ES2335022T3 - Procedimientos y kits para medir complejos adamts13/fxi. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar complejos ADAMTS 13/FXI en una muestra que comprende: a) unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a una fase sólida; b) añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo; c) añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida, uniéndose el anticuerpo anti-FXI a FXI en complejos ADAMTS 13/FXI; y d) detectar complejos ADAMTS 13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI.
Description
Procedimientos y kits para medir complejos
ADAMTS13/FXI.
La presente solicitud hace referencia a la
solicitud internacional número PCT/US2004/023177, presentada el 19
de julio de 2004.
La invención proporciona ensayos para la
medición de la actividad de ADAMTS13 y el diagnóstico de la púrpura
trombocitopénica trombótica.
La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es
una enfermedad microangiopática trombótica potencialmente mortal
caracterizada por anemia hemolítica y trombocitopenia asociada con
agregación plaquetaria. La causa de la PTT se ha vinculado
recientemente a anomalías en una metaloproteinasa denominada
ADAMTS13 o proteasa de rotura del factor de von Willebrand. ADAMTS
13 es una enzima que está presente en niveles significativos en el
plasma, y puede expresarse en otros tejidos (Levy et al.
2001, Nature 413:488-494; Plaimauer et al.
2002, Blood 100:3626-3632). Suzuki et al.
(2004, Biochem. Biophys. Res. Com. 313:212-216)
notificaron recientemente ADAMTS 13 en plaquetas.
ADAMTS13 actúa rompiendo multímeros de factor de
von Willebrand (VWF) ultralargos en proteínas de VWF más pequeñas.
Una disminución de la actividad proteasa de rotura de VWF conduce a
la persistencia de multímeros inusualmente largos de VWF que se
unen a plaquetas, produciendo agregados plaquetarios, hemólisis
microangiopática y trombocitopenia en pacientes con PTT. Las
manifestaciones clínicas de la PTT son difíciles de distinguir del
síndrome urémico hemolítico (SUH), otro trastorno microangiopático
trombótico. Estudios recientes indican que niveles bajos de
actividad de ADAMTS 13 están asociados con la PTT, pero no con SUH
(Veyradier A, et al. 2002, Blood
98:1765-1772; Furlan et al. 1998, Blood
91:2839-2846). Por tanto, puede realizarse un
diagnóstico diferencial de la PTT midiendo la actividad de ADAMTS
13.
Hay dos formas de PTT - congénita (familiar) y
adquirida (Furlan et al. 1996, Blood
87:4223-4234; Furlan et al. 1998, Blood
91:2839-2846). La PTT congénita está provocada por
mutaciones genéticas en el gen de ADAMTS13, que dan como resultado
una pérdida en la producción de ADAMTS13 y/o la producción de una
enzima ADAMTS 13 no funcional. La PTT adquirida es una enfermedad
de tipo autoinmunitario, que se ha vinculado con la ingesta de
ciertos fármacos farmacéuticos. La PTT adquirida está provocada por
la generación de autoanticuerpos frente a la proteína ADAMTS 13. La
aparición de la PTT adquirida se ha vinculado con la ingesta de
ciertos fármacos farmacéuticos.
Se conocen en la técnica varios procedimientos
para medir la presencia y/o actividad de ADAMTS 13. Estos
procedimientos incluyen ensayos de unión a colágeno, ensayos de
cofactor ristocetina, análisis electroforético (por ejemplo,
análisis de multímeros) y procedimientos inmunológicos. Los
inmunoensayos electroforéticos, tales como el análisis de
inmunotransferencia de tipo Western, se han sustituido en buena
parte por ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos
inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) (Laffan et al.
2004, Haemophilia 10:199-217). Varios informes
describen ensayos de ADAMTS 13 en los que se usa el dominio A2 de
VWF como sustrato (Zhou et al. 2004, Thromb. Haemost.
91:806-811; Kokame et al. 2004, Hemost.
Thromb. Vasc. Biol. Blood 103:607-612; Cruz et
al. 2004, Thromb. Haemost. 90:1204-1209). Se
controla la rotura del dominio A2 mediante un procedimiento de
ELISA. Los ensayos disponibles para ADAMTS 13 requieren un nivel de
destreza técnica relativamente alto, y por tanto no se realizan en
la mayoría de los laboratorios clínicos. Además, la obtención de los
resultados puede llevar varios días usando las pruebas disponibles,
lo que es perjudicial para pacientes que presentan PTT, que
requieren un rápido diagnóstico.
Se necesita un ensayo para ADAMTS 13 sencillo,
específico y rápido para resolver los problemas de los ensayos
actualmente disponibles; sin embargo, no se ha desarrollado ninguno
hasta la fecha. Los intentos de desarrollar un ensayo de este tipo
usando ADAMTS 13 aislado a partir de plasma no han sido
satisfactorios. Furlan et al. sometieron a prueba 28
sustratos peptidílicos cromogénicos sintéticos con
para-nitroanilina (pNA) como grupo saliente, y no
observaron resultados constantes, repetibles (2002 Seminars in
Thrombosis and Hemostasis 23(2): 167-172).
Estos resultados demuestran la dificultad en la técnica de
desarrollar un ensayo rápido, fiable para determinar la actividad
de ADAMTS 13.
Se ha descubierto que ADAMTS 13 en plaquetas
tiene una capacidad potenciada, en relación con ADAMTS13 en plasma,
para romper sustratos peptidílicos pequeños. La diferencia entre
ADAMTS13 plasmática y plaquetaria se debe probablemente al hallazgo
de que ADAMTS 13 plaquetaria se rompe, mientras que ADAMTS13
plasmática no se rompe y permanece como un único polipéptido. La
actividad de ADAMTS 13 en plaquetas puede potenciarse mediante
tratamiento con el factor de coagulación XI activado (FXIa). Esto
indica que FXIa puede provocar la rotura de ADAMTS 13. Se han
desarrollado ensayos cromogénicos de diagnóstico para medir la
actividad de ADAMTS 13 en plaquetas y en plasma usando diferentes
sustratos peptidílicos con grupos salientes distintos de pNA. Se ha
desarrollado también un procedimiento de ensayo para medir
autoanticuerpos frente a ADAMTS13 y un ELISA para medir la proteína
ADAMTS13 en plasma. Además, se ha desarrollado un ELISA para medir
complejos ADAMTS13/FXI en plasma.
En un aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para medir la actividad de ADAMTS13 que comprende (a)
incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en el
que el sustrato comprende un resto peptídico y un resto
fluorogénico o cromogénico, en el que el resto peptídico comprende
X-Val-Tyr,
X-Leu-Tyr o
X-Ile-Tyr, en los que X es
cualquier aminoácido, y en el que el resto cromogénico no es
para-nitroanilina (pNA); y (b) medir la densidad
óptica o fluorescencia de la muestra; midiendo de ese modo la
actividad de ADAMTS13.
En un segundo aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para medir la actividad de ADAMTS 13 que comprende
(a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en
el que el sustrato comprende X-resto
peptídico-Z, en el que el resto peptídico comprende
Val-Tyr-Met,
Leu-Tyr-Met o
Ile-Tyr-Met, en el que X es un resto
donador y Z es un resto aceptor y en el que los restos donador y
aceptor median la transferencia de energía de resonancia por
fluorescencia; y (b) medir la fluorescencia de la muestra; midiendo
de ese modo la actividad de ADAMTS13.
También se describe mediante la solicitud una
proteína ADAMTS13 aislada a partir de plaquetas, en la que la
proteína ADAMTS13 se rompe en más de un péptido y en la que al menos
un péptido roto tiene un peso molecular en un gel de
SDS-PAGE de aproximadamente 120 kD o inferior a 120
kD.
La solicitud describe también un procedimiento
para preparar un sustrato de ADAMTS13 para medir la actividad de
ADAMTS13 que comprende unir covalentemente un resto peptídico a un
resto cromogénico o fluorogénico, en el que el resto peptídico
comprende X-Val-Tyr,
X-Leu-Tyr o
X-Ile-Tyr, en los que X es cualquier
aminoácido, y en el que el sustrato cromogénico no es pNA.
En un quinto aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para preparar un sustrato de ADAMTS 13 para medir la
actividad de ADAMTS 13 que comprende unir covalentemente un resto
donador, un resto peptídico y un resto aceptor secuencialmente, en
el que el resto peptídico comprende
Val-Tyr-Met,
Leu-Tyr-Met o
Ile-Tyr-Met y en el que los restos
donador y aceptor median la transferencia de energía de resonancia
por fluorescencia.
Otra realización de la solicitud, que no forma
parte de la invención, es un kit que comprende un sustrato para
medir la actividad de ADAMTS13, en el que el sustrato comprende un
resto peptídico tal como se describe en el presente documento y un
resto cromogénico o fluorogénico. Como alternativa, el sustrato
comprende un resto donador, un resto peptídico tal como se describe
en el presente documento y un resto aceptor, en el que los restos
donador y aceptor median la transferencia de energía de resonancia
por fluorescencia.
En otro aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para inhibir la actividad de ADAMTS 13 que comprende
incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un anticuerpo
inhibidor contra ADAMTS13.
En un aspecto adicional, la solicitud describe
un procedimiento para identificar un inhibidor de ADAMTS13 que
comprende (a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un
inhibidor candidato de ADAMTS13; y medir la actividad de ADAMTS13
en la muestra de prueba según el procedimiento del primer o segundo
aspecto de la invención; en el que el inhibidor se identifica
mediante la actividad reducida de ADAMTS 13 en la muestra en
comparación con la actividad de ADAMTS 13 en una muestra control que
comprende ADAMTS13, en el que la muestra control no se incuba con
el inhibidor candidato.
La solicitud describe adicionalmente un
procedimiento para medir la cantidad de ADAMTS13 en una muestra que
comprende (a) unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a
una fase sólida; (b) añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose
ADAMTS13 presente en la muestra al anticuerpo; (c) detectar ADAMTS13
unida usando inmunomarcaje directo o indirecto; y (d) cuantificar
ADAMTS 13 detectada; midiendo de ese modo la cantidad de ADAMTS13 en
la muestra.
