ES2276951T3 - Nuevos sustratos cromogenos y su utilizacion para la dosificacion de la actividad de carboxipeptidasas. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de fórmula (I) siguiente: en la que: - R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3. - R3 = la cadena lateral de un aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A. - R4 = la cadena lateral de un aminoácido básico.
Description
Nuevos sustratos cromógenos y su utilización
para la dosificación de la actividad de carboxipeptidasas.
La presente invención se refiere a unos
compuestos cromógenos y a su utilización para la dosificación de
enzimas de la familia de las carboxipeptidasas U. Se refiere más
específicamente a la utilización de dichos compuestos para la
dosificación de la actividad del TAFI (Thrombin Activatable
Fibrinolysis Inhibitor) en una muestra sanguínea y al procedimiento
de dosificación correspondiente.
Las carboxipeptidasas (CP) constituyen un grupo
de enzimas en el núcleo de la familia de las exopeptidasas. Son los
enzimas que rompen las uniones amida de las cadenas polipeptídicas a
nivel del último aminoácido COOH-terminal.
Comprenden las serina-carboxipeptidasas, las
cisteína-carboxipeptidasas y las
metalocarboxipeptidasas.
Se han aislado y se han secuenciado numerosas
carboxipeptidasas, en las bacterias, las levaduras y los vegetales.
Dichos enzimas están asimismo presentes en un gran número de tejidos
en los mamíferos.
Se han aislado principalmente unas
carboxipeptidasas a nivel del páncreas y en los mastocitos. Asimismo
se han clonado, aislado y secuenciado otras carboxipeptidasas
circulantes en el plasma.
Todos los enzimas tienen un papel in vivo
dependiendo a la vez de su localización y de sus propiedades
físicas. De este modo las carboxipeptidasas se clasifican de forma
diferente según su especificidad por el sustrato. Las
carboxipeptidasas A tienen un espectro relativamente amplio:
hidrolizan la unión peptídico C-terminal del último
aminoácido preferentemente si es hidrófobo (Phe, Leu, Val, Ala).
Hidrolizan más lentamente los aminoácidos dicarboxílicos (Asp, Glu)
así como la glicina (Gly), y no hidrolizan los aminoácidos básicos
como la arginina (Arg), la lisina (Lys), la histidina (His) o la
ornitina (Orn), un homólogo inferior de la lisina, ni los
aminoácidos secundarios como la prolina (Pro) o la hidroxiprolina
(Hyp).
Las carboxipeptidasas B hidrolizan
específicamente los últimos aminoácidos C-terminales
básicos, como Arg, Lys. Esta clase de enzimas se subdivide en
subclases constituidas por las carboxipeptidasas H (denominadas
asimismo encefalina convertasa o carboxipeptidasa E), M, N y U.
La carboxipeptidasa E se ha localizado en los
gránulos secretores de los islotes pancreáticos, las glándulas
suprarrenales y pituitarias, y el cerebro. La carboxipeptidasa M es
un enzima de membrana presente en numerosos tejidos y células en
cultivo.
La carboxipeptidasa N (denominada algunas veces
a continuación como CPN) es un enzima circulante en el plasma.
Protege el organismo contra el efecto vascoactivo e inflamatoria de
péptidos que contienen un aminoácido C-terminal
básico (preferentemente una lisina), liberados a la circulación.
Este enzima existe en su forma activa en la sangre. También se
denomina cininasa debido a sus sustratos que son la bradicinina, las
cininas, las anafilotoxinas.
Por último, las carboxipeptidasas U (del inglés
unestable, inestable) (denominadas a veces a continuación como CPU)
son unos enzimas que hidrolizan también los aminoácidos
C-terminales básicos, preferentemente las
argininas, pero que contrariamente a las carboxipeptidasas N, son
muy inestables cuando se encuentran en su forma activa.
BOUMA et al. (1) han realizado una
revisión general reciente sobre los enzimas de la familia de las
carboxipeptidasas.
El TAFI es una metalocarboxipeptidasa con zinc
básica (1-4). Es más precisamente una
carboxipeptidasa U, porque su actividad es inestable a una
temperatura de 37ºC. Dicho enzima, cuyo ADNc y la secuencia de
aminoácidos correspondiente en los humanos se describen por ejemplo
en la patente US nº 5.206.161, es una proteína plasmática cuyo
papel en la regulación de la fibrinolisis se ha probado inicialmente
a partir de la observación in vitro de un retraso de la
lisis del coágulo en presencia de TAFI activado.
El TAFI activado divide los residuos arginina y
lisina expuestos en posición COOH-terminal sobre la
fibrina. Esta hidrólisis conduce a una disminución del número de
sitios de fijación del plasminógeno y del tPA en la superficie del
coágulo de fibrina, y por lo tanto una disminución de la
transformación del plasminógeno en plasmina por el tPA.
El TAFI se ha identificado sucesivamente bajo el
nombre de procarboxipeptidasa B (pro-PCPB) después
la procarboxipeptidasa inestable (proCPU: Unestable
ProCarboxypeptidase) y procarboxipeptidasa R (CPR), debido a una
actividad carboxipeptidasa sobre los residuos arginina. La forma
zimógena es una glicoproteína de cadena simple de 60 KDa sintetizada
en el hígado y circulante en plasma.
La división del zimógeno se lleva a cabo
mayoritariamente por la trombina a nivel del sitio arg 92. Dicha
proteolisis libera un péptido N-terminal de 92
aminoácidos que contiene varios sitios de glicosilación. La acción
catalítica de la trombina sobre el TAFI aumenta considerablemente
por la trombomodulina en presencia de iones divalentes. La
velocidad de activación del TAFI catalizada por la trombina aumenta
de esa manera en más de 1.000 veces debido a la formación de un
complejo ternario con la trombomodulina.
El TAFI activado (TAFIa) está constituido por el
dominio catalítico C-terminal del zimógeno y
presenta 309 aminoácidos.
Debido a su papel clave en los mecanismos de
regulación del proceso de la fibrinolisis, se ha probado rápidamente
útil poder medir la cantidad de TAFI activado constitucional y de
TAFI activable presente en el plasma en diferentes estados
patológicos.
Se han descrito en la técnica varios métodos de
dosificación de la actividad de diversas carboxipeptidasas que
utilizan unos sustratos específicos.
De este modo, WOLFF et al. (5) han
comparado los rendimientos de los sustratos sintéticos
Hip-Arg, Hip-Lys,
Hip-Orn sobre las carboxipeptidasas B pancreáticas
purificadas por cromatografía midiendo las diferencias de absorción
en UV.
