JPH0334591B2 - - Google Patents
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- JPH0334591B2 JPH0334591B2 JP3484383A JP3484383A JPH0334591B2 JP H0334591 B2 JPH0334591 B2 JP H0334591B2 JP 3484383 A JP3484383 A JP 3484383A JP 3484383 A JP3484383 A JP 3484383A JP H0334591 B2 JPH0334591 B2 JP H0334591B2
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- total bilirubin
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は生体体液試料、特に血液または尿中の
総ビリルビンを定量する方法に関する。さらに詳
しくは、検液に銅イオン、コバルトイオン、フエ
リシアンイオンまたは過沃素酸イオンの各化合物
の少なくとも一種以上と界面活性剤および／また
はシアン化物を作用せしめることによりビリルビ
ンを酸化し、その際の光学的変化からビリルビン
を定量する方法に関する。 ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素で
あり、血液中には正常人の場合約１mg／dl以下含
まれるが、病的には20mg／dlに達することもあ
る。血清中での存在は、グルクロン酸、硫酸など
と結合した直接型ビリルビン（抱合型ビリルビン
とも言う）およびアルブミンと結合した間接型ビ
リルビン（非抱合型ビリルビンとも言う）に大別
される。本発明法はこれらビリルビンの総計、即
ち総ビリルビンを定量することを目的とする。ビ
リルビンの定量は黄疸疾患の診断に有用である。 従来、ビリルビンの定量法としては、ビリルビ
ンとシアゾ試薬が反応して生ずるアゾビリルビン
の紅色を比色定量する方法（金井泉：臨床検査法
提要，第28版，金原出版，ページＸ−24，昭和
53年）などの化学的方法が主として用いられてい
る。この方法は、ジアゾ試薬がビリルビン以外の
血清成分と反応するため正確性に欠けることがあ
り、また操作が極めて繁雑である。 本発明者等はビリルビンに反応する物質につい
て検討したところ、銅イオン化合物、コバルトイ
オン化合物、フエリシアンイオン化合物または過
沃素酸イオン化合物（以下これらを「イオン化合
物」という）と界面活性剤またはシアン化物を併
用し、ビリルビンに作用させるとビリルビンの黄
色が減少、消失することを知つた。イオン化合物
は一種または二種以上同時に用いてもよいが、そ
れだけでは直接型ビリルビンには若干反応するも
のの間接型ビリルビンにはほとんど反応しない。
しかし、イオン化合物に加え界面活性剤またはシ
アン化物を用いることにより反応が進み、さらに
界面活性剤とシアン化物の両者を用いると極めて
速やかに反応することを見いだし、本発明の完成
に至つたものである。 上記イオン化合物の他に鉄、カルシウム、ス
ズ、マグネシウム、マンガン、タングステン酸、
モリブデン酸、ストロンチウム、亜鉛、ジルコニ
ウム、リチウム、ニツケル、ビスマスおよびフエ
ロシアンの各イオン化合物についても検討した
が、ビリルビンへの作用は認められなかつた。 本発明法は、従来のビリルビンの測定法に比較
し、極めて簡単でしかも安価な試薬を用いた正確
な測定法を提供するものである。 本発明法で用いるイオン化合物は塩または酸の
形で使用でき、例えば硫酸銅、塩化第二銅、酢酸
第二銅、リン酸第二銅などの２価の銅イオン化合
物、硫酸コバルト、塩化コバルト、酢酸コバル
ト、硝酸コバルトなどの２価のコバルトイオン化
合物、フエリシアン化ナトリウム、フエリシアン
化カリウムなどのフエリシアンイオン化合物、ま
たは過沃素酸、過沃素酸ナトリウム、過沃素酸カ
リウムなどのメタ過沃素酸イオン化合物が用いら
れる。その他の原子価のイオン化合物はビリルビ
ンに作用せず、本発明の目的には使用できない。
第１表にイオン化合物のビリルビンに対する反応
速度の比較を示す。
総ビリルビンを定量する方法に関する。さらに詳
しくは、検液に銅イオン、コバルトイオン、フエ
リシアンイオンまたは過沃素酸イオンの各化合物
の少なくとも一種以上と界面活性剤および／また
はシアン化物を作用せしめることによりビリルビ
ンを酸化し、その際の光学的変化からビリルビン
を定量する方法に関する。 ビリルビンは胆汁中に最も多く存在する色素で
あり、血液中には正常人の場合約１mg／dl以下含
