JPH0698024B2 - ビリルビンの分別測定法 - Google Patents
ビリルビンの分別測定法Info
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- JPH0698024B2 JPH0698024B2 JP24492885A JP24492885A JPH0698024B2 JP H0698024 B2 JPH0698024 B2 JP H0698024B2 JP 24492885 A JP24492885 A JP 24492885A JP 24492885 A JP24492885 A JP 24492885A JP H0698024 B2 JPH0698024 B2 JP H0698024B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はビリルビンを分別測定する方法に関する。さら
に詳しくは、本発明は酵素ビリルビンオキシダーゼ（EC
1.3.3.5）およびジアゾニウム塩を用いるデルタビリル
ビンおよび抱合型ビリルビンの分別測定法に関する。ビ
リルビンは臨床化学検査における重要な測定項目の一つ
である。
に詳しくは、本発明は酵素ビリルビンオキシダーゼ（EC
1.3.3.5）およびジアゾニウム塩を用いるデルタビリル
ビンおよび抱合型ビリルビンの分別測定法に関する。ビ
リルビンは臨床化学検査における重要な測定項目の一つ
である。
従来の技術 ビリルビンはヘモグロビンの代謝によって生成する黄色
の物質で、肝臓から胆汁の色素として分泌される。血清
などの生体体液中において、ビリルビンは三種類の形態
で主に存在する。即ち、抱合型ビリルビン（以下Bcとい
う）、非抱合型ビリルビン（以下Buという）およびデル
タビリルビン（以下Ｂδという）の三種類に分類され、
これらの合計がトータルビリルビン（以下TBという）を
称される。Bcは、ビリルビンが肝臓中のUDPグルクロニ
ルトランスフエラーゼの作用でグルクロン酸抱合を受け
て生成したもので、グルクロン酸が１分子結合したモノ
グルクロナイド型または２分子結合したジグルクロナイ
ド型として存在する。Buは上記の抱合酵素の作用を受け
ておらず、遊離型ビリルビンとも称される。BcおよびBu
は血清中ではアルブミンと比較的緩く結合した状態で存
在する。第三の形態のＢδは血清アルブミンと非可逆的
に結合した状態で存在する〔J.Lab.Clin.Med.,67,294−
306,（1966）およびClin.Chem.,28,629−637,（198
2）〕。上記の各形態のビリルビンの分別定量は肝疾患
の診断の指標として重要である。
の物質で、肝臓から胆汁の色素として分泌される。血清
などの生体体液中において、ビリルビンは三種類の形態
で主に存在する。即ち、抱合型ビリルビン（以下Bcとい
う）、非抱合型ビリルビン（以下Buという）およびデル
タビリルビン（以下Ｂδという）の三種類に分類され、
これらの合計がトータルビリルビン（以下TBという）を
称される。Bcは、ビリルビンが肝臓中のUDPグルクロニ
ルトランスフエラーゼの作用でグルクロン酸抱合を受け
て生成したもので、グルクロン酸が１分子結合したモノ
グルクロナイド型または２分子結合したジグルクロナイ
ド型として存在する。Buは上記の抱合酵素の作用を受け
ておらず、遊離型ビリルビンとも称される。BcおよびBu
は血清中ではアルブミンと比較的緩く結合した状態で存
在する。第三の形態のＢδは血清アルブミンと非可逆的
に結合した状態で存在する〔J.Lab.Clin.Med.,67,294−
306,（1966）およびClin.Chem.,28,629−637,（198
2）〕。上記の各形態のビリルビンの分別定量は肝疾患
の診断の指標として重要である。
従来ビリルビンの分別測定法としては、ビリルビンとジ
アゾニウム塩との反応で生ずるアゾビリルビンを比色す
るジアゾ法、ビリルビンオキシダーゼの作用によるビリ
ルビンの黄色の消失を測定する酵素的方法、媒染された
ビリルビンの色を比色するEKTACHM法（コダツク社の登
録商標）およびカラムクロマトグラフイーによる方法
〔J.Lab.Clin.Med.,67,282−293,（1966）〕または高速
液体クロマトグラフイーによる方法〔前掲のJ.Lab.Cli
n.Med.,67,294−306,（1966）およびJ.Chromatogr.,22
6,391−402,（1981）〕が知られている。
アゾニウム塩との反応で生ずるアゾビリルビンを比色す
るジアゾ法、ビリルビンオキシダーゼの作用によるビリ
ルビンの黄色の消失を測定する酵素的方法、媒染された
ビリルビンの色を比色するEKTACHM法（コダツク社の登
録商標）およびカラムクロマトグラフイーによる方法
〔J.Lab.Clin.Med.,67,282−293,（1966）〕または高速
液体クロマトグラフイーによる方法〔前掲のJ.Lab.Cli
n.Med.,67,294−306,（1966）およびJ.Chromatogr.,22
6,391−402,（1981）〕が知られている。
生体体液中のビリルビンは、ジアゾ法により、メタノー
ルに例示されるようなジアゾニウム塩と非抱合型ビリル
ビンとのカツプリング反応を推進する添加剤を必要とす
る間接型ビリルビンおよびそれを必要としない直接型ビ
リルビンに分別される（金井泉著：臨床検査法提要，第
28版，金原出版，第XII−24頁，昭和53年）。間接型お
よび直接型の呼称はジアゾニウム塩に対するビリルビン
の反応性の相違による命名である。即ち、間接反応型の
ビリルビンはBuに相当するが、直接反応型のビリルビン
にはＢδおよびBcが含まれる。ジアゾ法を利用したＢδ
およびBcの分別測定法本願出願前には知られていない。
ルに例示されるようなジアゾニウム塩と非抱合型ビリル
ビンとのカツプリング反応を推進する添加剤を必要とす
る間接型ビリルビンおよびそれを必要としない直接型ビ
リルビンに分別される（金井泉著：臨床検査法提要，第
28版，金原出版，第XII−24頁，昭和53年）。間接型お
よび直接型の呼称はジアゾニウム塩に対するビリルビン
の反応性の相違による命名である。即ち、間接反応型の
ビリルビンはBuに相当するが、直接反応型のビリルビン
にはＢδおよびBcが含まれる。ジアゾ法を利用したＢδ
およびBcの分別測定法本願出願前には知られていない。
ビリルビンオキシダーゼを用いる酵素的分別測定法で
は、ビリルビンオキシダーゼの直接型および間接型ビリ
ルビンに対する反応性の差異を基本的に利用して、即ち
ビリルビンオキシダーゼを単独で使用して直接型ビリル
ビン（以下DBという）が、そしてビリルビンオキシダー
ゼを界面活性剤と共に使用してTBが測定される〔臨床病
理，30（補）,123,（1982）;Selected Topics in Clin.