En 1970, S. SUZUKI et al (6) mejoraron la
detección del producto de hidrólisis derivando la benzoglicina
liberada por el reactivo TT
(2,4,6-tricloro-triacina). Dicha
derivación actuaba específicamente sobre el CH_{2} de la glicina
en \alpha de una función ácido libre únicamente. Dicho derivado
adquiere un color amarillo fuerte (longitud de onda máxima a 382
nm).
Dicho procedimiento de desarrollo de la
coloración amarillo sobre los restos Hipurilo se ha utilizado
ampliamente por diversos autores posteriormente.
En 1972, K. LORENTZ et al. (7) utilizaron
una reacción de coloración de la arginina liberada esta vez por la
acción de las carboxipeptidasas B sobre un sustrato
Hip-Arg utilizando la p-benzoquinona
como reactivo. De este modo, el derivado coloreado presenta una
longitud de onda máxima de 480 nm.
En 1980, Th. H Plummer et al. (8)
utilizaron un sustrato sintético: el
Furilacriloil-Ala-Lys para
cuantificar las carboxipeptidasas N, la lectura se llevaba a cabo a
324 nm (UV próximo pero no visible).
En 1985, G.H. Fisher et al. (9)
utilizaron un sustrato fluorescente por dansilación
N-terminal de un péptido específico de la
carboxipeptidasa que se debe dosificar. Dicha dosificación
necesitaba una etapa de extracción de los productos de hidrólisis
para una buena separación de las especies antes de la lectura.
En 1986, H. SARUTA et al. determinaron
mediante un método colorimétrico, la actividad de la
carboxipeptidasa A (10). Estos utilizaron un enzima específico:
"la hipuricasa" para hidrolizar el derivado hipuricilo obtenido
él mismo por hidrólisis del sustrato
hidroxi-hipuricil-Phg por la CPA.
Dicha reacción se ha revelado finalmente con la
4-aminoantipirina para proporcionar un colorante
quinoneimida absorbente a 505 nm.
En 1998, NAM JOO HONG et al. utilizaron
un sustrato sintético con un análogo de la arginina, la tiarginina
para dosificar las CPB (11).
No obstante, los métodos colorimétricos
descritos anteriormente o bien no se han utilizado nunca para
dosificar específicamente la actividad enzimática de la CPN o CPU,
principalmente el TAFI, o bien presentan determinados
inconvenientes incompatibles con un ensayo de dosificación simple y
eficaz de este tipo de enzima por colorimetría.
De hecho, según los casos considerados:
- -
- o bien la reacción de derivación que desemboca en un producto coloreado no es específica de las especies liberadas en el momento de la hidrólisis,
- -
- o bien los reactivos de derivación son muy tóxicos y no se pueden utilizar a escala industrial,
- -
- o bien el procedimiento de revelado coloreado es muy largo y restrictivo y de se puede automatizar fácilmente.
En 1996, W.L. Mock et al. describieron un
procedimiento de dosificación de una endoproteasa de zinc
extracelular de origen bacteriano, la termolisina, con la ayuda de
sustratos sintéticos que se destiñen bajo la acción de la
hidrólisis enzimática (12). Para ello, los autores han sintetizado
unos compuestos dipeptídicos constituidos por un residuo leucina
que presenta un grupo N-(4-metoxifenilazoformil)
implantado a nivel de la función amina, y de otro aminoácido neutro
(Leu, Ala, Phe o Gly).
La incorporación del grupo arazoformilo da lugar
a un compuesto altamente coloreado. En presencia de la termolisina,
la molécula de colorante se reajusta durante la reacción química de
hidrólisis según un mecanismo bien descrito en
(12-13), dando lugar a unos productos no coloreados
(fragmento anizol, N_{2}, CO_{2} y aminoácido). Resulta por lo
tanto fácil seguir la velocidad del enzima a través de la velocidad
de decoloración del medio.
Los mismos autores han descrito asimismo un
método cinético de dosificación por espectrofotometría basado en el
mismo principio que el anterior para la carboxipeptidasa A (13) y la
carboxipeptidasa B porcina pancreática (14).
En este caso, los compuestos utilizados estaban
constituidos por un solo aminoácido conocido para ser dividido por
la carboxipeptidasa A (Phe, Leu) o la carboxipeptidasa B (Lys), que
presenta un grupo N-arazoformilo. La división
enzimática de dichos compuestos en productos no coloreados, se ha
seguido mediante la medición de la disminución de coloración del
medio.
Partiendo de estos descubrimientos, los autores
de la presente invención han sintetizado nuevos compuestos
coloreados para dosificar mediante un procedimiento colorimétrico la
actividad de las carboxipeptidasas U, y más particularmente, la
actividad del TAFI.
Según un primer aspecto, la presente invención
tiene por lo tanto como objetivo unos nuevos compuestos, que
constituyen unos sustratos de carboxipeptidasa U, y más
particularmente de los sustratos del TAFI activado. Dichos
compuestos son unos sustratos cromógenos.
Los compuestos de la invención se caracterizan
porque se trata de unos compuestos arazoformilo de fórmula general
(I) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- R1, R2 = H, -CH_{3}, -CH(CH_{3})_{2}, -OCH_{3}, -Cl, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}.
- -
- R_{3} = la cadena lateral de un aminoácido hidrolizable (o un radical de aminoácido hidrolizable) por una carboxipeptidasa A.
- -
- R_{4} = un radical de aminoácido básico.
Más particularmente, R_{3} se selecciona de
entre los radicales de aminoácidos hidrófobos como:
- -
- la tirosina
- -
- la fenilalanina
- -
- la alanina: R_{3} = -CH_{3}
- -
- la valina: R_{3} = -CH-(CH_{3})_{2}
- -
- la leucina: R_{3} = -CH_{2}-CH-(CH_{3})_{2}
- -
- la isoleucina:
R_{3} = --
\delm{C}{\delm{\para}{ \hskip-0.14cm CH _{3} }}H
-- CH_{2} --
CH_{3}
- -
- la fenilglicina
R4 se selecciona más precisamente de entre los
radicales de aminoácidos como:
- -
- la arginina
- -
- la lisina (R_{4} = -(CH_{2})_{4}-NH_{2})
- -
- la ornitina R_{4} = -(CH_{2})_{3}-NH_{2}
Preferentemente, R_{3} representa un resto de
un aminoácido aromático y en particular la fenilalanina o la
tirosina, y R4 la arginina y la lisina.
R_{1} se selecciona preferentemente de
entre:
- -H y -CH_{3}, y,
R_{2} se selecciona preferentemente de
entre:
- -CH3, -O-CH_{3} y S-CH_{3}.
Una familia preferida de compuestos según la
invención está representada por la fórmula general:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- R_{1}, R_{2} = -H, -CH_{3}, (CH_{3})_{2} CH-, -CH_{3}-O, -Cl, -CF_{3}
- -
- R_{3} = un radical aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A.
- -
- R_{4} = un radical de aminoácido básico.
