総ビリルビン測定法および
直接ビリルビン測定法の正確度が確認された。

実施例６ 種々の金属化合物について総ビリルビン測定における発
色効果を調べた。

試薬の調製： 第１試薬＋１．６ｍＭ金属化合物剤（後記第３表および
第７図参照、ただし、酸化亜鉛は水に溶は難いため、第
１試薬中０．１ｍＭとする）、１ｍＭＭ　Ｂ　Ｔ　Ｈの
各濃度になるようにＯ，ＩＭ　　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）で溶解する。

第２試薬＝４０単位ビリルビンオキシダーゼ（ミロセシ
ウム属由来）を０．１Ｍ　　ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ６
，５）で溶解し、全量を＊（ｌｙＱとする。

測定方法。

直接ビリルビンも含有している血清０　、１　Ｒ（ｌに
第１試薬２　、　Ｏｍ（ｌを加え、３７℃で５分間予加
温したのち、第２試薬０　、５　ｘＱを加え、同温でＩ
Ｏ分反応させた、精製水を対照にして、３００〜８００
ｎｎの吸収曲線を島原ＵＶ−２１００分光光度計を用い
て測定した。それらの結果を下記第３表および第７図に
示す。

第３表 ○：発色色素が長波長にシフトする ×：発色色素が長波長にシフトしない 第３表および第７図の結果から明らかなように、亜鉛化
合物を添加した場合だけが、分子吸光係数が大きい、安
定な緑色色素の反応生成物になり、亜鉛化合物によるそ
の効果が得られた。亜鉛化合物と同じ族のカドミウム化
合物、ベリリウム化合物、バリウム化合物などの金属は
その効果は認められなかった。

発明の効果 本発明によれば亜鉛化合物の効果で、分子吸光係数が大
きい安定な緑色色素に発色し、血清中のビリルビンを特
異的に定量でき、しかも、反応後の液を強酸酸性にしな
くてもよいことから操作は簡単となり、また、強酸性で
は不溶となる直接化剤も用いることができ、患者血清中
のビリルビン反応が迅速になるため、本発明の定量法お
よびその試薬は血清中の総ビリルビン、直接ビリルビン
の臨床検査にきわめて有用である。さらにきわめて簡便
かつ迅速に実施できるため、自動分析への適用が容易で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法による試料中の総ビリルビン測定に
おける吸収曲線、第２図は標準血清の段階希釈液につい
て総ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、第
３図は本発明方法による試料中の直接ビリルビン測定に
おける吸収曲線、第４図は標準血清の段階希釈液につい
て直接ビリルビンを測定した場合の吸収を示すグラフ、
第５図は本発明方法による総ビリルビン測定値と一般の
ジアゾ法による測定値との相関を示すグラフ、第６図は
本発明方法による直接ビリルビン測定値と一般のジアゾ
法による測定値との相関を示すグラフ、第７図は種々の
亜鉛化合物を用いた本発明方法による総ビリルビン測定
における吸収曲線を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビリルビンを光学的に測定する方法において、ビ
   リルビン含有検体を、緩衝液中で亜鉛化合物、発色剤お
   よびビリルビンオキシダーゼと反応させることを特徴と
   するビリルビンの光学的測定法。
2. （２）ｐＨ６．０〜９．０の緩衝液中で反応させて、総
   ビリルビンを測定する請求項第（１）項の測定法。
3. （３）ｐＨ３．０〜４．５の緩衝液中で反応させて、直
   接ビリルビンを測定する請求項第（１）項の測定法。
4. （４）亜鉛化合物が亜鉛酸化物、無機酸亜鉛、有機酸亜
   鉛、ハロゲン化亜鉛およびシアン化亜鉛から選ばれる少
   なくとも１種である請求項第（１）、（２）または（３
   ）項の測定法。
5. （５）発色剤が３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−
   ヒドラゾン、２−ヒドラジノベンゾチアゾールまたは１
   −ヒドラジノフタラジン塩酸塩である請求項第（１）〜
   （４）項いずれか１つの測定法。
6. （６）緩衝液が、グッド緩衝液から選ばれる１種である
   請求項第（２）項の測定法。
7. （７）緩衝液が、酒石酸−酒石酸ナトリウム緩衝液、乳
   酸−乳酸ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、酢
   酸−酢酸ナトリウム緩衝液、および酢酸ナトリウム−塩
   酸緩衝液から選ばれる１種である請求項第（３）項の測
   定法。
8. （８）亜鉛化合物および発色剤を含有する緩衝液および
   ビリルビンオキシダーゼを含有する緩衝液からなること
   を特徴とするビリルビン測定用試薬。
9. （９）緩衝液が、ｐＨ６．０〜９．０のグッド緩衝液か
   ら選ばれる１種である総ビリルビン測定用の請求項第（
   ８）項の試薬。
10. （１０）緩衝液が、ｐＨ３．０〜４．５の酒石酸−酒石
    酸ナトリウム緩衝液、乳酸−乳酸ナトリウム緩衝液、グ
    リシン−塩酸緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、お
    よび酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液から選ばれる１種であ
    る直接ビリルビン測定用の請求項第（８）項の試薬。