DE69022019T2

DE69022019T2 - Faktor-ix chromogenisches assay.

Info

Publication number: DE69022019T2
Application number: DE69022019T
Authority: DE
Inventors: Hendrik Coenraad Hemker
Original assignee: Baxter Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Switzerland
Priority date: 1989-08-17
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-08-17
Also published as: ES2078978T3; CA2039173A1; JPH04501809A; DE69022019D1; EP0440775B1; CA2039173C; JP3041457B2; US5627038A; WO1991002813A1; EP0440775A1

Description

Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft allgemein den Bereich chromogener Untersuchungen und genauer den Bereich chromogener Analysen zur Bestimmung der Werte van Blutkoagulationsfaktoren, die im Plasma und anderen Fluiden enthalten sind.

Hintergrund der Erfindung

Hämophilie ist eine geschlechtsgebundene Erkrankung, die durch einen Mangel an bestimmten Blutgerinnungsfaktoren im Blutkreislauf verursacht wird. Hämophilie A ist eine solche Erkrankung, die mit einem Mangel an Koagulationsfaktor VIII verbunden ist. Hämophilie B ist eine weitere solche Erkrankung, die von einem Mangel der Koagulationsfaktor IX-Gehalte herrührt. Hämophilie B ist fünfmal bis siebenmal weniger häufig als Hämophilie A und wird beim Menschen als eine rezessive Eigenschaft, die mit dem X-Chromosom verknüpft ist, übertragen. Demnach tritt die Erkrankung fast ausschließlich bei Männern auf, die das schadhafte Gen von ihren leiblichen Müttern erhalten.
Obwohl jedes Individuum, das den schadhaften Genotypus für Hämophilie B hat, einen Mangel an Serumfaktor IX hat, unterscheiden sich solche Individuen deutlich in der Schwere der Erkrankung. Klinisch werden alle Individuen, die eine Serumdefizienz an Faktor IX haben, der fünf bis fünfundzwanzig Prozent (5 - 25%) der Werte ist, die normalerweise in normalem Serum beobachtet werden, als leichte Fälle eingestuft. Solche Individuen, die Defizienzen von einem bis fünf Prozent (1 - 5%) von normal haben, werden als mittelschwer angesehen, und diejenigen, die weniger als ein Prozent (1%) haben, werden als schwere Fälle angesehen Etwa zwanzig bis fünfzig Prozent (20 - 50%) der Faktor IX-Normalwerte werden für eine Minimalhämostase benötigt. Unterhalb dieses Bereiches gibt es eine Neigung zur Haemorrhagie, wobei schwerere Blutungen lebensbedrohlich sind. Es ist deshalb wichtig, klinisch in der Lage zu sein, genau die Werte von Faktor IX im Serum von Haemophilie B-Patienten zu überwachen, um rechtzeitig eine entsprechende Therapie durchzuführen.
Es gibt andere medizinische Zustände, die genaue Bestimmungen des Faktor IX erforderlich machen. Es ist bekannt, daß bestimmte Arzneimittel-Behandlungen, zum Beispiel die Behandlung mit Warfarin, die Faktor IX Werte beeinflussen. Auch Patienten, die an konsumptiven Koagulopathien, wie Thrombose oder Verbrauchskoagulopathie (disaviates intravascular coagulation, DIC) leiden, können Anomalien bei den Faktor IX Werten zeigen, die eine sorgfältige klinische Behandlung erforderlich machen. Eine erfolgreiche Behandlung dieser Zustände erfordert in ähnlicher Weise eine genaue Bestimmung der Faktor IX Werte im Serum. Für eine allgemeine Übersicht über die physiologischen und biochemischen Gesichtspunkte der Faktor IX Defizienzerkrankungen in Bezug zu normaler Blutkoagulation siehe R. Coreman, Hrsg., Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 2. Aufl., Lippincott, Duiladelphic, 1989.