Otro procedimiento descrito por la solicitud es
un procedimiento para detectar anticuerpos
anti-ADAMTS13 en una muestra de prueba que
comprende (a) unir un anticuerpo anti-ADAMTS13
producido en una primera especie a una fase sólida; (b) añadir
ADAMTS13 a la fase sólida, uniéndose la ADAMTS 13 al anticuerpo
producido en la primera especie; (c) añadir la muestra de prueba a
la fase sólida, siendo la muestra de una segunda especie y
uniéndose los anticuerpos anti-ADAMTS13 presentes en
la muestra de prueba a la ADAMTS13; (d) añadir un anticuerpo
marcado contra anticuerpos de la segunda especie, en el que el
anticuerpo marcado se produce en una tercera especie, en el que el
anticuerpo marcado se une a los anticuerpos
anti-ADAMTS13 unidos a la ADAMTS13; y (e) detectar
el anticuerpo marcado; detectando de ese modo anticuerpos
anti-ADAMTS13 en la muestra de prueba.
En otro aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para diagnosticar PTT en un sujeto que comprende (a)
medir la actividad de ADAMTS13 en una muestra de prueba del sujeto
según el procedimiento descrito en el primer o segundo aspecto de
la invención; y (b) comparar la actividad de ADAMTS13 en la muestra
de prueba con la actividad de ADAMTS13 en una muestra control que
tiene una actividad de ADAMTS13 normal; en el que se diagnostica
PTT mediante la actividad reducida de ADAMTS13 en la muestra de
prueba en comparación con la muestra control.
Aún en otro aspecto, la solicitud describe un
procedimiento para diagnosticar PTT adquirida en un sujeto que
comprende (a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con plasma
del sujeto; y (b) medir la actividad de ADAMTS13 en la muestra
según el procedimiento descrito en el primer o segundo aspecto de la
invención; en el que se diagnostica PTT adquirida mediante la
actividad reducida de ADAMTS13 en la muestra en comparación con la
actividad de ADAMTS13 en una muestra control que tiene un actividad
de ADAMTS 13 normal.
La solicitud describe adicionalmente un
procedimiento para controlar el tratamiento de un paciente con PTT
que comprende medir la actividad de ADAMTS13 según el primer o
segundo aspecto descrito en la invención durante el tratamiento del
paciente.
La invención proporciona un procedimiento para
detectar complejos ADAMTS13/FXI en una muestra, que comprende (a)
unir un anticuerpo anti-ADAMTS13 a una fase sólida;
(b) añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos
ADAMTS13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo; (c) añadir un
anticuerpo anti-FXI a la fase sólida; y (d)
detectar los complejos ADAMTS13/FXI mediante inmunomarcaje directo o
indirecto del anticuerpo anti-FXI.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para medir la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en
una muestra, que comprende (a) unir un anticuerpo
anti-ADAMTS13 a una fase sólida; (b) añadir la
muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS13/FXI
presentes en la muestra al anticuerpo; (c) añadir un anticuerpo
anti-FXI a la fase sólida; (d) detectar los
complejos ADAMTS13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto
del anticuerpo anti-FXI; y (e) cuantificar el
anticuerpo anti-FXI detectado, midiendo de ese modo
la cantidad de complejos ADAMTS 13/FXI en la muestra.
Una realización adicional de la invención es un
procedimiento para diagnosticar PTT en un sujeto que comprende (a)
medir la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra de prueba
uniendo un anticuerpo anti-ADAMTS13 a una fase
sólida; (b) añadir la muestra de prueba a la fase sólida, uniéndose
los complejos ADAMTS13/
FXI presentes en la muestra de prueba al anticuerpo; (c) añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida; (d) detectar los complejos ADAMTS13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI; (e) cuantificar el anticuerpo anti-FXI detectado, midiendo de ese modo la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra; y (f) comparar la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba con la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra control que tiene una actividad de ADAMTS 13 normal. Se diagnostica PTT mediante una cantidad reducida de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba en comparación con la muestra control.
FXI presentes en la muestra de prueba al anticuerpo; (c) añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida; (d) detectar los complejos ADAMTS13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI; (e) cuantificar el anticuerpo anti-FXI detectado, midiendo de ese modo la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra; y (f) comparar la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba con la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra control que tiene una actividad de ADAMTS 13 normal. Se diagnostica PTT mediante una cantidad reducida de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba en comparación con la muestra control.
En particular, la invención proporciona los
procedimientos reivindicados en las reivindicaciones adjuntas.
En particular, la invención proporciona un
procedimiento para detectar complejos ADAMTS 13/FXI en una muestra
que comprende:
- a)
- unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a una fase sólida;
- b)
- añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS 13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo;
- c)
- añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida, uniéndose el anticuerpo anti-FXI a FXI en complejos ADAMTS 13/FXI; y
- d)
- detectar los complejos ADAMTS 13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la invención proporciona además
un procedimiento para medir la cantidad de complejos
ADAMTS13/
FXI en una muestra que comprende:
FXI en una muestra que comprende:
- a)
- unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a una fase sólida;
- b)
- añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS 13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo;
- c)
- añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida, uniéndose e el anticuerpo anti-FXI a FXI en complejos ADAMTS 13/FXI; y
- d)
- detectar los complejos ADAMTS 13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI, y
- e)
- cuantificar el anticuerpo anti-FXI unido detectado, midiendo de ese modo la cantidad de complejos ADAMTS 13/FXI en la muestra.
En particular, la invención proporciona además
un procedimiento para diagnosticar púrpura trombocitopénica
trombótica (PTT) en un sujeto que comprende
- a)
- medir la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra de prueba del sujeto según las etapas de procedimiento a) a e) anteriores; y
- b)
- comparar la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba con la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra control que tiene una actividad de ADAMTS 13 normal;
en el que se diagnostica PTT mediante una
cantidad reducida de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba
en comparación con la muestra control.
Según la invención, la muestra se selecciona
preferiblemente del grupo constituido por un líquido biológico,
sangre completa, suero, plasma, plasma rico en plaquetas (PRP),
plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado (PNP),
plaquetas lavadas y sobrenadante de cultivo tisular.
Se proporciona también un kit para detectar
complejos ADAMTS13/FXI en una muestra. El kit de la invención
comprende (i) una fase sólida recubierta con un anticuerpo
anti-ADAMTS13 y (ii) un anticuerpo
anti-FXI. En una realización preferida, el
anticuerpo anti-FXI está marcado. En una realización
particularmente preferida, el anticuerpo anti-FXI
está conjugado con peroxidasa del rábano (HRP). Opcionalmente, el
kit puede incluir un sustrato de HRP. El kit también puede contener
una muestra para crear una curva patrón de concentración de
complejos ADAMTS 13/FXI. La muestra patrón puede ser cualquiera de
las muestras descritas en el presente documento, incluyendo líquido
biológico, sangre completa, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma
pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado (PNP), plaquetas
lavadas, sobrenadante de cultivo tisular y proteínas recombinantes.
La muestra patrón puede diluirse en serie por el usurario final para
obtener una curva patrón. Otros componentes opcionales del kit
incluyen un tampón de lavado y un control positivo. El control
positivo también puede ser cualquiera de las muestras descritas en
el presente documento.
En una realización especialmente preferida, el
kit de la invención comprende (i) una placa recubierta con un
anticuerpo anti-ADAMTS 13; (ii) un anticuerpo
anti-FXI marcado con HRP; (iii) un sustrato de HRP;
(iv) una muestra patrón; (v) un control positivo; y (vi) un tampón
de lavado.
En un aspecto adicional, la solicitud describe
un procedimiento para regular la actividad de ADAMTS 13 y/o FXI y/o
FXIa potenciando o inhibiendo la formación de complejos ADAMTS
13/FXI.
Otra realización de la solicitud, que no forma
parte de la presente invención, es un procedimiento de tratamiento
de PTT u otras enfermedades relacionadas con la sangre administrando
a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz
de complejos ADAMTS13/FXI.
La presente invención se describirá ahora a modo
de ejemplo, haciéndose referencia a las siguientes figuras en las
que:
La figura 1 muestra la estructura de la forma
plasmática de ADAMTS13. S: péptido señal; P: propéptido; Dis:
región similar a desintegrina; Cys: región rica en Cys. Se muestran
también la región catalítica (metaloproteasa) y los dos dominios
CUB. Se muestran las repeticiones de trombospondina tipo I (TSP1)
como círculos numerados.
La figura 2 muestra LVY-pNA como
sustrato para ADAMTS13.
La figura 3 muestra una comparación de los
sustratos LVY-AMC y
Suc-LLVY-AMC para medir la actividad
de ADAMTS13.
La figura 4 muestra la medición de la rotura de
un sustrato de ADAMTS 13 usando transferencia de energía de
resonancia por fluorescencia (FRET). El sustrato,
NH_{2}-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH,
se incubó con plaquetas normales y se midió el aumento de
fluorescencia a lo largo del tiempo.
La figura 5 muestra la actividad de ADAMTS 13 en
líquido de cultivo tisular de células HEK 293 transfectadas con
ADAMTS 13 y transfectadas de manera simulada. Se midió la actividad
usando el sustrato fluorescente
Suc-LLVY-AMC.
La figura 6 muestra una comparación de la
actividad de ADAMTS 13 en plasma de sujetos normales y de sujetos
con PTT adquirida usando el sustrato fluorescente
Suc-LLVY-AMC.
La figura 7 muestra la cuantificación de la
actividad de ADAMTS13 en PRP de sujetos normales (+\blacksquare y
sujetos con PTT adquirida(\blacklozenge).
\newpage
La figura 8 muestra la medición de la actividad
de ADAMTS 13 en plasma rico en plaquetas (PRP) y plasma pobre en
plaquetas (PPP) de seis muestras individuales tomadas de sujetos
normales. Se midió la actividad de ADAMTS13 usando el sustrato
fluorescente Suc-LLVY-AMC.
La figura 9 muestra una comparación de la
actividad de ADAMTS13 por mg de proteína en plaquetas de sujetos
normales y sujetos con PTT adquirida.
