KR890003948B1 - Hdl 콜레스테롤의 정량 방법 및 제제 - Google Patents

Hdl 콜레스테롤의 정량 방법 및 제제 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

HDL 콜레스테롤의 정량 방법 및 제제
제1도는 시간에 따른 색 형성도이다.
제2도는 HDL 콜레스테롤 측정치를 비교한 것이다.
본 발명은 혈청 또는 혈장내의 HDL 콜레스테롤의 특이 정량 방법 및 제제에 관한 것이다.
임상 실험에서 확실하게 정립된 혈청(또는 혈장)내의 총 콜레스테롤의 정량 이외에도, 최근에 "고 밀도 지단백질"분설(HDL 콜레스테롤)에 결합된 콜레스테롤의 부가적인 분석이 아테롬성 동맥경화증 또는 심근 경색증의 개량된 진단에 상당히 중요하게 되었다.
총 혈장 콜레스테롤(HDL 뿐만 아니가 유미지립, VLL(매우 낮은 밀도의 지단백질), LDL(저 밀도 지단백질) 지단백질 분설에 결합된 유리 및 에스테르화 지방산 콜레스테롤의 합)의 증가로 심근 경색증 위험에 높아짐을 임상 연구로 알 수 있지만, 반면에 혈청 HDL-콜레스테롤 함량 및 혈관의 아테롬성동맥경화증의 위험 사이에는 역 관계가 있다(G. Assmann, Lipidstoffwechselund Atherosklerose, pub. Schattauer-Verlag Stuttgart, 1982 참고).
혈청 총 콜레스테롤 정량에 있어서, 약 15년 동안 손으로 뿐만 아니라 자동 분석 시스템으로 샘플 선처리 단계없이 행해지고 다음의 반응 개요인 단순하지만 정확한 효소 분석 공정이 적용되었다 :
1) 콜레스테롤 에스테르+H2O
Figure kpo00001
콜레스테롤+지방산
2) 콜레스테롤+O2
Figure kpo00002
4-콜레스텐-3-온-H2O2
콜레스테롤은 형성된 과산화 수소, 바람직하게는 적색에서 보라색 퀴논-이민 물질("Trinder 반응")을 주는 4-아미노안티피린과 페놀 또는 페놀 또는 아닐린 유도체의 과산화효소 촉매된 산화 커플링에 의한 비색 정량적으로 또는 형성된 콜레스테논 또는 식 2)에 따라 소비된 산소로 정량된다. 이 정량 방법은 독일 연방공화국 특허명세서 제2,224,132호 및 2,506,712호에 공지되었다.
총 콜레스테롤 정량에 대한 분석 제제 또는 적당한 반응계의 중요 특징은 담즙산 나트륨같은 담즙산 염과 비이온성 알킬 또는 알킬아릴 폴리에틸렌 산화물 에테르 같은 세정제의 존재이다. 세정제는 콜레스테롤 에스테르 분해 효소가 가수분해 작용없이 부가적으로 용해제로서 작용한다. 콜레스테롤 에스테르 분해효소로서 바람직하게 미생물 기관의 효소가 사용된다.
혈청의 HDL 콜레스테롤 정량도 동일 원리에 따라 가능하지만, 기타의 콜레스테롤을 포함하는 지단백 입자(유미지립, VLDL 및 LDL)는 하나 또는 그 이상의 반응 단계에서 혈청으로부터 미리 분리되어야 한다.
이 지단백 분리에, 특히 초원심분리 전기영동 또는 인텅스텐산/Mg+2, 텍스트란 황산염/Mg+2또는 헤파린/Mn+2과 또는 폴리에틸렌 글리콜(Arztl, Lab., 29, 107-114/1983 ; Clin. Chem., 31, 252-256/1985 참고)과의 침전, 면역 침전같은 역 침전방법이 사용된다.
필요한 부가 장치이외에도, 이 분리 방법은 상당한 시간과 비용이 필요해서, 임상 실험의 보통 HDL-콜레스테롤 정량이 더 어렵고 더 비싸다.