R3 representa preferentemente la fenilalanina, o
la tirosina y,
R4 representa preferentemente la arginina o la
lisina.
R_{1} se selecciona preferentemente de
entre:
- -
- -H y -CH_{3}, y,
R_{2} se selecciona preferentemente de
entre:
- -CH3, -O-CH_{3} y S-CH_{3}.
Un compuesto particularmente preferido de la
familia de la presente invención es un compuesto de fórmula (I) en
la que:
dicho compuesto se selecciona de
entre el grupo constituido por los compuestos siguientes, en los
que:
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\vskip1.000000\baselineskip
* los números entre paréntesis determinan la
posición de los grupos metilo sobre el radical fenilo.
La invención se refiere en particular, en el
marco de las definiciones proporcionadas anteriormente, a cada
compuesto que responde a la fórmula (I) y que resulta de las
combinaciones posibles de los grupos A, R1, R2, R3 y R4 de los
cuales se ha proporcionado una definición preferida
anteriormente.
A continuación, los compuestos definidos de este
modo se denominarán indiferentemente "compuestos de la fórmula
(I)" o "sustratos de fórmula (I)".
Según un segundo aspecto, la presente invención
tiene como objetivo un procedimiento de dosificación colorimétrica
de la actividad de una carboxipeptidasa CPU, en una muestra
biológica en la que:
- -
- se pone en contacto dicha muestra con un compuesto cromógeno de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, y un enzima de la familia de las carboxipeptidasas A, en unas condiciones que permiten la hidrólisis de la muestra, y
- -
- se determina la hidrólisis de dicho compuesto de la fórmula (I) mediante la CPU de la muestra mediante la medición de la disminución de su coloración (correspondiente a una disminución de la absorción) a una longitud de onda seleccionada a partir del espectro de absorción de dicho compuesto.
La disminución de la coloración resulta de la
doble hidrólisis del sustrato de fórmula (I) por las
carboxipeptidasas U de la muestra por una parte, por la
carboxipeptidasa A por otra parte.
El procedimiento según la presente invención se
realiza preferentemente con la ayuda de un compuesto de fórmula (I)
en el que el aminoácido hidrófobo es la fenilalanina o
preferentemente la tirosina, y el aminoácido básico es la arginina
o la lisina.
El procedimiento de la invención se realiza
preferentemente con la ayuda de un compuesto de fórmula (I) en el
que R_{1} se selecciona de entre -H y-CH_{3} y
R_{2} de entre -CH_{3}, -O-CH_{3} y
-S-CH_{3}. Ventajosamente, cuando en el compuesto
de la fórmula (I), R_{1} es H, R_{2} es
S-CH_{3}.
El procedimiento de la presente invención se
realiza ventajosamente con la familia de compuestos de la fórmula
(I) en la que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R_{1} y R_{2} presentan una de las
significaciones descritas anteriormente y R_{2} es preferentemente
-S-CH_{3}. Más particularmente el compuesto de
fórmula (I) utilizado es un compuesto fenilazoformilo en el
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
dicho compuesto se selecciona de
entre el grupo constituido por los compuestos siguientes, en los
que:
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Los números entre paréntesis determinan la
posición de los grupos metilo sobre el radical fenilo.
La carboxipeptidasa A utilizada puede proceder
de diferentes fuentes, como, por ejemplo, el páncreas o unas
células mastocitarias. Puede ser de origen humano o animal.
Se utiliza preferentemente en el marco de la
invención de la carboxipeptidasa A pancreática de origen bovino.
El principio del procedimiento de la invención
se basa en la hidrólisis de un sustrato coloreado de fórmula (I)
como se ha descrito anteriormente, mediante la acción de la
carboxipeptidasa U eventualmente presente en una muestra analizada,
asociada a la de la carboxipeptidasa A añadida al medio. Dicha
hidrólisis específica conduce a una extinción de la coloración del
compuesto de partida que se puede seguir con la ayuda de un
espectrofotómetro.
Más precisamente, teniendo en cuenta unas
especificidades de hidrólisis de las carboxipeptidasas N o U y A
expuestas anteriormente, y unas características estructurales de los
compuestos de la fórmula (I) descritos anteriormente, el contacto
de una carboxipeptidasa A y de una carboxipeptidasa U activada con
un compuesto tal va a generar un corte a nivel de la unión entre el
primer y el segundo aminoácido de dicho compuesto debido a la
acción de la carboxipeptidasa U, seguida casi simultáneamente por un
corte a nivel de la unión entre el grupo azaformilo y el primer
aminoácido, debido a la acción de la carboxipeptidasa A.
La resultante de dichas dos reacciones será una
decoloración del medio de partida. Será por lo tanto fácil seguir
dicha disminución de coloración, en función del tiempo, colocándose
a una longitud de onda de absorción del colorante [compuesto
fórmula (I)], preferentemente a la longitud de onda correspondiente
a su máximo (pico) de absorción.
Dicha disminución es representativa de la
cinética de la hidrólisis. La cantidad de carboxipeptidasa U activa
presente inicialmente en la muestra se calcula comparando la
densidad óptica medida con la de una curva de calibrado que se
puede establecer por ejemplo a partir de una escala de
concentraciones de carboxipeptidasa U purificada activa en
solución.
Inversamente, si la muestra no contiene
carboxipeptidasa U o si ésta es inactiva, no se producirá un corte
entre el primer y el segundo aminoácido del compuesto de fórmula
(I), y por lo tanto, la carboxipeptidasa A no podrá reaccionar a
nivel de la unión del grupo coloreado sobre el primer aminoácido.
Por ello, no se observará disminución de la coloración de la
solución de partida.
La invención se refiere más particularmente a un
procedimiento de dosificación de la actividad de una CPU en una
muestra biológica, principalmente una muestra sanguínea como sangre
total o del plasma puro o diluido, y preferentemente, un
procedimiento de dosificación de la actividad del TAFI en una
muestra sanguínea, principalmente del plasma puro o diluido.
En este caso, la muestra que se debe ensayar se
pone en principio en presencia de una solución tampón con, si es
necesario, un activador de la carboxipeptidasa del que deseamos
medir la actividad (solución denominada tampón activador a
continuación), y se deja en incubación, el tiempo necesario para
obtener la activación de la carboxipeptidasa estudiada. La
incubación se realiza preferentemente a una temperatura ambiente
durante 5 a 20 minutos, ventajosamente de 8 a 12 minutos,
preferentemente 10 minutos.
Según una forma de realización preferida de la
invención, el activador de carboxipeptidasa puede ser un activador,
principalmente un factor de la coagulación, que se deja actuar de
modo que activa la carboxipeptidasa U, en particular el TAFI.
