CN1176388A - 试剂组合物、试验片和分析盒 - Google Patents

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Abstract

检测液体样品中分析物的试剂组合物,它包含由通式(1)表示的四(N－羟基烷基)乙二胺的铁(Ⅲ)络合物(其中n、m、p和q各自为1—3的整数)。

Description

试剂组合物、试验片和分析盒
本发明涉及测定液体样品中特殊成分的试剂组合物和试验片，更具体地讲，涉及测定特殊成分的试剂组合物和试验片，藉此消除液体样品(诸如血清、血浆、尿或培养介质之类)中诸如抗坏血酸之类还原物质的影响。
诸如血清、血浆、尿或培养介质之类的液体样品中含有具有还原作用的多种物质。这类还原物质的实例包括抗坏血酸和尿酸。
用借助于氧化还原反应检测例如葡萄糖或潜血的试验片进行测定期间，液体样品中诸如抗坏血酸之类的还原物质的浓度越高，它们在降低分析物测量值方面的影响就越大。
因此已知许多方法来避免这类还原物质的影响。
例如，日本专利申请公开No.52-150692公开了用抗坏血酸氧化酶避免这类影响的方法。然而，该方法的问题在于抗坏血酸氧化酶很昂贵，并且不稳定。
日本专利申请公开No.59-230161公开了用铜离子氧化抗坏血酸的方法。然而该方法的问题在于金属离子直接氧化氧化还原染料，并引起染料变色。
日本专利申请公开No.56-151358公开了用碘酸盐氧化抗坏血酸的方法。然而该方法的问题在于氧化性能太强，碘酸盐直接氧化氧化还原染料，引起染料变色。
在日本专利申请公开No.59-187266(日本专利公告No.1-41223)中，加入由式R1R2NCH2COOH或R3R4NXNR5CH2COOH表示的化合物的铁(II)或铁(III)络合物，或加入葡萄糖酸的铁(II)或铁(III)络合物，以在测量体液成分期间消除抗坏血酸。然而该方法的问题在于金属离子直接氧化氧化还原染料，引起染料变色。
在日本专利申请公开No.59-193354(日本专利公告No.4-18630)中，将多羧基烷胺的铁(III)络合物加入组合物中，以检测过氧化物活性物质。然而该方法的缺点在于金属离子直接氧化氧化还原染料，引起染料变色。
为了克服上述缺点，本申请人已研制出一种检测过氧化物活性物质的组合物(日本专利申请公开No.6-148168，美国专利No.5,439,827)，它包含有机氢过氧化物、色原体和通式[(OOC-X-COO)3Fe]Me3表示的铁络合物，其中X为亚烷基基团，而M为一价阳离子。使用该组合物可以有效地消除还原物质的影响，但该影响是温度依赖性的。例如在设备中将温度调至大约37℃进行测量时，测量可以准确，但在目测期间，在室温观察比色表时，仍有待改进。组合物本身的储藏稳定性也有待改进。
本发明将克服上述缺点，并将提供试剂组合物，也提供试验片和分析盒，其中可改进了储藏稳定性，并且甚至在室温可消除还原物质、特别是抗坏血酸的影响。
发明人做了大量研究以克服上述缺点，结果发现，当试剂组合物含有四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物时，可以改进储藏稳定性，并且可以测定液体样品中的分析物，而在室温完全不受抗坏血酸等的影响。根据该发现，完成了本发明。
本发明提供检测液体样品中分析物的试剂组合物，它包含由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物：其中n、m、p和q各自为1-3的整数。
氧化还原反应中的反应性物质或催化剂是分析物的实例。络合物的通式(1)中的符号n、m、p和q最好满足n＝m和p＝q。
本发明也提供检测液体样品中分析物的试验片，后者包含载体和载于载体上的上述试剂组合物。
本发明还提供检测液体样品中分析物的分析盒，它包含氧化还原反应的反应性物质或催化剂、因氧化还原反应而变色的色原体、以及包含由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物的含络合物组合物。