まれるが、病的には20mg／dlに達することもあ
る。血清中での存在は、グルクロン酸、硫酸など
と結合した直接型ビリルビン（抱合型ビリルビン
とも言う）およびアルブミンと結合した間接型ビ
リルビン（非抱合型ビリルビンとも言う）に大別
される。本発明法はこれらビリルビンの総計、即
ち総ビリルビンを定量することを目的とする。ビ
リルビンの定量は黄疸疾患の診断に有用である。 従来、ビリルビンの定量法としては、ビリルビ
ンとシアゾ試薬が反応して生ずるアゾビリルビン
の紅色を比色定量する方法（金井泉：臨床検査法
提要，第28版，金原出版，ページＸ−24，昭和
53年）などの化学的方法が主として用いられてい
る。この方法は、ジアゾ試薬がビリルビン以外の
血清成分と反応するため正確性に欠けることがあ
り、また操作が極めて繁雑である。 本発明者等はビリルビンに反応する物質につい
て検討したところ、銅イオン化合物、コバルトイ
オン化合物、フエリシアンイオン化合物または過
沃素酸イオン化合物（以下これらを「イオン化合
物」という）と界面活性剤またはシアン化物を併
用し、ビリルビンに作用させるとビリルビンの黄
色が減少、消失することを知つた。イオン化合物
は一種または二種以上同時に用いてもよいが、そ
れだけでは直接型ビリルビンには若干反応するも
のの間接型ビリルビンにはほとんど反応しない。
しかし、イオン化合物に加え界面活性剤またはシ
アン化物を用いることにより反応が進み、さらに
界面活性剤とシアン化物の両者を用いると極めて
速やかに反応することを見いだし、本発明の完成
に至つたものである。 上記イオン化合物の他に鉄、カルシウム、ス
ズ、マグネシウム、マンガン、タングステン酸、
モリブデン酸、ストロンチウム、亜鉛、ジルコニ
ウム、リチウム、ニツケル、ビスマスおよびフエ
ロシアンの各イオン化合物についても検討した
が、ビリルビンへの作用は認められなかつた。 本発明法は、従来のビリルビンの測定法に比較
し、極めて簡単でしかも安価な試薬を用いた正確
な測定法を提供するものである。 本発明法で用いるイオン化合物は塩または酸の
形で使用でき、例えば硫酸銅、塩化第二銅、酢酸
第二銅、リン酸第二銅などの２価の銅イオン化合
物、硫酸コバルト、塩化コバルト、酢酸コバル
ト、硝酸コバルトなどの２価のコバルトイオン化
合物、フエリシアン化ナトリウム、フエリシアン
化カリウムなどのフエリシアンイオン化合物、ま
たは過沃素酸、過沃素酸ナトリウム、過沃素酸カ
リウムなどのメタ過沃素酸イオン化合物が用いら
れる。その他の原子価のイオン化合物はビリルビ
ンに作用せず、本発明の目的には使用できない。
第１表にイオン化合物のビリルビンに対する反応
速度の比較を示す。
【表】
界面活性剤およびシアン化物はイオン化合物の
ビリルビン酸化反応を促進する作用を持つもの
で、好ましい例として、界面活性剤としてはドデ
シル硫酸ナトリウム、Ｐ−トルエンスルホン酸、
コール酸ナトリウム、タウロコール酸またはトリ
トンＸ−100など、シアン化物としてはシアン化
ナトリウムまたはシアン化カリウムなどが上げら
れる。これらは一種だけ使用してもよいが、二種
以上あるいは界面活性剤シアン化物の両者を同時
に使用することもできる。特に界面活性剤とシア
ン化物の両者を併用することは、極めて反応が速
やかに進行するため好ましい。 ビリルビンの有する黄色は、460nm付近に最大
吸収波長を持つが、これにイオン化合物と界面活
性剤および／またはシアン化物を作用させると、
460nm付近の吸収が減少し、代わつて330nmおよ
び380nm付近に吸収のある物質が生成されてく
る。本生成物はビリルビンが酸化されて生じたビ
リベルビン、あるいはビリベルジンがさらに変化
した物質と推定される。従つて、460nm付近の吸
光度の減少若しくは330nmまたは380nm付近の吸
光度の増加を測定することによりビリルビンの定
量が可能となつた。ただし、分子吸光係数はビリ
ルビンの方が反応生成物よりもはるかに大きいた
め460nm付近の吸光度の減少を測定した方が精度
の高い測定ができる。 イオン化合物の好ましい使用量は反応液中で
0.01〜10mMであり、同じく界面活性剤は0.01〜
１％、シアン化物は0.01〜10mMである。いずれ
も使用量の多いほど反応時間は短くてすむ。第２
表に硫酸銅または塩化コバルトの使用量と反応時
間の関係を示す。反応系は、ドデシル硫酸ナトリ
ウム0.05％および硫酸銅または塩化コバルトを含
む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３mlとアルブ
ミン結合型ビリルビンであるビリルビンコントロ
ール（デイド社製）水溶液（20mg／dl）0.1mlを
