ES2219324T3 - DETERMINATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE FORMS OF PROTEOLITIC ENZYMES. - Google Patents
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Abstract
Description
Determinación de formas biológicamente activas de enzimas proteolíticas.Determination of biologically active forms of proteolytic enzymes
La presente invención corresponde al campo del diagnóstico y se refiere más en particular a un método para la determinación de formas biológicamente activas de enzimas proteolíticas, tales como trombina, en la sangre y en otros fluidos corporales.The present invention corresponds to the field of diagnosis and refers more particularly to a method for determination of biologically active forms of enzymes proteolytics, such as thrombin, in the blood and other fluids bodily
En el mundo occidental, la trombosis arterial y venosa, y la arteriosclerosis son conjuntamente responsables en la actualidad de más del 50% de la mortalidad y morbilidad grave. En unas pocas décadas ésta será la situación a escala mundial [Murray, C.J. y A.D. López, Science (1996) 274: 740-743]. La trombosis es provocada por un exceso de actividad del mecanismo hemostático que es responsable de interrumpir el sangrado de una herida. Este sistema hemostático-trombótico (HTS) es una interacción compleja entre las paredes de los vasos, las células sanguíneas, especialmente las plaquetas de la sangre y proteínas del plasma. Ver, por ejemplo, Hemker H.C. Thrombin generation, an essential step in haemostasis and thrombosis. In: Heamostasis and thrombosis, A.L. Bloom y otros, eds., Churchill Livingstone, Edimburgo, (1994) 477-490.In the western world, arterial and venous thrombosis, and arteriosclerosis are now jointly responsible for more than 50% of severe mortality and morbidity. In a few decades this will be the situation worldwide [Murray, CJ and AD López, Science (1996) 274: 740-743]. Thrombosis is caused by excessive activity of the hemostatic mechanism that is responsible for interrupting bleeding from a wound. This hemostatic-thrombotic system (HTS) is a complex interaction between vessel walls, blood cells, especially blood platelets and plasma proteins. See, for example, Hemker HC Thrombin generation, an essential step in haemostasis and thrombosis . In: Heamostasis and thrombosis, AL Bloom et al., Eds., Churchill Livingstone, Edinburgh, (1994) 477-490.
En la sangre hay por lo menos tres series de cascadas de proenzima-enzima de gran importancia biológica: el sistema de coagulación de la sangre, el sistema fibrinolítico y el sistema complementario. En cada uno de estos sistemas proteolíticos, las proenzimas son activadas y a continuación inhibidas. En general es importante que la concentración de una enzima activada en esta cascada pueda ser medida a efectos de evaluar la función del sistema. A continuación se indicará una descripción típica del sistema de coagulación con énfasis en su enzima más importante, la trombina. No obstante, se debe observar que la presente invención se relaciona también con otras enzimas de la coagulación y enzimas de la ruta fibrinolítica y complementaria.In the blood there are at least three series of proenzyme-enzyme cascades of great importance biological: the blood coagulation system, the system Fibrinolytic and the complementary system. In each of these proteolytic systems, proenzymes are activated and at continued inhibited. In general it is important that the concentration of an activated enzyme in this cascade can be measure to evaluate the function of the system. Then a typical description of the coagulation system with emphasis on its most important enzyme, thrombin. However, it It should be noted that the present invention also relates to other coagulation enzymes and enzymes of the fibrinolytic pathway and complementary.
El mecanismo de generación de la trombina se puede indicar con un cierto detalle a continuación. En el sistema de coagulación plasmática el factor Xa se forma por la acción del complejo factor tejido-factor VIIa (TF-VIIa). El factor Xa se une al inhibidor de la ruta del factor tejido (TFPI) y el complejo TFPI-Xa inhibe el complejo TF-VIIa. La trombina activa los factores V, VIII y XI y, por lo tanto, acelera su propia generación, pero también se une a la trombomodulina y, por lo tanto, pone en marcha el mecanismo de la proteína C que fracciona los factores activados V y VIII, inhibiendo por lo tanto de manera indirecta la generación adicional de trombina. Una fracción importante (\approx30%) de toda la trombina formada en el plasma en coagulación está unida al coágulo de fibrina. La trombina unida al coágulo retiene sus características trombóticas, puede coagular el fibrinógeno, puede activar los factores V, VIII y XI, así como las plaquetas [Béguin, S. y R. Kumar, Thromb. Haemost. (1997) 78: 590-594; Kumar, R., S. Béguin, y H.C. Hernker, Thromb. Haemost. (1994) 72:713-721, y (1995) 74:962-968]. No es inhibida por la antitrombina.The thrombin generation mechanism is You can indicate with some detail below. In the system of Plasma coagulation factor Xa is formed by the action of complex tissue factor-factor VIIa (TF-VIIa). Factor Xa binds to the inhibitor of tissue factor pathway (TFPI) and the TFPI-Xa complex inhibits the TF-VIIa complex. Thrombin activates factors V, VIII and XI and, therefore, accelerates its own generation, but it also binds to thrombomodulin and therefore puts on marching the mechanism of protein C that divides the factors activated V and VIII, thereby indirectly inhibiting the additional thrombin generation. An important fraction (approx30%) of all thrombin formed in plasma in Coagulation is attached to the fibrin clot. Thrombin bound to Clot retains its thrombotic characteristics, it can coagulate the fibrinogen, can activate factors V, VIII and XI, as well as platelets [Béguin, S. and R. Kumar, Thromb. Haemost (1997) 78: 590-594; Kumar, R., S. Béguin, and H.C. Hernker, Thromb. Haemost (1994) 72: 713-721, and (1995) 74: 962-968]. It is not inhibited by antithrombin.
La acción de la trombina provoca receptores en la membrana de la plaqueta para unirse con el fibrinógeno, lo cual provoca la agregación de las plaquetas. La activación de las plaquetas conduce también a la exposición de fosfolípidos procoagulantes en una reacción dependiente del factor Von Willebrand [Béguin S., R. Kumar, I. Keularts, U. Seligsohn, B.C. Coller y H.C. Hemker, Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von Willebrand Factor, Blood (1999) 93:564-570; Béguin, S. y R. Kumar, supra (1997)]. Estos fosfolípidos son necesarios para la activación adecuada del factor X y la protrombina. Recientemente, esta cuestión se ha complicado por el descubrimiento de que la fibrina, que anteriormente se había creído que era un producto final inerte de la coagulación, juega en sí misma un papel activo. Se une y activa con el factor Von Willebrand, que activa las plaquetas y provoca la exposición de los fosfolípidos procoagulantes con intermedio de una ruta alternativa.The action of thrombin causes receptors in the platelet membrane to bind with fibrinogen, which causes platelet aggregation. Platelet activation also leads to exposure of procoagulant phospholipids in a von Willebrand factor-dependent reaction [Béguin S., R. Kumar, I. Keularts, U. Seligsohn, BC Coller and HC Hemker, Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von Willebrand Factor, Blood (1999) 93: 564-570; Béguin, S. and R. Kumar, supra (1997)]. These phospholipids are necessary for the proper activation of factor X and prothrombin. Recently, this issue has been complicated by the discovery that fibrin, which had previously been believed to be an inert end product of coagulation, itself plays an active role. It binds and activates the von Willebrand factor, which activates platelets and causes the exposure of procoagulant phospholipids through an alternative route.