Enzymol.,２,97−107,（1984）および特開昭59−17,99
9）。更に、最近ビリルビンオキシダーゼを使用しより
高精度にビリルビンを分別定量するための条件が報告さ
れている。例えば、pH3.5〜4.5において、または界面活
性剤の存在下pH6〜９において試料にビリルビンオキシ
ダーゼを作用せしめそれぞれDBおよびTBを測定する方法
（特開昭59−125,889および同59−130,198）、pH4.4で
反応を行いBcを測定する方法〔臨床病理，32（補）,37
3,（1984）〕、界面活性剤の存在下pH5〜６で反応を行
いBcを測定する方法（特開昭60−152,955）、界面活性
剤の存在下pH8以上で反応を行いBuを測定する方法（特
開昭60−154,162）およびグリシン−水酸化ナトリウム
緩衝剤（pH10.0）の存在下で反応を行いBcを測定する方
法〔日本臨床検査自動化学会会誌，10（補冊）,154,（1
985）〕が報告されている。
は、ビリルビンオキシダーゼの直接型および間接型ビリ
ルビンに対する反応性の差異を基本的に利用して、即ち
ビリルビンオキシダーゼを単独で使用して直接型ビリル
ビン（以下DBという）が、そしてビリルビンオキシダー
ゼを界面活性剤と共に使用してTBが測定される〔臨床病
理，30（補）,123,（1982）;Selected Topics in Clin.
Enzymol.,２,97−107,（1984）および特開昭59−17,99
9）。更に、最近ビリルビンオキシダーゼを使用しより
高精度にビリルビンを分別定量するための条件が報告さ
れている。例えば、pH3.5〜4.5において、または界面活
性剤の存在下pH6〜９において試料にビリルビンオキシ
ダーゼを作用せしめそれぞれDBおよびTBを測定する方法
（特開昭59−125,889および同59−130,198）、pH4.4で
反応を行いBcを測定する方法〔臨床病理，32（補）,37
3,（1984）〕、界面活性剤の存在下pH5〜６で反応を行
いBcを測定する方法（特開昭60−152,955）、界面活性
剤の存在下pH8以上で反応を行いBuを測定する方法（特
開昭60−154,162）およびグリシン−水酸化ナトリウム
緩衝剤（pH10.0）の存在下で反応を行いBcを測定する方
法〔日本臨床検査自動化学会会誌，10（補冊）,154,（1
985）〕が報告されている。
上述のBcの測定に関する先行技術において、最後に述べ
たグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いる方法以外
の方法では、得られた測定値にはＢδが一部含まれ、真
のBc値を表しているとはいえない。また、酵素法による
Ｂδの測定法は報告されていない。
たグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いる方法以外
の方法では、得られた測定値にはＢδが一部含まれ、真
のBc値を表しているとはいえない。また、酵素法による
Ｂδの測定法は報告されていない。
EKTACHEM法は、試料中のBuおよびBcの各々に作用する特
定の媒染剤を反応させ、生成した媒染ビリルビンの各々
異なる波長における特異吸収の強度を測定し、Buおよび
Bcの濃度を求め、これらの合計値をジアゾ法で測定した
TB値より差し引いてＢδを求めるものである。従って、
TB、BuおよびBcをそれぞれ異なる波長で検出する必要が
ある〔Clin.Biochem.,17,221−229,（1984）および特開
昭56−19,454）。
定の媒染剤を反応させ、生成した媒染ビリルビンの各々
異なる波長における特異吸収の強度を測定し、Buおよび
Bcの濃度を求め、これらの合計値をジアゾ法で測定した
TB値より差し引いてＢδを求めるものである。従って、
TB、BuおよびBcをそれぞれ異なる波長で検出する必要が
ある〔Clin.Biochem.,17,221−229,（1984）および特開
昭56−19,454）。
発明が解決しようとする問題点 前記の従来のジアゾ法によるビリルビンの測定法におい
ては、BcおよびＢδの分別測定が出来なかった。ビリル
ビンオキシダーゼによる酵素的測定法では、DB、TBおよ
びBcをそれぞれ異なるpHで測定するため、pHの移動によ
りビリルビンの分子吸光係数が変化すること、およびpH
の変動により酵素並びに基質ビリルビンが不安定になる
という欠点がある。EKTACHEM法は、三種類の異なる波長
で測定しなければならない繁雑な方法である。また、ク
ロマトグラフイー法は日常の臨床化学検査の分野では到
底採用できない繁雑な方法である。
ては、BcおよびＢδの分別測定が出来なかった。ビリル
ビンオキシダーゼによる酵素的測定法では、DB、TBおよ
びBcをそれぞれ異なるpHで測定するため、pHの移動によ
りビリルビンの分子吸光係数が変化すること、およびpH
の変動により酵素並びに基質ビリルビンが不安定になる
という欠点がある。EKTACHEM法は、三種類の異なる波長
で測定しなければならない繁雑な方法である。また、ク
ロマトグラフイー法は日常の臨床化学検査の分野では到
底採用できない繁雑な方法である。
本発明の目的は、生体体液中に存在するＢδおよびBcを
簡単かつ高精度に分別測定する方法を提供するものであ
る。より詳しくは、本発明は公知のジアゾ法における場
合と同じ検出方法でＢδおよびBcが分別測定可能な方法
を提供するものである。本発明によれば、公知のジアゾ
法によるTBの測定と同じ波長でＢδとBcの測定ができ
る。
簡単かつ高精度に分別測定する方法を提供するものであ
る。より詳しくは、本発明は公知のジアゾ法における場
合と同じ検出方法でＢδおよびBcが分別測定可能な方法
を提供するものである。本発明によれば、公知のジアゾ
法によるTBの測定と同じ波長でＢδとBcの測定ができ
る。
問題点を解決するための手段および作用 本発明は、ビリルビンオキシダーゼのビリルビンに対す
る反応性がpHによって異なること、即ちpH9乃至11の範
囲においてビリルビンオキシダーゼのＢδよびBuに対す
る反応性が最小となり、従ってそのpH範囲においてBcに
対する反応性とＢδおよびBuに対する反応性との差が最
大になるという新たな知見、およびビリルビンはジアゾ
ニウム塩とカツプリングしてアゾ色素を生成し、この生
成アゾ色素の呈色の強度がビリルビンの濃度に比例する
という公知の知見、を基礎としている。
る反応性がpHによって異なること、即ちpH9乃至11の範
囲においてビリルビンオキシダーゼのＢδよびBuに対す
る反応性が最小となり、従ってそのpH範囲においてBcに
対する反応性とＢδおよびBuに対する反応性との差が最
大になるという新たな知見、およびビリルビンはジアゾ
ニウム塩とカツプリングしてアゾ色素を生成し、この生
成アゾ色素の呈色の強度がビリルビンの濃度に比例する
という公知の知見、を基礎としている。
本発明によれば、最終的にビリルビンとジアゾニウム塩
との反応で生成したアゾ色素の呈色を測定することによ
りＢδとBcを測定することができる。本発明によるＢδ
とBcの測定は、それぞれ途中の工程が異なる二種の手段
が提供される。
との反応で生成したアゾ色素の呈色を測定することによ
りＢδとBcを測定することができる。本発明によるＢδ
とBcの測定は、それぞれ途中の工程が異なる二種の手段
が提供される。
第一の手段の原理は以下のとおりである。
（ａ） pH9乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料中に含ま
れるBcを消去する。従って生成した反応混合物中には未
反応のＢδとBuが含まれる。
ルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料中に含ま
れるBcを消去する。従って生成した反応混合物中には未
反応のＢδとBuが含まれる。
（ｂ） 上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニウ
ム塩を混合しアゾ色素を生成せしめる。この生成アゾ色
素の呈色の強度がＢδの濃度に比例する。
ム塩を混合しアゾ色素を生成せしめる。この生成アゾ色
素の呈色の強度がＢδの濃度に比例する。
（ｃ） 試料とジアゾニウム塩を混合し、DBとジアゾニ
ウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈色を測定
する。
ウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈色を測定
する。
（ｄ） 上記（ｃ）で得られた測定法より（ｂ）で得ら
れた測定値を差し引くことによりBcを算出する。
れた測定値を差し引くことによりBcを算出する。
本発明におけるＢδおよびBcの測定法は第二の手段の原
理は以下のとおりである。
理は以下のとおりである。
（ａ） pH9乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料中に含ま
れるBcを消去する。生成反応混合物Ｋには未反応のＢδ
とBuが残存する。
ルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料中に含ま
れるBcを消去する。生成反応混合物Ｋには未反応のＢδ
とBuが残存する。
（ｂ） 上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニウ
ム塩およびメタノール、カフエイン−安息香酸塩、ダイ
フイリン−酢酸塩で例示されるようなジアゾニウム塩と
Buとのカツプリング反応を推進しうる添加剤を混合し、
アゾ色素を生成せしめる。この生成アゾ色素の呈色の強
度がＢδとBuの合計に濃度に比例する。
ム塩およびメタノール、カフエイン−安息香酸塩、ダイ
フイリン−酢酸塩で例示されるようなジアゾニウム塩と
Buとのカツプリング反応を推進しうる添加剤を混合し、
アゾ色素を生成せしめる。この生成アゾ色素の呈色の強
度がＢδとBuの合計に濃度に比例する。
（ｃ） 試料、ジアゾニウム塩および上記添加剤を混合
し、TBとジアゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ
色素の呈色を測定する。
し、TBとジアゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ
色素の呈色を測定する。
（ｄ） 試料およびジアゾニウム塩を混合し、DBとジア
ゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈色を
測定する。
ゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈色を
測定する。
（ｅ） 上記（ｂ）で得られた測定値と（ｄ）で得られ
た測定値の合計より（ｃ）で得られた測定値を差し引く
ことによりＢδを算出する。
た測定値の合計より（ｃ）で得られた測定値を差し引く
ことによりＢδを算出する。
（ｆ） 上記（ｃ）で得られた測定値より（ｂ）で得ら
れた測定値を差し引くことによりBcを算出する。
れた測定値を差し引くことによりBcを算出する。
上述の二種類の手段で用いられる試薬類は同じであり、
いずれも公知のものが使用できる。
いずれも公知のものが使用できる。
本発明で用いられる緩衝剤は、pH9乃至11の範囲であれ
ばその組成は特に限定されないが、その緩衝剤中におい
てビリルビンオキシダーゼのBcに対する反応性が高く
く、その反応性とＢδおよびBuに対する反応性との差が
可能な限り大きい緩衝剤を選択することが好ましい。好
ましい緩衝剤としては、グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化
ナトリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤〔クエン酸、リン酸−カ
リウム、硼酸、ジエチルバルビツール酸および水酸化ナ
トリウムより成る;Analyst,64,490（1939）／、炭酸塩
−水酸化ナトリウム緩衝剤、ジエタノールアミン−塩酸
緩衝剤およびリン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩
衝剤が挙げられる。とくに好ましくは、Bcに対するビリ
ルビンオキシダーゼの反応性とＢδおよびBuに対するそ
れとの比が大きいグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤お
よびトリス−水酸化ナトリウム緩衝剤が挙げられる。
ばその組成は特に限定されないが、その緩衝剤中におい
てビリルビンオキシダーゼのBcに対する反応性が高く
く、その反応性とＢδおよびBuに対する反応性との差が
可能な限り大きい緩衝剤を選択することが好ましい。好
ましい緩衝剤としては、グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化
ナトリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤〔クエン酸、リン酸−カ
リウム、硼酸、ジエチルバルビツール酸および水酸化ナ
トリウムより成る;Analyst,64,490（1939）／、炭酸塩
−水酸化ナトリウム緩衝剤、ジエタノールアミン−塩酸
緩衝剤およびリン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩
衝剤が挙げられる。とくに好ましくは、Bcに対するビリ
ルビンオキシダーゼの反応性とＢδおよびBuに対するそ
れとの比が大きいグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤お
よびトリス−水酸化ナトリウム緩衝剤が挙げられる。
本発明で使用されるビリルビンオキシダーゼは黄色のビ
リルビンを酸化して緑色のビリベルジンに転換する反応
を触媒する酵素として知られている。ビリルビンオキシ
ダーゼ類は不完全菌、担子菌および植物から得られる
が、本発明で最も好ましく用いられるのは不完全菌ミロ
セシウム（Myrothecium）属に由来する酵素である。こ
の酵素は市販されており容易に入手可能である。
リルビンを酸化して緑色のビリベルジンに転換する反応
を触媒する酵素として知られている。ビリルビンオキシ
ダーゼ類は不完全菌、担子菌および植物から得られる
が、本発明で最も好ましく用いられるのは不完全菌ミロ
セシウム（Myrothecium）属に由来する酵素である。こ
の酵素は市販されており容易に入手可能である。
本発明で使用されるジアゾニウム塩は、公知のジアゾ法
によるビリルビンの測定で用いられているものを使用す
ることができる。ジアゾニウム塩の例示として、Jendra
ssik-Grof変法〔Clin.Chem.,29,31−36,（1983）〕、Ma
lloy-Evelyn法〔J.Biol.Chem.,119,481,〔1937）〕で示
されるような、スルフアニル酸、4-アミノ‐1-ナフタリ
ンスルホン酸、5-アミノ‐1-ナフタリンスルホン酸など
のアニリン化合物と亜硝酸塩塩から生成されるジアゾニ
ウム塩、および安定化ジアゾニウム塩として知られてい
る2,4-ジクロルフエニルジアゾニウム‐1,5-ナフタレン
ジスルホン酸塩、p-スルフアニルベンゼンジアゾニウム