En este caso, se añade a continuación en la
mezcla un inhibidor de las serinaproteasas para dar lugar a un
bloqueo del proceso de coagulación. El inhibidor de las
serinaproteasas es por ejemplo el PPACK
(H-D-Phe-Pro-Arg-cloro-metilcetona-Bachem-Ref.
N. 1065) utilizado en una escala de concentración final de 1 a 50
\muM, preferentemente de 30 \muM, que corresponde a unas
concentraciones iniciales de 10 a 250 \muM y preferentemente 150
\muM. Otros compuestos, como el Péfabloc
[4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluorohipocloruro-Pentapharm-Réf.
399.01]. utilizado preferentemente a una concentración de 0,1 mM
resultan también convenientes.
Simultáneamente o inmediatamente después de la
adición del inhibidor, se añade uno de los compuestos de fórmula
(I) según la invención en solución acuosa. Dicho compuesto se
utiliza en general a una escala de concentraciones finales
comprendidas entre 0,25 y 10 mM, preferentemente entre 0,25 y 2,5
mM, ventajosamente entre 0,25 y 1 mM. Se utiliza preferentemente a
0,4 mM.
Después de una nueva fase de incubación,
preferentemente a temperatura ambiente, durante la cual el sustrato
de la fórmula (I) se habrá cortado a nivel de su segundo aminoácido
por la CPU de la muestra cuya actividad investigamos, se puede
parar la hidrólisis mediante adición de HClL, seguida inmediatamente
por la adición de un base para reajustar el pH a un valor
comprendido entre 7 y 8.
La densidad óptica de la mezcla obtenida de este
modo se mide entonces una primera vez sin adición de CPA al medio.
La CPA se añade a continuación al medio, y se mide de nuevo la DO.
Su disminución se puede seguir al espectrofotómetro. Traduce la
hidrólisis del sustrato de fórmula (I) mediante la acción conjunta
de la CPU de la muestra y de la CPA.
Las delta DO (\Delta DO) medidas se comparan
con los valores presentados en una curva de calibrado que se puede
obtener por ejemplo a partir de una muestra deficiente en la CPU
estudiada, sobrecargada con un enzima purificado.
El protocolo descrito anteriormente constituye
una forma de realización preferida de la invención. Sin embargo, se
pueden considerar diversas variantes del mismo, tanto en lo que se
refiere a las secuencias de adición de los diferentes compuestos
utilizados, como a la naturaleza de dichos compuestos. Entran
igualmente en la definición de la presente invención.
De este modo, por ejemplo es fácil incorporar el
sustrato de la fórmula (1) desde el principio del procedimiento, al
mismo tiempo que el tampón activador de la coagulación.
Asimismo, se puede realizar la dosificación a
partir de dos alícuotas del mismo medio de reacción, de los que uno
sólo se trata con la CPA. A continuación se mide la \Delta DO
entre dichas dos alícuotas.
En el caso en el que tampón activador activa la
coagulación, la activación se puede llevar a cabo según diferentes
vías conocidas por el experto en la materia, y utilizadas de forma
rutinaria en los ensayos de coagulación.
Dichas vías de activación son
principalmente:
- -
- la vía de activación por el complejo trombina/trombomodulina. Esta primera posibilidad constituye una forma de realización preferida de la presente invención.
- -
- la vía de activación por el factor XI activado, que en este caso sustituye a la trombina en el tampón activador. Para acelerar la reacción, se puede añadir de nuevo ventajosamente trombomodulina al medio.
- -
- la vía de activación por unos venenos, principalmente unos venenos de serpiente, asimismo con la adición eventual de protrombina y/o trombomodulina en el medio. Los venenos preferentemente utilizados son los venenos de la familia de las "thrombin-like" como el veneno de Arkistrodon rhodostoma o de Bathrops atrox, así como los venenos de activadores de protrombina, como los de Notechis scutatus o de Echis carinatus (15-18).
- -
- la vía de activación por el factor tisular, en presencia de fosfolípidos y de calcio (activación de la vía exógena según el principio de un tiempo de Quick),
- -
- la vía de activación de la fase de contacto,
- -
- la vía de activación por la plasmina.
Ventajosamente, el procedimiento según la
invención permite medir para una misma muestra, por una parte la
actividad de la CPU "constitucional" presente en la mismo, es
decir la CPU presente en forma activa "naturalmente" (es
decir, sin inducción de la activación por un tampón activador), y
por otra parte, la actividad de la CPU activable, es decir la CPU
presente en la muestra en forma inactiva, cuya actividad será
inducida o generada durante el proceso de activación ligado al
efecto del tampón activador.
Para ello, se compara la actividad de hidrólisis
sobre un sustrato de fórmula (I) de una muestra según el
procedimiento descrito anteriormente, poniendo la muestra o bien en
presencia de tampón activador (detección de la actividad total de
la CPU en la muestra), o bien en presencia de un tampón fisiológico
sin activador (detección de la actividad de la CPU
constitucional).
La diferencia de delta de DO entre las dos
medidas permite obtener la actividad de la CPU activable presente
en la muestra.
Según una variante preferida, la presente
invención tiene como objetivo un procedimiento de dosificación del
TAFI activado en una muestra biológica, principalmente una muestra
sanguínea, utilizando dicho procedimiento uno de los compuestos o
sustratos de la fórmula (I) descritos anteriormente.
La actividad del TAFI constitucional y/o
activable se mide tratando la muestra tal como se acaba de
describir, en presencia o en ausencia de un inhibidor específico
del TAFI.
El inhibidor que se utiliza preferentemente es
el CPI ("Carboxypeptidase Inhibitor from Potato Tubers") cuya
utilización en unos estudios in vitro e in vivo sobre
la función del TAFI ha sido ampliamente descrita en la literatura
(Ref. 1). Hoy en día es bien sabido por el experto en la materia que
la CPI inhibe específicamente el TAFI sin alterar la actividad de
otras CP plasmáticas. En el marco del procedimiento de la invención,
la CPI se puede utilizar en una escala de concentraciones
comprendida entre 0,10 y 0,50 mM (concentraciones iniciales) o de 2
a 10 \muM expresadas en concentraciones finales. Se utiliza
preferentemente a 7 \muM (concentración final) ó 0,38 mM
(concentración
inicial).
inicial).
Según el principio de esta variante preferida,
la muestra se activa por el tampón de activación del TAFI, por
ejemplo un tampón de activación de la coagulación por el complejo
trombina/trombomodulina, y se trata según el procedimiento descrito
anteriormente o bien en presencia o bien en ausencia del inhibidor
del TAFI.
La diferencia de coloración del medio con y sin
inhibidor del TAFI permite de esta manera determinar la actividad
enzimática propia del TAFI activado (TAFIa) en la muestra.