La cooperación entre las plaquetas y el sistema de coagulación, incluyendo la fibrina, es básica para el sistema hemostático-trombótico. El mecanismo muestra abundancia de bucles de realimentación positivos y negativos, frecuentemente anidados. Una subactividad provoca sangrado, un exceso de actividad provoca trombosis. La trombosis se manifiesta como infarto coronario, apoplejia, embolias pulmonares y un gran número de enfermedades menos frecuentes.Cooperation between platelets and the system Coagulation, including fibrin, is basic to the system hemostatic-thrombotic. The mechanism shows abundance of positive and negative feedback loops, frequently nested A subactivity causes bleeding, a Excessive activity causes thrombosis. Thrombosis manifests such as coronary infarction, stroke, pulmonary embolisms and a large number of less frequent diseases.
Para evaluar la función de dicho sistema, también a efectos de diagnóstico y para la utilización segura de medicamentos antitrombóticos, se requiere una sonda para la situación funcional del sistema hemostático-trombótico. Una prueba funcional importante del HTS es la curva de generación de trombina (TGC). Llevada a cabo en plasma pobre en plaquetas, proporciona información sobre el funcionamiento del sistema de coagulación plasmática. En el plasma rico en plaquetas, mide también en función de las mismas.To evaluate the function of that system, also for diagnostic purposes and for the safe use of antithrombotic medications, a probe is required for functional status of the system hemostatic-thrombotic. A functional test Important of the HTS is the thrombin generation curve (TGC). Carried out in platelet-poor plasma, it provides information on the functioning of the plasma coagulation system. In the Platelet-rich plasma, also measures based on them.
De acuerdo con la técnica anterior el TGC puede ser medido por submuestreo o de manera continuada. En el método antiguo de submuestreo [Biggs, R. y R.G. Macfarlane, Human Blood Coagulation and its Disorders. 1953, Oxford:Blackwell; Quick, A.J., Haemorrhagic Diseases. 1957, Filadelfia: Lea & Febiger], se toman muestras de una mezcla de coagulación y se mide en cada muestra la concentración de trombina.In accordance with the prior art, the TGC can be measured by subsampling or continuously. In the old method of subsampling [Biggs, R. and RG Macfarlane, Human Blood Coagulation and its Disorders. 1953, Oxford: Blackwell; Quick, AJ, Haemorrhagic Diseases . 1957, Philadelphia: Lea & Febiger], samples of a coagulation mixture are taken and the thrombin concentration is measured in each sample.
La trombina activa sobrevive en el plasma durante un período limitado de tiempo solamente (el tiempo de vida media es de 16-17 segundos). Esto es debido a las antitrombinas circulantes. La mayor parte de la trombina (64%) es inactivada por antitrombina (AT), una plasma-proteína de 57 kD, 23% por \alpha_{2}-macroglobulina (\alpha_{2}M), una plasma-proteína de 725 kD, y 13% por otros distintos agentes [Hemker, H.C., G.M. Willems, y S. Béguin, A computer assisted method to obtain the prothrombin activation velocity in whole plasma independent of thrombin decay processes, Thromb. Haemost. (1986) 56:9-17]. El complejo \alpha_{2}-macroglobulina-trombina (\alpha_{2}M-IIa) tiene la peculiaridad de que es inactivo con respecto a todos los substratos macromoleculares, pero conserva su actividad contra substratos de pequeño peso molecular (artificiales). La \alpha_{2}-macroglobulina es una glicoproteína de Mr 725.000, que se encuentra presente en el plasma en una concentración de 2500 mg/L o 3,5 \muM. Es un tetrámero de subunidades idénticas de 185 kD. La reacción de inactivación de una proteinasa activa o un factor de coagulación activado con \alpha_{2}M es un proceso de tres etapas: 1º. Formación de un complejo libre, 2º. Hidrólisis de un péptido diana en \alpha_{2}M, provocando 3º. un rápido cambio de conformación que atrapa físicamente la molécula de la enzima dentro de la molécula \alpha_{2}M. [Ver como resumen: Travis, J. y G.S. Salvesen, Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. (1983) 52: 655-709].Active thrombin survives in the plasma for a limited period of time only (the half-life is 16-17 seconds). This is due to circulating antithrombins. Most thrombin (64%) is inactivated by antithrombin (AT), a 57 kD plasma protein, 23% by α2-macroglobulin (α2 M), a plasma protein of 725 kD, and 13% by other different agents [Hemker, HC, GM Willems, and S. Béguin, A computer assisted method to obtain the prothrombin activation velocity in whole plasma independent of thrombin decay processes, Thromb. Haemost (1986) 56: 9-17]. The α2 -macroglobulin-thrombin complex (α2M-IIa) has the peculiarity that it is inactive with respect to all macromolecular substrates, but retains its activity against small (artificial) molecular weight substrates. Α2 -macroglobulin is a glycoprotein of Mr 725,000, which is present in plasma in a concentration of 2500 mg / L or 3.5 µM. It is a tetramer of identical subunits of 185 kD. The inactivation reaction of an active proteinase or a coagulation factor activated with α2M is a three step process: 1st. Formation of a free complex, 2nd. Hydrolysis of a target peptide in α2M, causing 3rd. a rapid change of conformation that physically traps the enzyme molecule within the α2M molecule. [See as summary: Travis, J. and GS Salvesen, Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. (1983) 52: 655-709].
El grupo de Hemker que desarrolló un método continuo en el que la formación de un producto catalizado por trombina a partir de substratos adecuados es controlada directamente [Hemker, H.C., y otros, Continuous regisfration of thrombin generation in plasma, its use for the detennination of the thrombin potential. Thromb. Heamost. (1993) 70:617-624]. Las constantes cinéticas del substrato son tales que, a la concentración utilizada, la velocidad de formación del producto es proporcional a la cantidad de enzima presente (trombina o \alpha_{2}M-IIa). La actividad de la enzima a lo largo del tiempo en la muestra se puede estimar como primera derivada de la curva producto-tiempo.The Hemker group that developed a method continuous in which the formation of a product catalyzed by thrombin from suitable substrates is directly controlled [Hemker, H.C., and others, Continuous regisfration of thrombin generation in plasma, its use for the arresnination of the thrombin potential. Thromb. Heamost (1993) 70: 617-624]. The Kinetic constants of the substrate are such that, at the concentration used, the speed of product formation is proportional to the amount of enzyme present (thrombin or α2 M-IIa). Enzyme activity at length of time in the sample can be estimated as first derived from the product-time curve.
Un inconveniente de este método es que una parte de la trombina en el plasma se une a la \alpha_{2}-macroglobulina. La \alpha_{2}-macroglobulina es el inhibidor no específico de proteasa más abundante del plasma sanguíneo. Interrumpe la actividad biológica de las proteasas (factores de coagulación activados, enzimas fibrinolíticas activadas y factores complementarios activados) sin ocupar su centro activo, de manera que existe una actividad residual en los habituales substratos-señal de oligopéptidos.A drawback of this method is that a part of thrombin in plasma binds to the α2 -macroglobulin. The α2 -macroglobulin is the non-inhibitor more abundant protease specificity of blood plasma. Disrupts the biological activity of proteases (factors of activated coagulation, activated fibrinolytic enzymes and factors activated complements) without occupying its active center, so that there is a residual activity in the usual oligopeptide signal substrates.