‐1,5-ナフタリンスルホン酸塩、パラニトロベンゼンジ
アゾニウム四フツ化ホウ酸塩、ジアゾ化スルフアニル酸
四ツ化ホウ酸塩が挙げられる。更に、ジアゾニウム塩を
安定化するためにpH調節剤、安定剤を添加することもで
きる。これらの例としては、弗化硼素酸塩、硫酸塩、メ
タリン酸塩、アリル硫酸塩などの塩類、スルホサリチル
酸、メタリン酸、クエン酸、フタル酸などの緩衝剤が挙
げられる。また、ジアゾ反応停止剤としてのアスコルビ
ン酸、アゾ色素の吸収波長をシフトさせるための酒石酸
塩を添加することもできる。
によるビリルビンの測定で用いられているものを使用す
ることができる。ジアゾニウム塩の例示として、Jendra
ssik-Grof変法〔Clin.Chem.,29,31−36,（1983）〕、Ma
lloy-Evelyn法〔J.Biol.Chem.,119,481,〔1937）〕で示
されるような、スルフアニル酸、4-アミノ‐1-ナフタリ
ンスルホン酸、5-アミノ‐1-ナフタリンスルホン酸など
のアニリン化合物と亜硝酸塩塩から生成されるジアゾニ
ウム塩、および安定化ジアゾニウム塩として知られてい
る2,4-ジクロルフエニルジアゾニウム‐1,5-ナフタレン
ジスルホン酸塩、p-スルフアニルベンゼンジアゾニウム
‐1,5-ナフタリンスルホン酸塩、パラニトロベンゼンジ
アゾニウム四フツ化ホウ酸塩、ジアゾ化スルフアニル酸
四ツ化ホウ酸塩が挙げられる。更に、ジアゾニウム塩を
安定化するためにpH調節剤、安定剤を添加することもで
きる。これらの例としては、弗化硼素酸塩、硫酸塩、メ
タリン酸塩、アリル硫酸塩などの塩類、スルホサリチル
酸、メタリン酸、クエン酸、フタル酸などの緩衝剤が挙
げられる。また、ジアゾ反応停止剤としてのアスコルビ
ン酸、アゾ色素の吸収波長をシフトさせるための酒石酸
塩を添加することもできる。
本発明で用いられるジアゾニウム塩とBuとのカツプリン
グ反応を推進しうる添加剤としては、公知のジアゾ法に
よる間接型ビリルビンの測定に用いられる添加剤を用い
ることができ、例えばメタノール、カフエイン−安息香
酸塩、ダイフイリン−酢酸塩、ジメチルスルホキシドが
挙げられる。
グ反応を推進しうる添加剤としては、公知のジアゾ法に
よる間接型ビリルビンの測定に用いられる添加剤を用い
ることができ、例えばメタノール、カフエイン−安息香
酸塩、ダイフイリン−酢酸塩、ジメチルスルホキシドが
挙げられる。
本発明によるＢδおよびBcの測定のプロセスについてさ
らに詳細に説明する。
らに詳細に説明する。
前述の本発明の測定法における第一の原理によれば、pH
9乃至11の範囲の緩衝剤およびビリルビンオキシダーゼ
を含む第一の試験管を用意し、この試験管にビリルビン
が含まれる試料を添加し、約25℃−45℃においてBcが酸
化されるまでの十分な時間保持する。ビリルビンオキシ
ダーゼの使用量は試料1ml当り６−200単位が好ましい。
その後、上記で得られた反応混合物にジアゾニウム塩を
添加し、生成したアゾ色素の可視部における吸光度を光
度計で測定する。試料として標準のビリルビン溶液を用
いて作成した検量線と上記測定値を対比することにより
試料中のＢδ値が得られる。次ぎに、ジアゾニウム塩と
試料の反応を第二の試験管で行い、生成したアゾ色素の
呈色を測定する。得られた測定値と上記第一の試験管で
得られた測定値との差を検量線と対比することにより試
料中のBc値が得られる。
9乃至11の範囲の緩衝剤およびビリルビンオキシダーゼ
を含む第一の試験管を用意し、この試験管にビリルビン
が含まれる試料を添加し、約25℃−45℃においてBcが酸
化されるまでの十分な時間保持する。ビリルビンオキシ
ダーゼの使用量は試料1ml当り６−200単位が好ましい。
その後、上記で得られた反応混合物にジアゾニウム塩を
添加し、生成したアゾ色素の可視部における吸光度を光
度計で測定する。試料として標準のビリルビン溶液を用
いて作成した検量線と上記測定値を対比することにより
試料中のＢδ値が得られる。次ぎに、ジアゾニウム塩と
試料の反応を第二の試験管で行い、生成したアゾ色素の
呈色を測定する。得られた測定値と上記第一の試験管で
得られた測定値との差を検量線と対比することにより試
料中のBc値が得られる。
本発明の第二の手段においては、pH9乃至11の範囲の緩
衝剤、ビリルビンオキシダーゼ、ジアゾニウム塩および
添加剤を含む（Ｂδ＋Bu）測定用の第一の試験管、ジア
ゾニウム塩および添加剤を含むTB測定用の第二の試験
管、およびジアゾニウム塩を含むDB測定用の第三の試験
管を用意し、それぞれ試料と反応させる。得られた測定
値を前述の原理に従って処理することによりＢδとBcが
得られる。
衝剤、ビリルビンオキシダーゼ、ジアゾニウム塩および
添加剤を含む（Ｂδ＋Bu）測定用の第一の試験管、ジア
ゾニウム塩および添加剤を含むTB測定用の第二の試験
管、およびジアゾニウム塩を含むDB測定用の第三の試験
管を用意し、それぞれ試料と反応させる。得られた測定
値を前述の原理に従って処理することによりＢδとBcが
得られる。
本発明法は溶液状態での分析または乾燥状態での分析
（いわゆるドライケミストリー）のいずれの方法でも実
施できる。ドライケミストリーは、試薬が乾燥状態で含
まれた試験片を用いる分析方法をいう。乾燥試験片は公
知の方法により調製することができる（特公昭53−2811
9、特開昭54−33094、同55−44992、同56−10255、同56
−30503、同57−23859、同59−44661、同59−171864、
同59−230160）。試験片としては、ろ紙、ガラス繊維、
プラスチツク素材よりなる不織布、酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリス
チレン、ガラスなどの担体に前述の試薬を吸収、含浸ま
たは被覆したものが用いられる。試験片は、さらに湿潤
剤としてアルキルピリジニウムクロライド、ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシルベンゼン
スルホン酸塩などの界面活性剤および試薬または試料を
担体または拡散するための酢酸セルロース、ゼラチン、
デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルアクリレー
ト、ヒドロキシエチルメタクリレート、N-（ヒドロキシ
アルキル）アクリルアミド、酸化チタンなどを含むこと
もできる。本発明においては、複数の試薬層からなる多
層分析試験片を用いることができる。例えば、pH9乃至1
1の範囲の緩衝剤およびビリルビンオキシダーゼからな
る層、およびジアゾニウム塩からなる層を少なくとも多
層分析試験片によりＢδが測定される。
（いわゆるドライケミストリー）のいずれの方法でも実
施できる。ドライケミストリーは、試薬が乾燥状態で含
まれた試験片を用いる分析方法をいう。乾燥試験片は公
知の方法により調製することができる（特公昭53−2811
9、特開昭54−33094、同55−44992、同56−10255、同56
−30503、同57−23859、同59−44661、同59−171864、
同59−230160）。試験片としては、ろ紙、ガラス繊維、
プラスチツク素材よりなる不織布、酢酸セルロース、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリス
チレン、ガラスなどの担体に前述の試薬を吸収、含浸ま
たは被覆したものが用いられる。試験片は、さらに湿潤
剤としてアルキルピリジニウムクロライド、ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル、ドデシルベンゼン