혈청내의 HDL-콜레스테롤 함량뿐만 아니라 전체 콜레스테롤 함량이 진단에 극히 중요하기 때문에, 특별한 샘플 제제의 필요없이, 반응용기내에서 혈청 전체 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 분석을 가능하게 하는 제제 및 방법을 적용하는 것이 더 중요하다.
그러므로 샘플로부터 HDL-콜레스테롤, VLDL-콜레스테롤 및 유미지립 콜레스테롤의 선 분리없이 혈청 또는 혈장내에서 HDL-콜레스테롤 정량을 직접적으로 행하는 방법이 본 발명의 목적이다. 혈청 또는 혈장내의 총 콜레스테롤 정량과 결합하여 그 방법을 수행하는 것도 본 발명의 목적이다.
그러므로 본 발명에 따라, 완충된 수성 배지내에 콜레스테롤 산화효소 및 콜레스테롤 에스테르 분해효소를 포함하는, 콜레스테롤 정량계로 배양하고, 콜레스테롤 산화효소 반응 생성물 또는 산소 소비를 측정하여, 혈청 또는 혈장내의 HDL-콜레스테롤을 특이 정량하는 방법이 제공되는데, 테스트될 샘플은 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸실포숙시네이트(에어로솔(Aerosol) OT)의 존재하에 배양하고, 첫번째로 측정하고, 비이온성 폴리에틸렌 산화물 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트를 부가하고, 다시 배양하고 두번째로 측정하는데, HDL-콜레스테롤의 양은 첫번째 및 두번째 측정치의 차로 결정된다.
본 발명은 흑종의 세정세안이 콜레스테롤 에스테르 분해효소 및 콜레스테롤 산화효소외의 반응에 유용하다는 놀라운 탐지에 기초하였고 유미지립, VLDL 및 LDL에 포함된 콜레스테롤은 첫번째 배양 단계에서 상기 효소와 이 콜레스테롤 분설이 반응하고 두번째 배양 단계에서, 비이온성 폴리에틸렌 산화물 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트를 부가하여, HDL 콜레스테롤을 반응물에 주입한다. 단일 용기내에서 총 콜레스테롤 뿐만 아니라 HDL 콜레스테롤을 얻기위해, 유미지립, VLDL 및 LDL에 포함된 콜레스테롤이 먼저 정량되거나, 또는 유미지립, VLDL 및 LDL 콜레스테롤이 정량함이 없이 반응하고 그러면 HDL 콜레스테롤의 양만이 측정된다. 첫번째의 경우에, HDL 콜레스테롤의 량은 첫번째 및 두번째 배양후에 측정치 및 두번째 배양만 한 후에 측정치로부터 총 콜레스테롤 양의 차이로 정량된다. 두번째 경우에, 첫번째 배양시, HDL 몰레스테롤의 정량에 있어서, 과산화효소 뿐만 아니라 페놀 또는 아닐린 유도체는 존재하지만, 아미노안티피린, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존(MBTH) 또는 설폰화된 유도체(MBTH-S)는 존재하지 않는다. 식 2)에 따라 형성된 과산화 수소는 색을 형성하지 않고 반응한다. HDL농도를 직접 측정하는 4-아미노안티피린(4-AAP), MBTH 또는 MBTH-S의 존재하에 두번째 배양했을 때만 색이 형성된다. 결과적으로 변경공정의 경우에, HDL 정량에 한 측정 방법만이 필요하다.
그러므로, 본 발명에 따르는 방법은 색 형성에 의해 콜레스테롤 산화효소 반응의 생성물로서 과산화 수소를 측정하는데 콜레스테롤 정량 계가 사용되는 방법으로 바람직하게 행해진다. 과산화 수소 정량에 사용 가능한 적당한 발색 계가 공지되었다. 소위 페놀 또는 페놀 유도체 또는 치환 아닐린, 4-아미노안티피린 및 과산화효소로 구성된 트린더(Trinder)계가 바람직하다. 사용 가능한 페놀 화합물중에서, 클로로페놀뿐만 아니라 페놀 자체, 트리요오도-및 트리브로모하이드록시벤조산 및 디클로로페놀설폰산이 중요하다. 4-아미노안티피린 대신에, 4-아미노안티피리딘과 결합하여 사용가능하다고 입증된 N-에틸-N-β-설포에틸-
Figure kpo00003
-톨루이딘 또는 N-에틸-N-β-하이드록시에틸-
Figure kpo00004
-톨루이딘, 디메틸아닐린 또는 디메틸아미노벤조산은 치환 아닐린과 바람직하게 결합하여, 예를들면 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존(MBTH) 및 이것의 설폰화된 유도체(MBTH-S)가 사용될 수 있다.