Bei der Behandlung einer der vor stehend erwähnten -nedizinischen Zustände betrifft eine Behandlungsart die Verabreichung von exogenem Faktor IX, das durch die Fraktionierung von Blutplasma unter Verwendung von Verfahren, die denen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, erhalten wurde. Der nach solchen Verfahren erhaltene Faktor IX wird im allgemeinen konzentriert, um in einer leicht zu handhabenden Dosis verabreicht zu werden. Es ist unbedingt erforderlich, daß die genaue Konzentration von solchen therapeutischen Dosen gemessen und die Menge an Faktor IX bei jedem Schritt des Reinigungsverfahrens genau überwacht wird.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Blutkoagulationsfaktors IX stehen deshalb auf dem Fachgebiet zur Verfügung. Das bedeutendste Verfahren, das in diesem Bereich zur Standardanalyse geworden ist, ist als aktivierte partielle Thromboplastinzeit (Activated Partial Thromboplastin Time, APTT) bekannt. Bei diesem Verfahren wird der Prozentanteil an Faktor IX, der in einer Testprobe vorhanden ist, nach dem Verbesserungsgrad bestimmt, der erreicht wird, wenn das Plasma zu einem Plasma gegeben wird, das eine Faktor IX Defizienz hat. Der Verbesserungsgrad wird durch die aktivierte partielle Thromboplastinzeit bestimmt. Die Ergebnisse werden mit dem Verbesserungsgrad verglichen, der erhalten wird, wenn Verdünnungen von normalem Plasma zu dem Referenzplasma, das einen Mangel an Faktor IX hat, gegeben werden.
Bei der APTT-Analyse wird gemäß Matchett und Ingram, Partial Thromboplastin Time Test with Kaolin, J. Clin. Path., 18 (1965), 465, eine Plasmaprobe in einer gepufferten Lösung, die Kaolin enthält, inkubiert, zu der dann eine Inosithin- Suspension gegeben wird. Die Gerinnungszeit wird gemessen, und die Meßdaten werden gegen eine Standardkurve aufgetragen.
Das Verfahren nach dem Stand der Technik wurde vielfach geprüft und verbessert und kann entweder in einer oder in zwei Stufen durchgeführt werden. Die ganzen Verfahrensänderungen haben jedoch den Nachteil, daß die Ergebnisse streuen, insbesondere bei der Bestimmung von niedrigen Faktor IX Werten. Dieser Mangel an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit tritt gerade bei den Nachweisbereichen auf, bei denen die Genauigkeit am kritischsten ist.
Ein weiterer großer Nachteil des APTT-Verfahrens ist der, daß Arzneimittel, wie Heparin, bei der Untersuchung stören und dadurch zu falschen oder irreführenden Ergebnissen führen. Noch weitere Nachteile schließen das Erfordernis von großen Mengen von Plasma, das eine Faktor IX-Defizienz hat, ein, was schwierig und teuer zu beschaffen ist, sowie die Schwierigkeit, die Verfahren zu automatisieren. Schließlich sind das APTT- und verwandte Verfahren nicht spezifisch für den Faktor IX, sondern sind für die Analyse von mehreren Blutgerinnungsfaktoren anwendbar, die SUA verwenden, das einzeln für den zu analysierenden Faktor entzogen wird. Alle diese Analysen verlassen sich auf die Annahme, daß "normales" Plasma eine einhundert Prozent (100%)-Verbesserung der Thromboplastinzeit ergibt. Dies bedeutete, daß Personen, die die Analyse durchführen, der Unannehmlichkeit unterworfen werden, jedesmal, wenn die Analyse durchgeführt wird, eine Standardkurve auszuarbeiten.
Thrombin Research, 27 (1982), S. 289-301, "Measurement of Human Factor IXa Activity In An Isolated Factor X Activation System", M.J. Griffith et al., offenbart eine Faktor IX Analyse unter Einbeziehung von Faktor X Aktivierung, bei der der Faktor VIII durch Thrombin in einem Analysegemisch aktiviert und Faktor Xa mit einem chromogenen Indikator nachgewiesen wird. Diese Veröffentlichung berücksichtigt nicht die Wirkung von Thrombin auf den chromogenen Indikator und offenbart nicht die Zugabe eines Thrombin-Inhibitors mit dem Indikator zu dem Analysegemisch.
Thromb Haemostas, 48 (1982), S. 127-132, ''Activation of Factor IX by Factor Xla - A spectrophotometric Assay for Factor IX in Human Plasma", G. Tans et al., offenbart eine spektrophotometrische Analyse für den Faktor IXa und offenbart, daß der Faktor Villa Vmax für die Faktor Xa Bildung verstärkt. Diese Veröffentlichung offenbart nicht die Zugabe von Thrombin zu der Analyse.
Biochem, J., 233 (1984), S. 607-615, "The Contribution of Ca²&spplus; and Phospholipids to the Activation of Human Blood-coagulation Factor X by Activated Factor IX", K. Mertens und R. Bertina, offenbart spektrophotometrische Untersuchungen, die dazu bestimmt sind, den Beitrag von Calciumionen und Phospholipiden an der Aktivierung von Faktor X durch den Faktor IXa zu bestimmen. Diese Veröffentlichung offenbart nicht die Zugabe von Thrombin zu dem Analysengemisch.