スルホン酸塩などの界面活性剤および試薬または試料を
担体または拡散するための酢酸セルロース、ゼラチン、
デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルアクリレー
ト、ヒドロキシエチルメタクリレート、N-（ヒドロキシ
アルキル）アクリルアミド、酸化チタンなどを含むこと
もできる。本発明においては、複数の試薬層からなる多
層分析試験片を用いることができる。例えば、pH9乃至1
1の範囲の緩衝剤およびビリルビンオキシダーゼからな
る層、およびジアゾニウム塩からなる層を少なくとも多
層分析試験片によりＢδが測定される。
以下実験例、実施例および参考例をもって本発明をさら
に詳細に説明するが、本発明は何等これらによって限定
的に解釈されるものではない。
に詳細に説明するが、本発明は何等これらによって限定
的に解釈されるものではない。
使用した試薬、ビリルビン標準試料の調製、並びにビリ
ルビンオキシダーゼの活性の定義は以下のとおりであ
る。
ルビンオキシダーゼの活性の定義は以下のとおりであ
る。
ビリルビンオキシダーゼ溶液は、ビリルビンオキシダー
ゼ（天野製薬社製）を5mMトリス塩酸緩衝液に15単位/ml
となるように溶解した。
ゼ（天野製薬社製）を5mMトリス塩酸緩衝液に15単位/ml
となるように溶解した。
ジアゾ化試薬溶液は、4.88g/のスルフアニル酸および
0.12g/の亜硝酸ナトリウムよりなる。
0.12g/の亜硝酸ナトリウムよりなる。
カフエイン／安息香酸塩溶液は、37g/のカフエイン、
56g/の安息香酸ナトリウム、56g/の無水酢酸ナトリ
ウムおよび1g/のエチレンジアミン四酢酸よりなる。
56g/の安息香酸ナトリウム、56g/の無水酢酸ナトリ
ウムおよび1g/のエチレンジアミン四酢酸よりなる。
酒石酸塩溶液は、263g/の酒石酸ナトリウム・２水塩
および75g/の水酸化ナトリウムよりなる。
および75g/の水酸化ナトリウムよりなる。
Bcの標準溶液は、1mMジタウロビリルビン・２ナトリウ
ム塩（USバイオケミカル社製）と1mMヒト血清アルブミ
ン（シグマ社製）を1:4の割合（容量比）で混合して調
製した。
ム塩（USバイオケミカル社製）と1mMヒト血清アルブミ
ン（シグマ社製）を1:4の割合（容量比）で混合して調
製した。
Buの標準溶液は、上記Bcの標準溶液の調製と同じように
結晶ビリルビン（シグマ社製）をヒト血清アルブミンと
混合して調製した。
結晶ビリルビン（シグマ社製）をヒト血清アルブミンと
混合して調製した。
Ｂδの標準溶液は、Lauffらの方法〔Clin.Chem.,28,629
−637,（1982）〕に準じてヒト血清より分離したＢδ試
料を用いて調製した。即ち、高間接型ビリルビン患者の
血清100mlを用意し、これにリン酸でpH2.0に調製したメ
タノールを400ml加え、生成したグロブリン分画の沈澱
を−10℃で遠心分離し、除去した。得られた上清をポリ
エチレングリコールを用いて1/5量まで濃縮し、純水に
対して透析した後、カフエイン（37g/）、安息香酸ナ
トリウム（56g/）、エチレンジアミン四酢酸・２ナト
リウム（1g/）および無水酢酸ナトリウム（56g/）
からなるアルブミン解離剤を加えて可逆的にヒト血清ア
ルブミンと結合しているビリルビンを解離させ、次いで
この溶液を中空糸膜（旭化成社製 C5P型,0.8mmφ×1.2
m）に通し遊離状態のビリルビンおよびその他の低分子
物質を除去した。得られた非透過性の画分に水を加え、
上記の膜ろ過を更に続け低分子物質を十分除去した。得
られた水溶液を分離用高速液体クロマトグラフイーに供
し、Ｂδ画分を分取し、透析した後、凍結乾燥した。得
られたＢδ試料を前記Bcの標準溶液の調製の項と同様に
ヒト血清アルブミンと混合し、Ｂδ標準溶液とした。上
記の高速液体クロマトグラフイーの操作は、Nucleosil
300-7C18カラム（10φ×250mm;M・ナーゲル社製）をセ
ツトしたクロマトグラフイー装置（島津製作所製LC-4A
型）を使用し、溶媒としてメタノール（pH2.0）：ジメ
チルスルホキシド：水:1モル／硫酸水素テトラ‐n-ブ
チルアンモニウムを（40:19:40:1）から（80:19:0:1）
にグラジエントで流す逆相分配法で行った。
−637,（1982）〕に準じてヒト血清より分離したＢδ試
料を用いて調製した。即ち、高間接型ビリルビン患者の
血清100mlを用意し、これにリン酸でpH2.0に調製したメ
タノールを400ml加え、生成したグロブリン分画の沈澱
を−10℃で遠心分離し、除去した。得られた上清をポリ
エチレングリコールを用いて1/5量まで濃縮し、純水に
対して透析した後、カフエイン（37g/）、安息香酸ナ
トリウム（56g/）、エチレンジアミン四酢酸・２ナト
リウム（1g/）および無水酢酸ナトリウム（56g/）
からなるアルブミン解離剤を加えて可逆的にヒト血清ア
ルブミンと結合しているビリルビンを解離させ、次いで
この溶液を中空糸膜（旭化成社製 C5P型,0.8mmφ×1.2
m）に通し遊離状態のビリルビンおよびその他の低分子
物質を除去した。得られた非透過性の画分に水を加え、
上記の膜ろ過を更に続け低分子物質を十分除去した。得
られた水溶液を分離用高速液体クロマトグラフイーに供
し、Ｂδ画分を分取し、透析した後、凍結乾燥した。得
られたＢδ試料を前記Bcの標準溶液の調製の項と同様に
ヒト血清アルブミンと混合し、Ｂδ標準溶液とした。上
記の高速液体クロマトグラフイーの操作は、Nucleosil
300-7C18カラム（10φ×250mm;M・ナーゲル社製）をセ
ツトしたクロマトグラフイー装置（島津製作所製LC-4A
型）を使用し、溶媒としてメタノール（pH2.0）：ジメ
チルスルホキシド：水:1モル／硫酸水素テトラ‐n-ブ
チルアンモニウムを（40:19:40:1）から（80:19:0:1）
にグラジエントで流す逆相分配法で行った。
以下の実施例のＢδおよびBcの測定で用いた検量線は、
試料として0.5,1.0,2.0,5.0,10.0および20.0mg/dlのビ
リルビンを含む前述のBuの標準溶液を用い、後述の実施
例２におけるTBの測定に準じて作成した。
試料として0.5,1.0,2.0,5.0,10.0および20.0mg/dlのビ
リルビンを含む前述のBuの標準溶液を用い、後述の実施
例２におけるTBの測定に準じて作成した。
ビリルビンオキシダーゼの単位は、0.02mg/mlの結晶ビ
リルビンおよび1mMのエチレンジアミン四酢酸・２ナト
リウムを含む0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.4）中で、3
7℃においてビリルビンオキシダーゼを作用させ、440nm
における吸光度の減少を測定したとき、１分間に１マイ
クロモルのビリルビンを酸化する酵素量を１単位とし
た。
リルビンおよび1mMのエチレンジアミン四酢酸・２ナト
リウムを含む0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.4）中で、3
7℃においてビリルビンオキシダーゼを作用させ、440nm
における吸光度の減少を測定したとき、１分間に１マイ
クロモルのビリルビンを酸化する酵素量を１単位とし
た。
実験例１ ビリルビンオキシダーゼのビリルビンに対する反応性と
pHの関係は次の実験により示される。
pHの関係は次の実験により示される。
各種pHの0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液または
0.1Mユニバーサル緩衝液1.6ml、試料として前述のBc、B