Más precisamente, el procedimiento de la
invención se puede realizar según el protocolo siguiente: la muestra
a ensayar se divide en 2 alícuotas o más si es necesario, según se
desee determinar la actividad de todo el TAFI contenido en la
muestra o bien se desee hacer la distinción entre la actividad del
TAFI constitucional y la del TAFI activable.
- -
- Una primera alícuota que contiene el inhibidor del TAFI se activa y se trata según el procedimiento descrito anteriormente. Éste por lo tanto sólo va a generar una coloración débil del medio, que resulta de una hidrólisis residual del sustrato de la fórmula (I) por acción de otras carboxipeptidasas presentes en la muestra.
- -
- Una segunda alícuota se trata de forma idéntica a la anterior, pero en ausencia del inhibidor del TAFI. Resultará de ello una fuerte decoloración del medio, ligada a la hidrólisis del sustrato de fórmula (I) por el TAFI activado en la muestra.
- -
- Se mide la diferencia de coloración (\Delta DO) entre la primera y la segunda alícuota.
Ésta es por lo tanto representativa de la
actividad específica del TAFI activado en la muestra.
Si se desea distinguir entre la actividad
específica del TAFI activable y la del TAFI constitucional, se
utiliza una tercera alícuota de la misma muestra de la que se mide
también la actividad de hidrólisis sobre el sustrato de la fórmula
(I), pero en el que no se habrá desencadenado la activación, sin
añadir tampón activador en el medio.
Las \Delta DO entre estas diferentes alícuotas
permiten obtener o bien la actividad del TAFI total de la muestra,
o bien la del único TAFI constitucional y por lo tanto deducir la
del TAFI activable.
Según un tercer aspecto, la invención tiene como
objetivo un equipo de diagnóstico para la dosificación de una CPU,
dicho equipo de diagnóstico que comprende un sustrato de fórmula (I)
como se ha definido anteriormente.
Preferentemente, el equipo de diagnóstico según
la presente invención es un equipo para medir la actividad del TAFI
en una muestra sanguínea.
Dicho equipo de diagnóstico comprende
principalmente:
- -
- un activador del TAFI, principalmente un tampón activador del TAFI,
- -
- carboxipeptidasa A,
- -
- un sustrato de fórmula (I),
- -
- un inhibidor del TAFI.
El equipo comprende asimismo opcionalmente un
inhibidor de las serinaproteasas.
Cada uno de estos componentes se presenta
preferentemente en polvo o en forma liofilizada.
Los ejemplos y las figuras siguientes ilustran
la presente invención.
Figura 1: espectro de absorción de los
diferentes componentes de la fórmula (1) sintetizados, medidos con
un espectrofotómetro UV-visible.
Figura 2: análisis del AAFFR efectuado por
hidrólisis ácida.
Figura 3: curva de calibrado establecida a
partir de un plasma deficiente en TAFI, sobrecargado del TAFI
purificado para obtener una escala de concentración que varía desde
0 a 26 \mug/ml.
Figura 4: curva de calibrado para una escala de
concentración, obtenido a partir de un plasma pool. La calibración
se lleva a cabo en procedimiento de generación de trombina. La
dosificación colorimétrica se realiza sobre el sustrato cromógeno
4-MTPAFYR.
La tabla I siguiente indica las fórmulas
químicas de 8 de los compuestos preferidos de entre los compuestos
de fórmula (I) según la invención. Sus espectros de absorción
medidos con un espectrofotómetro UV-visible
(UVIKON-KONTRON) se presentan en la figura 1.
Se describe a continuación con detalle la
síntesis de uno de ellos, el compuesto nº 4 (MxPAFFR).
Las etapas descritas a continuación para dicho compuesto son
idénticas para cada uno de los otros, excepto para el compuesto nº
5 (MxPAFFK) para el que es necesaria una etapa complementaria de
desprotección de la lisina (ver esquema de reacción y las
explicaciones siguientes).
Introducción: Todas las etapas descritas
a continuación son idénticas para cada colorante. Cada etapa se
sigue mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución y por
análisis de los aminoácidos para los acoplamientos con la
Fenilalanina y la Arginina.
\newpage
1ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Preparar 1 eq. de
4-bromoanisol y 1 eq. de magnesio. Introducir el
magnesio y 20% en masa del 4-bromoanisol en una
botella de vidrio de tres cuellos, resuspender en tetrahidrofurano
anhidra (2 ml/mmol) y colocar el montaje bajo nitrógeno. Iniciar la
reacción calentando el recipiente de vidrio de tres cuellos en un
punto con un decapador térmico, el medio de reacción se vuelve
marrón. Cuando la reacción se inicia (efervescencia en la
superficie del magnesio), colocar a reflujo a una temperatura de
90ºC después adicionar lentamente el resto del
4-bromoanisol resuspendido en el THF anhidra (2
ml/mmol). Parar el reflujo después de 1 hora. El bromuro de
4-metoxifenilmagnesio se utiliza tal cual para la
etapa siguiente (color marrón).
Advertencia: El vidrio y el magnesio se
calientan anteriormente en la estufa a una temperatura de 120ºC y
los otros productos en el desecador.
Tiempo de reacción: El reactivo de Grignard es
un compuesto muy inestable y sensible al agua, se obtienen por lo
tanto tres tiempos de retención característicos de los productos de
degradación formados en el momento del análisis HPLC:
Tiempo de retención 1: 2,68 min
Tiempo de retención 2: 3,32 min
Tiempo de retención 3: 5,38 min
2ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender a partes
iguales 1 eq. de
di-t-butilazodicarboxilato y 1 eq.
de bromuro de 4-metoxifenilmagnesio (reactivo de
Grignard) en THF anhidra (2 ml/mmol). Enfriar cada uno entre
0-5ºC. Añadir el reactivo de Grignard sobre el
di-t-butilazodicarboxilato. Agitar
durante 10 min., añadir 1,02 eq. de ácido acético después dejar
calentar a temperatura ambiente. Efectuar una extracción agua/éter.
Secar la fase etérea, evaporar en seco. Se obtiene un aceite de
color amarillo.
Tiempo de retención: 7,85 min
3ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender 1 eq. de
N,N’-bis-(t-butoxicarbonil)-4-(metoxi)
fenilhidracina en el isopropanol (10,2 ml/mmol) después añadir HCl
en el dioxano 4,8 M (2 ml/mmol). Llevar a reflujo (80ºC). Después de
15 min., enfriar, añadir el éter (5 ml/mmol). El 4-(metoxi)
fenilhidracina clorhidrato precipita. Filtrar y secar. Resuspender
el polvo en agua y después llevar a pH 7. Efectuar una extracción
agua/diclorometano y evaporar la fase diclorometano en seco. Se
obtiene la 4-(metoxi) fenilhidracina (polvo de color amarillo) que
se seca.
Tiempo de retención: 2,20 min.
4ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender 1,4 eq.
difenilcarbonato en el benceno (0,25 ml/mmol) y llevar a reflujo a
una temperatura de 120ºC. Añadir lentamente 1 eq. de 4-(metoxi)
fenilhidracina resuspendida en benceno (0,7 ml/mmol). Parar el
reflujo después de 6 horas. Concentrar el medio de reacción después
efectuar una cristalización hexano/benceno (4/1). Filtrar y secar
los cristales blanquecinos en el desecador.
Tiempo de retención: 6,74 min.
5ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Llevar a reflujo (95ºC)
1,2 eq. de sal de trietilamonio de la fenilalanina resuspendidos en
dimetilformamida (3,33 ml/mmol). Añadir lentamente 1 eq. de
4-(metoxi) fenilhidrazoformiato resuspendido en dimetilformamida (2
ml/mmol). Parar el reflujo después de 1h30, dejar volver a
temperatura ambiente, concentrar. Acidificar (pH = 2). Purificar
por cromatografía (cristales blanquecinos).
Tiempo de retención: 6,12 min.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
6ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender 1 eq. de
N-(4-metoxifenilhidrazoformil)-L-fenilalanina
en agua ultrapura (20,8 ml/mmol) que contiene 1 eq. de hdróxido
sódico y 1 eq. de acetato de amonio. Añadir 1 eq. de metaperiodato
de sodio resuspendido en el agua ultrapura (4,2 ml/mmol). Después de
20 min. el medio de reacción se acidifica (pH = 2) después se
purifica por cromatografía (cristales naranja).
Tiempo de retención: 6,86 min.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
7ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender 1 eq. de
Argininametiléster, clorhidrato en la dimetilformamida (3 ml/mmol).
Añadir 1,1 eq. de DIAE (Diisopropiletilamina), 1 eq. de
N-(4-metoxifenilazoformil)-L-fenilalanina
después 1,1 eq. de TBTU
(O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio
tetrafluoroborato). Añadir la cantidad necesaria de DIAE para
obtener un pH de 7-8. Después de 5 min., evaporar en
seco y purificar por cromatografía (cristales naranja).
Tiempo de retención: 6,06 min.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
8ª etapa
Esquema de
reacción
Modo operativo: Resuspender 1 eq. de
N-(4-metoxifenilazoformil)-L-fenilalaninargininametiléster
en una mezcla de agua/etanol (Proporción ½; 3 ml/mmol). Añadir 3
eq. de hidróxido sódico 1N. Después de 1 h, acidificar el MR,
concentrar y después efectuar una extracción agua/diclorometano. La
fase de diclorometano se evapora y después se seca. Se obtiene
N-(4-metoxifenilazoformil)-L-fenilalanilarginina
que es un polvo de color naranja.
Tiempo de retención: 5,5 min.
Se realiza un análisis del aminoácido del
producto final después de una hidrólisis ácida para controlar la
homogeneidad de la secuencia. Los resultados de este análisis se
presentan en el cromatograma de la figura 2.
Condiciones analíticas:
- \ding{226}
- Cadena HPLC AAA: Derivación precolumna al PITC (fenilisocianato)
- \ding{226}
- Columna C18; 100 A; 5 \mu; 250 x 4,6 mm
- \ding{226}
- Detección a 254 nm; Velocidad = 1 mL/min.
- \ding{226}
- Eluyentes:
- A: Tampón acetato pH 5,74
- B: Tampón 70% CH_{3}CN, 30% AcONa; 32 mM; pH = 6,10
- C: CH_{3}CN
Los protocolos de síntesis para los otros
compuestos se basan en las mismas etapas que las que acaban de ser
descritas anteriormente. Estos se resumen en los esquemas de
reacción siguientes.
Los tiempos de retención obtenidos de cada etapa
de síntesis de estos compuestos se presentan en la tabla II
siguiente:
Condiciones analíticas:
- \ding{226}
- Columna C18; 5 \mu; 100 x 4,6 mm
- \ding{226}
- Detección a 254 nm; Velocidad = 1 ml/min.
- \ding{226}
- Gradiente: 0' \rightarrow 10%B 10' \rightarrow 90% B
- \ding{226}
- Con A: agua al 0,1% de ácido trifluoroacético
- B: Acetonitrilo al 0,1% de ácido trifluoroacético
1ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
2ª etapa
3ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
4ª etapa
\newpage
5ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
6ª etapa
\newpage
7ª etapa
8ª etapa
1ª etapa
2ª etapa
3ª etapa
\newpage
4ª etapa
5ª etapa
\newpage
6ª etapa
7ª etapa
8ª etapa
1ª etapa
2ª etapa
3ª etapa
4ª etapa
5ª etapa
\newpage
6ª etapa
7ª etapa
\newpage
8ª etapa
1ª etapa
\newpage
2ª etapa
3ª etapa
4ª etapa
5ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
6ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
7ª etapa
8ª etapa
9ª etapa
Este compuesto particular necesita una etapa
complementaria para desproteger la cadena lateral de la lisina
(\varepsilon-Boc:
N-\varepsilon-tertiobutoxicarbonilo).
Modo operativo: Resuspender 1 eq. de
N-(4-metoxifenilazoformil)-L-fenilalanil-L-lisina
(\varepsilon-Boc) en diclorometano (3 ml/mmol) en
un recipiente. Colocar bajo agitación. Conectar una ampolla de bromo
que contiene el ácido trifluoroacético (3 ml/mmol). Adicionar
lentamente (gota a gota). Después de 15 min, concentrar el medio de
reacción y purificarlo por cromatografía líquida de alta resolución.
Se obtiene al final un polvo de color anaranjado.
1ª etapa
Esquema de
reacción
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2ª etapa
Esquema de
reacción
\vskip1.000000\baselineskip
3ª etapa
Esquema de
reacción
\newpage
4ª etapa
Esquema de
reacción
\vskip1.000000\baselineskip
5ª etapa
Esquema de
reacción
\newpage
6ª etapa
Esquema de
reacción
7ª etapa
Esquema de
reacción
\newpage
8ª etapa
Esquema de
reacción
1ª etapa
Esquema de
reacción
\newpage
2ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de
reacción
3ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de
reacción
\newpage
4ª etapa
Esquema de
reacción
5ª etapa
Esquema de
reacción
\newpage
6ª etapa
Esquema de
reacción
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
7ª etapa
Esquema de
reacción
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
8ª etapa
Esquema de
reacción
1ª etapa
2ª etapa
3ª etapa
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4ª etapa
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5ª etapa
\newpage
6ª etapa
7ª etapa
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8ª etapa
1ª etapa
2ª etapa
3ª etapa
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4ª etapa
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5ª etapa
\newpage
6ª etapa
7ª etapa
\newpage
8ª etapa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de plasma ensayada se divide en dos
alícuotas, a una se le añade PIC (Calbiochem-Ref.