本发明使得提供试剂组合物、试验片和分析盒成为可能，藉此甚至在室温也可消除诸如抗坏血酸之类还原物质的影响，并且达到出色的储藏稳定性。
图1描述了本发明试验片的温度依赖性；
图2描述了比较例试验片的温度依赖性；
图3描述了本发明试验片的储藏稳定性；
图4描述了比较例试验片的储藏稳定性。
本发明试剂组合物是检测液体样品中分析物的试剂组合物，其特征在于包含由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物。
本发明中提到的液体样品包括诸如血清、血浆、尿酸和多种类型培养介质的体液。本发明试剂组合物的分析物实例包括在上述液体样品中的成分，该成分可以作为氧化还原反应中的反应性物质或催化剂。本发明试剂组合物中用于检测分析物的成分的实例包括那些可以同样作为氧化还原反应中反应性物质或催化剂的成分。根据分析物，可以按需要选择检测分析物的成分。例如，要检测潜血时，分析物可以是血红蛋白，那么试剂组合物可以含有过氧化物物质和因氧化而变色的色原体。本文所用的“催化剂”包括化学催化剂和酶。反应性物质是指因氧化还原反而转化为另一物质、或在氧化状态中改变的物质。
本发明可以用于通过氧化还原反应可以检测到的任何物质。例如，分析物的实例包括过氧化物物质、葡萄糖、胆固醇、甘油、丙酮酸、尿酸等。试剂组合物含有的检测分析物的成分应该根据分析物进行选择。例如，如果分析物为葡萄糖，那么试剂组合物可以含有葡萄糖氧化酶，并与色原体(由于葡萄糖的氧化产生的过氧化氢而变色)一起使用。同样地，试剂组合物当分析物为胆固醇时，可以含有胆固醇氧化酶；当分析物为甘油时，可以含有甘油氧化酶；当分析物为丙酮酸时，可以含有丙酮酸氧化酶；当分析物为尿酸时，可以含有尿酸氧化酶(尿酸酶)。因氧化而变色的色原体实例包括3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、3，3’-二氨基联苯胺和邻二甲基联苯胺。本发明提到的色原体为因氧化而变为彩色或变色、即颜色改变的色原体，包括那些发光(诸如荧光类型之类)色原体。
试剂组合物除检测分析物的成分外，还可以含有色原体，但对于那些在试剂组合物储藏期间可以进行氧化还原反应的试剂组合物，在有过氧化物物质和色原体的情况下，色原体可以与试剂组合物分离，并且可以分别以分析盒的形式制备。下面描述分析盒。
除本发明试剂组合物含有由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物外，如上所述，本发明试剂组合物与利用氧化还原反应检测分析物的普通试剂组合物没有区别。
为什么加入上述络合物可提供本发明作用的原因如下：当例如要检测潜血时，血红蛋白为分析物，试剂组合物含有过氧化物物质和由于氧化还原而变色的色原体。当试剂组合物溶于含有血红蛋白的样品溶液时，色原体氧化，并由于血红蛋白的类过氧化物酶活性引起的过氧化物物质和色原体的反应而变色。这时，常规试剂组合物的问题在于，当液体样品中存在还原物质时，由于还原物质干扰色原体的氧化，测量值降低。相反，本发明试剂组合物中的上述络合物可以氧化这类还原物质，而不氧化色原体，使得分析物可以测定，而无此类还原物质的影响。因此，本发明的试剂组合物在分析物为氧化还原反应中的反应性物质或催化剂时，特别有效。
在用于本发明络合物的通式(1)中，最好n＝m，而p＝q，更好是n＝m＝p＝q，特别好是n＝m＝p＝q＝2(乙二胺四乙醇)。
本发明的试剂组合物可以为粉末、颗粒、片剂等形式，或为溶液形式。