Haemostasis, 12 (1982), S. 241-255, "Use of Chromogenic Peptide Substrates in the Determination of Clotting Factors II, VII, IX and X in Normal Plasma and in Plasma of Patients treated with Oral Anticoagulants", M.P. van Dieijen- Visser et al., offenbart eine spektrophotometrische Analyse von Faktor IXa, der an den Faktor X gekoppelt ist, und erwähnt die Möglichkeit, den Faktor VIIIa zuzugeben, weil der letztere die Geschwindigkeit der Faktor X Aktivierung stimuliert. Diese Veröffentlichung offenbart nicht die Zugabe von Thrombin zu der Analyse.
Die Oberbegriffe der Ansprüche 1 und 5 basieren auf der Griffith et al. Veröffentlichung, und die unterscheidenden Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den kennzeichnenden Teilen der Ansprüche 1 und 5 dargelegt.
Die Erfindung liefert eine hochempfindliche, reproduzierbare und einfache Analyse zur Bestimmung der Werte vom Blutkoagulationsfaktor IX, der im Blutserum, im Plasma und anderen Fluiden vorhanden ist. Bei der erfindungsgemäßen Analyse wird eine Testprobe Blutserum, Plasma oder anderer Faktor IX-haltiger Fluide zu einer Lösung, die den aktivierten Blutkoagulationsfaktor XI (nachstehend als Faktor XIa bezeichnet) und Calciumionen enthält, gegeben. Nach einem Inkubationszeitraum, während dessen der Faktor IX im wesentlichen vollständig in den aktivierten Faktor IX (nachstehend als Faktor IXa bezeichnet) umgewandelt wird, wird eine zweite Lösung, die die Blutkoagulationsfaktoren VIII, X, Phospholipide und Calciumionen enthält, zu dem Inkubationsgemisch gegeben und weiter inkubiert. Während dieser Inkubation dient der Faktor IXa, der während der ersten Inkubation erzeugt wurde, dazu, die Umwandlung des Faktors X in den aktivierten Faktor X (nachstehend als Faktor Xa bezeichnet) zu beschleunigen. Die Geschwindigkeit, mit der der Faktor Xa bei dieser Reaktion erzeugt wird, ist direkt proportional der Menge des gebildeten Faktors IXa. Zu dem Gemisch wird ein Indikatormittel zugegeben, das mit dem so gebildeten Faktor Xa reagiert, um ein Signalmolekül, das einfach gemessen werden kann, freizusetzen. Thrombin wird vor Zugabe des Faktor VIII zu dem Analysegemisch zugegeben, und ein Thrombin-Inhibitor wird zusammen mit einem Indikatormittel zu dem Gemisch gegeben.
Die nachfolgenden Gleichungen veranschaulichen die Schritte des vorliegenden Verfahrens weiter:
1) Faktor XI Faktor IXa/Ca&spplus;&spplus; Faktor IXa
2) Faktor X Thrombin Faktor IXa/Phospholipid Faktor VIII Ca&spplus;&spplus; Faktor Xa
3) Indikatormittel + Thrombin-Inhibitor Faktor Xa Signalmolekül
In Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Analysenmethode zur Verfügung gestellt, die einen hohen Grad an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit hat, insbesondere in den unteren Faktor IX-Konzentrationsbereichen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Versuchsausrüstung zur einfachen Durchführung routinemäßiger Laboruntersuchungen von Faktor IX-haltigen Fluiden zur Verfügung zu stellen.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Das Verfahren der erfindungsgemäßen Analyse weist die folgenden Schritte auf:
1. Vereinigen einer Fluid-Probe, die eine bekannte oder unbekannte Menge Faktor IX enthält, mit Faktor XIa in Gegenwart von Calciumionen (Ca&spplus;&spplus;) zu einem Gemisch;
2. Inkubieren des Gemisches für einen Zeitraum, der ausreicht, um im wesentlichen den gesamten Faktor IX in den Faktor IXa umzuwandeln;
3. Weiteres Vereinigen des Inkubationsgemisches mit dem Faktor X in Gegenwart von Phospholipiden, Faktor VIII und Calciumionen (Ca&spplus;&spplus;);
4. Inkubieren des Gemisches für einen Zeitraum, der ausreicht, um den ganzen oder einen Teil des Faktors X in Faktor Xa umzuwandeln;
5. Zugeben eines Indikatormittels, das mit Faktor Xa unter Freisetzung eines Signalmoleküls zu reagieren vermag, zu dem Inkubationsgemisch; und
