DE60011128T2

DE60011128T2 - Monitoring der aktivität von faktor xa-inhibitoren

Info

Publication number: DE60011128T2
Application number: DE60011128T
Authority: DE
Inventors: Chu Valeria FUNG-HWEI
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-10-28
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2020-10-29
Also published as: CA2389747C; EP1230382B1; IL149398A0; US20030049704A1; AU1515701A; ATE267876T1; EP1230382A2; ES2222250T3; CA2389747A1; US7220553B2; WO2001033217A3; WO2001033217A2; JP4463460B2; JP2003513280A; DE60011128D1; MXPA02003693A

Description

Diese Erfindung betrifft die Messung der Faktor Xa-Aktivität. Eine derartige Aktivität kann unter Verwendung der Blutgerinnungsdauer oder chromogener Substrate gemessen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft Assayverfahren zur Messung der Aktivität von Faktor Xa-Inhibitoren. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Russells-Schlangengift (hierin nachstehend "RVV-X"), um die endogene Faktor Xa-Aktivität des Individuums hervorzurufen und die Wirkung von Faktor Xa-Inhibitoren zu messen. Die Verfahren zur Messung der Faktor Xa-Aktivität im Plasma beruhen auf der Gerinnungsdauer und chromogener Methodik.
Die Veröffentlichung (Clinical Chemistry, 26/7, Seiten 885–890, 1980) beschreibt einen Assay für Faktor X, worin Faktor X direkt durch Russells-Schlangengift aktiviert wird, in Alcohol (Bd. 13, Nr. 6, Seiten 539–545, 1996) ist die Wirkung von Acetaldehyd auf den Faktor X und den Faktor Xa beschrieben. In einer Fallstudie ist ein IgG beschrieben, welches sich an die leichte Kette von intaktem Faktor X bindet und so die Aktivierung von Faktor X inhibiert (Thrombosis & Haemostasis (72(3), Seiten 363–371, 1994).
Assays, wie APTT und PT, wurden bislang verwendet, um die Blutgerinnungsdauer zu messen. Derartige Assays sind jedoch nicht empfindlich, um Dosierungsdifferenzen bei der Verabreichung von direkten Faktor Xa(hierin nachstehend "FXa")-Inhibitoren festzustellen. Die vorliegende Erfindung spricht das Problem der Überwachung der Sicherheit und der Wirksamkeit von direkten FXa-Inhibitoren an. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können in allen Spezies zur Überwachung der Sicherheit und der Wirksamkeit von intravenös oder oral wirksamen Faktor Xa-Inhibitoren verwendet werden. Es wird angenommen, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden könnten, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Thrombininhibitoren und indirekten Faktor Xa-Inhibitoren, wie Antikoagulantien für Faktoren stromaufwärts in der Gerinnungskaskade und Heparin, spezieller Heparin mit geringem Molekulargewicht, zu messen. Die Verfahren könnten verwendet werden, um den prothrombotischen Zustand eines Patienten vorherzusagen. In dem Bestreben verbesserte Assayverfahren zur Messung der Aktivität von Faktor Xa-Inhibitoren bereitzustellen, wurde nun festgestellt, daß dies durch Verwendung von Russells-Schlangengift (hierin nachstehend "RVV-X") zur Messung der durch die Aktivität von Faktor Xa-Inhibitoren hervorgerufenen Verlängerung der Gerinnungsdauer erzielt werden kann.
Die Erfindung, wie sie in den Ansprüchen erläutert ist, erreicht das Ziel durch ein Verfahren der Überwachung der Wirkung von Faktor Xa-Inhibitoren, welches die Schritte von:

a) Sammeln einer Plasmaprobe von einem Patienten, welcher einen Faktor Xa-Inhibitor, ein Antikoagulans, ein Antithrombosemittel oder jedwede Kombination hiervon erhalten hat;
b) Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift zur Plasmaprobe, und
c) Messen der Gerinnungsdauer oder einer chromogenen Veränderung