Este complejo \alpha_{2}M-IIa no tiene actividad fisiológica conocida, pero es capaz de fraccionar substratos cromogénicos. De este modo, la formación de producto observada es el resultado de las actividades combinadas de la trombina libre y de la trombina unida a la \alpha_{2}-macroglobulina. Los datos relevantes, es decir, la cantidad de producto formado solamente por la trombina libre, pueden ser extraídos de la formación de producto experimental por una operación matemática. No obstante, la operación tiene que ser llevada a cabo en el conjunto de la curva de generación del producto. Por lo tanto, la formación de producto requiere ser controlada de manera continuada. Si bien el principio de este método continuo es aplicable a todos los substratos que proporcionan un producto que puede ser detectado a lo largo del tiempo, por ejemplo, por señales fluorescentes, electroquímicas o NMR, su aplicación está habitualmente restringida a la utilización de substratos cromogénicos en un medio ópticamente transparente, es decir, plasma pobre en plaquetas desfibrinado (PPP).This α2M-IIa complex It has no known physiological activity, but is able to fractionate chromogenic substrates. In this way, product formation observed is the result of the combined activities of the free thrombin and thrombin bound to the α2 -macroglobulin. The relevant data, that is, the amount of product formed only by thrombin free, can be extracted from experimental product training For a mathematical operation. However, the operation has to be carried out in the whole of the generation curve of the product. Therefore, product training needs to be continuously monitored. While the beginning of this method continuous is applicable to all substrates that provide a product that can be detected over time, for example, by fluorescent, electrochemical or NMR signals, its application is usually restricted to the use of substrates chromogenic in an optically transparent medium, i.e. plasma defibrinated platelet poor (PPP).
Por lo tanto, existe todavía la necesidad de un método eficaz para medir la cantidad de (formas activas de) enzimas proteolíticas, tales como trombina, en la sangre y otros fluidos, lo cual obvia los inconvenientes de la técnica anterior. La presente invención da a conocer un método de este tipo.Therefore, there is still a need for a effective method to measure the amount of (active forms of) enzymes proteolytic, such as thrombin, in the blood and other fluids, what which obviates the drawbacks of the prior art. The present The invention discloses such a method.
El documento WO 96/21740 da a conocer un método para determinar el potencial endógeno de la trombina (ETP) de una muestra, preferentemente en un ensayo continuo, que comprende el contacto de una muestra a evaluar con un substrato sintético soluble en agua que comprende un grupo cedente que genera una señal detectable en el fraccionamiento. El ETP se define como la superficie situada por debajo de la curva trombina-tiempo y se cree por los autores que es el parámetro que mejor indica la capacidad generadora de trombina de una muestra de plasma.WO 96/21740 discloses a method to determine the endogenous thrombin potential (ETP) of a sample, preferably in a continuous test, comprising the contact of a sample to be evaluated with a soluble synthetic substrate in water comprising a transfer group that generates a signal detectable in the fractionation. The ETP is defined as the surface below the curve thrombin-time and it is believed by the authors that it is the parameter that best indicates the thrombin generating capacity of A plasma sample.
El documento US-A-3985620 da a conocer ciertos substratos para determinar proteasas en los que una proteína de substrato está unida por un enlace covalente en distribución fina en la superficie de un portador sólido o sobre dicha superficie, siendo teñido con un tinte reactivo. Son substratos preferentes hemoglobina, fibrinógeno de caseína, colágeno, y productos de modificación de estas proteínas. No se hace referencia al fraccionamiento del substrato por una proteasa en complejo.The document US-A-3985620 discloses certain substrates for determining proteases in which a protein from substrate is joined by a covalent bond in fine distribution in the surface of a solid carrier or on said surface, being Dyed with a reactive dye. They are preferred substrates hemoglobin, casein fibrinogen, collagen, and products Modification of these proteins. No reference is made to fractionation of the substrate by a complex protease.
De acuerdo con la presente invención, se da a conocer un procedimiento para la evaluación de una enzima proteolítica en la sangre u otra muestra de fluido biológico, comprendiendo posiblemente un complejo de dicha enzima proteolítica y \alpha_{2}-macroglobulina, de manera que dicha muestra establece contacto con un substrato que comprende una molécula que tiene un M_{r} superior a 10kD acoplado a un substrato-señal, comprendiendo dicho substrato-señal un grupo cedente detectable, en el que dicho substrato es hidrolizado por dicha enzima proteolítica pero no por dicho complejo.In accordance with the present invention, it is given to know a procedure for the evaluation of an enzyme proteolytic in the blood or other biological fluid sample, possibly comprising a complex of said proteolytic enzyme and? 2 -macroglobulin, so that said sample establishes contact with a substrate comprising a molecule that has an M_ {r} greater than 10kD coupled to a substrate-signal, said said comprising substrate-signal a detectable assigning group, in the that said substrate is hydrolyzed by said proteolytic enzyme but not for said complex.
La enzima proteolítica activa se selecciona preferentemente del grupo que consiste en trombina, factor de coagulación activado, factor fibrinolítico activado, y componente activado del sistema complementario. De éstos, la trombina es la más preferente.The active proteolytic enzyme is selected preferably from the group consisting of thrombin, factor of activated coagulation, activated fibrinolytic factor, and component Activation of the complementary system. Of these, thrombin is the most preferential.
Las moléculas de dimensiones suficientes son seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en una proteína inerte, preferentemente ovalbumina, polisacárido, y polímero sintético. Preferentemente, estas moléculas inertes son solubles en agua y tienen dimensiones tales que no encajan en la cavidad de las moléculas de \alpha_{2}M. Un grupo de moléculas inertes preferentes tienen unas dimensiones aproximadas de 40 kD y una solubilidad como mínimo de 40 mg/ml. Las de mayor preferencia son moléculas inertes con unas dimensiones aproximadas de 20 kD y una solubilidad mínima de 50 mg/ml.The molecules of sufficient dimensions are preferably selected from the group consisting of a protein inert, preferably ovalbumin, polysaccharide, and polymer synthetic. Preferably, these inert molecules are soluble in water and have dimensions such that they do not fit in the cavity of the α2M molecules. A group of inert molecules Preferred have approximate dimensions of 40 kD and a solubility at least 40 mg / ml. The most preferred are inert molecules with approximate dimensions of 20 kD and a minimum solubility of 50 mg / ml.
Estos y otros aspectos de la invención serán explicados en la descripción siguiente.These and other aspects of the invention will be explained in the following description.
La figura 1 representa curvas teóricas de productos de hidrólisis formados en plasma o sangre en coagulación por hidrólisis de un pequeño substrato de trombina y un substrato grande de trombina.Figure 1 represents theoretical curves of coagulation products formed in plasma or blood in coagulation by hydrolysis of a small thrombin substrate and a substrate large thrombin
La figura 2 representa las curvas de productos de hidrólisis del substrato S2288 acoplado con ovalbumina por hidrólisis con \alpha_{2}M-IIa y trombina, respectivamente.Figure 2 represents the product curves of hydrolysis of substrate S2288 coupled with ovalbumin by hydrolysis with α2M-IIa and thrombin, respectively.
La figura 3 representa los modelos de fluorescencia del substrato fluorescente Ala-Arg-AMC acoplado con ovalbumina por hidrólisis con trombina libre y trombina inactivada por \alpha_{2}M, respectivamente.Figure 3 represents the models of fluorescence of the fluorescent substrate Ala-Arg-AMC coupled with ovalbumin by hydrolysis with free thrombin and inactivated thrombin by α2 M, respectively.