混合し、37℃で反応させて460nmにおける吸光度
の減少を記憶し平衡に達するまでの時間を測定し
た。
ビリルビン酸化反応を促進する作用を持つもの
で、好ましい例として、界面活性剤としてはドデ
シル硫酸ナトリウム、Ｐ−トルエンスルホン酸、
コール酸ナトリウム、タウロコール酸またはトリ
トンＸ−100など、シアン化物としてはシアン化
ナトリウムまたはシアン化カリウムなどが上げら
れる。これらは一種だけ使用してもよいが、二種
以上あるいは界面活性剤シアン化物の両者を同時
に使用することもできる。特に界面活性剤とシア
ン化物の両者を併用することは、極めて反応が速
やかに進行するため好ましい。 ビリルビンの有する黄色は、460nm付近に最大
吸収波長を持つが、これにイオン化合物と界面活
性剤および／またはシアン化物を作用させると、
460nm付近の吸収が減少し、代わつて330nmおよ
び380nm付近に吸収のある物質が生成されてく
る。本生成物はビリルビンが酸化されて生じたビ
リベルビン、あるいはビリベルジンがさらに変化
した物質と推定される。従つて、460nm付近の吸
光度の減少若しくは330nmまたは380nm付近の吸
光度の増加を測定することによりビリルビンの定
量が可能となつた。ただし、分子吸光係数はビリ
ルビンの方が反応生成物よりもはるかに大きいた
め460nm付近の吸光度の減少を測定した方が精度
の高い測定ができる。 イオン化合物の好ましい使用量は反応液中で
0.01〜10mMであり、同じく界面活性剤は0.01〜
１％、シアン化物は0.01〜10mMである。いずれ
も使用量の多いほど反応時間は短くてすむ。第２
表に硫酸銅または塩化コバルトの使用量と反応時
間の関係を示す。反応系は、ドデシル硫酸ナトリ
ウム0.05％および硫酸銅または塩化コバルトを含
む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３mlとアルブ
ミン結合型ビリルビンであるビリルビンコントロ
ール（デイド社製）水溶液（20mg／dl）0.1mlを
混合し、37℃で反応させて460nmにおける吸光度
の減少を記憶し平衡に達するまでの時間を測定し
た。
【表】
第３表にはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の
使用量と反応速度を示す。硫酸銅0.15mMを用い
た他は上記に準じ行つた。
使用量と反応速度を示す。硫酸銅0.15mMを用い
た他は上記に準じ行つた。
【表】
第４表にはドデシル硫酸ナトリウム0.05％とシ
アン化カリウム（KCN）を併用した場合のシア
ン化カリウムの効果を示す。方法は前記に準ず
る。
アン化カリウム（KCN）を併用した場合のシア
ン化カリウムの効果を示す。方法は前記に準ず
る。
【表】
反応の至適PHは使用するイオン化合物によつて
異なり、銅イオン化合物コバルトイオン化合物の
場合はPH7.5〜10、フエリシアンイオン化合物は
PH７〜９、過沃素酸イオン化合物はPH4.5〜7.5が
好ましい。反応温度は特に限定されないが、室温
〜40℃程度で行われる。 実施例 １ 硫酸銅0.6mMおよびドデシル硫酸ナトリウム
0.1％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３ml
と各種濃度のビリルビンコントロール水溶液
（１，２，５，10，20mg／dl）各々0.1mlを混合
し、37℃、15分反応後460nmにおける吸光度の減
少を測定した。ビリルビンコントロールの濃度
（ｙmg／dl）と減少吸光度（xOD）の関係をグラ
フ上にプロツトし検量線を作成したところ、回帰
式はｙ＝62.8xとなつた。 次いで、血清サンプルを検液として上記と同様
に操作し吸光度を検量線と対比したところ、総ビ
リルビン濃度は11.5mg／dlであつた。なお、公知
のジアゾ法によるビリルビン測定試薬であるビリ
ルビンＢテスト「和光」（和光純薬社製）を用い
て測定した場合は12.7mg／dlであつた。 実施例 ２ 第５表に示す濃度のイオン化合物およびドデシ
ル硫酸ナトリウム0.1％を含む同表に示すPHのト
リス塩酸緩衝液（ただし過沃素酸イオン化合物の
場合はリン酸緩衝液）を用い、実施例１と同様に
操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、第
５表に示す結果となつた。
異なり、銅イオン化合物コバルトイオン化合物の
場合はPH7.5〜10、フエリシアンイオン化合物は
PH７〜９、過沃素酸イオン化合物はPH4.5〜7.5が
好ましい。反応温度は特に限定されないが、室温
〜40℃程度で行われる。 実施例 １ 硫酸銅0.6mMおよびドデシル硫酸ナトリウム