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Überwachung der Wirkung von Faktor Xa-Inhibitoren, umfassend die Schritte von:

a) Sammeln einer Plasmaprobe von einem Säugetier;
b) Bereitstellen einer an Faktor X armen Plasmaprobe der gleichen Spezies, welche verwendet wird, um serielle Verdünnungen der normalen Plasmaprobe herzustellen;
c) Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift zu den in a) und b) definierten Plasmaproben;
d) Vergleichen der Gerinnungsdauer, welche für die Plasmaprobe von einem Säugetier gemessen wird, mit der Gerinnungsdauer, welche für die Plasmaproben gemessen wird, die mit an Faktor X armem Plasma verdünnt wurden;
e) Erstellen einer Standardkurve der % FXa-Aktivität (proportional zum normalen Plasmagehalt) und Messen der Verlängerung der Gerinnungsdauer;
f) Kennen der Gerinnungsdauer eines Individuums, welches eine FXa-Inhibitorbehandlung erhalten hat, und Ermitteln der Rest-FXa-Aktivität oder der % FXa-Inhibierung aus der Standardkurve.

a) Sammeln einer Plasmaprobe von einem Säugetier;
b) Teilen der genannten Plasmaprobe in Portionen, wobei eine Portion als das Kontrollnormalplasma behalten wird und mehrere serielle Verdünnungen von Faktor Xa-Inhibitor zu den anderen Portionen zugesetzt werden;
c) Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift zu den in b) definierten Plasmaproben;
d) Vergleichen der für die Plasmaprobe ohne Faktor Xa-Inhibitor gemessenen Gerinnungsdauer mit der Gerinnungsdauer der Plasmaproben mit zugesetztem Faktor Xa-Inhibitor;
e) Erstellen einer Kurve der dosisabhängigen Gerinnungsdauerverlängerung, und Bestimmen der Konzentration an einem FXa-Inhibitor, die erforderlich ist, um die Gerinnungsdauer auf das Zweifache der Gerinnungsdauer für das Kontrollplasma zu verlängern.

Ein Säugetier ist ein Mensch oder ein Tier, wie Rinder, Schafe, Hasen, Mäuse oder Ratten. Der Faktor Xa-Inhibitor ist eine Verbindung, welche ein Inhibitor der Blutgerinnungsenzyme, insbesondere des Faktors Xa ist. Der Ausdruck "Patient" bedeutet einen Menschen oder ein Säugetier.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Überwachung der Wirkung von Faktor Xa-Inhibitoren durch chromogenes Messen der restlichen Faktor Xa-Aktivität, umfassend die Schritte von:

a) Sammeln einer Plasmaprobe von einem Säugetier;
b) Teilen der genannten Plasmaprobe in Portionen, wobei eine Portion als das Kontrollnormalplasma behalten wird und mehrere serielle Verdünnungen von Faktor Xa-Inhibitor zu den anderen Portionen zugesetzt werden;
c) Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift zu den in b) definierten Plasmaproben;
d) Vergleichen der für die Plasmaprobe ohne Faktor Xa-Inhibitor gemessenen FXa-Aktivität mit der restlichen FXa-Aktivität, die für die Plasmaproben mit zugesetztem Faktor Xa-Inhibitor gemessen werden;
e) Erstellen einer Standardkurve der dosisabhängigen Inhibierung von RVV-X, welche durch FXa-Inhibitor hervorgerufen wird;
f) unter Verwendung der Standardkurve könnte die Konzentration von FXa-Inhibitor in einem Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung mit Faktor Xa-Inhibitor ermittelt werden.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Variationen bei der Messung der Gerinnungsdauer infolge der Handhabung der Plasmaproben zu verringern oder zu minimieren. Dies wird durch Zusetzen von Cephalin zu den Plasmaproben erzielt. Eine bevorzugte Cephalinquelle ist Hasenhirn. Eine bevorzugte chromogene Verbindung zur Ermittlung der FXa-Aktivität ist Spectrozyme Fxa^®. Andere FXa-chromogene Substrate können ebenfalls verwendet werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird vorzugsweise in einem Puffer mit einem pH von 7 bis 8 durchgeführt. Ein bevorzugter Puffer ist Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (Tris), enthaltend Natriumchlorid (NaCl) und Polyethylenglycol-8000 (PEG-8000). Bevorzugte Konzentrationen sind von 10 mM bis 200 mM, von 20 mM bis 600 mM und von 0,02% bis 1% für Tris, NaCl bzw. PEG-8000.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, einen Kit zur Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung für ein diagnostisches Assay zur FXa-Inhibitor-Bestimmung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung der Aktivität eines Faktor-Xa-Inhibitors. Ein besonders bevorzugter FXa-Inhibitor ist Methyl-3-(4'-N-oxopyridylphenoyl)-3-methyl-2-(m-amidinobenzyl)propionat.
In den Beispielen ist gezeigt, daß das RVVT-Protokoll zur Messung der durch RVV-X hervorgerufenen FXa-Aktivität im Plasma mittels der Gerinnungsdauer nützlich ist. Das zweite Protokoll, das RVVC-Protokoll, ist nützlich, um die durch RVV-X hervorgerufene FXa-Aktivität im Plasma durch chromogene Verfahren zu ermitteln. RVVT zeigte eine dosisabhängige Verlängerung der Gerinnungsdauer durch FXa-Inhibitoren. RVVC zeigte eine dosisabhängige FXa-Inhibierung durch FXa-Inhibitoren. Beide Verfahren wurden erfolgreich verwendet, um variierende Konzentrationen von FXa-Inhibitoren in ex-vivo-Plasmaproben von Humanpatienten zu unterscheiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den folgenden Beispielen im Detail beschrieben.
Beispiel 1
Protokoll der durch Russells-Schlangengift hervorgerufenen Gerinnungsdauer (RVVT-Protokoll)
Reagenzien
FXa-Puffer
0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,1% PEG-8000, pH 7,5.
Man setzt 6,06 g Tris, 8,77 g NaCl, 1,0 g PEG-8000 zu 800 ml H₂O zu, man stellt den pH unter Verwendung von konzentrierter HCl auf pH 7,5 ein. Man füllt mit H₂O auf 1 l auf.
RVV-X
Enzyme Research Lab.
Man verdünnt auf 1 mg/ml mit FXa-Puffer, anschließend 1/400 im gleichen Puffer.
RVV-X-Arbeitslösung (RVV-Ca)
2 ml 1/400 RVV-X + 18 ml 0,0035 M CaCl₂.
Die Konzentration von RVV-X an diesem Punkt beträgt 0,25 μg/ml.
FX-armes Plasma
American Diagnostica Inc.
Verfahren
Alle Reagenzien sollten vor der Verwendung bei 4°C (auf einem Eis-Wasser-Gemisch) gehalten werden.
Standard

1. Man stellt zweifache serielle Verdünnungen von normalem gesammeltem Plasma oder von Patientenplasma mit an Faktor X-armem Plasma von 1~1/256 her.
2. Man setzt 0,2 ml FXa-Puffer, 0,1 ml Plasmaverdünnung zur Küvette hinzu, anschließend 0,1 ml RVV-Ca. (Der MLA-800-Clotter setzt dieses Reagenz automatisch hinzu.)
3. Man mißt die Gerinnungsdauer.
4. Man erstellt eine Standardkurve.

Kurve für die dosisabhängige Verlängerung der Gerinnungsdauer mittels der Verbindung Methyl-3-(4'-N-oxopyridylphenoyl)-3-methyl-2-(m-amidinobenzyl)-propionat (hierin nachstehend "RPR") oder des Trifluoracetatsalzes von RPR

1. Man setzt 0,1 ml FXa-Puffer, 0,1 ml serielle Verdünnung von RPR, 0,1 ml normales ge sammeltes oder Patientenplasma zur Küvette hinzu, anschließend 0,1 ml RVV-Ca. (Der MLA-800-Clotter setzt dieses Reagenz automatisch hinzu.)
2. Man mißt die Gerinnungsdauer.
3. Man erstellt die Kurve für die dosisabhängige Verlängerung der Gerinnungsdauer.
4. Man berechnet die Konzentration für 2 × RVVT.