La figura 10 muestra la inmunotinción de
inmunotransferencias de tipo Western de proteínas plaquetarias
mediante diversos anticuerpos anti-ADAMTS13. La
figura 10A muestra proteínas plaquetarias sometidas a electroforesis
usando condiciones reductoras (carriles A y B) y condiciones no
reductoras (carriles C y D). Los carriles A y C se tiñeron con
anticuerpo de cabra anti-PAI-1 como
control; los carriles B y D se tiñeron con anticuerpo de cabra
anti-ADAMTS 13; el carril E contiene patrones de
peso molecular. Las flechas a la izquierda indican bandas de
proteínas inmunoteñidas específicamente mediante anticuerpos
anti-ADAMTS13. La figura 10B muestra la
inmunotinción de proteínas plaquetarias usando anticuerpos humanos.
Carril A: condiciones reductoras e Ig de un sujeto con PTT
adquirida; carril B: condiciones no reductoras e Ig de un sujeto con
PTT adquirida; carril C: condiciones no reductoras e Ig de un
sujeto normal (control); carril D: marcadores de peso molecular.
La figura 11 muestra que la actividad de ADAMTS
13 en plaquetas normales y en plaquetas de un sujeto con PTT
adquirida se potencia mediante tratamiento con el factor XIa (FXIa)
activado por peptidasa.
La figura 12 muestra una gráfica de la actividad
de ADAMTS 13 plaquetaria activada por FXIa en plasma normal y su
inhibición mediante plasma de un sujeto con PTT adquirida.
La figura 13 muestra una curva patrón que
representa el aumento dependiente de la concentración de la densidad
óptica usando el ELISA de ADAMTS 13 y diferentes cantidades de
plasma normal.
La figura 14 muestra la determinación de los
niveles de ADAMTS13, en relación con plasma normal combinado (PNP),
en veinticuatro muestras de plasma individuales de sujetos normales
usando el procedimiento de ELISA.
La figura 15 muestra la inhibición de la
actividad de ADAMTS13 recombinante mediante anticuerpo de cabra
anti-ALAMTS13.
La figura 16 muestra la actividad de ADAMTS13
recombinante en presencia de cantidades variables de plasma normal
o plasma de sujetos con PTT adquirida, que contiene un inhibidor de
la enzima.
La figura 17 muestra la inhibición de la
actividad de ADAMTS 13 en plaquetas aisladas mediante anticuerpos
anti-ADAMTS13 de diferentes especies.
La figura 18 muestra los resultados de un
experimento que mide autoanticuerpos anti-ADAMTS 13
en plasma incubando previamente una muestra de plasma con plaquetas
normales aisladas.
La figura 19 muestra la inhibición dependiente
de la concentración de la actividad de ADAMTS 13 plaquetaria
mediante anticuerpos frente a ADAMTS 13 humanos en plasma de sujetos
con PTT adquirida.
La figura 20 muestra el efecto de usar
diferentes cantidades de plaquetas en el ensayo de fluorescencia de
la invención. Se midió la actividad de ADAMTS 13 en PRP de sujetos
normales y sujetos con PTT adquirida.
La figura 21 muestra una curva patrón que usa un
ELISA de la invención para medir el nivel de complejos ADAMTS13/FXI
en diversas concentraciones de plasma normal.
La figura 22 muestra la formación de complejos
entre ADAMTS 13 recombinante y FXI inmovilizado en una placa de
microtitulación.
La figura 23 muestra el nivel de complejos
ADAMTS13/FXI en plasma deficiente en FXI, en comparación con plasma
normal.
La figura 24 muestra que se formaron cantidades
crecientes de complejos ADAMTS 13/FXI en plasma deficiente en FXI
tras la adición de cantidades crecientes de FXI.
En esta descripción, "comprende", "que
comprende", "que contiene", "que tiene" y similares
pueden tener el significado atribuido a los mismos en la Ley de
Patentes Estadounidense y pueden significar "incluye", "que
incluye" y similares. "Que está constituido esencialmente
por" o "constituido esencialmente por" pueden tener
asimismo el significado atribuido en la Ley de Patentes
Estadounidense y la expresión es abierta, permitiendo la presencia
de más de lo que se menciona siempre que las características básicas
o novedosas de lo que se menciona no cambien por la presencia de
más de lo que se menciona, pero excluye realizaciones de la técnica
anterior.
ADAMTS13, también conocida como proteasa de
rotura del factor de von Willebrand (VWF), es un miembro de la
familia de metaloproteasas nombrada por la combinación
característica de un dominio similar a desintegrina y una
metaloproteasa (tipo reprolisina) con motivos de trombospondina tipo
1. La estructura de ADAMTS 13 plasmática se muestra en la figura 1.
Pueden encontrarse detalles estructurales e información de secuencia
sobre ADAMTS 13 en Zheng et al. (2001; J. Biol. Chem.
276(44):41059-41063). ADAMTS13 rompe VWF en
el enlace Tyr^{1605}-Met^{1606} y requiere
tanto iones calcio como cinc para funcionar.
Hasta la presente invención, se estudiaba
principalmente la actividad de ADAMTS 13 en plasma. Esta forma de
ADAMTS13 se denomina en el presente documento "ADAMTS13
plasmática". Se ha descubierto ahora una forma novedosa de
ADAMTS 13 en plaquetas y se denomina en el presente documento
"ADAMTS13 plaquetaria". También puede prepararse "ADAMTS 13
recombinante" usando técnicas de biología molecular
convencionales, tales como las encontradas en Sambrook, et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel
et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª ed.,
John Wiley & Sons, Inc. (así como la versión completa de Current
Protocols in Molecular Biology).
Por tanto, la solicitud describe una proteína
ADAMTS 13 y la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas. Esta proteína
parece ser distinta de ADAMTS 13 plasmática porque ADAMTS13
plasmática es un polipéptido contiguo, mientras que la proteína
ADAMTS13 plaquetaria se rompe en más de un polipéptido, que entonces
se sujetan entre sí mediante enlaces disulfuro. Se observan
polipéptidos de aproximadamente 120 kD, aproximadamente 84 kD,
aproximadamente 60 kD, aproximadamente 43 kD y aproximadamente 30
kD en un gel de SDS-PAGE de ADAMTS13 plaquetaria.
ADAMTS13 plaquetaria parece romperse por FXIa. Asimismo, esta forma
de ADMATS13 también parece ser distinta de la notificada por Suzuki
et al. (2004, Biochem. Biophys. Res. Commun.
313:212-216). A diferencia de la ADAMTS13
plaquetaria rota de la presente invención, la ADAMTS13 de Suzuki
et al. tiene un peso molecular de aproximadamente 220 kD en
un gel de SDS-PAGE. Además, Suzuki et al.
notifican la forma más grande de ADAMTS13 en plaquetas, mientras
que los experimentos realizados por los presentes inventores indican
actividad de ADAMTS 13 en la superficie de plaquetas. Sin querer
restringirse a la teoría, es posible que la ADAMTS 13 plaquetaria de
la invención haya experimentado una modificación postraduccional
diferente que la de Suzuki et al., dando como resultado una
proteína de superficie rota, en vez de una proteína citoplasmática
más grande.
Los ensayos descritos en esta solicitud pueden
usarse para detectar ADAMTS 13 plaquetaria, ADAMTS 13 plasmática y
ADAMTS13 recombinante.
Las fuentes de ADAMTS 13 para su uso en los
ensayos y procedimientos de la invención pueden ser plasma rico en
plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal
combinado (PNP), plaquetas aisladas, sangre completa, sobrenadante
de cultivo tisular o ADAMTS13 purificada. Pueden encontrarse
procedimientos para preparar PRP, PPP, plaquetas aisladas y
sobrenadante de cultivo tisular en la sección de ejemplos. Puede
prepararse ADAMTS13 purificada a partir de plasma, plaquetas o
células recombinantes usando técnicas bioquímicas convencionales
para la purificación y el aislamiento de proteínas incluyendo, pero
sin limitarse a, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de
exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico,
inmunoprecipitación y precipitación con sulfato de amonio. El
término plasma puede incluir PRP, PPP y PNP.
Tal como se usa en el presente documento, las
"plaquetas normales", el "plasma normal", el "PRP
normal", etc. se derivan de individuos que no tienen ni PTT
congénita ni PTT adquirida. El PNP es una mezcla de plasma tomado
de múltiples individuos que no tienen PTT. Asimismo, las
"plaquetas de PTT", el "plasma de PTT", "el PRP de
PTT", etc. se derivan de individuos que tienen o bien PTT
congénita o bien PTT adquirida. Las "plaquetas de PTT
adquirida", el "plasma de PTT adquirida", el "PRP de PTT
adquirida", etc. se derivan de individuos que tienen la forma
adquirida de PTT.
Las mediciones de la actividad de ADAMTS 13 se
realizan en relación con la "actividad normal", es decir, la
actividad de ADAMTS13 en plaquetas normales, plasma normal, PRP
normal, ADAMTS13 recombinante o purificada, etc. Por tanto,
expresiones tales como "actividad reducida de ADAMTS13" o
"actividad inhibida de ADAMTS13" se refieren a la actividad de
ADAMTS13 en relación con la actividad medida en una muestra normal,
es decir, plaquetas normales, plasma normal, PRP normal, ADAMTS13
recombinante o purificada, etc.
Los procedimientos de la invención pueden
aplicarse a aplicaciones clínicas, veterinarias y/o de
investigación.
El factor XI (FXI) es un zimógeno de la familia
de serina proteasa plasmática que, tras su activación, participa
tanto en la formación de fibrina como en la fibrinólisis (von dem
Borne et al. 1995, Blood 86:3035-3042). FXI
está compuesto por 2 polipéptidos de 80-kD idénticos
conectados por un único enlace disulfuro. La proteína tiene una
cadena pesada no catalítica N-terminal y una cadena
ligera catalítica similar a tripsina C-terminal. La
cadena pesada consiste en 4 subunidades homólogas denominadas
dominios "manzana", una característica que comparte FXI con la
precalicreína estrechamente relacionada (Gailani et al. 2001,
Blood 17:3117-3122).
\newpage
FXI se activa in vitro mediante el factor
XII activado (FXIIa), la trombina y el factor XI activado (FXIa)
(Gailani. et al. 1991, Science 253:909). Las pruebas sugieren
fuertemente que FXI y FXIa se unen a plaquetas activadas de una
manera que requiere el cofactor proteico cininógeno de alto peso
molecular, e iones cinc (Sinha et al. 1984, J. Clin. Invest.