用于本发明的试剂组合物最好含有缓冲液。根据配基选择缓冲液，使得络合物在该pH下稳定，并表现适宜的氧化能力。在该pH下配基不氧化诸如四甲基联苯胺之类的色原体，提供一种状态，使得具有氧化能力的络合物只允许诸如抗坏血酸之类的还原物质氧化。选择缓冲液的类型和量，使得液体形式的试剂组合物的pH、或为染料形式并含有络合物的试剂组合物溶于水中时获得的水溶液的pH最好为5-8、更好为5.5-7。尽管可以使用多种类型的缓冲液，但最好是在该范围内证明具有出色缓冲作用的那些缓冲液。具体实例包括诸如三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)和Hepes之类的碱和诸如柠檬酸、草酸、磷酸、苹果酸和丙二酸之类的酸，可以从中选择和混合适宜的碱和盐。其中，含有三(羟甲基)-氨基甲烷和丙二酸的缓冲液特别适宜。
试剂组合物也含有表面活性剂。这是因为表面活性剂可以提高试剂组合物和分析物之间的反应性和敏感性。尽管推荐阴离子类型、特别是二异辛基磺基丁二酸钠或月桂基磺酸钠的表面活性剂，但可以使用任何阴离子、阳离子、非离子和两性表面活性剂。可以混合使用两种或多种类型的表面活性剂。试剂组合物也可以含有诸如2，6-二甲基喹啉之类的致敏剂。试剂组合物还可以含有分析体系中所需的辅酶等。
本发明的试验片为检测液体样品中分析物的试验片，包含载体和载于载体上的诸如上述的试剂组合物。
载体可以为可固定上述试剂组合物的载体，可以使用通常用于试验片的任何载体。具体实例包括滤纸、纺织物、非织造织物、玻璃滤器、膜滤器、陶瓷、泉华等。
本发明的试验片可以用载体和诸如上述的试剂组合物，用生产试验片的常规方法生产。例如，载体可以通过将载体浸入溶解试剂组合物的溶液(浸渍溶液)中，或用上述溶液涂布载体等，用溶液浸渍载体，然后可以干燥载体。当这时同时存在色原体和诸如过氧化物物质之类的氧化物质时，色原体有时在试验片储藏期间氧化，因此最好制备分别含有过氧化物物质和色原体的浸渍溶液，并且载体在两个阶段中用这些浸渍溶液浸渍。这时当将诸如聚乙烯吡咯烷酮之类的粘合剂加入其中一种溶液时，可以防止诸如氢过氧化异丙基苯之类的过氧化物物质的挥发，并且可以减少色原体和过氧化物物质之间的接触。其中一种溶液可以含有2，6-二甲基喹啉之类的致敏剂。
通过首先生成四(N-羟基烷基)乙二胺和铁(III)盐的络合物，然后将所得的络合物加入浸渍溶液中，或将四(N-羟基烷基)乙二胺和铁(III)盐溶于浸渍溶液中以生成络合物，可以在浸渍溶液中提供四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物。铁(III)盐的实例包括氯化铁、硫酸铁和磷酸铁。
含有本发明试剂组合物的浸渍溶液，即含有由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物的浸渍溶液，最好将其pH调至5-8，更好是5.5-7。
本发明的试验片可以为长条形式，它可以用双面胶带固定到由树脂(诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯之类)制成的部分组成的支持物的一端。
本发明的分析盒为检测液体样品中分析物的分析盒，包含氧化还原反应的反应性物质或催化剂、由氧化还原反应而变色的色原体和含有由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物的含络合物组合物。
本发明分析盒中装有含有上述络合物的含络合物组合物。可以含有未经改变的含络合物组合物，或溶于水时可以构成上述络合物的成分。溶于水时构成上述络合物的成分的实例包括乙二胺四乙醇和氯化铁的混合物。
含络合物组合物也可以含有诸如Tris-丙二酸之类的缓冲液、诸如二异辛基磺基丁二酸钠和月桂基磺酸钠之类的表面活性剂和诸如2，6-二甲基喹啉之类的添加剂等。
氧化还原反应的反应性物质或催化剂为通过由与色原体的氧化还原反应而引起色原体变色来检测分析物的成分。具体地说，在四甲基联苯胺用作色原体，而诸如血红蛋白之类的具有类过氧化物活性的物质用作分析物的情况下，使用诸如氢过氧化异丙基苯之类的过氧化物物质。
含络合物组合物可以含有色原体和氧化还原反应的反应性物质或催化剂，但对于那些在试剂组合物储藏期间可以发生氧化还原反应的成分，象在有过氧化物物质和色原体的情况下，色原体可以与试剂组合物分离，可以分别以分析盒的形式制备。从减少分析盒结构成分的角度来看，含络合物组合物最好含有色原体和氧化还原反应的反应性物质或催化剂中的一种。