La figura 4 muestra los resultados de la determinación del ETP en plasma con SQ68 y OA-Phe-Pip-Lys-pNA.Figure 4 shows the results of the determination of plasma ETP with SQ68 and OA-Phe-Pip-Lys-pNA.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que ciertos substratos-señal para enzimas proteolíticas, especialmente substratos de trombina, son fraccionados por trombina pero no por el complejo \alpha_{2}M-IIa. Por lo tanto, estos substratos-señal son insensibles a la acción de las enzimas proteolíticas cuando están unidos a \alpha_{2}-macroglobulina.The present invention is based on the surprising discovery that certain signal substrates for proteolytic enzymes, especially thrombin substrates, are fractionated by thrombin but not by the complex α2 M-IIa. Therefore these Signal substrates are insensitive to the action of proteolytic enzymes when bound to α2 -macroglobulin.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "substrato-señal" significa un substrato que es fraccionado por enzima o enzimas proteolíticas presentes en el medio, del cual se separa un grupo cedente o grupo inicial que es detectable por métodos ópticos, NMR u otros. Los grupos iniciales que son ópticamente detectables son, por ejemplo, p-nitroanilida y 7-amido-4-metilcoumarina. La p-Nitroanilida absorbe a 405 nm y la 7-amido-4-metilcoumarina es fluorescente (excitación a 390 nm y emisión a 460 nm). Son ejemplos de grupos cedentes activos NMR los que contienen ^{31}P, ^{13}C, o cualquier otro átomo que puede ser detectado por NMR o técnica similar. También se pueden utilizar iones H^{+} como grupo cedente, que pueden ser detectados midiendo cambios en el pH.As used in this description, the term "substrate-signal" means a substrate that is fractionated by enzyme or proteolytic enzymes present in the medium, from which a transfer group or group is separated initial that is detectable by optical methods, NMR or others. The initial groups that are optically detectable are, for example, p-nitroanilide and 7-amido-4-methylcoumarin. P-Nitroanilide absorbs at 405 nm and the 7-amido-4-methylcoumarin It is fluorescent (excitation at 390 nm and emission at 460 nm). They are examples of NMR active donor groups containing 31 P, 13 C, or any other atom that can be detected by NMR or similar technique. H + ions can also be used as a group assignor, which can be detected by measuring changes in pH.
La presente invención tiene la ventaja de que la actividad enzimática transitoria de la trombina libre en la muestra de coagulación puede ser evaluada a partir de la cantidad total de substrato que es convertida, de manera que se puede omitir el proceso matemático.The present invention has the advantage that the transient enzymatic activity of free thrombin in the sample Coagulation can be assessed from the total amount of substrate that is converted, so that you can skip the mathematical process
La formación de trombina en sangre coagulante o plasma se origina en la protrombina por una reacción enzimática controlada que es llamada protrombinasa. Inicialmente esta reacción es lenta, pero la velocidad aumenta de manera exponencial hasta que la trombina formada activa los inactivadores de la protrombinasa y se agota la protrombina.Coagulant blood thrombin formation or plasma originates in prothrombin by an enzymatic reaction controlled that is called prothrombinase. Initially this reaction it is slow, but the speed increases exponentially until the thrombin formed activates prothrombinase inactivators and Prothrombin runs out.
Los inventores han descubierto que la formación de trombina puede adaptarse a la siguiente ecuación matemática:The inventors have discovered that the formation of thrombin can be adapted to the following mathematical equation:
(i)FIIa_{t} \ = \ PT \ . \ (1 \ - \ e^{-b*t}) \ c(i) FIIa_ {t} \ = \ PT \. \ (1 \ - \ e ^ {- b * t}) \ c
en la que FIIa_{t} es la formación de trombina a lo largo del tiempo, PT es la cantidad inicial de protrombina, b y c son constantes y t es el tiempo. Al adaptar una curva de generación de trombina medida de forma real con esta fórmula, se observa una adaptación muy satisfactoria con la misma y los datos cuando b = 0,02 y c = 4.in which FIIa_ {t} is thrombin formation Over time, PT is the initial amount of prothrombin, b and c are constants and t is time. When adapting a curve of Really measured thrombin generation with this formula, observe a very satisfactory adaptation with it and the data when b = 0.02 and c = Four.
La trombina formada reaccionará con los inhibidores plasmáticos, de los cuales AT y \alpha_{2}M son los más importantes. Las constantes de reacción (constantes de degradación) de esta reacción son aproximadamente de 20.000 (M.s)^{-1} y 1.500 (M.s)^{-1}, respectivamente.The thrombin formed will react with the plasma inhibitors, of which AT and α2M are the more important. The reaction constants (constants of degradation) of this reaction are approximately 20,000 (M.s) -1 and 1,500 (M.s) -1, respectively.
Si la cantidad de trombina se tiene que medir de manera continuada, se añade un substrato de trombina a la mezcla de reacción. Por la acción de la trombina se separa una molécula del substrato que se puede medir, por ejemplo, en un espectrofotómetro o un fluorómetro.If the amount of thrombin has to be measured in Continuously, a thrombin substrate is added to the mixture of reaction. By the action of thrombin a molecule is separated from substrate that can be measured, for example, in a spectrophotometer or a fluorometer
Se ha descubierto, después de extensas investigaciones y experimentos, que como contraste con los substratos pequeños, cuando se utiliza un substrato de trombina relativamente voluminoso, la hidrólisis cesa cuando toda la trombina ha quedado inactivada y la actividad enzimática total de la trombina se puede medir como ensayo de punto final.It has been discovered, after extensive research and experiments, which in contrast to small substrates, when using a thrombin substrate relatively bulky, hydrolysis ceases when all thrombin has been inactivated and the total enzymatic activity of thrombin It can be measured as an endpoint test.
De acuerdo con ello, según un aspecto de la presente invención se disponen substratos-señal cromogénicos y fluorogénicos y otros, de grandes dimensiones, en la medida de que no pueden penetrar en la cavidad de la molécula \alpha_{2}M y por lo tanto no son hidrolizados por \alpha_{2}M-IIa. Esto se consigue al acoplar el substrato-señal a una molécula portadora voluminosa inerte, lo cual tiene como resultado un "substrato". El acoplamiento es llevado a cabo preferentemente por vía química, de forma que es conocida por los técnicos en la materia.Accordingly, according to one aspect of the present invention signal substrates are arranged chromogenic and fluorogenic and others, large, in the extent that they cannot penetrate the cavity of the molecule α2M and therefore are not hydrolyzed by α2 M-IIa. This is achieved by attaching the substrate-signal to a bulky carrier molecule inert, which results in a "substrate." The coupling is preferably carried out chemically, of form that is known to those skilled in the art.
