JPH0695094B2 - フルクトサミンの測定法 - Google Patents
フルクトサミンの測定法Info
- Publication number
- JPH0695094B2 JPH0695094B2 JP1343438A JP34343889A JPH0695094B2 JP H0695094 B2 JPH0695094 B2 JP H0695094B2 JP 1343438 A JP1343438 A JP 1343438A JP 34343889 A JP34343889 A JP 34343889A JP H0695094 B2 JPH0695094 B2 JP H0695094B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- fructosamine
- ascorbic acid
- minutes
- measured
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- Expired - Lifetime
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、構造式（１）の化合物又はその塩を用いてフ
ルクトサミンを測定するテトラゾリウム塩法に関するも
のである。
ルクトサミンを測定するテトラゾリウム塩法に関するも
のである。
（従来の技術） 従来、フルクトサミンは、アルカリ下におけるフルクト
サミンのテトラゾリウム塩に対する還元力を利用して測
定されている。
サミンのテトラゾリウム塩に対する還元力を利用して測
定されている。
テトラゾリウム塩法は、感度が高いということにより従
来から好んで使用されてきた。ただ、テトラゾリウム塩
法の問題点として、アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモ
グロビンの影響をうけることが従来より指摘されてい
る。
来から好んで使用されてきた。ただ、テトラゾリウム塩
法の問題点として、アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモ
グロビンの影響をうけることが従来より指摘されてい
る。
フルクトサミンは、現在糖尿病診断のマーカとしてグリ
コヘモグロビンと同様、大変注目されており、最近その
検査が急速に増えてきた。
コヘモグロビンと同様、大変注目されており、最近その
検査が急速に増えてきた。
グリコヘモグロビンが、過去２カ月間の血糖状態を反映
すると言われるが、フルクトサミンは過去１〜２週間の
血糖状態を反映すると言われる。現在フルクトサミンの
測定法として、血清中の蛋白質がグルコースと結合して
生ずるケトアミン（フルクトサミン）が、アルカリ溶液
中でテトラゾリウム塩を還元して生じるホルマザン発色
を利用して測定する方法がよく用いられている。
すると言われるが、フルクトサミンは過去１〜２週間の
血糖状態を反映すると言われる。現在フルクトサミンの
測定法として、血清中の蛋白質がグルコースと結合して
生ずるケトアミン（フルクトサミン）が、アルカリ溶液
中でテトラゾリウム塩を還元して生じるホルマザン発色
を利用して測定する方法がよく用いられている。
この従来方法はシスティンやグルタチオン等のSH化合
物、アスコルビン酸、血清蛋白等の影響をうける点が非
常に問題とされている。特に、アルコルビン酸による影
響が大きく、試薬中にアスコルビン酸を加えただけでも
強く発色する。アスコルビン酸の影響を避けるため、通
常、アスコルビン酸の発色を終わらせた後、測定ポイン
トを２点選んでその吸光度差をとって測定されている。
しかし、アスコルビン酸の発色は完結するまで10〜15分
かかり、さらにブランク値が高いレベルから測定しなけ
ればならず、正確な測定が難しい上、最近の測定時間の
短い自動分析装置にはのりにくいという問題があった。
それで、アスコルビン酸を消去するためにアスコルビン
酸オキシダーゼを用いる方法が報告されているが、消去
後も徐々に発色してしまうという問題があった。さらに
ビリルビン高値の検体においてはフルクトサミンと同様
な反応パターンを示し、反応時間を10〜15分おいてもビ
リルビンの影響を回避することは出来ない。
物、アスコルビン酸、血清蛋白等の影響をうける点が非
常に問題とされている。特に、アルコルビン酸による影
響が大きく、試薬中にアスコルビン酸を加えただけでも
強く発色する。アスコルビン酸の影響を避けるため、通
常、アスコルビン酸の発色を終わらせた後、測定ポイン
トを２点選んでその吸光度差をとって測定されている。
しかし、アスコルビン酸の発色は完結するまで10〜15分
かかり、さらにブランク値が高いレベルから測定しなけ
ればならず、正確な測定が難しい上、最近の測定時間の
短い自動分析装置にはのりにくいという問題があった。
それで、アスコルビン酸を消去するためにアスコルビン
酸オキシダーゼを用いる方法が報告されているが、消去
後も徐々に発色してしまうという問題があった。さらに
ビリルビン高値の検体においてはフルクトサミンと同様
な反応パターンを示し、反応時間を10〜15分おいてもビ
リルビンの影響を回避することは出来ない。
（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、下記構造式（１）の化合物又はその塩を用
いることによって、より効果的かつ迅速に検体中のビリ
ルビン、アスコルビン酸及びシステイン，グルタチオン
等のSH化合物、蛋白質の影響を受けずにフルクトサミン
を測定できることを見出し本発明を完成したものであ
る。
いることによって、より効果的かつ迅速に検体中のビリ
ルビン、アスコルビン酸及びシステイン，グルタチオン
等のSH化合物、蛋白質の影響を受けずにフルクトサミン
を測定できることを見出し本発明を完成したものであ
る。
本発明は、下記構造式（１）の化合物又はその塩を用い
ることによって、ビリルビン、アスコルビン酸及びシス
テイン，グルタチオン等のSH化合物、蛋白質の影響を受
けずにフルクトサミンの測定を可能とし、かつ３〜５分
以内にRate Assayを可能とした測定方法を提供するこ
とを目的とする。
ることによって、ビリルビン、アスコルビン酸及びシス
テイン，グルタチオン等のSH化合物、蛋白質の影響を受
けずにフルクトサミンの測定を可能とし、かつ３〜５分
以内にRate Assayを可能とした測定方法を提供するこ
とを目的とする。
（課題を解決するための手段） 上記目的を達成するために、本発明においては、テトラ
ゾリウム塩を用いてフルクトサミンを測定する方法にお
いて、下記の構造式（１）の化合物又はその塩を含む反
応液に検体を加えてあらかじめ前処理することによって
測定するようにしてものである。
ゾリウム塩を用いてフルクトサミンを測定する方法にお
いて、下記の構造式（１）の化合物又はその塩を含む反