6. Messen des Signalmoleküls; wobei Thrombin vor Zugeben des Faktors VIII zu dem Analysegemisch zugegeben wird und wobei ein Thrombin-Inhibitor zusammen mit dem Indikatormittel zu dem Gemisch zugegeben wird.
Das vorstehende Verfahren kann einfach unter Bezug auf die nachfolgenden Gleichungen erklärt werden:
1) Faktor IX Faktor IXa/Ca&spplus;&spplus; Faktor IXa
2) Faktor X Thrombin Faktor IXa/Phospholipid Faktor VIII Ca&spplus;&spplus; Faktor Xa
3) Indikatormittel + Thrombin-Inhibitor Faktor Xa Signalmolekül
Die Faktoren XI, VIII und X können für die Durchführung der Analyse faktisch aus jeder tierischen oder menschlichen Quelle erhalten werden, und sie können nach jedem Fraktionierungs- oder Konzentrationsverfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden. Ferner besteht eine hochreine Quelle solcher Faktoren aus rekombinierten Vektoren, die in geeigneten Wirtszellen vermehrt wurden. Ein Vorteil bei der Verwendung von Faktoren, die tierischen oder rekombinierten Vektor-Ursprungs sind, ist die Gewißheit, daß die Produktfaktoren nicht mit menschlichen Krankheitserregern, wie Hepatitis A oder B, HTLV-III, oder anderen solchen Viren, verunreinigt sind. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Analyse stammen die Koagulationsfaktoren vom Rind.
Die Umwandlung von Faktor X in Xa geht am wirksamsten bei Anwesenheit von Phospholipiden vonstatten. Diese Phospholipide können solche typische Verbindungen, wie Phosphotidylcholin, Phosphotidylserin oder Cholesterin und Gemische davon mit verschiedenen Anteilen sein. Andere Lipid- und Phospholipid-Zusammensetzungen können ebenfalls eingesetzt werden, aber die bevorzugte Phospholipid-Zusammensetzung besteht aus etwa 60% Phosphotidylcholin, 23% Phosphotidylserin und 8% Cholesterin.
Jede beliebige chemische Quelle für Calcium-Kationen kann verwendet werden, um die Umwandlung der Faktoren X und XI zu bewirken.
Es können ausreichend Calciumionen zu dem ursprünglichen Inkubationsgemisch gegeben werden, um die Reaktion, die den Faktor X in Faktor Xa umwandelt, zu beschleunigen, oder eine zweite Menge Calciumionen kann zu dem Zeitpunkt zugegeben werden, an dem der Faktor X umgewandelt werden soll. Obwohl die Quelle der Calcium-Kationen (Ca&spplus;&spplus;) Verbindungen wie CaCl&sub2;, Ca(NO&sub2;)&sub2;, CaSO&sub4; oder andere anorganische oder organische Calcium-Kationen-haltige Verbindungen sein können, ist die bevorzugte Quelle CaCl&sub2;.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Analyse können sehr unterschiedliche Proteinkonzentrationen, Inkubationszeiten, Reagenzkonzentrationen und Temperaturen verwendet werden. Die Auswahl bestimmter Analyse-Parameter wird durch den Ursprung, die Art und Größe der zu untersuchenden Probe, die zu erwartenden Faktor IX-Werte, die darin enthalten sind, und durch die gewünschte Empfindlichkeitsschwelle beeinflußt. Wenn diese Umstände berücksichtigt werden, sind für einen Fachmann die Auswahl der Analyse-Parameter offensichtlich. Die Parameter der Analyse, die es jedem Fachmann erlauben, die Analyse entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform durchzuführen, werden in dem nachfolgenden Beispiel angegeben.
Da die Menge des in der Testprobe vorhandenen Faktors IX proportional der Geschwindigkeit ist, mit der der Faktor X in den Faktor Xa umgewandelt wird, ist es vorteilhaft, diese Analyse durch Messen des Signalmoleküls, das von dem Indikationsmittel zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion freigesetzt wird, durchzuführen. Demnach besteht ein möglicher zusätzlicher Schritt der vorliegenden Analyse in der Zugabe einer Quench-Zusammensetzung zu dem Inkubationsgemisch zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion, bei der der Faktor X in den Faktor Xa umgewandelt wird. Die Quench-Zusammensetzung kann jede beliebige Substanz sein, die in der Lage ist, eine chemische Reaktion, die durch ein Protein vermittelt wird, zu unterbrechen, die bevorzugte Zusammensetzung ist aber eine gepufferte Lösung, die Triethylendiamintetraessigsäure, Natriumchlorid und Natriumazid aufweist. Die Konzentrationen der Bestandteile der bevorzugten Zusammensetzung werden in dem Beispiel angegeben.