217359), la otra tampón Hepes.
Las dos alícuotas se tratan a continuación de
forma idéntica según el principio siguiente:
Activación del TAFI
- 150 \mul de plasma diluido al 1/20 en tampón Hepes (o TAFI purificado a 13 \mug/ml en tampón hepes).
- 10 \mul PIC o H2O
- 5 minutos a temperatura ambiente
- 150 \mul de tampón activador de la coagulación
- 10 minutos a temperatura ambiente
- 100 \mul PPACK + 100 \mul MxPAFFR (sustrato) (5 mM)
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de actividad del TAFI
- 30 minutos a temperatura ambiente
- 100 \mul HCl 1M + 100 \mul NaOH 1M
- Revelado
- Dilución al 1/3 en tampón Hepes
- Lectura de la DO a 382 nm
- 25 \mul Carboxipeptidasa A
- Lectura de la DO a 382 nm durante1 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes posibles del primer modo
operativo:
- -
- se puede efectuar la dosificación a una temperatura de 37ºC
- -
- el sustrato se puede incorporar desde el inicio, al mismo tiempo que el tampón activador
- -
- la lectura se puede hacer mediante HPLC
\vskip1.000000\baselineskip
Concentraciones finales preferidas de los
diferentes productos
- -
- PPACK: H-D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona PM = 451 30 \muM (Bachem-Ref. N. 1065)
- -
- Pefabloc: se puede utilizar en lugar de PPACK: 0,1 mM (Pentapharm-Ref. 399.01)
- -
- Sustrato (MxPAFFR): 1 mM
- -
- Carboxipeptidasa A: origen páncreas bovino (Sigma-Ref. C 0386)
- Frasco de 5,1 ml de 5.000 unidades, 21 mg prot/ml, 47 unidades/mg proteína
- La CPA se filtra con un prefiltro, filtro 5 \mum y filtro 0,45 \mum, para ello se añaden ml H2O.
- -
- PIC utilizado a 7 \muM
- 1 mg de PCI para inhibir aproximadamente 8 mg de TAFI (50 U/mg) al 50% según indicaciones del proveedor (Calbiochem).
La concentración de 30 \muM de PPACK
correspondería a una concentración inicial de 150 \muM. La
concentración final del 1 mM de sustrato correspondería a una
concentración inicial de 5 mM. La concentración final de 7 \muM
de CPI correspondería a una concentración inicial de 0,38 mM.
Los inventores han observado que las
concentraciones indicadas anteriormente se pueden modificar para
utilizar una concentración final de PPACK disminuida hasta 4 \muM
y una concentración final en sustrato disminuida.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón activador:
- \bullet
- La vía de activación preferida de la coagulación en el marco de la presente invención es la vía de activación por el complejo trombina/trombomodulina. En este caso, el tampón activador utilizado comprende los constituyentes siguientes:
- 37 \mul de trombomodulina de 0 a 80 nM y preferentemente a 10 nM (Rabbit lung thrombomodulin-American Diagnostica-Ref. 237)
- 6 \mul de trombina de 0,2 a 10 NIH/ml y preferentemente a 0,8 NIH/ml (Diagnostica Stago-Producto de investigación)
- 750 \mul de cloruro cálcico de 0 a 80 nm y preferentemente a 40 nM
- 705 \mul de tampón Hepes 9,4 mM pH= 7,6.
Las concentraciones se proporcionan para un
volumen final de 1.498 \mul de tampón activador.
N.B: el tampón hepes contiene: Hepes 20 mM, KCl
4 mM y BSA al 1%, se han realizado otros ensayos con Hepes 20 mM y
NaCl 150 mM.
- \bullet
- Como se ha indicado en la descripción, otras vías de activación son posibles de las que principalmente la vía de activación del factor XIa.
En este caso un ejemplo de tampón activador
contiene los constituyentes siguientes:
- 5 \mul de trombomodulina a 30 U/ml
- 30 \mul de factor XIa puro (Calbiochem-Ref. 233483).
- 88 \mul de tampón Hepes pH= 7,4 (Hepes 20 mM y NaCl 150 mM).
Las concentraciones se proporcionan a modo de
ejemplo y el experto en la materia los puede reajustar.
Otra vía de activación de la coagulación hace
intervenir la trombina y requiere la utilización de un activador de
la fase de contacto.
La figura 3 siguiente representa una curva de
calibrado establecida a partir de un plasma deficiente en TAFI
sobrecargado con TAFI purificado para obtener una escala de
concentración de TAFI que varia desde 0 a 26 \mug/ml.
El compuesto de la fórmula I utilizado es el
MxPAAFR a una concentración de 5 mM.
Las \Delta DO medidas según el procedimiento
de la invención se presentan en la tabla III siguiente:
Como se puede apreciar en la Figura 3, la curva
de calibrado es lineal para los intervalos de concentraciones
estudiados. Cubre ampliamente la zona de normalidad, el TAFI está
presente en el organismo a unas concentraciones desde 5 a 15
\mug/ml.
El procedimiento de la invención permite por lo
tanto de descifrar tanto unos déficits en TAFI como unas tasas
normalmente elevadas.
El procedimiento de la invención se ha aplicado
sobre diferentes tipos de plasmas según el protocolo descrito en el
ejemplo nº 2.
Se puede efectuar la dosificación sobre plasma
fresco o plasmas congelados pero se observa una disminución de DO
entre los dos. Esto es debido a una ligera degradación del TAFI en
el momento de la descongelación (la proteína se degrada).
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Plasmas frescos \+ \hskip3cm \+ Plasmas
congelados \cr \+\+\cr 9,4 \mu g/ml \+ \+ 6,0 \mu g/ml\cr
11,2 \mu g/ml \+ \+ 6,5 \mu g/ml\cr 10,7 \mu g/ml \+ \+ 5,6
\mu g/ml\cr}
Sobre un plasma liofilizado, la dosificación del
TAFI es posible y similar a un plasma congelado.
| Plasma congelado | Plasma liofilizado | |
| \Delta DO: | 0,302 | 0,354 |
| Plasmas de origen diverso congelados: | ||
| Trombolítico | 2,9 \mug/ml | |
| CIVD | 2,8 \mug/ml | |
| Cirrosis | 1,4 \mug/ml | |
| Maternidad | 7,1 \mug/ml | |
| Hiperfibrinogenemia | 4,6 \mug/ml | |
| HNF | 6,1 \mug/ml | (heparinas no fraccionadas) |
| AVK | 5,8-8,2-6,5-7,1 \mug/ml | (antivitamina K). |
El procedimiento de la invención se ha aplicado
a una solución que contiene TAFI purificado, con diferentes
compuestos descritos en el ejemplo nº 1.