応液に検体を加えてあらかじめ前処理することによって
測定するようにしてものである。
（式（１）において、X,Y:H又はハロゲン） なお、上記構造式（１）の化合物の塩としては、Na,K,L
i,NH4等の塩が挙げられる。具体的な例としては、イン
ドフェノール、2,6−ジクロロフェノールインドフェノ
ールナトリウム、３−クロロインドフェノールナトリウ
ム（３−クロロフェノールインドフェノールナトリウ
ム）、０−ブロモフェノールインドフェノールナトリウ
ム、2,6−ジブロモフェノールインドフェノールナトリ
ウム等を挙げることができる。
i,NH4等の塩が挙げられる。具体的な例としては、イン
ドフェノール、2,6−ジクロロフェノールインドフェノ
ールナトリウム、３−クロロインドフェノールナトリウ
ム（３−クロロフェノールインドフェノールナトリウ
ム）、０−ブロモフェノールインドフェノールナトリウ
ム、2,6−ジブロモフェノールインドフェノールナトリ
ウム等を挙げることができる。
本発明方法において、あらかじめ上記構造式（１）の化
合物を含む試薬に検体を加えて前処理することによっ
て、効果的にフルクトサミンを測定することができる。
本発明にもちいるテトラゾリウム塩としてニトロテトラ
ゾリウムブルー（NTB）、ネオテトラゾリウムブルー、
テトラゾリウムブルー（TB）、テトラニトロテトラゾリ
ウムブルー、INT、MTT等が挙げられる。
合物を含む試薬に検体を加えて前処理することによっ
て、効果的にフルクトサミンを測定することができる。
本発明にもちいるテトラゾリウム塩としてニトロテトラ
ゾリウムブルー（NTB）、ネオテトラゾリウムブルー、
テトラゾリウムブルー（TB）、テトラニトロテトラゾリ
ウムブルー、INT、MTT等が挙げられる。
（実施例） 以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.05mM （DCIP:2,6−ジクロロフェノールインドフェノールナト
リウム） 第２試薬： 炭酸揺衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM （NTB:ニトロブルーテトラゾリウム） 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第１図に示し
た。
リウム） 第２試薬： 炭酸揺衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM （NTB:ニトロブルーテトラゾリウム） 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第１図に示し
た。
比較例１ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料100μ
ｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nm吸
光度を測定し、反応の経時変化を記録し、実施例１と共
に第１図に示した。
ｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nm吸
光度を測定し、反応の経時変化を記録し、実施例１と共
に第１図に示した。
比較例１においては、アスコルビン酸の反応が急激に進
行するが、実施例１ではアスコルビン酸の反応が著しく
抑制されたことがわかる。
行するが、実施例１ではアスコルビン酸の反応が著しく
抑制されたことがわかる。
実施例２ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.08mM 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにビリルビン20mg/dlを添加した試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させた後、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させた。540nmで４〜５分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
μｌ加え、37℃５分間反応させた後、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させた。540nmで４〜５分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
比較例２ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにビリルビン20mg/dlを添加した試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。540nmで４〜５分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。540nmで４〜５分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
比較例２では、ビリルビン濃度20mg/dlで測定値は30％
上昇し、実施例２ではビリルビン濃度20mg/dlまでは、
ほとんど影響を受けないことがわかった。
上昇し、実施例２ではビリルビン濃度20mg/dlまでは、
ほとんど影響を受けないことがわかった。
実施例３ 試薬の組成 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.05mM 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬400μｌに血清または標準血清（表示値2.7mM）
を20μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬20
0μｌ加え、37℃で４分後試薬ブランク対照に主波長546
nm（副波長700nm）で１分間あたりの吸光度変化を測定
し、フルクトサミン値を求め、比較例３との相関をと
り、第２図に示した。
を20μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬20
0μｌ加え、37℃で４分後試薬ブランク対照に主波長546
nm（副波長700nm）で１分間あたりの吸光度変化を測定
し、フルクトサミン値を求め、比較例３との相関をと
り、第２図に示した。
比較例３ 試薬の組成 試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.25mM 試薬500μｌに血清または標準血清（表示値2.7mM）20μ
ｌ加え、37℃で９分後試薬ブランクを対照に主波長546n
m（副波長700nm）で１分間当たりの吸光度変化を測定し
フルクトサミン値を求めた。
ｌ加え、37℃で９分後試薬ブランクを対照に主波長546n