含络合物组合物、色原体和氧化还原反应反应性物质或催化剂每一种可以为粉末、颗粒、片剂等形式，或为液体形式。
通过将含络合物组合物、色原体和氧化还原反应反应性物质或催化剂溶于样品溶液中，并测定着色程度来进行分析。
实施例
下面参考实施例详细描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
检测尿中潜血的试剂组合物和试验片的生产
将多种成分按照以下配方1混合，制备其中溶解本发明试剂组合物的第一阶段浸渍溶液，以及制备含色原体的第二阶段浸渍溶液。
将滤纸(Whatman，3MMchr用第一阶段浸渍溶液浸渍，从液体中取出，然后在50℃风干10分钟。然后将其用第一阶段浸渍溶液浸渍，从液体中取出，然后在50℃风干10分钟，获得试验片。
将所得的试验片切成5mm×5mm大小，然后用双面胶带固定到5mm×80mm白色聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)(厚0.25mm)的顶端。
配方1
第一阶段浸渍溶液
蒸馏水                                  10ml
2M Tris-丙二酸缓冲液(pH5.5)             36ml
乙二胺四乙醇                            1.18g
氯化铁                                  1.35g
氢过氧化异丙基苯                        4ml
二异辛基磺基丁二酸钠                    0.3g
月桂基磺酸钠                            0.3g
甲醇                                    50ml
(第一阶段浸渍pH：6.8)
第二阶段浸渍溶液
3，3’，5，5’-四甲基联苯胺             2g
二异辛基磺基丁二酸钠                    0.3g
2，6-二甲基喹啉                         1.58g
甲苯                                    70ml
20％聚乙烯吡咯烷酮K-30(BASF)乙醇溶液    20ml
实施例2
检测尿中潜血的分析盒
将配方1的第一和第二阶段浸渍溶液分别用作含络合物组合物溶液和色原体溶液，获得检测尿中潜血的分析盒。
比较例1
按照以下配方2混合多种成分来制备第一和第二阶段浸渍溶液，将滤纸用这些浸渍溶液浸渍并干燥，制备试验片，然后用实施例1的同样方法将试验片固定到PET上。
配方2
第一阶段浸渍溶液
蒸馏水                                 10ml
2M Tris-丙二酸缓冲液(pH5.5)            36ml
草酸铁铵                               2.14g
氢过氧化异丙基苯                       4ml
二异辛基磺基丁二酸钠                   0.3g
月桂基磺酸钠                           0.3g
甲醇                                   50ml
第二阶段浸渍溶液
3，3’，5，5’-四甲基联苯胺            2g
二异辛基磺基丁二酸钠                   0.3g
2，6-二甲基喹啉                        1.57g
甲苯                                   70ml
20％聚乙烯吡咯烷酮K-30(BASF)乙醇溶液   20ml
实施例3
血红蛋白的分析