0.1％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）３ml
と各種濃度のビリルビンコントロール水溶液
（１，２，５，10，20mg／dl）各々0.1mlを混合
し、37℃、15分反応後460nmにおける吸光度の減
少を測定した。ビリルビンコントロールの濃度
（ｙmg／dl）と減少吸光度（xOD）の関係をグラ
フ上にプロツトし検量線を作成したところ、回帰
式はｙ＝62.8xとなつた。 次いで、血清サンプルを検液として上記と同様
に操作し吸光度を検量線と対比したところ、総ビ
リルビン濃度は11.5mg／dlであつた。なお、公知
のジアゾ法によるビリルビン測定試薬であるビリ
ルビンＢテスト「和光」（和光純薬社製）を用い
て測定した場合は12.7mg／dlであつた。 実施例 ２ 第５表に示す濃度のイオン化合物およびドデシ
ル硫酸ナトリウム0.1％を含む同表に示すPHのト
リス塩酸緩衝液（ただし過沃素酸イオン化合物の
場合はリン酸緩衝液）を用い、実施例１と同様に
操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、第
５表に示す結果となつた。
【表】
実施例 ３
硫酸銅0.6mMおよび第６表に示す各界面活性
剤0.5％を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い
て実施例１と同様に操作し血清中の総ビリルビン
を求めたところ、第６表に示す結果となつた。
剤0.5％を含むトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い
て実施例１と同様に操作し血清中の総ビリルビン
を求めたところ、第６表に示す結果となつた。
【表】
実施例 ４
硫酸銅0.6mMおよびシアン化カリウムまたは
シアン化ナトリウム各0.1mMを含む0.1Mトリス
塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例１と同様に
操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、シ
アン化カリウムの場合11.6mg／dl、シアン化ナト
リウムの場合は11.9mg／dlであつた。 実施例 ５ 硫酸銅0.2mM、フエリシアン化カリウム
0.2mMおよびコール酸ナトリウム0.5％を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例
１と同様に操作し血清中の総ビリルビンを求めた
ところ、11.9mg／dlであつた。 実施例 ６ 硫酸銅0.2mM、ドデシル硫酸ナトリウム0.1％
およびシアン化カリウム0.1mMを含む0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例１と同様
に操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、
11.7mg／dlであつた。 実施例 ７ 硫酸銅0.6mMおよびドデシル硫酸ナトリウム
0.1％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用
い、実施例１に準ずる方法で血清サンプル43種類
のビリルビンを測定した。本測定値とジアゾ法に
よる測定値との相関分析をしたところ、相関係数
は0.97であつた。
シアン化ナトリウム各0.1mMを含む0.1Mトリス
塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例１と同様に
操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、シ
アン化カリウムの場合11.6mg／dl、シアン化ナト
リウムの場合は11.9mg／dlであつた。 実施例 ５ 硫酸銅0.2mM、フエリシアン化カリウム
0.2mMおよびコール酸ナトリウム0.5％を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例
１と同様に操作し血清中の総ビリルビンを求めた
ところ、11.9mg／dlであつた。 実施例 ６ 硫酸銅0.2mM、ドデシル硫酸ナトリウム0.1％
およびシアン化カリウム0.1mMを含む0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.4）を用い、実施例１と同様
に操作し血清中の総ビリルビンを求めたところ、
11.7mg／dlであつた。 実施例 ７ 硫酸銅0.6mMおよびドデシル硫酸ナトリウム
