JPH0695094B2 - フルクトサミンの測定法 - Google Patents

フルクトサミンの測定法

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JPH0695094B2
JPH0695094B2 JP1343438A JP34343889A JPH0695094B2 JP H0695094 B2 JPH0695094 B2 JP H0695094B2 JP 1343438 A JP1343438 A JP 1343438A JP 34343889 A JP34343889 A JP 34343889A JP H0695094 B2 JPH0695094 B2 JP H0695094B2
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fructosamine
ascorbic acid
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宏紀 高橋
才仁 金島
健治 小島
元信 市野
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Sanko Junyaku Co Ltd
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Sanko Junyaku Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、構造式(1)の化合物又はその塩を用いてフ
ルクトサミンを測定するテトラゾリウム塩法に関するも
のである。
(従来の技術) 従来、フルクトサミンは、アルカリ下におけるフルクト
サミンのテトラゾリウム塩に対する還元力を利用して測
定されている。
テトラゾリウム塩法は、感度が高いということにより従
来から好んで使用されてきた。ただ、テトラゾリウム塩
法の問題点として、アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモ
グロビンの影響をうけることが従来より指摘されてい
る。
フルクトサミンは、現在糖尿病診断のマーカとしてグリ
コヘモグロビンと同様、大変注目されており、最近その
検査が急速に増えてきた。
グリコヘモグロビンが、過去2カ月間の血糖状態を反映
すると言われるが、フルクトサミンは過去1〜2週間の
血糖状態を反映すると言われる。現在フルクトサミンの
測定法として、血清中の蛋白質がグルコースと結合して
生ずるケトアミン(フルクトサミン)が、アルカリ溶液
中でテトラゾリウム塩を還元して生じるホルマザン発色
を利用して測定する方法がよく用いられている。
この従来方法はシスティンやグルタチオン等のSH化合
物、アスコルビン酸、血清蛋白等の影響をうける点が非
常に問題とされている。特に、アルコルビン酸による影
響が大きく、試薬中にアスコルビン酸を加えただけでも
強く発色する。アスコルビン酸の影響を避けるため、通
常、アスコルビン酸の発色を終わらせた後、測定ポイン
トを2点選んでその吸光度差をとって測定されている。
しかし、アスコルビン酸の発色は完結するまで10〜15分
かかり、さらにブランク値が高いレベルから測定しなけ
ればならず、正確な測定が難しい上、最近の測定時間の
短い自動分析装置にはのりにくいという問題があった。
それで、アスコルビン酸を消去するためにアスコルビン
酸オキシダーゼを用いる方法が報告されているが、消去
後も徐々に発色してしまうという問題があった。さらに
ビリルビン高値の検体においてはフルクトサミンと同様
な反応パターンを示し、反応時間を10〜15分おいてもビ
リルビンの影響を回避することは出来ない。
(発明が解決しようとする課題) 本発明者は、下記構造式(1)の化合物又はその塩を用
いることによって、より効果的かつ迅速に検体中のビリ
ルビン、アスコルビン酸及びシステイン,グルタチオン
等のSH化合物、蛋白質の影響を受けずにフルクトサミン
を測定できることを見出し本発明を完成したものであ
る。
本発明は、下記構造式(1)の化合物又はその塩を用い
ることによって、ビリルビン、アスコルビン酸及びシス
テイン,グルタチオン等のSH化合物、蛋白質の影響を受
けずにフルクトサミンの測定を可能とし、かつ3〜5分
以内にRate Assayを可能とした測定方法を提供するこ
とを目的とする。
(課題を解決するための手段) 上記目的を達成するために、本発明においては、テトラ
ゾリウム塩を用いてフルクトサミンを測定する方法にお
いて、下記の構造式(1)の化合物又はその塩を含む反
応液に検体を加えてあらかじめ前処理することによって
測定するようにしてものである。
(式(1)において、X,Y:H又はハロゲン) なお、上記構造式(1)の化合物の塩としては、Na,K,L
i,NH4等の塩が挙げられる。具体的な例としては、イン
ドフェノール、2,6−ジクロロフェノールインドフェノ
ールナトリウム、3−クロロインドフェノールナトリウ
ム(3−クロロフェノールインドフェノールナトリウ
ム)、0−ブロモフェノールインドフェノールナトリウ
ム、2,6−ジブロモフェノールインドフェノールナトリ
ウム等を挙げることができる。
本発明方法において、あらかじめ上記構造式(1)の化
合物を含む試薬に検体を加えて前処理することによっ
て、効果的にフルクトサミンを測定することができる。
本発明にもちいるテトラゾリウム塩としてニトロテトラ
ゾリウムブルー(NTB)、ネオテトラゾリウムブルー、
テトラゾリウムブルー(TB)、テトラニトロテトラゾリ
ウムブルー、INT、MTT等が挙げられる。
(実施例) 以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明す
る。
実施例1 試薬の組成 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.05mM (DCIP:2,6−ジクロロフェノールインドフェノールナト