m（副波長700nm）で１分間当たりの吸光度変化を測定し
フルクトサミン値を求めた。
その結果を第２図に示した。ｙ＝0.9820x＋0.018、相関
関数ｒ＝0.9845、検体数ｎ＝60（y:実施例３、x:比較例
３）と良好な相関が得られた。
関数ｒ＝0.9845、検体数ｎ＝60（y:実施例３、x:比較例
３）と良好な相関が得られた。
実施例４ （オルトブロモフェノールインドフェノールナトリウム
を用いた例） 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 オルトブロモフェノールインドフェノールナトリウム…
…0.05mM 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第３図に示し
た。
を用いた例） 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 オルトブロモフェノールインドフェノールナトリウム…
…0.05mM 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第３図に示し
た。
実施例１と同様にアスコルビン酸の反応が著しく抑制さ
れることがわかった。
れることがわかった。
実施例５ （３−クロロインドフェノールナトリウムを用いた例） 第１試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 ３−クロロインドフェノールナトリウム ……0.05mM 第２試薬： 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第１試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第４図に示し
た。実施例１と同様にアスコルビン酸の反応が著しく抑
制されることがわかった。
μｌ加え、37℃５分間反応させたのち、第２試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第４図に示し
た。実施例１と同様にアスコルビン酸の反応が著しく抑
制されることがわかった。
（発明の効果） 以上のように、本発明は、前記構造式（１）の化合物又
はその塩を用いることによって、ビリルビン、アスコル
ビン酸及びシステイン，グリタチオン等のSH化合物等の
影響を受けずにフルクトサミンの迅速な測定を可能とし
かつ２試薬に分けて３〜５分以内にRate Assayを可能
としたものである。
はその塩を用いることによって、ビリルビン、アスコル
ビン酸及びシステイン，グリタチオン等のSH化合物等の
影響を受けずにフルクトサミンの迅速な測定を可能とし
かつ２試薬に分けて３〜５分以内にRate Assayを可能
としたものである。
第１図は実施例１と比較例１の吸光度変化の測定結果を
示すグラフ、第２図は実施例３と比較例３とのフルクト
サミン相関を示すグラフ、第３図は実施例４の吸光度変
化の測定結果を示すグラフ及び第４図は実施例５の吸光
度変化の測定結果を示すグラフである。
示すグラフ、第２図は実施例３と比較例３とのフルクト
サミン相関を示すグラフ、第３図は実施例４の吸光度変
化の測定結果を示すグラフ及び第４図は実施例５の吸光
度変化の測定結果を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】テトラゾリウム塩を用いてフルクトサミン
を測定する方法において、下記の構造式（１）の化合物
又はその塩を含む反応液に検体を加えてあらかじめ前処
理することを特徴とするフルクトサミンの測定法。 （式（１）において、X,Y:H又はハロゲン）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1343438A JPH0695094B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | フルクトサミンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1343438A JPH0695094B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | フルクトサミンの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03202770A JPH03202770A (ja) | 1991-09-04 |
| JPH0695094B2 true JPH0695094B2 (ja) | 1994-11-24 |
Family
ID=18361516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1343438A Expired - Lifetime JPH0695094B2 (ja) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | フルクトサミンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0695094B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3760250B2 (ja) * | 1995-12-21 | 2006-03-29 | マルキンバイオ株式会社 | 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット |
| US20030226769A1 (en) * | 2000-05-23 | 2003-12-11 | Koji Sode | Kit for assaying saccharified protein |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6188153A (ja) * | 1984-09-13 | 1986-05-06 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 生体微量成分の定量法 |
| JPS61232000A (ja) * | 1985-04-04 | 1986-10-16 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 過酸化水素の新規定量方法 |
-
1989
- 1989-12-29 JP JP1343438A patent/JPH0695094B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03202770A (ja) | 1991-09-04 |
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