73: 1550-1559). FXI y FXIa se unen ambos a plaquetas
activadas (Greengard, J. et al (1986) Biochemistry 25:
3884-3890).
Los presentes inventores han encontrado que
tanto FXI como FXIa se unen a ADAMTS13. Se forma de ese modo un
complejo entre ADAMTS 13 y FXI o FXIa. La invención comprende tanto
complejos ADAMTS13-FXI como complejos
ADAMTS13-FXIa. FXIa parece romper ADAMTS13. Sin
querer restringirse a la teoría, se cree que la rotura de ADAMTS 13
por FXIa aumenta la actividad de ADAMTS 13. La invención proporciona
procedimientos de detección de complejos
ADAMTS13-FXI en una muestra. La detección de
complejos puede usarse como medición de los niveles y/o la
actividad de ADAMTS 13, y puede ser diagnóstico para PTT y otros
estados hemostáticos.
Las fuentes de FXI para su uso en los ensayos y
procedimientos de la invención pueden ser plasma rico en plaquetas
(PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado
(PNP), plaquetas aisladas, sangre completa, sobrenadante de cultivo
tisular o FXI purificado. Puede prepararse FXI purificado a partir
de plasma, plaquetas o células recombinantes usando técnicas
bioquímicas convencionales para la purificación y el aislamiento de
proteínas incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía de
inmunoafinidad, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía
de intercambio iónico, inmunoprecipitación y precipitación con
sulfato de amonio. Tal como se usa en el presente documento, el
"plasma deficiente en FXI" se deriva de individuos con una
deficiencia en FXI congénita o
adquirida.
adquirida.
Se describen en el presente documento ensayos
para medir la actividad de ADAMTS13. En un ensayo de este tipo se
incuba una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato que
comprende un resto peptídico y un resto cromogénico o fluorogénico
y se mide la densidad óptica o fluorescencia de la muestra, midiendo
de ese modo la actividad de ADAMTS13. En una realización, el resto
peptídico comprende X-Val-Tyr,
X-Leu-Tyr o
X-Ile-Tyr, en los que X es
cualquier aminoácido. Por ejemplo, X es Leu. En otras realizaciones,
el resto peptídico es Leu-Val-Tyr,
Leu-Leu-Val-Tyr o
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.
El experto en la técnica puede realizar
sustituciones de aminoácidos en el resto peptídico sin
experimentación excesiva. Por ejemplo, pueden realizarse
sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud en polaridad,
carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la
naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la
actividad de unión del sustrato. Por ejemplo, los aminoácidos
cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico;
los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y
los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que tienen
valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina,
valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
fenilalanina y tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservativas,
por ejemplo, según la tabla a continuación. Los aminoácidos en el
mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma
línea de la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
Preferiblemente, el resto peptídico es al menos
de aproximadamente 3 residuos de aminoácido de longitud. Más
preferiblemente, el resto peptídico está en el intervalo de
aproximadamente 3 a aproximadamente 20 residuos de aminoácido de
longitud. También pueden usarse aminoácidos no convencionales tales
como los encontrados en la serie Spectrozyme de sustratos
peptidílicos de American Diagnostica Inc. (Stamford, CT) para
sustituir aminoácidos convencionales, siempre que el péptido
conserve su capacidad de unirse a y se rompa por ADAMTS13.
Los restos cromogénicos adecuados para su uso en
la invención incluyen s-bencilo, ácido
5-amino-2-nitrobenzoico
y
6-amino-1-naftalensulfonamidas.
El resto cromogénico no es para-nitroanilina (pNA),
que se ha demostrado que es un resto ineficaz para un sustrato de
ADAMTS 13. Sin querer restringirse a la teoría, es posible que la
estructura de pNA cree un impedimento estérico que evite la
actividad de ADAMTS 13.
Los restos fluorogénicos adecuados para su uso
en la invención incluyen cumarinas, fluoresceínas, rodaminas,
resorufinas y dimetilacridinonas. En una realización preferida, el
resto fluorogénico es una cumarina. En una realización
particularmente preferida, la cumarina es
7-amino-4-metilcumarina
(AMC).
Otro ensayo descrito en el presente documento es
un procedimiento para medir la actividad de ADAMTS 13 incubando una
muestra que comprende ADAMTS 13 con un sustrato que tiene restos
donador y aceptor que median la transferencia de energía de
resonancia por fluorescencia (FRET). Además de los restos donador y
aceptor, el sustrato comprende un resto peptídico que comprende
Val-Tyr-Met,
Leu-Tyr-Met o
Ile-Tyr-Met. La actividad de ADAMTS
13 se determina midiendo la fluorescencia de la muestra.
FRET es una interacción dependiente de la
distancia entre los estados electrónicos excitados de dos moléculas
de colorante en la que la excitación se transfiere desde un resto
donador hasta un resto aceptor sin la emisión de un fotón. Esto se
logra usando pares de donador/aceptor en los que el espectro de
emisión del donador se solapa con el espectro de absorción del
aceptor. Cuando los dos están en proximidad espacial, la energía de
excitación del donador se transfiere al aceptor a través de
interacciones dipolo-dipolo de largo alcance.
Cuando se produce la transferencia de energía, el aceptor extingue
la fluorescencia del donador, y, por tanto, el resto aceptor se
denomina también un extintor. Los restos donador y aceptor deben
estar a una distancia de aproximadamente 100 angstroms o 10 nm
entre sí para lograr una transferencia de energía eficaz.
Se conocen bien en la técnica pares de
donador/aceptor adecuados para su uso en FRET. Pueden encontrarse
ejemplos de pares de donador/aceptor en la tabla 1. Debe indicarse
que la tabla 1 no contiene una lista exhaustiva de pares de
donador/aceptor de FRET y que el experto en la técnica puede elegir
un par de donador/aceptor basándose en su conocimiento de la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
El par de donador/aceptor preferido es
EDANS/DABCYL.
Preferiblemente, el resto peptídico es al menos
de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos de longitud. Más
preferiblemente, el resto peptídico está en el intervalo de
aproximadamente 3 a aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de
longitud. Ventajosamente, el resto peptídico es
Asn-Leu-Val-Tyr-Met-Val-Thr-Gly-Asp.
Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos tal como se
describió anteriormente sin apartarse del espíritu y alcance de la
invención.
El sustrato preferido para su uso en esta
realización de la invención es
NH_{2}-Arg-Lys-(DABCYL)-Asn-Leu-Val-Tyr-Met-Val-Thr-Gly-Asp-(EDANS)-Arg-COOH.
Se contemplan también en el presente documento
procedimientos para preparar los sustratos de ADAMTS13. Dichos
procedimientos comprenden unir covalentemente un resto peptídico,
tal como se describió anteriormente, a un resto cromogénico o
fluorogénico, o a un resto donador y un resto aceptor que median
FRET, usando técnicas de síntesis bien conocidas.
Una realización descrita en la invención de la
solicitud implica un procedimiento para inhibir ADAMTS 13 usando un
anticuerpo inhibidor contra ADAMTS13. Están disponibles varios
anticuerpos anti-ADAMTS13 a partir de diversas
fuentes. Por ejemplo, los ejemplos 12 y 14 demuestran los efectos
inhibidores de anticuerpos anti-ADAMTS13 de cabra,
conejo y ser humano.
Pueden detectarse autoanticuerpos que inhiben la
actividad de ADAMTS 13 en sujetos con PTT adquirida. (Véase Klaus
et al. 2004, Blood 103(12):4514-4519.)
Estos anticuerpos pueden aislarse del plasma de pacientes con PTT
adquirida y usarse in vitro como inhibidores de ADAMTS13.
Además, un procedimiento de diagnóstico de PTT adquirida
proporcionado por la presente invención es incubar una muestra de
ADAMTS13 con plasma de un sujeto que va a someterse a prueba para
detectar PTT adquirida y para medir la actividad de ADAMTS 13 usando
uno de los ensayos de la invención. La inhibición de la actividad
de ADAMTS 13 por el plasma indica la presencia de anticuerpos
anti-ADAMTS 13 inhibidores en el plasma y confirma
por tanto un diagnóstico de PTT adquirida.
\newpage
Klaus et al. (ibídem) realizaron
experimentos de mapeo de epítopos con el fin de deducir la
naturaleza de los anticuerpos frente a ADAMTS 13 inhibidores en
pacientes con PTT adquirida. Los resultados indican que los
anticuerpos dirigidos contra el dominio espaciador/rico en cisteína
de ADAMTS13 se detectaron en todos los casos. Además, los
anticuerpos dirigidos contra la repetición de TSP1-1
o un fragmento que contiene la repetición de
TSP1-1, el dominio similar a desintegrina y el
dominio catalítico se detectaron en el 72% de los pacientes.
Además, los anticuerpos dirigidos contra los dominios CUB 1 y/o CUB
2 se detectaron en el 64% de los pacientes. Para los fines de esta
invención, el extremo C-terminal está constituido
por repeticiones 2-8 de trombospondina tipo 1 TSP1
y los dominios CUB. La figura 1 muestra un diagrama esquemático de
ADAMTS13.
Se describe en el presente documento un
procedimiento para identificar inhibidores de ADAMTS13. El inhibidor
puede ser, entre otros, un polipéptido, un péptido, un
oligonucleótido, un polinucleótido, un nucleósido o análogo de
nucleósido, un sacárido, una molécula pequeña o una sustancia
química natural o sintética. El procedimiento comprende incubar una
muestra de ADAMTS13 con un inhibidor candidato y medir la actividad
de ADAMTS13 según uno o más de los ensayos proporcionados por la
invención. El inhibidor se identifica mediante la actividad
reducida de ADAMTS13 en la muestra de prueba, en comparación con la
actividad de ADAMTS13 en una muestra control no incubada con el
inhibidor candidato. El inhibidor candidato puede generarse usando
técnicas conocidas y puede derivarse, por ejemplo, de una
biblioteca de compuestos químicos, una biblioteca de presentación en
fago, una biblioteca de productos químicos naturales o una
biblioteca de química combinatoria.
En ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA) es un inmunoensayo en fase sólida que se usa ampliamente en
entornos de investigación tanto clínica como básica. En un tipo de
ELISA, se une un antígeno a la fase sólida, que es lo más
comúnmente una membrana, una placa, un micropocillo o una perla. Se
incuba entonces la fase sólida con un anticuerpo frente al antígeno
(un "anticuerpo primario"). Si el anticuerpo primario está
conjugado con un marcador, puede detectarse. Este procedimiento se
conoce como inmunomarcaje directo. Como alternativa, el anticuerpo
primario puede no estar marcado, en cuyo caso se incuba con la fase
sólida un anticuerpo frente al anticuerpo primario (un
"anticuerpo secundario"), producido en una especie diferente
del anticuerpo primario y conjugado con un marcador. Este
procedimiento de detección se denomina inmunomarcaje indirecto. Se
conocen bien en la técnica procedimientos de inmunomarcaje.
En un tipo diferente de ELISA, se une un
anticuerpo a la fase sólida. Este anticuerpo puede usarse entonces
para capturar un antígeno de interés. Pueden emplearse técnicas de
inmunomarcaje directo o indirecto para el análisis. En la presente
invención, puede medirse ADAMTS 13 en una muestra uniendo un
anticuerpo anti-ADAMTS13 a una fase sólida y
añadiendo la muestra a la fase sólida. La ADAMTS13 presente en la
muestra se une al anticuerpo y se detecta la ADAMTS 13 unida usando
inmunomarcaje directo o indirecto. La cantidad de ADAMTS13 en la
muestra puede medirse cuantificando el marcador.
En una realización preferida, la muestra es o
comprende plaquetas. En otra realización preferida, la muestra es
plasma.
Se usa otro ELISA descrito por la solicitud para
detectar anticuerpos anti-ADAMTS13 en una muestra de
prueba. En el presente documento, un anticuerpo
anti-ADAMTS13 producido en una primera especie, por
ejemplo una cabra, se une a una fase sólida. Se añade ADAMTS 13 y
se une al anticuerpo producido en la primera especie. Se añade una
muestra de prueba de una segunda especie, por ejemplo ser humano, y
cualquier anticuerpo anti-ADAMTS 13 presente en la
muestra de prueba se une a la ADAMTS13. Finalmente, se añade un
anticuerpo marcado contra anticuerpos de la segunda especie. El
anticuerpo marcado se produce en una tercera especie, por ejemplo
asno, y se une al anticuerpo de la segunda especie. Detectando el
marcador, pueden detectarse anticuerpos anti-ADAMTS
13 en la muestra de
prueba.
prueba.
Se usa un ELISA proporcionado por la invención
para detectar complejos ADAMTS13-FXI en una muestra.
En una realización, se une un anticuerpo
anti-ADAMTS 13 a una fase sólida. Se añade una
muestra a la fase sólida y los complejos
ADAMTS13-FXI presentes en la muestra se unen al
anticuerpo. Se añade un anticuerpo anti-FXI y se
detecta el complejo ADAMTS13-FXI mediante marcaje
directo o indirecto con un resto cromogénico o fluorescente, tal
como se describe en el presente documento. Las cantidades de
complejos ADAMTS13-FXI se cuantifican mediante la
detección del marcador.
En otra realización que no forma parte de esta
invención, se une FXI a una fase sólida y se añade una muestra de
prueba que contiene ADAMTS13 a la fase sólida y se forma un complejo
con el FXI inmovilizado. Se añade un anticuerpo
anti-ADAMTS13 y se une a los complejos ADAMTS13/FXI.
El anticuerpo frente a ADAMTS13 puede detectarse mediante marcaje
directo o indirecto tal como se describe en el presente
documento.
La muestra de prueba puede ser cualquier líquido
biológico, tal como sangre, plasma, suero, líquido de cultivo,
líquido cefalorraquídeo o esputo. En una realización preferida, el
líquido biológico es plasma.
El marcador puede ser cualquier resto conocido
en la técnica, incluyendo sistemas enzimáticos cromogénicos, tales
como peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, glucosa
6-fosfato deshidrogenasa. Estos marcadores
enzimáticos reaccionan con un sustrato cromogénico que puede
detectarse mediante técnicas convencionales. En una realización
preferida, el marcador es peroxidasa del rábano y el sustrato es
tetrametilbencidina. El marcador puede ser también un colorante
fluorescente, incluyendo rodamina, fluoresceína, colorantes Cy,
Rojo Texas y derivados de los mismos.
Además del procedimiento tratado anteriormente
para diagnosticar PTT adquirida sometiendo a prueba las propiedades
inhibidoras del plasma sobre una muestra de ADAMTS 13, la invención
proporciona otros procedimientos para el diagnóstico de PTT tanto
congénita como adquirida.
Por ejemplo, no formando parte de la presente
invención, puede diagnosticarse PTT congénita o adquirida midiendo
la actividad de ADAMTS13 en una muestra de prueba de un sujeto
usando uno de los ensayos descritos en el presente documento y
comparando posteriormente la actividad de ADAMTS13 en la muestra de
prueba con la actividad de ADAMTS13 en una muestra control que
tiene una actividad de ADAMTS13 normal. Una actividad reducida de
ADAMTS13 en la muestra de prueba en comparación con la muestra
control indica un diagnóstico positivo de
PTT.
PTT.
La PTT congénita o adquirida se diagnostica
preferiblemente midiendo la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en
una muestra de prueba de un sujeto usando el ELISA descrito en el
presente documento y comparando posteriormente la cantidad de
complejos en la muestra de prueba con la cantidad de complejos en
una muestra control que tiene una actividad de ADAMTS 13 normal. Un
nivel reducido de complejos ADAMTS 13/FXI en la muestra de prueba en
comparación con la muestra control indica un diagnóstico positivo
de PTT. Tal como se muestra en el ejemplo 20, hay una correlación
lineal entre la actividad de ADAMTS 13 y el nivel de complejos
ADAMTS13/FXI en una muestra.
Puede diagnosticarse PTT adquirida en un sujeto
incubando una muestra que comprende ADAMTS 13 con plasma de los
sujetos; y midiendo la actividad de ADAMTS 13 en la muestra usando
uno de los ensayos descritos en el presente documento. Una
actividad reducida de ADAMTS13 en la muestra, en comparación con la
actividad de ADAMTS13 en una muestra control que tiene una
actividad de ADAMTS 13 normal, indica PTT adquirida.
Las técnicas descritas en el presente documento
pueden usarse para controlar el tratamiento de un paciente para
PTT. Por ejemplo, durante el tratamiento, puede medirse la actividad
de ADAMTS13 usando los ensayos de la invención. Esto permite al
médico evaluar la eficacia del tratamiento y/o determinar la
duración de una sesión de tratamiento que se requiere para
restaurar la actividad de ADAMTS13.
Un tratamiento para PTT es la plasmaféresis. En
pacientes con TOP adquirida, la plasmaféresis se usa para eliminar
los anticuerpos anti-ADAMTS13 inhibidores del plasma
del paciente. Se proporciona la sustitución de la ADAMTS13
deficiente mediante el plasma infundido. Recientes avances en el
entendimiento de los mecanismos patológicos de PTT proporcionan un
fundamento para controlar la plasmaféresis por medio de la medición
de los niveles de actividad de ADAMTS13 en el paciente que se
somete a plasmaféresis.
Debido a que la forma plaquetaria de ADAMTS 13
reacciona con sustratos de bajo peso molecular más eficazmente que
la forma plasmática, es probable que ADAMTS 13 plaquetaria sea una
mejor diana para fármacos diseñados para tratar la PTT. Por tanto,
la invención proporciona un procedimiento para tratar PTT en un
paciente que necesita del mismo que comprende administrar al
paciente un fármaco que selecciona como diana específicamente
ADAMTS 13 plaquetaria. El fármaco puede identificarse usando los
procedimientos de selección proporcionados por la invención y
descritos en el presente documento. El término "fármaco"
pretende abarcar un polipéptido, un péptido, un oligonucleótido, un
polinucleótido o un vector que contiene un polinucleótido, un
nucleósido o análogo de nucleósido, un sacárido, una molécula
pequeña o un producto químico natural o sintético.
La invención se describirá adicionalmente ahora
a modo de los siguientes ejemplos no limitantes, facilitados a modo
de ilustración.
Se obtuvieron
Leu-Val-Tyr-AMC
(LVY-AMC) y
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC
(Suc-LLVY-AMC) de Bachem Bioscience
Inc. (King of Prussia, PA). LVY-AMC también lo
fabricaba QPR (Montreal, Canadá). El sustrato de FRET,
NH_{2}-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH,
lo fabricó para American Diagnostica Inc. el Centro de Recursos de
Biología Molecular ("Molecular Biology Resource
Center"), Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de
Oklahoma ("University of Oklahoma Health Sciences
Center" (Oklahoma City, OK).
Se recogió sangre mediante venopunción en tubos
de recogida que contenían citrato de sodio 0,12 M, un
anticoagulante. Se centrifugó la sangre tratada con citrato a 700
rpm durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante y se guardó como
la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP). Se centrifugó el PRP
a 10.000 rpm durante 20 minutos. Se separó el sobrenadante y se
guardó como la fracción de plasma pobre en plaquetas (PPP). El
sedimento contenía las plaquetas, que se lavaron mediante
resuspensión en tampón Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y
centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se resuspendieron
las plaquetas aisladas en tampón y se usaron en los
experimentos.
Se transfectaron células HEK 293 con un vector
que codificaba ADAMTS 13. El sobrenadante de cultivo celular de las
células HEK 293 transfectadas, que contenía ADAMTS13 recombinante,
lo proporcionó generosamente el Dr. David Ginsburg (Universidad de
Michigan, MI). Se proporcionó también como control sobrenadante de
células transfectadas de manera simulada sin ADAMTS 13
recombinante.
Tal como se trató anteriormente, Furlan et
al. notificaron que algunos restos de
peptidil-pNA, tales como XLY-pNA y
XVY-pNA, no eran sustratos para ADAMTS13. Se preparó
LVY-pNA y se sometió a prueba para determinar su
capacidad para romperse por ADAMTS 13. Los resultados mostrados en
la figura 2 confirman los hallazgos de Furlan et al., es
decir, ADAMTS13 no rompía LVY-pNA.