Die Blutkoagulationsfaktoren der vorliegenden Analyse und das zu analysierende Faktor IX-Protein sind fragile funktionale Proteine, und sinnvollerweise können ein Stabilisierungsmittel oder Substanzen während der Inkubation eingeschlossen werden, um die Analysebedingungen zu optimieren und die Funktionalität der Komponenten der Analyse zu schützen. Solche Stabilisierungsmittel schützen auch die Funktionalität während der Lagerung, wobei die Komponenten der Analyse entweder in einem feuchten oder gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gehalten werden. Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Stabilisierungsmittel bekannt; die bevorzugten Substanzen sind Polyethylenglycol und Serumalbumin vom Rind, entweder einzeln oder in Kombination.
Das erfindungsgemäße Indikatormittel ist ein Molekül, das in der Lage, ist mit dem Blutkoagulationsfaktor Xa zu reagieren. Bei einer solchen Reaktion müssen Nebenprodukte einer chemischen Reaktion entstehen, die eine meßbare Signaleinheit erzeugen. Die US Patente Nr. 4 480 030 und 4 666 831 beschreiben eine Klasse chromogener Verbindungen, die in der Lage sind, mit dem Faktor Xa zu reagieren. Das bevorzugte Mitglied dieser Verbindungsklasse, das besonders für die vorliegende Analyse geeignet ist, reagiert mit dem Faktor Xa entsprechend der nachfolgenden Gleichung:
CH&sub3;OCO-d-CHG-Gly-Arg-pNA/F Xa
CH&sub3;OCO-d-CHG-Gly-Arg-OH + p-Nitroanilin
wobei Gly Glycin ist, Arg Arginin ist und pNA para-Nitroanilin ist. Bei der Umsetzung mit dem Faktor Xa wird das Signalmolekül p-Nitroanilin freigesetzt, das einfach durch spektrophotometrische Bestimmung bei 405 nm gemessen werden kann.
Es stehen auch andere chromogenen Indikatormittel, die in der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, zur Verfügung. Dem Fachmann ist aus der vorstehenden Offenbarung ersichtlich, daß die Signaleinheit des ins Auge gefaßten Indikatormittels radioaktiv markiert sein kann, vorzugsweise mit Tritium oder Kohlenstoff-14, und daß das Signalmolekül bei der Freisetzung, zum Beispiel durch Ausschlußchromatographie, Dialyse, Immunoadsorption oder mit anderen günstigen Trennverfahren, isoliert werden kann. Obwohl sie beschwerlich zu handhaben sind, haben radioaktiv markierte Indikatormittel in denjenigen Situationen den Vorteil einer größeren Empfindlichkeit, in denen normalerweise eine große Empfindlichkeit benötigt wird.
Die Komponenten der Faktor IX-Analyse können als Versuchsausrüstung zur einfachen und routinemäßigen Durchführung einer großen Anzahl solcher Analysen erhältlich sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist diese Analysen-Versuchsausrüstung ein erstes Gefäß, das den Faktor XIa und Thrombin enthält, beide in einer Menge, die für eine oder eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht, ein zweites Gefäß, das die Faktoren VIII und X in einer Menge enthält, die für eine oder eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht, und ein drittes Gefäß auf, das ein Indikatormittel in einer Menge enthält, die für eine oder eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht. Gegebenenfalls wird ein weiteres Gefäß zur Verfügung gestellt, das eine Quench-Zusammensetzung in einer Menge enthält, das für eine oder eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht. Um die Lagerstabilität der Komponenten der Versuchsausrüstung zu optimieren, ist es wünschenswert, sie in den bereits erwähnten Gefäßen zu lyophilisieren. Die Komponenten können zu dem Zeitpunkt, wenn Analysen durchgeführt werden müssen, wieder leicht durch Zugabe von Wasser in den ursprünglichen Zustand rücküberführt werden. Die Gefäße, die die Analysenkomponenten enthalten, lassen sich leicht an ein automatisches Analysegerät anpassen.
Weitere vorteilhafte Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung sind aus dem nachfolgenden Beispiel ersichtlich.