El límite de exclusión de la cavidad de \alpha_{2}M en la que es atrapada una proteasa activa es aproximadamente de 10 kD (Barrett, A., Methods in Enzymol, (1981)70:737-754). Por lo tanto, las moléculas portadoras inertes adecuadas son mayores de 10 kD e incluyen, por ejemplo, proteínas, polisacáridos y polímeros sintéticos. Preferentemente, las moléculas inertes tienen una buena solubilidad. Un grupo preferente de moléculas inertes tiene dimensiones tales que las moléculas no caben en la cavidad de la molécula \alpha_{2}M. Otro grupo de moléculas inertes preferentes tiene dimensiones aproximadas de 40 kD y una solubilidad mínima de 40 mg/ml. Son más preferentes las moléculas inertes con dimensiones aproximadas de 20 kD y una solubilidad mínima de 50 mg/ml.The cavity exclusion limit of α2M in which an active protease is trapped is approximately 10 kD (Barrett, A., Methods in Enzymol, (1981) 70: 737-754). Therefore, the suitable inert carrier molecules are greater than 10 kD and include, for example, proteins, polysaccharides and polymers synthetic Preferably, the inert molecules have a good solubility. A preferred group of inert molecules has dimensions such that the molecules do not fit in the cavity of the α2M molecule. Another group of inert molecules Preferred has approximate dimensions of 40 kD and a solubility minimum of 40 mg / ml. Inert molecules with approximate dimensions of 20 kD and a minimum solubility of 50 mg / ml
De manera adecuada y preferente las proteínas son las disponibles comercialmente, tales como ovoalbúmina (Mr = 45 kD), albúmina de suero bovino (Mr = 67 kD), albúmina de suero humano (Mr = 67 kD) y lisozima de clara de huevo de gallina (Mr = 14,4 kD).Adequately and preferably proteins are commercially available ones, such as ovalbumin (Mr = 45 kD), bovine serum albumin (Mr = 67 kD), human serum albumin (Mr = 67 kD) and chicken egg white lysozyme (Mr = 14.4 kD).
Los polisacáridos adecuados tienen un Mr que puede variar desde unos pocos kD (de manera que no caben en la cavidad de \alpha_{2}M) hasta más de 500 kD. Un ejemplo de dichos polisacáridos es el dextrano.Suitable polysaccharides have a Mr that it can vary from a few kD (so that they do not fit in the α2M cavity) up to more than 500 kD. An example of said polysaccharides is dextran.
Los polímeros sintéticos adecuados incluyen polímeros solubles en agua hidrofílicos, con un Mr que varía también desde unos pocos kD hasta más de 500 kD, tal como ácido poliacrílico, óxido de polietileno, cloruro de polivinilo, poli(ácido 1-vinilpirrolidona-co-acrílico), poli(2-hidroxietilmetacrilato), y similares.Suitable synthetic polymers include hydrophilic water soluble polymers, with a Mr that also varies from a few kD to more than 500 kD, such as acid polyacrylic, polyethylene oxide, polyvinyl chloride, poly (acid 1-vinyl pyrrolidone-co-acrylic), poly (2-hydroxyethyl methacrylate), and Similar.
Son substratos-señal adecuados para el objetivo de la presente invención compuestos que tienen un grupo cedente que puede ser detectado fácilmente y que no es dividido por el complejo \alpha_{2}-macroglobulina-proteasa. El grupo cedente preferentemente proporciona una señal de densidad óptica o una señal fluorescente. Se incluyen entre los ejemplos de dichos grupos cedentes la p-nitroanilida y 7-amino-4-coumarina, respectivamente.They are suitable signal substrates for the purpose of the present invention compounds having a transfer group that can be easily detected and that is not divided by the complex α2 -macroglobulin protease. The transfer group preferably provides a density signal optical or a fluorescent signal. They are included among the examples of said yielding groups p-nitroanilide and 7-amino-4-coumarin, respectively.
Se incluyen entre los substratos adecuados para los objetivos de la presente invención compuestos obtenidos por acoplamiento de un substrato-señal con un Mr relativamente bajo y una molécula inerte de dimensiones suficientes. Se incluyen entre los ejemplos de substratos adecuados la ovoalbúmina acoplada a H-D-isoleucil-L-propil-L-arginina-p-nitroanilida.2HCl (a la que se hace referencia también como "OA-S2288"), ovoalbúmina acoplada a H-alanil-L-arginina-7-amido-4-metil-coumarina (indicada también como "OA-Ala-Arg-AMC"), y ovoalbúmina acoplada a H-D-fenilalanil-L-prolil-L-lisina-p-nitroanilida.2HCl (indicada también como "OA-Phe-Pro-Lis-pNA"). Otro ejemplo adecuado de substrato es la ovoalbúmina acoplada a un substrato-señal que libera uno o varios iones de hidrógeno como grupo cedente.They are included among the substrates suitable for The objectives of the present invention compounds obtained by coupling of a substrate-signal with a Mr relatively low and an inert molecule of sufficient dimensions. Examples of suitable substrates include the ovalbumin coupled to H-D-isoleucil-L-propyl-L-arginine-p-nitroanilide. 2HCl (referred to also as "OA-S2288"), ovalbumin coupled to H-alanyl-L-arginine-7-amido-4-methyl-coumarin (also indicated as "OA-Ala-Arg-AMC"), and ovalbumin coupled to H-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-lysine-p-nitroanilide. 2HCl (also indicated as "OA-Phe-Pro-Lis-pNA"). Another suitable substrate example is ovalbumin coupled to a substrate-signal that releases one or more ions from hydrogen as a donor group.
Cuando se utiliza un substrato de este tipo para medir la curva de generación de trombina (TGC), la trombina temporal hidrolizará una cierta cantidad de substrato, después de lo cual ya no tendrá lugar hidrólisis. La cantidad del substrato, así como las propiedades cinéticas del mismo, se escogen preferentemente de manera que la cantidad de trombina generada en el plasma (u otro medio) no consume el substrato de forma completa. El nivel final de producto de conversión formado se puede medir y es directamente proporcional a la superficie situada por debajo del TGC, que es el llamado potencial endógeno de la trombina (ETP).When a substrate of this type is used for measure thrombin generation curve (TGC), temporal thrombin will hydrolyze a certain amount of substrate, after which already Hydrolysis will not take place. The amount of the substrate, as well as the kinetic properties thereof, are preferably chosen from so that the amount of thrombin generated in the plasma (or other medium) does not consume the substrate completely. The final level of Conversion product formed can be measured and is directly proportional to the area below the TGC, which is the called endogenous thrombin potential (ETP).
Los substratos pueden ser utilizados de manera adecuada para medir la forma biológicamente activa de las enzimas proteolíticas en la sangre y otros fluidos que contienen \alpha_{2}-macroglobulina. Una aplicación importante es la generación y desaparición de trombina en sangre en coagulación, que es una importante prueba funcional del sistema hemostático-trombótico (HTS).The substrates can be used in a manner suitable for measuring the biologically active form of enzymes proteolytic in blood and other fluids that contain α2 -macroglobulin. an app important is the generation and disappearance of blood thrombin in coagulation, which is an important functional test of the system hemostatic-thrombotic (HTS).
Si bien la presente invención se describe de manera típica y se ejemplifica por la evaluación de la trombina (generada) en sangre y otros fluidos biológicos, se comprenderá que el método también es adecuado para la evaluación de otras enzimas proteolíticas en dichos fluidos biológicos utilizando posibles variaciones y modificaciones que son evidentes para el técnico en la materia. Los ejemplos de estas otras enzimas proteolíticas incluyen factor de coagulación activado, factor fibrinolítico activado y componente activado del sistema complementario.While the present invention is described in typical way and is exemplified by thrombin evaluation (generated) in blood and other biological fluids, it will be understood that The method is also suitable for the evaluation of other enzymes proteolytic in said biological fluids using possible variations and modifications that are evident to the technician in the subject. Examples of these other proteolytic enzymes include activated coagulation factor, activated fibrinolytic factor and Activated component of the complementary system.
La invención queda ilustrada además por los siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitativos de la invención en ningún aspecto.The invention is further illustrated by the following examples that should not be considered as limiting of The invention in any aspect.