Beispiel 2
Protokoll der chromogen gemessenen, durch Russells-Schlangengift hervorgerufenen FXa-Aktivität im Plasma (RVVC-Protokoll)
RVVC-ASSAY
Chromogen gemessene, durch RVV-hervorgerufene FXa-Aktivität im Plasma.
A) Reagenzien
PEG-Ca⁺⁺-Puffer
0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,01 M CaCl₂, 0,1% PEG-8000, pH 7,50.
Man setzt 6,06 g Tris, 8,77 g NaCl, 1 g PEG-8000, 1,47 g CaCl₂·2H₂O zu 800 ml H₂O hinzu, man stellt unter Verwendung von konzentrierter HCl auf pH 7,5 ein, man füllt mit H₂O auf 1 l auf.
RVV-X (Russells-Schlangengift)
Man setzt 44 μl PEG-Ca⁺⁺-Puffer zu 50 μl RVV-X-Ausgangslösung (Enzyme Research Labs, 1,88 mg/ml) hinzu, um eine 1 mg/ml Lösung herzustellen, man hält diese ständig auf Eis.
Man verdünnt die 1 mg/ml Ausgangslösung auf 1/10 → 1/10 → ¼ (= 1/400).
Die Verdünnungen werden in PEG-CAE-Puffer hergestellt.
Substrat Spectrozyme FXa^®
Man löst 50 μMol Spectrozyme FXa, American Diagnostic, in 5 ml sterilem Wasser, um eine 10 mM Ausgangslösung herzustellen.
Spectrozyme FXa^® 1,6 mM Arbeitslösung
Man setzt 0,8 ml der 10 mM Ausgangslösung zu 4,2 ml PEG-Ca-Puffer hinzu.
B) Verfahren

1. Man setzt die Reagenzien auf die Mikrotiterplatten oder in die Teströhrchen in der folgenden Reihenfolge zu:
2. Man verfolgt die Reaktion kinetisch während 5 Minuten.

C) Berechnung
Man mißt die Anfangsgeschwindigkeit; man ignoriert jedoch die Verzögerungsphase. Im allgemeinen mißt man die Anfangsgeschwindigkeit des linearen Anteils des zeitlichen Verlaufs.
Man verwendet die Anfangsgeschwindigkeiten von klinischen Proben zu verschiedenen Zeitpunkten und vergleicht diese mit der Kontrolle vor der Dosierung, um die % Inhibierung zu berechnen.
Es wurde mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung RPR versetztes Plasma hinsichtlich PT, APTT und PVVT-Verlängerung einem Assay unterworfen. Die Ergebnisse in Tabelle 1 legen na he, daß RVVT der empfindlichste Indikator unter den drei Gerinnungsdauerassays für die Wirkung der Verbindung RPR als FXa-Inhibitor ist.
Das Assay der durch RVV-X-hervorgerufenen Gerinnungsdauer (RVVT-Assay) könnte zweckmäßigerweise zur Überwachung der Wirkung von RPR auf den endogenen Plasma-FXa von Patienten verwendet werden: Tabelle 1
Beispiel 3
Protokoll (II) der durch Russells-Schlangengift hervorgerufenen Gerinnungsdauer (RVVT-Protokoll) (II)
Reagenzien
FXa-Puffer
0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,1% PEG-8000, pH 7,5.
Man setzt 6,06 g Tris, 8,77 g NaCl, 1,0 g PEG-8000 zu 800 ml H₂O hinzu, man stellt unter Verwendung von ungefähr 2 ml konzentrierter HCl auf pH 7,5 ein, man füllt mit H₂O auf 1 l auf.
RVV-X
Enzyme Research Lab.
Man verdünnt auf 1 mg/ml mit FXa-Puffer, anschließend 1/200 im gleichen Puffer.
2 ml 1/200 RVV-X + 18 ml 0,035 M CaCl₂, die Endkonzentration von RVV-X an diesem Punkt beträgt 0,5 μg/ml.
Hasenhirn-Cephalin
Centerchem.
Man rekonstituiert mit 3,125 ml 0,035 M CaCl₂ in FXa-Puffer auf eine Endkonzentration von 1,6 mg/ml.
RVV-X RB Cephalin-Arbeitslösung (RVV-Ca-Cephalin)
Gleiches Volumen von 0,5 μg/ml RVV-X, gemischt mit einem gleichen Volumen von 1,6 mg/ml Hasen hirn-Cephalin.
Die Endkonzentrationen von RVV-X und Cephalin im Reagenzreservoir in dieser Stufe betragen 0,25 μg/ml bzw. 0,8 mg/ml.
Verfahren
Alle Reagenzien sollten vor der Verwendung bei 4°C (auf einem Eis-Wasser-Gemisch) gehalten werden.
Vordosierungsplasma-Normal-RVVT