uまたはＢδの標準溶液0.05mlおよびビリルビンオキシ
ダーゼ溶液0.1mlを混合し、37℃で５分間インキュベー
トし、450nmにおける吸光度の減少を測定した。ブラン
クテストは酵素溶液の代わりに5mMトリス−塩酸緩衝液
（pH8.0）を用い上記と同様に操作した。得られた試料
とブランクの反応液の吸光度の差、即ちビリルビンオキ
シダーゼの反応性（相対値）と使用した緩衝液のpH並び
にその種類との関係を第１図に示す。
0.1Mユニバーサル緩衝液1.6ml、試料として前述のBc、B
uまたはＢδの標準溶液0.05mlおよびビリルビンオキシ
ダーゼ溶液0.1mlを混合し、37℃で５分間インキュベー
トし、450nmにおける吸光度の減少を測定した。ブラン
クテストは酵素溶液の代わりに5mMトリス−塩酸緩衝液
（pH8.0）を用い上記と同様に操作した。得られた試料
とブランクの反応液の吸光度の差、即ちビリルビンオキ
シダーゼの反応性（相対値）と使用した緩衝液のpH並び
にその種類との関係を第１図に示す。
第１図から分かるように、ビリルビンオキシダーゼはBc
に対しpH4〜５付近およびpH10付近に活性の極大値を有
し、一方、Buに対する活性はpH5〜６に極大を有するも
ののBcに対する活性よりも著しく低い。Ｂδに対する活
性はpHが低い程高いが、Buに対する活性よりも更に低
い。結局pH10付近においてビリルビンオキシダーゼのBu
とＢδに対する反応性がいずれも最小となり、このpH付
近で反応を行えばBcだけが特異的に酸化されることが分
かった。緩衝液の種類は、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液の方がBcに対する反応性とBuおよびＢδに対する
それとの比がより大であるため好ましい。
に対しpH4〜５付近およびpH10付近に活性の極大値を有
し、一方、Buに対する活性はpH5〜６に極大を有するも
ののBcに対する活性よりも著しく低い。Ｂδに対する活
性はpHが低い程高いが、Buに対する活性よりも更に低
い。結局pH10付近においてビリルビンオキシダーゼのBu
とＢδに対する反応性がいずれも最小となり、このpH付
近で反応を行えばBcだけが特異的に酸化されることが分
かった。緩衝液の種類は、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液の方がBcに対する反応性とBuおよびＢδに対する
それとの比がより大であるため好ましい。
実験例２ 実験例１において、緩衝液として第１表に示す0.1Mの各
種緩衝液（pH10.0）を使用した以外は同様に操作した。
得られた測定値（相対値）を第１表に示す。
種緩衝液（pH10.0）を使用した以外は同様に操作した。
得られた測定値（相対値）を第１表に示す。
第１表から分かるように、pH10.0のグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液またはトリス−水酸化ナトリウム緩衝液
を使用した場合、Bcに対するBuおよびＢδの交叉はいず
れも２％以下であることが分かる。その他の緩衝液を使
用した場合でも、Bcに対するBuの交叉は約７％以下、同
じくＢδの交叉は約４％以下であった。
トリウム緩衝液またはトリス−水酸化ナトリウム緩衝液
を使用した場合、Bcに対するBuおよびＢδの交叉はいず
れも２％以下であることが分かる。その他の緩衝液を使
用した場合でも、Bcに対するBuの交叉は約７％以下、同
じくＢδの交叉は約４％以下であった。
実施例１ 血清または胆汁試料0.05ml、0.1Mグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液（pH10.0）0.1mlおよびビリルビンオキシ
ダーゼ溶液0.05mlを混合し、37℃において５分間インキ
ュベートした。得られた反応混合物に0.05M塩酸0.25ml
およびジアゾ化試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間
放置した後、さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05m
l、酒石酸塩溶液0.4mlおよびカフエイン／安息香酸塩溶
液0.5mlを添加し、600nmにおける吸光度を測定して測定
値Ａを得た。
リウム緩衝液（pH10.0）0.1mlおよびビリルビンオキシ
ダーゼ溶液0.05mlを混合し、37℃において５分間インキ
ュベートした。得られた反応混合物に0.05M塩酸0.25ml
およびジアゾ化試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間
放置した後、さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05m
l、酒石酸塩溶液0.4mlおよびカフエイン／安息香酸塩溶
液0.5mlを添加し、600nmにおける吸光度を測定して測定
値Ａを得た。
次ぎに、上述した操作において、ビリルビンオキシダー
ゼ溶液の代わりに5mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）の0.05
mlを用いた以外は同じ操作を行い、測定値Ｂを得た。
ゼ溶液の代わりに5mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）の0.05
mlを用いた以外は同じ操作を行い、測定値Ｂを得た。
測定値Ａおよび計算値（Ｂ−Ａ）を検量線と対比するこ
とにより、それぞれ試料中のＢδおよびBc濃度を求め
た。得られたＢδおよびBcの値を第２表に示す。また、
比較のため、前述のＢδ試料の調製の項の高速液体クロ
マトグラフイーにおいて、4.6φ×250mmのカラムを使用
した以外は同じ方法により上記試料を分析し、得られた
値を第２表のHPLC法の欄に示す。本発明法で得られた値
とHPLC法で得られた値とは極めて相関関係が高いことが
分かる。
とにより、それぞれ試料中のＢδおよびBc濃度を求め
た。得られたＢδおよびBcの値を第２表に示す。また、
比較のため、前述のＢδ試料の調製の項の高速液体クロ
マトグラフイーにおいて、4.6φ×250mmのカラムを使用
した以外は同じ方法により上記試料を分析し、得られた
値を第２表のHPLC法の欄に示す。本発明法で得られた値
とHPLC法で得られた値とは極めて相関関係が高いことが
分かる。
参考例１ 実施例１において、試料としてそれぞれ0.5−20.0mg/dl
のビリルビンを含むBuの標準溶液またはBcの標準溶液を
用いた以外は同じ操作を行った。ＢδまたはBcとして得
られた測定値を第３表に示す。本発明法で得られたＢδ
値およびBc値はBuをほとんど測り込まず、また本発明法
で得られたＢδ値はBcをほとんど測り込まないことが分
かる。
のビリルビンを含むBuの標準溶液またはBcの標準溶液を
用いた以外は同じ操作を行った。ＢδまたはBcとして得
られた測定値を第３表に示す。本発明法で得られたＢδ
値およびBc値はBuをほとんど測り込まず、また本発明法
で得られたＢδ値はBcをほとんど測り込まないことが分
かる。
第３表に示すように、Bc標準溶液を実施例１の方法で測
定した場合のビリルビンの測定値は現実の濃度よりも低
い。このことは、Bc標準として使用したジ抱合型ビリル
ビンはこれを直接ジアゾ法で測定した場合、その回収率
はわずか70±５％であるとのD.H.LoおよびT-W.Wuの報告
〔前掲のClin.Chem.,29,31−36,（1983）〕により説明
される。
定した場合のビリルビンの測定値は現実の濃度よりも低
