JPH0455192B2

JPH0455192B2 -

Info

Publication number: JPH0455192B2
Application number: JP59118602A
Authority: JP
Inventors: Mikiaki Tanaka; Hiromi Nawa; Masami Ishihara
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1984-06-09
Filing date: 1984-06-09
Publication date: 1992-09-02
Also published as: JPS6184A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヘテロ環とカルボキシ基とをもつ新
規なテトラゾリウム塩に関する。一般に、テトラゾリウム塩は容易に還元されて
有色のホルマザンを生成することは周知であり、
この反応を利用して還元性物質を定量する測定方
法が種々知られている。例えば、テトラゾリウム化合物は、還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（NADPH）の水素受容体として機能
するとか、スーパーオキサイドイオンやアスコル
ビン酸によつて還元され、夫々の結果として定量
的に生成するホルマザンの量に比例する発色の程
度を、吸光々度測定法で測定することによつて、
NADH、NADPH又はスーパーオキサイドイオ
ン、アスコルビン酸などの還元性物質の量を測定
することができる。従つて周知の通り、脱水素酵
素の活性度の測定、それによる基質の定量、更に
スーパーオキサイドイオンを生成する酸化酵素の
作用対象である基質の定量、即ち生体々液成分と
か食品中の添加物などの定量に極めて有用であ
る。これらの原理を、乳酸脱水素酵素（LDH）の
活性度の測定の場合に例をとつて示せば、であり、これらの反応は定量的且つ特異的に進行
するから、生成するホルマザンの色濃度を定量す
ることによつて、LDHの活性度を測定すること
ができる。また脱水素酵素を使用した生体々液成
分の測定を、コレステロールの測定について示せ
ば、であり、同様にコレステロールの量を測定するこ
とができる。次にスーパーオキサイドイオンの測
定によつて、コレステロールを定量する場合につ
いて説明すれば、コレステロール＋2O₂コレステロールオキシダーゼ ――――――――――――――――→ コレステノン＋2O₂ ^-＋2H⁺ であり、同様にしてコレステロールを定量するこ
とができる。この式に於て、：Ｘはハロゲンを示
す。かかる方法の為に、従来提供されているテトラ
ゾリウム化合物としては、３−（ｐ−ヨウ化フエ
ニル）−２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニ
ル−2Hテトラゾリウム塩（INT）、３−（４，５
−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフエニ
ル−2H−テトラゾリウム塩（MTT）、３，3′−
（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニレン）−
ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル
−2Hテトラゾリウム塩］（NO₂−TB）、２，2′−
ｐ−ジフエニレン−３，3′，５，5′−テトラフエ
ニル−2H，2′H−ジテトラゾリウム塩（Neo−
TB）」を「３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビ
ス（２，５−ジフエニル−2Hテトラゾリウム塩）
（Neo−TB）などがあり、これらが還元されて
生成するホルマザンの極大吸収波長及び分子吸光
係数を示すと、夫々、次のとありである。