Beispiel

Proben von Patienten wurden durch Zugeben von neun Teilen frisch abgenommenen Blutes zu einem Teil 0,13 M Natriumcitrat mit anschließendem 10 minütigem Zentrifugieren bei etwa 3000 min&supmin;¹ hergestellt.
Die Plasmaproben der Patienten wurden zu einer mit Wasser wieder in den ursprünglichen Zustand zurückversetzten (rekonstituiert) gefriergetrockneten Zubereitung, die 4,5 pMol Faktor XIa vom Rind, 0,2 nMol Thrombin vom Rind, 0,06 mMol Calciumchlorid, 0,06 uMol Phospholipide, tris(Hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Puffer mit einem pH-Wert von 8 und die Stabilisatoren BSA und Polyethylenglycol 6000 enthielt, gegeben. Die Inkubation wurde anschließend etwa 10 Minuten wahlweise bei 25ºC, 30ºC und 37ºC durchgeführt. Nach der Inkubation wurde eine durch Wasser rekonstituierte gefriergetrocknete Zubereitung, die etwa 1 mMol Faktor X vom Rind, etwa drei Einheiten Faktor VIII vom Rind und Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8 enthielt, zu dem Inkubationsgemisch zugegeben. Nach zehn Minuten wurde eine durch Wasser rekonstituierte gefriergetrocknete Indikatorzubereitung, die 3,4 uMol CH&sub3;-OCO-d-CHG-Gly-Arg-pNA, einen Thrombin-Inhibitor und Proteinstabilisatoren enthielt, zugegeben. Die Umsetzung wurde durch Zugabe eines Quenchmittels, das Tris-Puffer (20 mM), Ethylendiamintetraessigsäure (10 mM), Natriumchlorid (5 mM) und Natriumazid (0,01 M) enthielt, beendet. Die Bestimmung der spektrophotometrischen Adsorption bei 405 nm wurde mit einem Beckman 2D Spektrophotometer durchgeführt.
Plasmaproben von 103 Patienten wurden auf ihren Faktor IX-Gehalt analysiert. Von vielen dieser Patienten war bekannt, daß sie Bluter waren, und einige von ihnen unterzogen sich einer Therapie mit verschiedenen Arzneimitteln, von denen bekannt ist, daß sie bei klassischen Analysen nach dem Stand der Technik stören.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Anwesenheit von Heparin im Plasma von Patienten, die sich einer Heparin-Therapie unterzogen, nicht bei der erfindungsgemäßen Analyse störte. Durch in vitro Zugabe von bis zu 3 U/ml Heparin zum Plasma hatte keine bedeutende Auswirkung auf die Analyse. Des weiteren gab es, wie in Fig. 1 gezeigt, bei einer Vergleichsstudie mit geteilten Proben, die nach der neuen Analysenmethode und der Analysenmethode nach dem Stand der Technik untersucht wurden, eine hochsignifikante Korrelation der Faktor IX- Werte: N = 98, r = 0,94 und Y = 0,97, und N = 98, r = 0,93 und y = 1,01 x + 3 an zwei verschiedenen Analyseorten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Werte von Blutgerinnungsfaktor IX in einer Fluid-Probe, das folgendes umfaßt:

a) Vereinigen der Fluid-Probe mit dem Blutgerinnungsfaktor XIa in Gegenwart von Calciumionen zu einem Gemisch;

b) Inkubieren des Gemisches für einen Zeitraum, der ausreicht, um im wesentlichen den gesamten Faktor IX in den Faktor IXa umzuwandeln;

c) weiteres Vereinigen des Inkubationsgemisches mit dem Faktor X in Gegenwart von Phospholipiden, Faktor VIII und Calciumionen;

d) Inkubieren des Gemisches für einen Zeitraum, der ausreicht, um den ganzen oder einen Teil des Faktors X in den Faktor Xa umzuwandeln;

e) Zugeben eines Indikatormittels, der mit Faktor Xa unter Freisetzung eines Signalmoleküls zu reagieren vermag, zu dem Inkubationsgemisch; und

f) Messen des Signalmoleküls;

g) wobei dem Gemisch Thrombin vor Zugabe des Faktors VIII zugegeben wird;

h) dadurch gekennzeichnet,

daß dem Gemisch ein Thrombin-Inhibitor mit dem Indikator zugegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, zusammen mit dem weiteren Schritt der Zugabe einer Quench-Zusammensetzung zu einem festgesetzten Zeitpunkt nach dem Beginn der Reaktion, in der der Faktor X in den Faktor Xa umgewandelt wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Signalmolekül p-Nitroanilin ist.

4. Versuchsausrüstung zur Durchführung einer Faktor IX Analyse, die folgendes aufweist:

a) ein erstes Gefäß, das Thrombin und den Faktor XIa enthält;

b) ein zweites Gefäß, das die Faktoren VIII und X enthält;

und dadurch gekennzeichnet,

daß ein drittes Gefäß einen Thrombin-Inhibitor enthält.

5. Versuchsausrüstung nach Anspruch 4, die ein weiteres Gefäß aufweist, das eine Quench-Zusammensetzung enthält.

6. Versuchsausrüstung nach Anspruch 4 oder 5, die folgendes aufweist:

- eine Menge an Faktor XIa, die für eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht;

- Thrombin-Faktoren VIII und X in einer Menge, die für eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht; und

- das Indikationsmittel und den Thrombin-Inhibitor in einer Menge, die für eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht.

7. Versuchsausrüstung nach Anspruch 5, die die Quench-Zusammensetzung in einer Menge aufweist, die für eine Vielzahl von Faktor IX Analysen ausreicht.

8. Versuchsausrüstung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Faktoren VIII, X und XIa und das Thrombin tierischen Ursprungs sind.

9. Versuchsausrüstung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Faktoren VIII, X und XIa und das Thrombin aus einem rekombinierten Vektor erhalten sind, der in einer Wirtszelle vermehrt worden ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Faktoren VIII, X, XIa und das Thrombin tierischen Ursprungs sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Faktoren VIII, X und XIa und das Thrombin aus einem rekombinierten Vektor erhalten werden, der in einer Wirtszelle vermehrt worden ist.