い。このことは、Bc標準として使用したジ抱合型ビリル
ビンはこれを直接ジアゾ法で測定した場合、その回収率
はわずか70±５％であるとのD.H.LoおよびT-W.Wuの報告
〔前掲のClin.Chem.,29,31−36,（1983）〕により説明
される。
実施例２ 実施例１で用いたと同じ血清または胆汁試料0.05ml、0.
1Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.0）0.1ml
およびビリルビンオキシダーゼ溶液0.05mlを混合し、37
℃において５分間インキュベートした。得られた反応混
合物にカフエイン／安息香酸塩溶液0.5mlおよびジアゾ
法試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間放置した後、
さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05ml、酒石酸塩溶
液0.4mlおよび0.05M塩酸0.25mlを添加し、600nmにおけ
る吸光度を測定して測定値Ａを得た。
1Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.0）0.1ml
およびビリルビンオキシダーゼ溶液0.05mlを混合し、37
℃において５分間インキュベートした。得られた反応混
合物にカフエイン／安息香酸塩溶液0.5mlおよびジアゾ
法試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間放置した後、
さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05ml、酒石酸塩溶
液0.4mlおよび0.05M塩酸0.25mlを添加し、600nmにおけ
る吸光度を測定して測定値Ａを得た。
上述した操作において、ビリルビンオキシダーゼ溶液の
代わりに5mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）の0.05mlを用い
た以外は同じ操作を行い測定値Ｂを得た。
代わりに5mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）の0.05mlを用い
た以外は同じ操作を行い測定値Ｂを得た。
上記と同じ試料0.05ml、0.1Mグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH10.0）0.1mlおよび5mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）0.05mlを混合し、37℃において５分間インキ
ュベートした。得られた反応混合物に0.05M塩酸0.25ml
およびジアゾ化試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間
放置した後、さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05m
l、酒石酸塩溶液0.4mlおよびカフエイン／安息香酸塩溶
液0.5mlを添加し、600nmにおける吸光度を測定して測定
値Ｃを得た。
ム緩衝液（pH10.0）0.1mlおよび5mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）0.05mlを混合し、37℃において５分間インキ
ュベートした。得られた反応混合物に0.05M塩酸0.25ml
およびジアゾ化試薬溶液0.2mlを加え、室温にて10分間
放置した後、さらに40g/のアスコルビン酸溶液0.05m
l、酒石酸塩溶液0.4mlおよびカフエイン／安息香酸塩溶
液0.5mlを添加し、600nmにおける吸光度を測定して測定
値Ｃを得た。
上記で得られた測定値を計算処理し、即ち（Ａ＋Ｃ−
Ｂ）および（Ｂ−Ａ）を算出し、検量線と対比すること
により、それぞれ試料中のＢδおよびBc濃度を求めた。
得られたＢδおよびBcの値、および前記HPLC法の値を第
４表に示す。本発明法で得られた値とHPLC法で得られた
値と極めて相関関係が高いことが分かる。
Ｂ）および（Ｂ−Ａ）を算出し、検量線と対比すること
により、それぞれ試料中のＢδおよびBc濃度を求めた。
得られたＢδおよびBcの値、および前記HPLC法の値を第
４表に示す。本発明法で得られた値とHPLC法で得られた
値と極めて相関関係が高いことが分かる。
参考例２ 実施例２において、試料としてBuの標準溶液またはBcの
標準溶液を用いた以外は同じ操作を行った。得られたＢ
δ値およびBc値はBuをほとんど測り込まず、また得られ
たＢδ値はBcをほとんど測り込まないことが確認され
た。
標準溶液を用いた以外は同じ操作を行った。得られたＢ
δ値およびBc値はBuをほとんど測り込まず、また得られ
たＢδ値はBcをほとんど測り込まないことが確認され
た。
発明の効果 本発明に従えば、生体体液中のＢδおよびBcを簡単な方
法で、高精度に分別測定することができる。本発明によ
れば、ＢδとBcの測定が、従来のジアゾ法によるTBの測
定と共通の、単一の波長で測定することができる。
法で、高精度に分別測定することができる。本発明によ
れば、ＢδとBcの測定が、従来のジアゾ法によるTBの測
定と共通の、単一の波長で測定することができる。
第１図はビリルビンオキシダーゼのBc、BuおよびＢδに
対する反応性とpHおよび用いた緩衝液の種類との関係を
示す図面である。
対する反応性とpHおよび用いた緩衝液の種類との関係を
示す図面である。
Claims (16)
- 【請求項１】液体試料中のビリルビンを分析する方法に
おいて、 （ａ） pH9乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートすること； （ｂ） 上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニウ
ム塩を混合し生成したアゾ色素を呈色を測定すること； の各工程より成ることを特徴とするデルタビリルビンの
測定法。 - 【請求項２】緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナ
トリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム
緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナト
リウム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤で
ある特許請求の範囲第１項記載のデルタビリルビンの測
定法。 - 【請求項３】工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲
第１項記載のデルタビリルビンの測定法。 - 【請求項４】工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請
求の範囲第１項記載のデルタビリルビンの測定法。 - 【請求項５】液体試料中のビリルビンを分析する方法に
おいて、 （ａ） 試料とジアゾニウム塩を混合し生成したアゾ色
素の呈色を測定すること； （ｂ） pH9乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成した
反応混合物とジアゾニウム塩を混合し生成したアゾ色素
の呈色を測定すること； （ｃ） 上記（ａ）で得られた測定値より（ｂ）で得ら
れた測定値を差し引くこと； の各工程より成ることを特徴とする抱合型ビリルビンの