콜레스테롤 에스테르 분해효소로서, 캔디다 실린드라새(Candida cylindracea), 또는 바람직한 췌장의 효소같은 미생물의 콜레스테롤 에스테르 분해효소가 사용된다.
담즙산 또는 담즙산 유도체로서 콜산, 데스옥시콜산, 리토콜산, 타우로콜산, 글리코콜산, 데스옥시글리코콜산 및 데스옥시타우로콜산의 알카리 금속 및 마그네슘 염 및 콜레인산, 콜산 나트륨이 바람직하다. 또한 나트륨 디옥틸설포숙시네이트(에어로솔 OT)도 사용 가능하다. 이들 제제는 유미지립, VLDL 및 LDL같은 소량의 단백질 부분으로 제공된 지질이 풍부한 지단백질을 소화만 해서, 그것에 포함돤 콜레스테롤의 효소 반응에 유용하다.
HDL 분설의 콜레스테롤은
Figure kpo00005
-도데실 폴리에틸렌 글리콜 에테르(테시트(Thesit)), 이소프리데칸올 폴리에틸렌 옥사이드 에테르(제나폴(Genapol) x-80) 및 이소옥틸페닐 폴리에틸렌 옥사이드 에테르(트리톤(Triton) x-100)같은 비이온성 알킬 또는 알킬아릴 폴리에틸렌 옥사이드 에테르인 비온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제에 의해 효소 정량에 유용하게 된다. 호스타퍼(Hostapur)로 시판되는 음이온성 2차 알칸 설포네이트도 사용된다. HDL을 절단하는 세정제는 메탄올, 에탄올,
Figure kpo00006
-프로판올 또는 이소프로판올과 같은 함께 바람직하게 사용되는데, 프로판올이 바람직하다. 사용된 알콜의 양은 바람직하게 0.05 내지 2%이다. 이 모든 농도는 반응 혼합물내의 최종 농도로 칭한다.
담즙산 또는 담즙산 유도체의 염이 0.2 내지 20밀리몰/리터의 농도로 바람직하게 부가된다. 그러나 이 양은 조사할 샘플에 따라 더 많고나 또는 적을 수 있다. 디옥틸설포숙시네이트에 대해서도 동일하게 적용한다.
비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트인 두번째 세정제에 대해, 0.02내지 2%의 농도가 바람직하다. 그러나 샘플에 따라서, 이 농도 이상 도는 이하일 수 있다.
그 밖의 점에 대해서는, 공지의 콜레스테롤 정량의 경우에 본 발명 방법을 수행할 때, 사용된 pH가 및 완충 물질은 사용된 효소 양에 적당한 것이다.
본 발명은 콜레스테롤 에스테르 분해효소, 콜레스테롤 산화효소 및 완충액을 포함하는, 혈청내의 HDL콜레스테롤을 특이 정량하는 제제를 또한 제공하는데, 최종 수성 용액은 다음을 포함한다. 0.1 내지 10U/ml 콜레스테롤 에스테르 분해효소, 0.05 내지 10U/ml 콜레스테롤 산화효소, 20 내지 500밀리몰/리터 완충액(pH 6.0 내지 8.0), 0.2 내지 20밀리몰/리터 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트 및 그것으로부터 각각, 0.02 내지 2% 비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트, 임의로 0.05 내지 2% C3를 포함하는 알콜.
첫번째 예에 따라, 본 발명에 따르는 제제는 0.05 내지 20U/ml 과산화효소, 0.2 재지 20밀리몰/리터 페놀 또는 아닐린 및 임의로 0.02 내지 5% 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 0.05 내지 2%
Figure kpo00007
-프로판올을 포함한다.