【表】これらのホルマザンは、λmax＝490〜565nｍ
に、ε＝1.4×10⁴〜3.6×10⁴の吸収を示し、これ
を利用して生体試料中の体液成分を定量すること
ができる。しかしながら、生体試料中には、500nｍ近辺
に吸収をもつビリルビンやヘモグロビンが存在
し、これらの着色物質の存在が、上記ホルマザン
の極大吸収波長近傍の吸収スペクトルに少なから
ぬ影響を及ぼし、測定地を誤差を与えている。こ
のような着色物質の影響は、その測定波長が
λmax＝600nｍ以上であるときは、効果的に回避
される。そこで、これら着色物質の影響を回避する目的
で、ホルマザンのキレート化合物を測定に利用す
る試みがなされている。一般に、ホルマザンは、CO²⁺やNi²⁺などの金
属イオンとキレート化合物を生成し、その極大吸
収波長は、より長波長測ヘシフトする。例えば、
前記MTTのCoキレートは、λmax＝660nｍ（ε
＝２×10⁴）となることが知られている。しかしながら、コバルトイオンはそれ自体酸化
や還元を受け易いので、臨床化学分析に於て、測
定誤差の原因となり得る。一方、Ni²⁺キレート化合物は、酵素分析に於
て、重要な中性付近のPHに於て比較的安定性が期
待されるものであり、且つ取扱いが容易なため、
更にまた、ニツケルイオンはコバルトイオンのよ
うに酸化や還元を受け易くないので、臨床化学分
析に於ける測定に有用であると考えられるが、一
般にNiキレートは、ホルマザン化合物とのキレ
ート生成反応が遅いことで知られており
（JAPANANALYST、Vol16（1967）、『ホルマザ
ン化合物の合成と金属イオンとの反応』、1367
頁）、この問題点を解決した、Ni²⁺とをキレート
を容易に生成させるホルマザンをもたらす、新規
なテトラゾリウム塩の開発が要望されていた。本発明者らは、これらの欠点を解決すべく鋭意
研究の結果、その還元成績体であるホルマザンと
Ni²⁺とのキレート生成反応が速やかで、且つ生
成したキレートの極大吸収波長が600nｍ以上で
ある、新規なテトラゾリウム塩を見出し、本発明
を完成するに到つた。即ち、本発明は、一般式（式中、Ｘはハロゲン表わす。）で示される、２
−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（２−カルボキ
シフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウ
ム塩（以下、BTCPTと略称する。）、及びこれを
用いる生体々液成分の定量方法の発明である。本発明化合物〔〕に於けるハロゲンとして
は、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。 BTCPTは、中性付近のPHで、NADHや
NADPH、スーパーオキサイドイオン、アスコ
ルビン酸などの還元性物質によつて、要すればジ
アホラーゼやフエナジンメトサルフエート
（PMS）などの電子伝達体の存在下に、容易に還
元される。このような還元反応により生成した、BTCPT
の還元成績体であるホルマザン（以下、BTCPF
と略称する。）は、中性付近の緩衝溶液中、速や
かに、Ni²⁺と反応して、極大吸収波長600nｍ以
上に強い吸収を有するキレート化合物を生成す
る。次に、NADHの定量の場合を例にとつて、本
発明を更に詳細に説明する。実施例 NADHの定量２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（２−カル
ボキシフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウムクロリド〔BTCPT−C1〕を0.5ｍmol／
、１−メトキシフエナジンメトサルフエート
（以下、１−メトキシ−PMSと略称する。（を
12μmol／、NADHを50μmol／の濃度になる
ように溶解した50ｍＭトリス塩酸か緩衝液（PH＝
8.5）を調製し、この溶液のUV吸収を測定する。
結果を表２に示す。また、これに、トリトンＸ−100を0.2％の濃度
になるように添加した場合、及びトリトンＸ−
100を0.2％及びNiCl₂を１ｍmol／の濃度にな
るように添加した場合の極大吸収波長及び分子吸
光係数も併せて表２に示す。

〔元素分析値〕

計算値（％）：C57.87；H3.24；N16.07 実測値（％）：C57.63；H3.27；N15.93 実施例２ NADHの定量 BTCPT−Clを0.5ｍmol／、１−メトキシ−
PMSを12μmol／、トリトンＸ−100を0.2％の
濃度になるように、これらを50ｍＭトリス塩酸緩
衝液（PH＝8.5）に溶解し、発色試液とする。 NADHを各々20、40、60、80、100μmol／
の濃度になるように、50ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH＝8.5）に溶解し、標準液とする。標準液1.5mlをとり、発色試液1.5mlを加えて、
37℃恒温槽中10分間加温後、試薬盲検を対照とし
て波長515nｍに於ける吸光度を測定する。この
際の測定液中のNADHの濃度は、各々10、20、
30、40、50μmol／である。各NADH濃度（μmol／）対してプロツトし
た吸光度（OD）を結ぶ検量線は、第１図に示さ
れるように、原点を通る直線となり、検量線は良
好な定量性を示している。実施例３ NADHの定量 BTCPT−Clを0.5ｍmol／、１−メトキシ−
PMSを12μmol／、トリトンＸ−100を0.2％、
NiCl₂を１ｍmol／の濃度になるように、これ
らを50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH＝8.5）に溶解
し、発色試液とする。 NADHを各々20、40、60、80、100μmol／
の濃度になるように、50μｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH＝8.5）に溶解し、標準液とする。標準液1.5mlをとり、発色試液1.5mlを加えて、
37℃恒温槽中10分間加温後、試薬盲検を対照とし
て波長605nｍに於ける吸光度を測定する。この
際の測定液中のNADHの濃度は、各々10、20、
30、40、50μmol／である。各NADH濃度（μmol／）に対してプロツト
した吸光度（OD）を結ぶ検量線は、第２図に示
されるように、原点を通る直線となり、検量線は
良好な定量性を示している。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、各々、実施例２及び実施
例３に於て得られた検量線を表わし、横軸の各
NADH濃度（μmol／）について得られた吸光
度を縦軸に沿つてプロツトした点を結んだもので
ある。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、Ｘはハロゲンを表わす。）で示される、
２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（２−カルボ
キシフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリ
ウム塩。２一般式（式中、Ｘはハロゲンを表わす。）で示されるテ
トラゾリウム化合物を、酵素反応系に共存させ
て、還元体であるホルマザンを得、その呈色を測
定することを特徴とする生体体液成分の定量方
法。３酵素反応系が還元性物質を生成する系である
特許請求の範囲第２項記載の生体体液成分の定量
方法。４還元性物質が還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NADH）又は還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（NADPH）である、特許請求の範囲第３項記載
の生体体液成分の定量方法。５還元性物質がスーパーオキサイドイオンであ
る、特許請求の範囲第３項記載の生体体液成分の
定量方法。