リウム) 第2試薬: 炭酸揺衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM (NTB:ニトロブルーテトラゾリウム) 第1試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μl加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第1図に示し
た。
比較例1 試薬の組成 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料100μ
l加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nm吸
光度を測定し、反応の経時変化を記録し、実施例1と共
に第1図に示した。
比較例1においては、アスコルビン酸の反応が急激に進
行するが、実施例1ではアスコルビン酸の反応が著しく
抑制されたことがわかる。
実施例2 試薬の組成 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.08mM 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬2mlにビリルビン20mg/dlを添加した試料を100
μl加え、37℃5分間反応させた後、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させた。540nmで4〜5分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
比較例2 試薬の組成 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬2mlにビリルビン20mg/dlを添加した試料を100
μl加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させる。540nmで4〜5分後吸光度変化
を測定した。なお、ビリルビンを含まない試料を対照と
し比較を行った。
比較例2では、ビリルビン濃度20mg/dlで測定値は30%
上昇し、実施例2ではビリルビン濃度20mg/dlまでは、
ほとんど影響を受けないことがわかった。
実施例3 試薬の組成 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 DCIP ……0.05mM 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬400μlに血清または標準血清(表示値2.7mM)
を20μl加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬20
0μl加え、37℃で4分後試薬ブランク対照に主波長546
nm(副波長700nm)で1分間あたりの吸光度変化を測定
し、フルクトサミン値を求め、比較例3との相関をと
り、第2図に示した。
比較例3 試薬の組成 試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.25mM 試薬500μlに血清または標準血清(表示値2.7mM)20μ
l加え、37℃で9分後試薬ブランクを対照に主波長546n
m(副波長700nm)で1分間当たりの吸光度変化を測定し
フルクトサミン値を求めた。
その結果を第2図に示した。y=0.9820x+0.018、相関
関数r=0.9845、検体数n=60(y:実施例3、x:比較例
3)と良好な相関が得られた。
実施例4 (オルトブロモフェノールインドフェノールナトリウム
を用いた例) 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 オルトブロモフェノールインドフェノールナトリウム…
…0.05mM 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μl加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第3図に示し
た。
実施例1と同様にアスコルビン酸の反応が著しく抑制さ
れることがわかった。
実施例5 (3−クロロインドフェノールナトリウムを用いた例) 第1試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 3−クロロインドフェノールナトリウム ……0.05mM 第2試薬: 炭酸緩衝液 ……100mM,pH10.3 NTB ……0.75mM 第1試薬2mlにアスコルビン酸20mg/dlを含む試料を100
μl加え、37℃5分間反応させたのち、第2試薬1ml加
え、37℃で反応させる。試薬ブランクを対照に540nmで
吸光度を測定し反応の経時変化を記録し、第4図に示し
た。実施例1と同様にアスコルビン酸の反応が著しく抑
制されることがわかった。
(発明の効果) 以上のように、本発明は、前記構造式(1)の化合物又
はその塩を用いることによって、ビリルビン、アスコル
ビン酸及びシステイン,グリタチオン等のSH化合物等の
影響を受けずにフルクトサミンの迅速な測定を可能とし
かつ2試薬に分けて3〜5分以内にRate Assayを可能
としたものである。
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例1と比較例1の吸光度変化の測定結果を
示すグラフ、第2図は実施例3と比較例3とのフルクト
サミン相関を示すグラフ、第3図は実施例4の吸光度変
化の測定結果を示すグラフ及び第4図は実施例5の吸光
度変化の測定結果を示すグラフである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】テトラゾリウム塩を用いてフルクトサミン
    を測定する方法において、下記の構造式(1)の化合物
    又はその塩を含む反応液に検体を加えてあらかじめ前処
    理することを特徴とするフルクトサミンの測定法。 (式(1)において、X,Y:H又はハロゲン)
JP1343438A 1989-12-29 1989-12-29 フルクトサミンの測定法 Expired - Lifetime JPH0695094B2 (ja)

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