본 발명에 다르는 바람직한 제제는 0.2 내지 2U/ml 콜레스테롤 에스테르 분해효소, 0.05 내지 0.5U/ml 콜레스테롤 산화효소 1 내지 5U/ml 과산화효소, 50 내지 200밀리몰/리터 인산 칼륨 완충액(pH 6.5 내지 7.0), 1.4 내지 10밀리몰/리터 페놀 또는 페놀 유도체, 1 내지 5밀리몰/리터 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트, 임의로 분리하여 0.2 내지 2밀리몰/리터 4-아미노안티피린 및 4-아미노안티피린, 0.5 내지 5.0% 비이온성 폴리에틸렌 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칼 설포네이트 및 임의로 0.1 내지 0.5%
Figure kpo00008
-프로판올 및 0.5 내지 5.0% 폴리에틸렌 글리콜을 제외하고, 기타 성분으로부터 각각인 것을 포함한다.
또한 예에서, 반응 성분은 담체 물질 상에 또는 그 안에 포화될 수 있다. 담체 물질은 흡수제이거나 또는 부풀 수 있거나 또는 차 포장 종이같이 얇은 물질 또는 종이인 막을 형성하는 담체 물질일 수 있다. 반응 성분은 다른 것과 접촉하는 여러 담체에 분배된다.
본 발명에 의해, HDL에 포함된 콜레스테롤은 기타의 콜레스테롤을 포함하는 지단백 분설로부터 분리함이 없이 직접적으로 정량된다. 이것은 정량 방법의 용이성 단순성을 의미한다.
다음 실시예는 본 발명을 상술할 목적으로 제공되는 것으로 다음의 약어가 사용된다.
CHOD =콜레스테롤 산화효소
CHOL-에스테라즈 =콜레스테롤 에스테르분해효소
POD =과산화효소
4-AAP =4-아미노안티피린
PEG 6000 =폴리에틸렌 글리콜 6000
TRA =트리에탄올아민
[실시예 1]
a) 기본제제 : 인산칼륨 0.1몰/리터(pH 6.7)
3mM 콜산나트륨
0.8mM 4-AAP
1.2U/ml. CHOD
0.5U/ml. CHOL 에스테라즈
1.4U/ml 페놀
0.1% PEG 6000
3U/ml. POD
b) 두번째 단계의 출발제제 : TRA 완충액 0.05M, pH 7.1
10% 테시트
10% 프로판올
c) 테스트 실행 :
파장 : 546nm
온도 : 25℃
제제공백에 대해 25℃에서 측정
광학 경로길이가 10mm인 큐빗(cuvette)내,
피펫 :
Figure kpo00009
d) 계산
공지된 전체 및 HDL 콜레스테롤 농도로 표준 혈청을 사용하여 동시에 계산하고, 표준 혈청은 샘플과 같은 방법으로 뱃치(batch) 시험에 사용된다.
Figure kpo00010
실시예에 따른 뱃치 시험에 상응하여 일어나는 색 형성 단계의 시간 경로는 다음 도면의 Fig. 1에 재현했다.
[실시예 2]
a) 기본 제제 : 4-AAP 없이 실시예 1과 같음
b) 출발 제제 : 80mM 4-AAP를 부가하는 것을 제외하고 실시예와 같음
c) 테스트 실행 :
파장 : 546nm
온도 : 25℃
제제 동백에 대해 25℃에서 측정
광학 경로길이가 10mm인 큐빗 내,
피펫 :
Figure kpo00011
d) 계산 :
계산은 공지된 전체 및 HDL 콜레스테롤 농도로 표준 혈청을 사용하여 동시에 하고, 표준 혈청은 샘플과 같은 방법으로 뱃치 시험에 사용된다.
Figure kpo00012
인텅스텐산(PTA)/황산마그네슘 침전물을 사용하는 본 발명의 방법을 사용하여 여러가지 사람의 혈청내에서 실시예 2에 따라 HDL 콜레스테롤 측정치를 비교한 것은 다음 도면의 Fig. 2에 상술 되었다. 비교 방법은 상관계수가 0.814인 Y=-0.907+0.019X의 퇴보를 제공한다.
HDL 콜레스테롤에 대한 동일한 결과는 실시예 1에 따라 행했을때 얻었다.