Por tanto, la naturaleza del grupo saliente del
sustrato peptidílico parece ser importante para determinar la
capacidad de ADAMTS13 para romper un cromóforo o un fluoróforo del
extremo de un sustrato peptidílico. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar el efecto de la
modificación de la longitud de la secuencia peptídica conjugada con
el fluorocromo AMC, se incubó PRP normal (20 \mul) a 37ºC con una
concentración final de Suc-LLVY-AMC
o LVY-AMC 0,8 mM en tampón Tris-HCl
10 mM pH 8,0 en un volumen total de 200 \mul. Se midió la
fluorescencia usando un lector de placas de microtitulación
fluorofotométrico (ex. 360 nm/em. 460 nm). ADAMTS 13 en PRP rompió
ambos sustratos de peptidil-AMC, proporcionando el
sustrato Suc-LLVY-AMC una señal
superior a lo largo del tiempo en comparación con el sustrato
LVY-AMC (figura 3).
Este ejemplo demuestra que pueden prepararse
diferentes sustratos de ADAMTS13 alterando la secuencia peptídica
que está conjugada al fluoróforo AMC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la actividad de ADAMTS 13 usando un
sustrato fluorescente unido a un resto donador y un resto aceptor
que actúa mediante transferencia de energía de resonancia por
fluorescencia (FRET). Se usó en este ejemplo el sustrato selectivo
de ADAMTS13,
NH_{2}-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH.
La secuencia peptídica NLVYMVTGD de este sustrato es homóloga al
sitio de rotura de ADAMTS 13 en VWF. El sustrato peptidílico
intacto tiene baja fluorescencia, debido a la extinción del
fluorocromo DABCYL por el extintor EDANS. La rotura del sustrato
entre la tirosina y la metionina de la secuencia peptídica da como
resultado un aumento de fluorescencia.
Se incubaron plaquetas aisladas en tampón de
ensayo Tris-HCl 10 mM pH 8,0 con una concentración
final de 8 \mug/ml del sustrato de FRET a 37ºC. Se midió la
fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico (ex. 360
nm/em. 440 nm). La figura 4 muestra que la incubación de plaquetas
con
NH_{2}-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH
da como resultado un aumento de fluorescencia a lo largo del
tiempo, indicando que la forma de ADAMTS 13 encontrada en las
plaquetas rompe este sustrato peptídico de FRET. El experto en la
técnica puede diseñar otros sustratos de FRET para medir la
actividad de ADAMTS 13 usando su propio conocimiento y las
enseñanzas del presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon las señales de fluorescencia entre
sobrenadante de cultivo tisular de células HEK 293 transfectadas
con un vector viral que codifica ADAMTS 13 recombinante
("recADAMTS13") y sobrenadante de células HEK 293
transfectadas de manera simulada, como control. (Los sobrenadantes
de cultivo los proporcionó el Dr. David Ginsburg, Universidad de
Michigan.) Se añadieron cantidades variables de los dos
sobrenadantes de cultivo al sustrato fluorescente
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC
0,8 mM en Tris-HCl 50 mM pH 8,0 en un volumen total
de 100 \mul. La figura 5 muestra que se produjo una señal de
fluorescencia mayor mediante el sobrenadante de células
transfectadas frente al sobrenadante de células transfectadas de
manera simulada. El aumento de la señal de fluorescencia se debe a
la rotura del sustrato mediante recADAMTS13 en sobrenadante del
sobrenadante de células transfectadas con el vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la actividad de ADAMTS 13 en plasma
usando el sustrato Suc-LLVY-AMC. Se
añadió plasma normal (50 \mul) o plasma de PTT adquirida (50
\mul) a sustrato en tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0.
La concentración final del sustrato era de 0,8 mM; se usó sustrato
en tampón como control de fondo. Se incubó la mezcla de reacción a
37ºC durante 4 horas y se registró la fluorescencia en un lector de
placas espectrofluorométrico a ex. 360 nM/em. 440 nM (figura 6). Se
observó una actividad de ADAMTS 13 superior en el plasma normal en
comparación con plasma de PTT adquirida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la actividad de ADAMTS13 de plasma
normal y de plasma de PTT adquirida en el ensayo de fluorescencia
descrito anteriormente. Específicamente, se diluyeron en serie 1:2
20 \mul de PRP normal en PPP normal en pocillos de
microtitulación. Se añadieron ochenta \mul de
LVY-AMC (concentración final de 0,2 mM) en tampón
Tris-HCl 10 mM pH 8,0 al PRP. Se colocó la placa de
microtitulación en un lector de placas de microtitulación
espectrofluorométrico a 37ºC y se controló la fluorescencia a ex.
360 nm/em. 440 nm durante 16 minutos.
Los resultados mostrados en la figura 7
demuestran que, a medida que disminuye la cantidad de PRP en el
ensayo, hubo una disminución de la señal de fluorescencia. Se
sometió a prueba el PRP de un paciente diagnosticado con PTT
adquirida en el ensayo en las mismas condiciones que el PRP normal.
En este experimento se usó en el ensayo más plasma del paciente con
PTT adquirida (20-60 \mul), en comparación con PRP
normal. No se generó ninguna señal fluorescente a la cantidad más
alta de PRP del paciente con PTT adquirida. Esto muestra que la
actividad de ADAMTS13 en PRP de un paciente con PTT adquirida tiene
significativamente menos actividad que PRP normal. Este
procedimiento puede usarse para diagnosticar la deficiencia en la
actividad de ADAMTS 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon PRP y PPP de seis voluntarios
normales tal como se describió anteriormente. Se añadieron cincuenta
\mul de cada muestra de plasma a 130 \mul de tampón
Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y 20 \mul de sustrato
Suc-LLVY-AMC 8 mM. Se incubaron las
mezclas de reacción a 37ºC y se controlaron durante 1 hora en un
lector de placas espectrofluorométrico a ex. 360 nm/em. 440 nm. Las
seis muestras de PRP presentaban una alta actividad de ADAMTS 13,
tal como se demuestra mediante la generación de una alta señal de
fluorescencia (RFU) a lo largo del tiempo (figura 8).
La tasa de generación de fluorescencia a lo
largo del tiempo era significativamente mayor en PRP que en plasma.
Tras sedimentar las plaquetas, se sometió a prueba también el PPP de
cada sujeto y presentaba muy poca actividad de ADAPTS13. Estos
resultados muestran que la mayor parte de la actividad de ADAMTS 13
en PRP está presente en las plaquetas y no en el plasma.
\newpage
Se prepararon plaquetas aisladas de un sujeto
normal y de un paciente diagnosticado con PTT adquirida tal como se
describió anteriormente. Se colocaron aproximadamente 600 \mug de
proteína en 100 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM pH
8,0 de las plaquetas aisladas normales y adquiridas en pocillos de
una placa de microtitulación de fluorescencia. Se añadió el
sustrato LVY-AMC a cada tubo hasta una concentración
final de 0,2 mM y se incubaron las mezclas de reacción a 37ºC
durante 1 hora. Se controló la fluorescencia a ex. 360 nm/em. 440
nm. La cantidad de actividad de ADAMTS13 por mg de proteína
asociada con plaquetas normales era significativamente mayor que la
asociada con plaquetas de un paciente con PTT adquirida (figura
9).
Este procedimiento puede usarse para cuantificar
la actividad de ADAMTS13 en plaquetas. Una baja actividad de
ADAMTS13 indicaría PTT. Puede diagnosticarse tanto PTT congénita,
provocada por mutación o alteración de ADAMTS13, como PTT
adquirida, provocada por la presencia de anticuerpos inhibidores
frente a ADAMTS 13, usando este procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la forma molecular de ADAMTS 13 en
plaquetas mediante inmunotinción de inmunotransferencias de tipo
Western de proteínas plaquetarias (figura 10). Se solubilizaron
plaquetas lavadas en tampón de muestra SDS con y sin
mercaptoetanol. Se realizó una electroforesis en
SDS-PAGE usando gel de acrilamida al
4-20%. Se sometieron a electrotransferencia las
proteínas resueltas sobre un papel de nailon y se inmunotiñeron con
diferentes anticuerpos anti-ADAMTS13 biotinilados y
estrepavidina-HRP/TMB. Un anticuerpo de cabra
anti-ADAMTS13 inmunotiñó específicamente bandas de
proteínas en condiciones reductoras a aproximadamente 120 kD, 43 kD
y 30 kD. Usando condiciones no reductoras, se inmunotiñó
específicamente una banda de alto peso molecular a aproximadamente
150 kD.
Estos hallazgos sugieren que ADAMTS 13 en
plaquetas está compuesta por más de una proteína sujetas entre sí
por enlaces disulfuro. Se ha notificado que ADAMTS 13 en plasma está
compuesta por una única proteína de peso molecular de
150-170 kD. La ADAMTS 13 asociada con plaquetas es
diferente de la ADAMTS13 plasmática, y parece estar rota. Se
inmunotiñó ADAMTS13 de plaquetas usando plasma de un paciente con
PTT adquirida. Se inmunotiñó específicamente una banda de alto peso
molecular en condiciones no reductoras. La reducción de la proteína
hizo que la ADAMTS13 no se tiñera mediante este plasma de PTT.
\vskip1.000000\baselineskip
La ADAMTS 13 en plaquetas parece romperse
proteolíticamente en al menos dos o más cadenas polipeptídicas
sujetas entre sí por enlaces disulfuro, mientras que la ADAMTS 13
plasmática es una única cadena peptídica. Se sometió a prueba si
una peptidasa puede romper ADAMTS 13 y aumentar la actividad hacia
sustratos peptídicos de ADAMTS 13.
La figura 11 muestra que la actividad de
ADAMTS13 en plaquetas se potencia mediante tratamiento con FXIa
activado por peptidasa. Se resuspendieron plaquetas normales
lavadas a partir de 200 \mul de PRP en 1 ml de tampón de ensayo.
Se resuspendieron plaquetas lavadas a partir de 1 ml de PRP de un
sujeto con PTT adquirida en 50 \mul de tampón de ensayo. Se
añadieron plaquetas normales o con PTT (10 \mul) a tampón de
ensayo Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (80 \mul) o tampón
de ensayo que contenía 0,3 ng/ml de FXIa (80 \mul). Se añadió
sustrato LVY-AMC (10 \mul de 2 mM) y se controló
la fluorescencia (ex. 360 nm/em. 440 nm) durante 1500 segundos. Se
usó FXIa a 0,3 ng/ml como control. La actividad de ADAMTS13 aumentó
significativamente (en aproximadamente 8 veces) hacia el sustrato
LVY-AMC tras el tratamiento de plaquetas con FXIa.