0.1％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4）を用
い、実施例１に準ずる方法で血清サンプル43種類
のビリルビンを測定した。本測定値とジアゾ法に
よる測定値との相関分析をしたところ、相関係数
は0.97であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビリルビンを含有する検液に銅イオン、コバ
ルトイオン、フエリシアンイオンまたは過沃素酸
イオンの各化合物の少なくとも一種以上と界面活
性剤および／またはシアン化物を作用せしめそれ
によるビリルビンの変化を光学的に測定すること
を特徴とする総ビリルビンの定量法。 ２ 銅イオン化合物が硫酸銅、塩化第二銅、酢酸
第二銅またはリン酸第二銅である特許請求の範囲
第１項記載の総ビリルビンの定量法。 ３ コバルトイオン化合物が硫酸コバルト、塩化
コバルト、酢酸コバルトまたは硝酸コバルトであ
る特許請求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定
量法。 ４ フエリシアンイオン化合物がフエリシアン化
ナトリウムまたはフエリシアン化カリウムである
特許請求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定量
法。 ５ 過沃素酸イオン化合物が過沃素酸、過沃素酸
ナトリウムまたは過沃素酸カリウムである特許請
求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定量法。 ６ 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ｐ−
トルエンスルホン酸、コール酸ナトリウム、タウ
ロコール酸またはトリトンＸ−100である特許請
求の範囲第１項記載の総ビリルビンの定量法。 ７ シアン化物がシアン化ナトリウムまたはシア
ン化カリウムである特許請求の範囲第１項記載の
総ビリルビンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3484383A JPS59160764A (ja) | 1983-03-02 | 1983-03-02 | 総ビリルビンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3484383A JPS59160764A (ja) | 1983-03-02 | 1983-03-02 | 総ビリルビンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59160764A JPS59160764A (ja) | 1984-09-11 |
| JPH0334591B2 true JPH0334591B2 (ja) | 1991-05-23 |
Family
ID=12425468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3484383A Granted JPS59160764A (ja) | 1983-03-02 | 1983-03-02 | 総ビリルビンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59160764A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1233755B (it) * | 1989-09-21 | 1992-04-14 | Diesse Diagnostica | Reattivo per la ricerca e la determinazione della bilirubina nelle urine. |
| DE69120373T2 (de) * | 1990-10-30 | 1997-02-06 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Verfahren zum Nachweis von Bilirubin |
| WO1995000843A1 (en) * | 1993-06-18 | 1995-01-05 | Synermed, Inc. | Assay for total bilirubin |
-
1983
- 1983-03-02 JP JP3484383A patent/JPS59160764A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59160764A (ja) | 1984-09-11 |
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