Se añade a sangre o plasma substrato de trombina 0,5 mM y la coagulación de la sangre empieza por calcificación y un iniciador adecuado, en este ejemplo de manera típica tromboplastina. La figura 1 muestra las curvas teóricas de la formación de productos de conversión a lo largo del tiempo.Thrombin substrate is added to blood or plasma 0.5 mM and blood clotting begins by calcification and a suitable initiator, in this example typically thromboplastin. Figure 1 shows the theoretical curves of product formation of conversion over time.
Las curvas (-\bullet- ó -\circ-) muestran la hidrólisis de un substrato de trombina en plasma en coagulación. Se supondrá que la formación de trombina tiene lugar en la fórmula (i), ver la Descripción detallada, con las constantes mencionadas en la misma. La trombina formada reaccionará tanto con AT como con \alpha_{2}M. La concentración de AT se dispone en 2,5 \muM y la concentración de \alpha_{2}M en 3,5 \muM. La constante de reacción de inactivación de la trombina por AT es de 20.000 (M.s)^{-1}, y la de inactivación de la trombina por \alpha_{2}M es de 1.450 (M.s)^{-1}. Para designar las curvas se han utilizado métodos numéricos. Los inventores han utilizado las etapas de 1 s. Después de 1 s se forma una cantidad de trombina que queda indicada por la ecuación (i). De 1 a 2 segundos esta cantidad de trombina reaccionará con AT y \alpha_{2}M a una velocidad determinada por las constantes anteriormente indicadas. Después de este segundo se forma una cierta cantidad de complejo de AT-trombina (AT-IIa) y \alpha_{2}M-II. Estas cantidades son deducidas de la cantidad presente de trombina, pero se forma nueva trombina en este segundo según la ecuación (i). Desde 2 a 3 segundos la nueva cantidad de trombina reaccionará con AT y \alpha_{2}M (corregidas ambas por los complejos) mientras se forman nuevas AT-IIa y \alpha_{2}M-IIa y por lo tanto se inactiva una parte de la trombina. Este proceso es repetido durante un período de tiempo de 15 minutos. De esta manera, se observa el aumento de AT-IIa y \alpha_{2}M-IIa durante el proceso y un incremento temporal de la trombina, seguido de la inactivación completa de trombina por AT y \alpha_{2}M.The curves (- \ - bullet- or - \ circ-) show the hydrolysis of a coagulation plasma thrombin substrate. I know it will assume that thrombin formation takes place in formula (i), See the detailed Description, with the constants mentioned in the same. The thrombin formed will react with both AT and α2M. The concentration of AT is set at 2.5 µM and the concentration of α2M in 3.5 µM. The constant of thrombin inactivation reaction by AT is 20,000 (M.s) -1, and the inactivation of thrombin by α2M is 1,450 (M.s) -1. To designate the curves have been used numerical methods. The inventors have used the stages of 1 s. After 1 s an amount of thrombin that is indicated by equation (i). 1 to 2 seconds this amount of thrombin will react with AT and? 2M at a speed determined by the constants indicated above. After this second a certain amount of complex of AT-thrombin (AT-IIa) and α2 M-II. These amounts are deducted of the present amount of thrombin, but new thrombin is formed in this second according to equation (i). From 2 to 3 seconds the new amount of thrombin will react with AT and α2M (both corrected by the complexes) while new ones are formed AT-IIa and α2 M-IIa and by therefore a part of the thrombin is inactivated. This process is repeated over a period of 15 minutes. In this way, the increase of AT-IIa is observed and α2 M-IIa during the process and a temporary increase in thrombin, followed by inactivation complete thrombin by AT and α2M.
Por adición de un pequeño substrato de trombina a esta mezcla se introducen dos nuevas reacciones: S es hidrolizada por la trombina libre y por \alpha_{2}M-IIa. Cuando S es un substrato grande será hidrolizado por la trombina libre, pero no por \alpha_{2}M-IIa. Estas reacciones seguirán la cinética de Michaelis-Menten: velocidad de hidrólisis = [Trombina] \cdot k_{cat}\cdotS/(K_{m} + S).By adding a small thrombin substrate to This mixture introduces two new reactions: S is hydrolyzed for free thrombin and for α2 M-IIa. When S is a large substrate it will be hydrolyzed by thrombin free, but not for? 2 M-IIa. These reactions will follow the kinetics of Michaelis-Menten: hydrolysis rate = [Thrombin] \ cdot k_ {cat} \ cdotS / (K_ {m} + S).
La cantidad del producto de hidrólisis es calculada por el proceso numérico descrito anteriormente. En el caso de la curva -\bullet-, S es un pequeño substrato de trombina y en el caso de la curva -\circ-, S es un substrato grande de trombina.The amount of the hydrolysis product is calculated by the numerical process described above. If of the curve -? - S is a small thrombin substrate and in the case of the curve - \ circ-, S is a large substrate of thrombin
El substrato de trombina (S) es hidrolizado por trombina con un K_{m} de 500 \muM y un k_{cat} de 1 s^{-1}. Asimismo \alpha_{2}M-IIa hidroliza S, en caso de la curva -\bullet- K_{m} es 500 \muM y K_{cat} es 0,5 s^{-1}, y en el caso de la curva -\circ- K_{m} es 1 M y k_{cat} es cero (es decir, S no se hidroliza).The thrombin substrate (S) is hydrolyzed by thrombin with a K m of 500 µM and a k cat of 1 s -1. Also α2 M-IIa hydrolyzes S, in case of the curve - K K_ {m} is 500 µM and K_ {cat} is 0.5 s <-1>, and in the case of the curve - \ circ- K_ {m} is 1 M and k_ {cat} is zero (i.e., S is not hydrolyzed).
En este ejemplo se utiliza un substrato modelo con las cinéticas antes indicadas. En la práctica real se dispone de substratos con cinéticas próximas a este modelo. Son ejemplos adecuados y preferentes de estos substratos SQ68, Msc-Val-Arg-pNA, DEMZ-Gly-Arg-pNA, y Petacromo TH/SR.In this example a model substrate is used with the kinetics indicated above. In actual practice, substrates with kinetics close to this model. Are examples suitable and preferred of these SQ68 substrates, Msc-Val-Arg-pNA, DEMZ-Gly-Arg-pNA, and TH / SR petachrome.
El procedimiento indicado es aplicado habitualmente en una versión ligeramente modificada por el hecho de que el proceso no es controlado de manera continua, pero se toman muestras cada 30 segundos y el producto de conversión formado (indicado por los círculos \bullet ó \circ) es medido.The indicated procedure is applied usually in a version slightly modified by the fact of that the process is not controlled continuously, but they are taken samples every 30 seconds and the conversion product formed (indicated by the circles \ bullet or \ circ) is measured.