Se potenció la actividad de las plaquetas aisladas a partir de PRP
de un paciente con PTT adquirida mediante el tratamiento con FXIa en
un grado mucho menor que las aisladas a partir de PRP de un
individuo normal. Esto muestra que los anticuerpos inhibidores en
plasma de PTT bloquean la activación de ADAMTS 13 plaquetaria
mediante FXIa.
La actividad de las plaquetas tratadas con FXIa
hacia LVY-AMC se redujo significativamente tras la
adición a los 1500 segundos de 50 \mul de plasma de PTT adquirida
a la mezcla de reacción, mientras que la adición de 50 \mul de
plasma normal no tuvo efecto significativo sobre la actividad
(figura 12). Estos resultados muestran que la potenciación de la
actividad de ADAMTS13 plaquetaria mediante FXIa está bloqueada por
anticuerpos anti-ADAMTS13. Estos hallazgos también
muestran que la actividad de ADAMTS13 puede potenciarse mediante
tratamiento con enzimas proteolíticas.
Estos hallazgos sugieren que ADAMTS13 presente
en plaquetas está en una forma diferente que la encontrada en
plasma. Los resultados anteriores muestran que ADAMTS 13 plaquetaria
perece tener una mayor actividad enzimática hacia sustratos
peptidílicos que ADAMTS13 plasmática. El hallazgo de ADAMTS 13 rota
proteolíticamente en plaquetas puede explicar las diferencias en
reactividad de ADAMTS13 unida a plaquetas y plasma hacia sustratos
peptidílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló un ELISA para medir la proteína
ADAMTS13 en líquidos biológicos.
Se recubrieron placas de microtitulación de 96
pocillos Immulon 4 (Dynex) con anticuerpo de cabra anti-
ADAMTS13 (2 \mug/ml) en 100 \mul de tampón MOPS 50 mM pH 6,0. Se lavaron las placas y se bloquearon con Superblock (Pierce, IN). Se diluyó en serie 1:2 una muestra de PNP en tampón y se añadieron 100 \mul a los pocillos de microtitulación. Tras la incubación durante 1 hora a 37ºC, se lavó la placa y se añadieron a los pocillos de microtitulación 0,5 \mug/ml de inmunoglobulina purificada a partir de plasma obtenido de un paciente con PTT adquirida. Tras la incubación a 37ºC durante 1 hora, se lavó la placa y se añadió a los pocillos anticuerpo de asno anti-Ig humana marcado con HRP (Jackson Laboratories, ME) (1:1000). Tras la incubación durante 1 hora a 37ºC, se lavó la placa y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de sustrato TMB (Moss Inc, MD). Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos y se detuvo la reacción añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 0,45 M. Se midió la absorbancia a 450 nm. La figura 13 muestra que el aumento de absorbancia era linealmente proporcional a la cantidad de plasma añadida que contenía ADAMTS13.
ADAMTS13 (2 \mug/ml) en 100 \mul de tampón MOPS 50 mM pH 6,0. Se lavaron las placas y se bloquearon con Superblock (Pierce, IN). Se diluyó en serie 1:2 una muestra de PNP en tampón y se añadieron 100 \mul a los pocillos de microtitulación. Tras la incubación durante 1 hora a 37ºC, se lavó la placa y se añadieron a los pocillos de microtitulación 0,5 \mug/ml de inmunoglobulina purificada a partir de plasma obtenido de un paciente con PTT adquirida. Tras la incubación a 37ºC durante 1 hora, se lavó la placa y se añadió a los pocillos anticuerpo de asno anti-Ig humana marcado con HRP (Jackson Laboratories, ME) (1:1000). Tras la incubación durante 1 hora a 37ºC, se lavó la placa y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de sustrato TMB (Moss Inc, MD). Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos y se detuvo la reacción añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 0,45 M. Se midió la absorbancia a 450 nm. La figura 13 muestra que el aumento de absorbancia era linealmente proporcional a la cantidad de plasma añadida que contenía ADAMTS13.
En otro experimento, se determinó la cantidad de
proteína ADAMTS13 en 24 muestras de plasma normal usando el
procedimiento de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 14.
Usando PNP como el 100%, la cantidad de ADAMTS13 en 24 muestras de
plasma normal individuales se distribuyó alrededor del valor de PNP.
Puede usarse este procedimiento de ELISA para determinar la
cantidad de ADAMTS13 en plasma y otros líquidos biológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió fluido de cultivo tisular (5 \mul)
de células HEK 293 transfectadas con un vector que codificaba
ADAMTS 13 recombinante o fluido de cultivo tisular (5 \mul) de
células HEK 293 transfectadas de manera simulada a 5 \mug de
anticuerpo de cabra anti-ADAMTS13 (Santa Cruz
Biochemicals, Santa Cruz, CA) y sustrato fluorescente
Suc-LLVY-AMC 0,8 mM en tampón
Tris-HCl 50 mM pH 8,0 (85 \mul). Se siguió la
fluorescencia (Vmáx.) en un lector de placas espectrofluorométrico
a ex. 360 nm/em. 440 nm (figura 15).
El fluido de cultivo con ADAMTS13 tenía más
actividad de fluorescencia que el fluido de cultivo transfectado de
manera simulada. El anticuerpo de cabra anti-ADAMTS
13 inhibió la fluorescencia del fluido con ADAMTS 13 pero no del
fluido de cultivo tisular de células transfectadas de manera
simulada. Estos resultados muestran que la actividad de
fluorescencia del fluido de células transfectadas de manera simulada
no se debe a ADAMTS13.
\vskip1.000000\baselineskip
El plasma de pacientes con PTT adquirida
("plasma de PTT adquirida") contiene un anticuerpo inhibidor
contra ADAMTS13. La figura 16 muestra que la adición de plasma de
PTT a sobrenadante de cultivo tisular que contiene recADAMTS13
inhibía la generación de una señal de fluorescencia cuando se usaba
Suc-LLVY-AMC como sustrato. La
cantidad de inhibición de la señal de fluorescencia dependía de la
cantidad de plasma de PTT añadida. El plasma de sujetos sanos
("plasma normal") no inhibió significativamente la actividad de
ADAMTS13, en comparación con el plasma de PTT adquirida, lo que
demuestra que la actividad de ADAMTS 13 se inhibía específicamente
mediante el plasma de PTT adquirida. Estos estudios muestran también
que los anticuerpos presentes en plasmas de PTT adquirida bloquean
la hidrólisis del sustrato fluorescente
Suc-LLVY-AMC mediante ADAMTS 13
recombinante.
\newpage
Se centrifugó un ml de PRP a 10.000 rpm y se
lavaron las plaquetas en el sedimento con tampón
Tris-HCl 50 mM pH 8,0. Se suspendieron las
plaquetas en 200 \mul de tampón de ensayo. Se añadieron plaquetas
aisladas (20 ul) a 70 \mul de diversos anticuerpos
anti-ADAMTS13 y se incubaron a temperatura ambiente
durante 15 minutos. Se usaron los anticuerpos de cabra G1 y G2
(Santa Cruz Biochemicals, Santa Cruz, CA) a 200 \mug/ml; se usó
el anticuerpo de conejo contra el fragmento
C-terminal de ADAMTS 13 (del Dr. Ginsburg) a 5,5
mg/ml. Se usó inmunoglobulina purificada (Ig) a partir de plasma de
PTT adquirida a una concentración de 4 mg/ml. Se añadieron noventa
\mul de tampón Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y 10 \mul
de LVY-AMC 8 mM y se midió la fluorescencia a lo
largo del tiempo como anteriormente. Los cuatro anticuerpos
específicos anti-ADAMTS13 inhibieron la actividad
de plaquetas normales (figura 17). Estos hallazgos indican que la
actividad en plaquetas se debía a la rotura por ADAMTS 13 del
sustrato LVY-AMC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la detección de autoanticuerpos
anti-ADAMTS13 usando plaquetas aisladas como fuente
de
ADAMTS13. Se incubaron plaquetas aisladas (preparadas a partir de 200 \mul de PRP normal) con 200 \mul de plasma normal combinado (PNP) o plasma de PTT adquirida. Se incubaron las mezclas a 37ºC durante 30 minutos. Se separaron cincuenta \mul de cada mezcla de reacción y se añadieron a 130 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y 20 \mul de sustrato LVY-AMC 8 mM. Se incubaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a 37ºC durante una hora y se controló la fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico (ex. 360 nm/em. 440 nm). Las plaquetas incubadas con plasma normal tenían una señal de fluorescencia alta (indicando una alta actividad de ADAMTS 13), mientras que las plaquetas incubadas con plasma de PTT adquirida tenían una señal de fluorescencia baja (indicando una baja actividad de ADAMTS 13) (figura 18). Estos resultados muestran que estaban presentes autoanticuerpos anti-ADAMTS13 en el plasma de PTT adquirida, pero no en el plasma normal y que los autoanticuerpos en el plasma de un paciente con PTT adquirida pueden detectarse usando este procedimiento. Pueden sustituirse otros sustratos fluorescentes de ADAMTS13 por LVY-AMC. Este procedimiento puede usarse para distinguir entre PTT congénita y PTT adquirida.
ADAMTS13. Se incubaron plaquetas aisladas (preparadas a partir de 200 \mul de PRP normal) con 200 \mul de plasma normal combinado (PNP) o plasma de PTT adquirida. Se incubaron las mezclas a 37ºC durante 30 minutos. Se separaron cincuenta \mul de cada mezcla de reacción y se añadieron a 130 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y 20 \mul de sustrato LVY-AMC 8 mM. Se incubaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a 37ºC durante una hora y se controló la fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico (ex. 360 nm/em. 440 nm). Las plaquetas incubadas con plasma normal tenían una señal de fluorescencia alta (indicando una alta actividad de ADAMTS 13), mientras que las plaquetas incubadas con plasma de PTT adquirida tenían una señal de fluorescencia baja (indicando una baja actividad de ADAMTS 13) (figura 18). Estos resultados muestran que estaban presentes autoanticuerpos anti-ADAMTS13 en el plasma de PTT adquirida, pero no en el plasma normal y que los autoanticuerpos en el plasma de un paciente con PTT adquirida pueden detectarse usando este procedimiento. Pueden sustituirse otros sustratos fluorescentes de ADAMTS13 por LVY-AMC. Este procedimiento puede usarse para distinguir entre PTT congénita y PTT adquirida.