Claims (12)

  1. 테스트될 샘플은 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트의 존재하에 배양하고, 첫번째로 측정하고, 비이온성 폴리에틸렌 산화물 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸설포네이트를 부가하고, 다시 배양하고 두번째로 측정하는데, HDL 콜레스테롤의 양은 첫번째 및 두번째 측정치의 차로 결정하고, 완충된 수성 배지내에 콜레스테롤 산화효소 및 콜레스테롤 에스테르 분해효소를 포함하는, 콜레스테롤 정량 계로 배양하고, 콜레스테롤 산화효소 반응 생성물 또는 산소 소비를 측정하여, 혈청 또는 혈장내의 HDL-콜레스테롤을 특이 정량하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 콜레스테롤 산화효소 반응의 생성물로서 과산화 수소를 가지는, 콜레스테롤 정량계가 색을 형성하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 색 형성을 위해, 페놀 또는 아닐린, 4-아미노안티피린 및 과산화효소를 포함하는 발색 계가 사용되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 첫번째 배양을, a) 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트, b) 페놀 또는 아닐린 및 c) 과산화효소의 존재하에 행하고, 비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트 및 4-아미노안티피린을 부가하고, 더 배양하고, 색 형성을 측정하는 변형 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 췌장으로부터의 콜레스테롤 에스테르 분해효소가 사용되는 방법.
  6. 제1항 또는 제4항에 잇어서, 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트가 0.2 내지 20밀리몰/리터의 농도로 부가되는 방법.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트를 0.02 내지 2% 농도로 부가하는 방법.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서, 6.0 내지 8.0의 pH에서 반응을 행하는 방법.
  9. 제1항 또는 제4항에 있어서, C3까지 포함하는 알콜이 0.05 내지 2%로 반응 배지에 부가되는 방법.
  10. 최종 수성 용액이 0.1 내지 10U/ml 콜레스테롤 에스테르 분해효소, 0.05 내지 10U/ml 콜레스테롤 산화효소, 20 내지 500밀리몰/리터 완충액(pH 6.0 내지 8.0), 0.2 내지 20밀리몰/리터 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 또는 디옥틸설포숙시네이트 및, 그것으로부터 각각, 0.02 내지 2% 비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트,및 임의로 0.05 내지 2% C3를 포함하는 알콜을 포함하고, 콜레스테롤 산화효소, 완충액 및 콜레스테롤 에스테르 분해효소를 포함하는 혈청 또는 혈장내의 HDL 콜레스테롤을 특이 정량하는 세제.
  11. 제10항에 있어서, 0.05 내지 10U/ml 과산화효소, 0.2 내지 20밀리몰/리더 페놀, 페놀 유도체 또는 아닐린 및 임의로 0.02 내지 5% 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 0.05 내지 2%
    Figure kpo00013
    -프로판올을 포함하는 제제.
  12. 제11항에 있어서, 0.05 내지 0.5U/ml 콜레스테롤 산화효소, 0.2 내지 2U/ml 과산화효소, 1 내지 5U/ml 콜레스테롤 에스테르 분해효소, 50 내지 200밀리몰/리터 인산 칼륨 완충액(pH6.5 내지 7.0), 1.4 내지 10밀리모/리터 페놀 또는 페놀 유도체, 1 내지 5밀리몰/리터 담즙산 또는 담즙산 유도체의 염 도는 디옥틸설포숙시네이트, 임의로 분리하여, 0.2 내지 2밀리몰/리터 4-아미노안티피린 및 4-아미노안티피린은 제외하고 기타 성분에서 분리하여, 0.05내지 0.5%비이온성 폴리에틸렌 옥사이드 그룹을 포함하는 세정제 또는 2차 알칸 설포네이트 및 임의로, 0.1 냐지 0.5%
    Figure kpo00014
    -프로판올 및/또는 폴리에틸렌 글리콜, 을 포함하는 제제.
KR1019860007833A 1985-09-18 1986-09-17 Hdl 콜레스테롤의 정량 방법 및 제제 KR890003948B1 (ko)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP-35-33-288.3 1985-09-18
DE3533288.3 1985-09-18
DE19853533288 DE3533288A1 (de) 1985-09-18 1985-09-18 Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von hdl-cholesterin im serum

Publications (2)

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