将预定量的血红蛋白(小牛血)和抗坏血酸加入人尿中，然后溶解以制备试验尿溶液。将实施例1和比较例1的试验片的滤纸成分浸入试验尿溶液中，立刻取出，让其在固定温度反应固定时间，然后用色差仪(SZ-∑90型，由Nihon Denshoku Kogyo生产)在640nm测定其反射比。
下面给出测量的细节。
(1)抗坏血酸影响的温度依赖性
通过在20℃、30℃和37℃保持恒定的时间进行反应，然后通过测定反射比值检查浸于尿溶液(通过加入0-100mg/dL抗坏血酸和0mg/dL、0.06mg/dL和0.2mg/dL血红蛋白获得的)的试验片和在不同温度下抗坏血酸的影响。图1给出了实施例1的试验片的结果，而图2给出了比较例1的试验片的结果。
在图1和图2中，(a)显示在反应期间20℃的结果，(b)显示30℃的结果，(c)显示37℃的结果。Hb表示血红蛋白，下面的数值显示样品中的浓度(mg/dL)。
如图所示，实施例1和比较例1的试验片浸于不含抗坏血酸而含有或者0.06mg/dL、或者0.2mg/dL的血红蛋白的试验尿溶液都变为可爱的蓝色。
然而，当抗坏血酸加入试验尿溶液时，在试验尿溶液温度为20℃以及抗坏血酸浓度为100mg/dL的条件下，比较例1的试验片不变为显示0.06mg/dL或0.2mg/dL的血红蛋白存在的蓝色。
相反，实施例1的试验片在不同温度下，甚至在有100mg/dL抗坏血酸的条件下变为蓝色。
(2)试验片的储藏稳定性
将储藏在40℃的实施例1和比较例1的试验片在经过一定时间后，在试验尿溶液中浸渍，然后立刻取出，测定反射比。监测在整个期间测量值的变化，以检查试验片的储藏稳定性。加入0mg/hdL、0.08mg/dL和0.2mg/dL血红蛋白和0mg/dL、20mg/dL和50mg/dL抗坏血酸来制备所用的试验尿溶液。图3给出了实施例1的试验片的测定结果，而图4给出了比较例1的试验片的测定结果。
在图3和图4中，Hb表示血红蛋白，而AsA表示抗坏血酸。下面的数值显示不同样品中的浓度(mg/dL)。
实施例1的试验片甚至在40℃储藏16星期后，浸入试验尿溶液时继续变为可爱的蓝色，而比较例1的试验片在整个期间蓝色变得越来越少。
根据上述结果可清楚看出，与比较例的试验片相比，本发明的试验片在室温下较少受抗坏血酸的影响，并且甚至当储藏一段时间时变色更好。也就是说，抗坏血酸影响的温度依赖性和储藏稳定性更好。

Claims (11)

1.检测液体样品中分析物的试剂组合物，它包含通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物：
Figure A9710555300021
其中n、m、p和q各自独立地为1-3的整数。
2.按照权利要求1的试剂组合物，其中所述液体样品为体液。
3.按照权利要求1的试剂组合物，其中所述分析物为氧化还原反应的反应性物质或催化剂。
4.按照权利要求1的试剂组合物，其中在权利要求1定义的通式(1)中，所述n、m、p和q满足n＝m和p＝q。
5.按照权利要求1的试剂组合物，还包含表面活性剂。
6.按照权利要求5的试剂组合物，其中所述表面活性剂选自二异辛基磺基丁二酸钠或月桂基磺酸钠。
7.按照权利要求1的试剂组合物，还包含缓冲液。
8.按照权利要求7的试剂组合物，其中所述缓冲液使得当含有该络合物的试剂组合物溶于水中时获得的水溶液的pH值调至5-8。
9.按照权利要求7的试剂组合物，其中所述缓冲液为三(羟甲基)-氨基甲烷和马来酸。
10.检测液体样品中分析物的试验片，它包含载体和载于载体上的权利要求1定义的试剂组合物。
11.检测液体样品中分析物的分析盒，它包含氧化还原反应的反应性物质或催化剂、由氧化还原反应而变色的色原体和含有由通式(1)表示的四(N-羟基烷基)乙二胺的铁(III)络合物的含络合物组合物：
Figure A9710555300031
其中n、m、p和q各自为1-3的整数。
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