La figura 19 muestra que el nivel de inhibición
de la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas depende de la cantidad de
autoanticuerpos anti-ADAMTS13 usados en el ensayo, y
por tanto de la actividad anti-ADAMTS13. Se diluyó
el plasma de un paciente con PTT adquirida hasta diferentes
cantidades (10%, 20% y 40%) en plasma normal y se incubó con
plaquetas aisladas en un volumen total de 90 \mul durante 15
minutos. Se añadieron diez \mul de sustrato
LVY-AMC 8 mM y se determinó la fluorescencia tras la
incubación a 37ºC durante 1 hora. La inhibición de la actividad de
ADAMTS 13 mediante plasma de PTT dependía de la cantidad de plasma
de PTT usada en el ensayo.
La cantidad de fluorescencia generada a lo largo
del tiempo en el ensayo depende de la cantidad de plaquetas usada
en el ensayo. Tal como se muestra en la figura 20, se generó una
señal fluorescente superior en el control (plasma normal sin
anticuerpos anti-ADAMTS13) usando más plaquetas. La
adición de plasma de PTT adquirida, que contenía anticuerpos frente
a ADAMTS 13, inhibió casi completamente la actividad de ADAMTS13,
independientemente de la cantidad de plaquetas en el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló un ensayo para medir la presencia
de complejos ADAMTS 13/FXI mediante análisis ELISA. Se generó una
curva patrón usando PNP (Saturn Biomedical), diluido 1:4 en tampón
ECD (PBS/BSA al 3%/gentamicina) y luego se diluyó en serie 1:2 en
tampón ECD. Se realizaron los ensayos por duplicado, usando 100
\mul de cada dilución patrón en placas de microtitulación de 96
pocillos Immulon 4 HBX (ThermoLabsystems, Franklin, MA) que se
recubrieron con anticuerpos de cabra anti-ADAMTS13
humana (SC21510; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una
concentración de 1 \mug/ml en tampón de recubrimiento
3-(N-morfolino)propanosulfonato (MOPS) (MOPS
0,1 M, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 0,05 M, trehalosa 0,066 M, NaN_{3}
al 0,02%, pH 7,4). Se bloquearon las placas de microtitulación con
SuperBlock (Pierce Chemical Co., Indianapolis, EN).
Se incubaron los patrones y las muestras
diluidas en micropocillos recubiertos durante 2 horas a temperatura
ambiente, con mezclado. Se lavó entonces la placa cuatro veces con
tampón de lavado (PBS + Tween al 1%, pH 7,4). Se diluyó un
anticuerpo anti-FXI marcado con HRP hasta 1
\mug/ml en suero de cabra normal al 7% en tampón ECD y entonces
se añadieron a cada pocillo 100 \mul del anticuerpo de detección
diluido. Se dejó que el anticuerpo se uniese durante una hora a
temperatura ambiente. Tras la incubación con el anticuerpo de
detección, se lavó la placa cuatro veces en tampón de lavado.
Entonces se añadió a los micropocillos el sustrato de HRP
tetrametilbencidina (TMB-HRP; 100 \mul). Tras 15
minutos, se terminó la reacción con ácido sulfúrico 0,5 N. Entonces
se leyó la densidad óptica de la mezcla en un espectrofotómetro a
450 nm. La curva patrón generada se muestra en la figura 21.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la unión de ADAMTS 13 recombinante a
FXI inmovilizado usando microplacas recubiertas con FXI humano a
una concentración de 1 \mug/ml. Se añadió ADAMTS 13 recombinante
en disolución a los micropocillos recubiertos con FXI y se
incubaron durante 1 hora. Se midieron los complejos ADAMTS13/FXI
usando ELISA. Específicamente, tras la incubación con ADAMTS13
recombinante, se lavaron las placas con PBS + Tween al 1%, seguido
por incubación durante 1 hora con anticuerpos policlonales de
conejo TSP5-7 anti-ADAMTS13 (1
\mug/ml). Se lavaron las placas de nuevo en PBS + Tween al 1%,
seguido por la adición de un anticuerpo murino
anti-IgG de conejo conjugado con HRP. Se incubó el
anticuerpo de detección durante una hora a temperatura ambiente.
Tras lavar el anticuerpo de detección en exceso de las placas, se
añadió el sustrato TMB, se incubó durante 10 minutos, tras lo cual
se añadió ácido sulfúrico 0,5 M para terminar la reacción. Se midió
la densidad óptica de la mezcla a 450 nm en un espectrofotómetro
(figura 22). Los resultados muestran que ADAMTS13 recombinante puede
formar un complejo estable con FXI.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron complejos ADAMTS 13/FXI en plasma de
23 individuos normales y 7 pacientes con PTT adquirida tal como se
describió en el ejemplo 16. La tabla 1 resume los niveles medios de
ADAMTS13/FXI en plasma normal y plasma de PTT. Esto apoya la
conclusión de que la formación de complejos ADAMTS 13/FXI en plasma
normal es superior que en plasma de PTT adquirida.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la formación de complejos en plasma de
pacientes con una deficiencia en FXI congénita usando el ELISA del
ejemplo 16. Los resultados muestran un nivel significativamente
inferior de complejos ADAMTS 13/FXI en plasma deficiente en FXI que
en plasma normal. Tal como muestra la figura 23, la cantidad de
complejos en plasma deficiente en FXI es aproximadamente
equivalente al 2,1% de la cantidad en plasma normal.
Se midió la formación de complejos ADAMTS13/FXI
tras la adición de FXI (Enzyme Research Lab, Canadá) a plasma
deficiente en FXI diluido 1:8 en ECD. Se añadieron diferentes
cantidades de FXI a plasma deficiente en FXI incubado durante 30
minutos para promover la formación de complejos. Se añadió entonces
el plasma que contenía complejos ADAMTS13/FXI recién formados a
micropocillos recubiertos con anticuerpos
anti-ADAMTS 13 y se cuantificaron, tal como se
describió en el ejemplo 16. La figura 24 muestra que se formaron
cantidades crecientes de complejos ADAMTS13/FXI tras la adición de
cantidades crecientes de FXI al plasma deficiente en FXI.
Claims (20)
1. Un procedimiento para detectar complejos
ADAMTS 13/FXI en una muestra que comprende:
- a)
- unir un anticuerpo anti-ADAMTS 13 a una fase sólida;
- b)
- añadir la muestra a la fase sólida, uniéndose los complejos ADAMTS13/FXI presentes en la muestra al anticuerpo;
- c)
- añadir un anticuerpo anti-FXI a la fase sólida, uniéndose el anticuerpo anti-FXI a FXI en complejos ADAMTS 13/FXI; y
- d)
- detectar complejos ADAMTS 13/FXI mediante inmunomarcaje directo o indirecto del anticuerpo anti-FXI.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la muestra se selecciona del grupo constituido por un
líquido biológico, sangre completa, suero, plasma, plasma rico en
plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal
combinado (PNP), plaquetas lavadas y sobrenadante de cultivo
tisular.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la fase sólida es una membrana, una placa, un micropocillo
o una perla.
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante
inmunomarcaje directo del anticuerpo anti-FXI.
5. El procedimiento según la reivindicación 4,
en el que el anticuerpo anti-FXI está marcado con
peroxidasa del rábano.
6. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante
inmunomarcaje indirecto del anticuerpo
anti-FXI.
7. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el anticuerpo anti-FXI se produce en una
primera especie y en el que un anticuerpo marcado producido en una
segunda especie contra anticuerpos de la primera especie se añade a
la fase sólida y se detecta.
8. Un procedimiento para medir la cantidad de
complejos ADAMTS13/FXI en una muestra que comprende el procedimiento
según la reivindicación 1 y que comprende además:
- e)
- cuantificar el anticuerpo anti-FXI unido detectado, midiendo de ese modo la cantidad de complejos ADAMTS 13/FXI en la muestra.
9. Un procedimiento para diagnosticar púrpura
trombocitopénica trombótica (PTT) en un sujeto que comprende
- a)
- medir la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra de prueba del sujeto según el procedimiento según la reivindicación 8; y
- b)
- comparar la cantidad de complejos ADAMTS 13/FXI en la muestra de prueba con la cantidad de complejos ADAMTS13/FXI en una muestra control que tiene una actividad de ADAMTS 13 normal;
en el que se diagnostica PTT mediante una
cantidad reducida de complejos ADAMTS13/FXI en la muestra de prueba
en comparación con la muestra control.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que la muestra de prueba se selecciona del grupo constituido
por sangre completa, suero, plasma, plasma rico en plaquetas (PRP),
plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma normal combinado (PNP) y
plaquetas lavadas.
11. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que la fase sólida es una membrana, una placa, un micropocillo
o una perla.
12. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante
inmunomarcaje directo del anticuerpo anti-FXI.
13. El procedimiento según la reivindicación 12,
en el que el anticuerpo anti-FXI está marcado con
peroxidasa del rábano.
14. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que la detección de complejos ADAMTS13/FXI es mediante
inmunomarcaje indirecto del anticuerpo
anti-FXI.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que el anticuerpo anti-FXI se produce en una
primera especie y en el que un anticuerpo marcado producido en una
segunda especie contra anticuerpos de la primera especie se añade a
la fase sólida y se detecta.
16. Un kit para detectar complejos ADAMTS 13/FXI
en una muestra que comprende:
- (i)
- una fase sólida recubierta con un anticuerpo anti-ADAMTS 13; y
- (ii)
- un anticuerpo anti-FXI.
17. El kit según la reivindicación 16, en el que
el anticuerpo anti-FXI está marcado.
18. El kit según la reivindicación 17, en el que
el anticuerpo frente a FXI está marcado con peroxidasa del
rábano.
19. El kit según la reivindicación 18, que
comprende además un sustrato para la peroxidasa del rábano.
20. El kit según la reivindicación 16, que
comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo
constituido por una muestra patrón, un control positivo y un tampón
de lavado.
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