Cuando se utiliza substrato de trombina pequeño, cuyo procedimiento había sido utilizado rutinariamente antes de la presente invención, se obtenían curvas mostradas por -\bullet-. A efectos de determinar la magnitud del producto de conversión formado por la acción de la trombina libre, la curva fue dividida en dos partes, formación de producto por trombina libre y \alpha_{2}M-IIa, respectivamente. La formación de producto por trombina libre se interrumpirá cuando se haya inactivado toda la trombina, pero la formación de producto por \alpha_{2}M-IIa continuará. Esto explica la formación lineal continuada de producto al final de la curva -\bullet-. La recogida de datos medidos tenía que ser dividida en un conjunto para formación de producto por trombina libre y un conjunto para formación de producto por \alpha_{2}M-IIa. Para este procedimiento se ha desarrollado un algoritmo matemático [Hemker, H.C., S. Welders, H. Kessels and S. Béguin, Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential ("Registro continuo de generación de trombina en el plasma, su utilización para la determinación del potencial de trombina"). Thromb. Haesmost. (1973) 70:617-624]. El principio es el siguiente. A t=0 no hay presencia de trombina ni de \alpha_{2}M-IIa y la señal se dispone en cero. A t=0,5 minutos (segundo punto de datos de medición) se mide una señal incrementada debido a hidrólisis S por trombina y \alpha_{2}M-IIa. Una fracción de esta señal (concentración k x \alpha_{2}M-IIa) es debida a \alpha_{2}M-IIa. A t=1 minuto, la señal se incrementa debido a hidrólisis S por trombina libre por la cantidad presente de \alpha_{2}M-IIa. Este procedimiento se continúa hasta que se alcanza el último punto de datos. Desde la curva teóricamente derivada y las observaciones reales, se sabe que al final de la curva toda la trombina libre ha sido inactivada y el incremento de la señal es debido por completo a la hidrólisis S por \alpha_{2}M-IIa. Al escoger el valor de k para el que la última parte de la curva se hace mínima (es decir, la formación de productos es constante en el tiempo) el conjunto de datos se puede dividir en una señal debida a hidrólisis S por trombina libre (-\circ-) y una señal debida al efecto de \alpha_{2}M-IIa (-\triangledown-).When a small thrombin substrate is used, the procedure of which had been routinely used before the present invention, curves shown by - are obtained. In order to determine the magnitude of the conversion product formed by the action of the free thrombin, the curve was divided into two parts, product formation by free thrombin and? 2 M-IIa, respectively. Product formation by free thrombin will be interrupted when all thrombin has been inactivated, but product formation by α2M-IIa will continue. This explains the continuous linear formation of the product at the end of the curve -. The collection of measured data had to be divided into a set for product formation by free thrombin and a set for product formation by α2 M-IIa. For this procedure a mathematical algorithm has been developed [Hemker, HC, S. Welders, H. Kessels and S. Béguin, Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential ("Continuous Generation Registration of thrombin in plasma, its use for the determination of thrombin potential "). Thromb. Haesmost (1973) 70: 617-624]. The principle is as follows. At t = 0 there is no presence of thrombin or α2 M-IIa and the signal is set to zero. At t = 0.5 minutes (second measurement data point) an increased signal is measured due to hydrolysis S by thrombin and? 2 M-IIa. A fraction of this signal (concentration kx? 2 M-IIa) is due to? 2 M-IIa. At t = 1 minute, the signal is increased due to hydrolysis S by free thrombin by the present amount of α2M-IIa. This procedure is continued until the last data point is reached. From the theoretically derived curve and the actual observations, it is known that at the end of the curve all the free thrombin has been inactivated and the increase in the signal is due entirely to the hydrolysis S by? 2 M-IIa. By choosing the value of k for which the last part of the curve is minimized (that is, the formation of products is constant over time) the data set can be divided into a signal due to hydrolysis S by free thrombin ( - \ circ-) and a signal due to the effect of? 2 M-IIa (- \ triangledown-).
Se observará que la señal provocada por la trombina libre alcanza un valor plataforma que sigue siendo el mismo, independientemente del método utilizado. Cuando se aplica un pequeño substrato de trombina, este techo tiene que ser determinado con un algoritmo matemático. No obstante, cuando se utiliza un substrato de trombina grande, de acuerdo con la presente invención, esta plataforma se puede determinar fácilmente por lectura del nivel final de la señal.It will be noted that the signal caused by the Free thrombin reaches a platform value that remains the same, regardless of the method used. When a small thrombin substrate, this roof has to be determined With a mathematical algorithm. However, when a large thrombin substrate, according to the present invention, This platform can be easily determined by reading the level end of the signal
En este ejemplo se demuestra que al acoplar ovoalbúmina a S2288, el substrato pierde su capacidad de ser hidrolizado por \alpha_{2}M-IIa, pero no por trombina. Este substrato (OA-S2288) fue preparado de la manera siguiente. Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 1 mM S2288, 50 mM de carbonato sódico (pH 10,2), 20 mg/ml de ovoalbúmina y 3,6 mg/ml bis(sulfosuccinimidil)suberato(BS^{3}). Esta mezcla fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente, a continuación se añadió 50 mM Tris (pH 8,2) y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla fue aplicada en la columna de Sephadex G25 (16 x 1,6 cm^{3}) y fue eluida a una velocidad de 3 ml/minuto. El tampón de elución era 50 mM HEPES, 100 mM NaCl (pH 7,35). El primer pico eluido de la columna contenía la ovoalbúmina acoplada a S2288 (OA-S2288).This example shows that when coupling ovalbumin to S2288, the substrate loses its ability to be hydrolyzed by α2M-IIa, but not by thrombin This substrate (OA-S2288) was prepared from The following way. A reaction mixture containing 1 was prepared mM S2288, 50 mM sodium carbonate (pH 10.2), 20 mg / ml of ovalbumin and 3.6 mg / ml bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). Is mixture was incubated for 30 minutes at room temperature, at 50 mM Tris (pH 8.2) was then added and the mixture was maintained at room temperature for 30 minutes. The mixture was applied in the Sephadex G25 column (16 x 1.6 cm3) and was eluted at a speed of 3 ml / minute. The elution buffer was 50 mM HEPES, 100 mM NaCl (pH 7.35). The first eluted peak of the column contained the ovalbumin coupled to S2288 (OA-S2288).
La actividad amidolítica de la trombina humana y de la \alpha_{2}M-IIa humana con respecto a OA-S2288 fue objeto de medición. Las mezclas de reacción contenían 22 \muM OA-S2288, 50 nM de trombina o \alpha_{2}M-IIa y 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 2 mg/ml de ovoalbúmina (pH 7,9).The amidolytic activity of human thrombin and of human α2 M-IIa with respect to OA-S2288 was measured. Mixtures of reaction contained 22 µM OA-S2288, 50 nM of thrombin or? 2 M-IIa and 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 2 mg / ml ovalbumin (pH 7.9).
En la figura 2 la cantidad formada de p-nitroanilida (pNA) libre, expresada como densidad milióptica a 405 nm, se ha indicado con respecto al tiempo. La temperatura de reacción era de 37ºC. Las curvas grises son los datos medidos, mientras que la línea negra se obtiene por acoplamiento, suponiendo que tiene lugar formación de producto de acuerdo con la cinética de Michaelis-Menten.In figure 2 the amount formed of p-nitroanilide (pNA) free, expressed as density Milioptic at 405 nm, it has been indicated with respect to time. The reaction temperature was 37 ° C. The gray curves are the data measured, while the black line is obtained by coupling, assuming that product training takes place according to the Michaelis-Menten kinetics.
La formación de producto a lo largo del tiempo puede ser descrita con la fórmula siguiente: E . k_{cat} . S_{t}/ (K_{m} + S_{t}), en la que S_{1} es la concentración de substrato en el tiempo (es decir, la concentración de substrato originalmente presente (S_{0}) menos el producto formado o substrato dividido, y E es la enzima que divide el substrato, trombina o \alpha_{2}M-IIa.Product formation over time It can be described with the following formula: E. k_ {cat}. S_ {t} / (K_ {m} + S_ {t}), in which S_ {1} is the concentration substrate over time (i.e. the substrate concentration originally present (S_ {0}) minus the product formed or divided substrate, and E is the enzyme that divides the substrate, thrombin or α2 M-IIa.