1. Man setzt 0,2 ml FXa-Puffer, 0,1 ml Vordo sierungsplasma zur Küvette hinzu, anschlie-ßend 0,1 ml RVV-Ca-Cephalin. (Die Endkonzentrationen von RVV-X und Cephalin betragen 0,0625 μg/ml bzw. 0,2 mg/ml.)
2. Man mißt die Gerinnungsdauer.

Ergebnis
Man berechnet die x-fache Veränderung ("foldchange") von RVVT.
Wirkung von Hasenhirn-Cephalin auf RVVT Gerinnungsdauer für RVV-induziertes Plasma (gesammeltes GK-Plasma und Donatoren DN, RB, TD) mit zugesetzten Verdünnungen von Cephalin (n = 2)
Schlußfolgerung
Die RVVT-Variationen infolge der Handhabung der Probe konnten durch Zugabe von ungefähr 0,2 mg/ml Rattenhirn-Cephalin in das Reaktionsgemisch verringert werden.

Claims

Verfahren zur Überwachung der Wirkung von Faktor Xa-Inhibitoren, umfassend die Schritte von: a) in einer Plasmaprobe von einem Säugetier, b) das Teilen der genannten Plasmaprobe in Portionen, wobei eine Portion als Kontrollplasma behalten wird und mehrere serielle Verdünnungen von Faktor Xa-Inhibitor zu den anderen Portionen zugesetzt werden, c) das Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift (RVV-X) zu den in b) definierten Plasmaproben, d) das Vergleichen der für das Kontrollplasma gemessenen FXa-Aktivität mit der für die anderen Plasmaproben mit zugesetztem Faktor Xa-Inhibitor gemessenen Rest-FXa-Aktivität, e) Erstellen einer Standardkurve der durch FXa-Inhibitor hervorgerufenen dosisabhängigen Inhibierung von RVV-X, f) wobei die Konzentration an FXa-Inhibitor unter Verwendung der Standardkurve abgeschätzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte von: a) in einer Plasmaprobe von einem Säugetier, b) das Teilen der genannten Plasmaprobe in Portionen, wobei eine Portion als das Kontrollnormalplasma behalten wird und mehrere serielle Verdünnungen von Faktor Xa-Inhibitor zu den anderen Portionen zugesetzt werden, c) das Zusetzen einer Lösung von Russells-Schlangengift zu den in b) definierten Plasmaproben, d) das Vergleichen der für die Plasmaprobe ohne Faktor Xa-Inhibitor gemessenen Gerinnungsdauer mit jener der Plasmaproben mit zugesetztem Faktor Xa-Inhibitor, e) das Erstellen einer Kurve der dosisabhängigen Gerinnungsdauerverlängerung und das Bestimmen der Konzen tration an einem FXa-Inhibitor, die erforderlich ist, um die Gerinnungsdauer auf das Zweifache der Gerinnungsdauer für das Kontrollplasma zu verlängern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Rest-FXa-Aktivität chromogenisch gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Cephalin den Plasmaproben zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Plasmaproben in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 8 inkubiert wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Plasmaprobe von einem Patienten gesammelt wird, welcher einen FXa-Inhibitor, ein Antikoagulans, ein antithrombotisches Mittel oder jedwede Kombination hiervon erhalten hat.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines diagnostischen Assays zur FXa-Inhibitor-Bestimmung.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Bestimmung der Aktivität eines direkten oder indirekten Faktor Xa-Inhibitors.
Verwendung nach Anspruch 8, worin der FXa-Inhibitor Methyl-3-(4'-N-oxopyridylphenoyl)-3-methyl-2-(m-amidinobenzyl)-propionat ist.