測定法。 - 【請求項６】緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナ
トリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム
緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナト
リウム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤で
ある特許請求の範囲第５項記載の抱合型ビリルビンの測
定法。 - 【請求項７】工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲
第５項記載の抱合型ビリルビンの測定法。 - 【請求項８】工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請
求の範囲第５項記載の抱合型ビリルビンの測定法。 - 【請求項９】液体試料中のビリルビンを分析する方法に
おいて、 （ａ） pH9乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成した
反応混合物とジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と非
抱合型ビリルビンとのカツプリング反応を推進しうる添
加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること； （ｂ） 試料およびジアゾニウム塩を混合し生成したア
ゾ色素の呈色を測定すること； （ｃ） 試料、ジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と
非抱合型ビリルビンとのカツプリング反応を推進しうる
添加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定するこ
と； （ｄ） 上記（ａ）で得られた測定値と（ｂ）で得られ
た測定値の合計より（ｃ）で得られた測定値を差し引く
こと； の各工程より成ることを特徴とするデルタビリルビンの
測定法。 - 【請求項１０】緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化
ナトリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナ
トリウム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤
である特許請求の範囲第９項記載のデルタビリルビンの
測定法。 - 【請求項１１】工程が溶液状態で行われる特許請求の範
囲第９項記載のデルタビリルビンの測定法。 - 【請求項１２】工程が乾燥試験片を用いて行われる特許
請求の範囲第９項記載のデルタビリルビンの測定法。 - 【請求項１３】液体試料中のビリルビンを分析する方法
において、 （ａ） 9pH乃至11の範囲の緩衝剤の存在下試料とビリ
ルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成した
反応混合物とジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と非
抱合型ビリルビンとのカツプリング反応を推進しうる添
加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること； （ｂ） 試料、ジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と
非抱合型ビリルビンとのカツプリング反応を推進しうる
添加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定するこ
と； （ｃ） 上記（ｂ）で得られた測定値より（ａ）で得ら
れた測定値を差し引くこと； の各工程より成ることを特徴とする抱合型ビリルビンの
測定法。 - 【請求項１４】緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化
ナトリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナ
トリウム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤
である特許請求の範囲第13項記載の抱合型ビリルビンの
測定法。 - 【請求項１５】工程が溶液状態で行われる特許請求の範
囲第13項記載の抱合型ビリルビンの測定法。 - 【請求項１６】工程が乾燥試験片を用いて行われる特許
請求の範囲第13項記載の抱合型ビリルビンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24492885A JPH0698024B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ビリルビンの分別測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24492885A JPH0698024B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ビリルビンの分別測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62105047A JPS62105047A (ja) | 1987-05-15 |
| JPH0698024B2 true JPH0698024B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=17126051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24492885A Expired - Lifetime JPH0698024B2 (ja) | 1985-10-31 | 1985-10-31 | ビリルビンの分別測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698024B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0675072B2 (ja) * | 1986-04-16 | 1994-09-21 | 協和メデックス株式会社 | 間接ビリルビンの定量法及び定量用キツト |
| JP2856757B2 (ja) * | 1989-03-13 | 1999-02-10 | ユニチカ株式会社 | 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 |
| JP3734115B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2006-01-11 | 日東紡績株式会社 | ビリルビン画分の測定方法 |
| JP4785926B2 (ja) * | 2007-04-27 | 2011-10-05 | アークレイ株式会社 | ビリルビン測定方法及びビリルビン測定に用いる分析用具 |
-
1985
- 1985-10-31 JP JP24492885A patent/JPH0698024B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62105047A (ja) | 1987-05-15 |
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