Se encontraron las siguientes constantes: S_{0} = 22 \muM, K_{m} = 1,47 \muM y k_{cat} = 0,31 s^{-1} cuando E es trombina y 0,002 s^{-1} cuando E es \alpha_{2}M-IIa.The following constants were found: S_ {0} = 22 µM, K m = 1.47 µM and k_ {cat} = 0.31 s -1 when E is thrombin and 0.002 s -1 when E is α2 M-IIa.
Este ejemplo muestra que al acoplar ovoalbúmina al substrato fluorescente de Ala-Arg-AMC, el substrato ya no se dividirá adicionalmente por trombina atrapada en la cavidad de \alpha2M. La figura 3 muestra que la trombina libre se separa del grupo fluorescente (AMC), pero que la trombina inactivada por \alpha2M no puede hacerlo.This example shows that when coupling ovalbumin to the fluorescent substrate of Ala-Arg-AMC, the substrate is no longer will further divide by thrombin trapped in the cavity of α2M. Figure 3 shows that free thrombin separates from fluorescent group (AMC), but that thrombin inactivated by α2M cannot do it.
El acoplamiento de la ovoalbúmina a Ala-Arg-AMC fue llevado a cabo del modo siguiente. A 1 ml de 1 mg/ml de ovoalbúmina en PBS (= 10 mM fosfato potásico, 150 mM NaCl, pH 7,4) se añadieron 6 \mul de 50 mM BS^{3} en 100% de dimetilsulfóxido. La mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 60 minutos y dializada dos veces contra 2 L PBS (2 horas en cada caso). A continuación, se añadieron 5 \mul de 100 mM Ala-Arg-AMC y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Finalmente, la muestra fue dializada igual que antes (dos veces contra 2 L PBS).Ovalbumin coupling to Ala-Arg-AMC was carried out from next way. At 1 ml of 1 mg / ml ovalbumin in PBS (= 10 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) 6 µl of 50 was added mM BS3 in 100% dimethylsulfoxide. The mixture was incubated at room temperature for 60 minutes and dialyzed twice against 2 L PBS (2 hours in each case). Then 5 were added 100 mM Ala-Arg-AMC and incubated at room temperature for 60 minutes. Finally the Sample was dialyzed as before (twice against 2 L PBS).
La figura 3 muestra los resultados de las mediciones de fluorescencia en un aparato Fluoroskan Acsent dotado de bloque termostático, un filtro de excitación a 390 nm y emisión a 460 nm. El ensayo fue llevado a cabo a 25ºC en microplacas con fondo en "U" Microfluor W de 96 pocillos (Dynex, Londres, Inglaterra) en 10 mM HEPES, 5 mM CaCl_{2}, 0,02% de acida de sodio, pH 8,0). En el caso -\circ- el recipiente contenía 5,5 \muM OA-AR-AMC (Ala-Arg-AMC acoplado a ovoalbúmina) y 85 nM de trombina humana y en el caso de -\triangledown-5,5 \muM OA-AR-AMC y 65 \muM humano \alpha_{2}M-IIa. Los símbolos en negro (-\bullet- y -\blacktriangledown-) fueron obtenidos por acoplamiento suponiendo que el substrato es hidrolizado por trombina de acuerdo con la cinética Michaelis-Menten. Del acoplamiento se encontraron las siguientes constantes para hidrólisis por trombina: concentración de substrato S_{0} = 5,5 \muM, k_{m} = 1,2 \muM y k_{cat} = 3,3 s^{-1}. Para hidrólisis por \alpha_{2}M-IIa se encontraron los S_{0} y K_{m} ya calculados y k_{cat} = 0,008 s^{-1}.Figure 3 shows the results of the fluorescence measurements in a Fluoroskan Acsent device equipped thermostatic block, an excitation filter at 390 nm and emission at 460 nm The test was carried out at 25 ° C in microplates with U-bottom 96-well Microfluor W (Dynex, London, England) in 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0.02% acid sodium, pH 8.0). In the case - \ circ- the container contained 5.5 µM OA-AR-AMC (Ala-Arg-AMC coupled to ovalbumin) and 85 nM human thrombin and in the case of - \ triangledown-5.5 µM OA-AR-AMC and 65 µM human α2 M-IIa. The symbols in black (- \ - and - \ blacktriangledown-) were obtained by coupling assuming that the substrate is hydrolyzed by thrombin according to kinetics Michaelis-Menten. Link found The following constants for thrombin hydrolysis: substrate concentration S 0 = 5.5 µM, k m = 1.2 µM and k_ {cat} = 3.3 s -1. For hydrolysis by α 2 M-IIa were found the S 0 and K_ {m} already calculated and k_ {cat} = 0.008 s -1.
Ver figura 4. Se midió la generación de trombina tal como se ha descrito anteriormente [Hemker, H.C., Wielders, S., Kessels, H., Béguin, S. Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential ("Registro continuo de generación de trombina en el plasma, su utilización para determinación del potencial de trombina"). Thromb. Haemost. (1993) 70:617-624, and Hemker, H.C. and Béguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential ("Generación de trombina en el plasma: su evaluación a través del potencial endógena de trombina"). Thromb. Haemost. (1995) 74:134-138].See figure 4. Thrombin generation was measured as described previously [Hemker, HC, Wielders, S., Kessels, H., Béguin, S. Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential ("Continuous recording of thrombin generation in plasma, its use to determine thrombin potential"). Thromb. Haemost (1993) 70: 617-624, and Hemker, HC and Béguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential (its evaluation through the endogenous thrombin potential). Thromb. Haemost (1995) 74: 134-138].
La formación de pNA en plasma en coagulación al que se añadió SQ68 (\bullet) o OA-Phe-Pip-Lys-pNA (\blacktriangledown); Pip significa pipecolilo. La formación de pNA fue controlada por medición de la densidad óptica a 405 nm. La concentración del substrato fue de 0,5 mM en ambos casos. El conjunto de datos obtenidos con SQ68 fueron analizados y divididos en pNA formados por trombina libre (\otimes) y pNA formados por \alpha_{2}M-IIa (\triangledown), utilizando el algoritmo descrito en el Ejemplo 1.The formation of plasma pNA in coagulation at that SQ68 (?) was added or OA-Phe-Pip-Lys-pNA (\ blacktriangledown); Pip means pipecolyl. The formation of pNA was controlled by measuring the optical density at 405 nm. The Substrate concentration was 0.5 mM in both cases. The data set obtained with SQ68 were analyzed and divided in pNA formed by free thrombin (\ otimes) and pNA formed by α2 M-IIa (\ triangledown), using the algorithm described in Example 1.
Se puede observar claramente que cuando se utiliza un substrato de acuerdo con la presente invención, se obtienen datos experimentales de manera muy eficaz que representan directamente la misma actividad biológica (es decir, la cantidad de substrato separada por trombina libre) que aquellos obtenidos de la disección matemática compleja de la curva a partir de un substrato convencional.It can be clearly seen that when uses a substrate according to the present invention, it they obtain experimental data very effectively that they represent directly the same biological activity (i.e. the amount of substrate separated by free thrombin) than those obtained from the complex mathematical dissection of the curve from a substrate conventional.
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