El ensayo se ha realizado sobre una solución al
6,5 \mug/ml de TAFI purificado en un tampón hepes. Los resultados
se presentan en la tabla IV siguiente.
El ejemplo siguiente pretende demostrar la
necesidad de utilizar el procedimiento y los compuestos de la
fórmula (I) de la invención para dosificar específicamente la
actividad de las CPN o U, en particular del TAFI, en relación con
otras carboxipeptidasas básicas.
1. La dosificación se realiza en este caso con
un sustrato de la familia de compuestos descritos por Mock en (14).
Este sustrato está constituido por un solo aminoácido portador del
radical cromóforo anicilazoformilo (porción
CH_{3}OC_{6}H_{4}-N = N-CO-).
El aminoácido seleccionado es la arginina, un aminoácido básico
normalmente hidrolizado por las carboxipeptidasas B (1).
Este sustrato se denomina a continuación AAFR
(anicilazoformilarginina) o MxAFR
(4-metoxifenilazoformilarginina).
Dicho sustrato (0,25 mM) se pone en presencia de
una muestra de TAFI plasmático, o bien de una solución de
carboxipeptidasa B pancreática porcina (Sigma-Ref.
C9584) a 5,2 mol/l.
La disminución de coloración de cada una de las
dos muestras se sigue con el espectrofotómetro. Cada una de las
muestras se trata según el protocolo siguiente:
- a)
- muestra de partida:
- \bullet TAFI plasmático: (presente en un pool normal de plasmas-diluido al 1/20) o
- \bullet carboxipeptidasa B pancreática porcina a 5,2 mol/l (en un tampón hepes).
- b)
- activación con el complejo trombina-trombomodulina-CaCl2 (ver ejemplo 2) para la muestra de TAFI plasmático.
- c)
- Adición de AAFR a 5 mM
- d)
- Lectura de DO a 382 nm.
El TAFI activado no hidroliza el AAFR
contrariamente a la CPB pancreática.
2. El procedimiento de la invención se aplica a
continuación sobre una solución de TAFI purificado, ya sea con un
sustrato de fórmula (I) (MxPAFFK), o bien con el MxAFR para
verificar que el TAFIa hidroliza sin embargo un compuesto de
fórmula (I). La activación de la coagulación se dispara gracias al
complejo
trombina-trombomodulina-CaCl2 (ver
protocolo del ejemplo 2).
La disminución de coloración de cada una de las
dos muestras se sigue al espectrofotómetro.
- a)
- muestras de partida: solución de TAFI purificado a 18 \mug/ml (diluido en un tampón hepes).
- b)
- activación de la coagulación.
- c)
- adición de MxAFR 27 mM o MxPAFFK (control) concentración del MxAFFK.
- d)
- adición de CPA en la muestra que contiene el MxPAFFK.
- e)
- Lectura DO a 382 nm.
EL TAFI activado no hidroliza el MxAFR mientras
que es activo sobre el MxPAFFK.
Se ha realizado una escala como se ha descrito
en el ejemplo 2 del modo operativo b) por dilución de un plasma
pool. (figura 4).
Esta metodología permite discriminar los plasmas
en función de su capacidad para generar la trombina. Es el mejor
reflejo del estado de hipercoagulación del paciente.
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(TAFI, Plasma Procarboxypeptidase B, Procarboxypeptidase R,
Procarboxypeptidase U)". Thromb. Research, 101:
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"Structural and functional properties of snake venom prothrombin
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1992.
Claims (40)
1. Compuesto de fórmula (I) siguiente:
en la
que:
- -
- R1, R2 = H, -CH_{3}, -CH(CH_{3})_{2}, -OCH_{3}, -Cl, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}.
- -
- R_{3} = la cadena lateral de un aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A.
- -
- R_{4} = la cadena lateral de un aminoácido básico.
2. Compuesto según la reivindicación 1 de
fórmula (I) siguiente:
en la
que:
- -
- R1, R2 = H, -CH_{3}, -CH(CH_{3})_{2}, -OCH_{3}, -Cl, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}.
- -
- R_{3} = la cadena lateral de un aminoácido hidrófobo.
- -
- R_{4} = la cadena lateral de la arginina o lisina.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque R1= H y R2 =
-S-CH_{3}.
4. Compuesto según la reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque R_{3} se selecciona de entre las
cadenas laterales de los aminoácidos siguientes:
- -
- la tirosina
- -
- la fenilalanina
- -
- la alanina
- -
- la valina
- -
- la leucina
- -
- la isoleucina
- -
- la fenilglicina.
5. Compuesto según la reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque R_{3} representa la cadena lateral de
la fenilalanina.
6. Compuesto según la reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque R_{3} representa la cadena lateral de
la fenilalanina o de la tirosina y R_{4} la de la arginina o de la
lisina.
7. Compuesto según la reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque R_{3} representa la cadena lateral de
la tirosina.
8. Compuesto según la reivindicación 1,
caracterizado porque R_{1} se selecciona de entre: -H y
-CH_{3} y R_{2} se selecciona de entre CH_{3},
O-CH_{3} y -S-CH_{3}.
9. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque A es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10. Compuesto según la reivindicación 1 de
fórmula (I) en la que
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo dicho compuesto seleccionado
de entre el grupo constituido por los compuestos siguientes, en los
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* los números entre paréntesis determinan la
posición de los grupos metilo sobre el radical fenilo.
11. Compuesto según la reivindicación 1,
caracterizado porque se trata del
4-MTPAFYR
(4-metiltiofenilazoformiltirosina arginina).
12. Procedimiento de dosificación de la
actividad de una carboxipeptidasa U en una muestra biológica, en la
que:
- -
- se pone en contacto dicha muestra con un compuesto de la fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y una carboxipeptidasa A, en unas condiciones que permiten la hidrólisis de la muestra y,
- -
- se mide la disminución de la coloración de la muestra que contiene el sustrato de fórmula (I) y la carboxipeptidasa A, que resulta de la doble hidrólisis del sustrato de fórmula (I) por la CPU de la muestra y por la CPA.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque R1= H y R2 =
-S-CH_{3}.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, caracterizado porque R_{4} es la cadena lateral de la
arginina o de la lisina.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque el sustrato es
un compuesto de fórmula (I) en el que R_{3} se selecciona de
entre las cadenas laterales de los aminoácidos siguientes:
- -
- la tirosina
- -
- la fenilalanina
- -
- la alanina
- -
- la valina
- -
- la leucina
- -
- la isoleucina
- -
- la fenilglicina.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque R_{3} es la
cadena lateral de la tirosina.
17. Procedimiento según la reivindicación 12 a
15, caracterizado porque el sustrato es un compuesto de
fórmula (I) en el que R_{3} representa la cadena lateral de la
fenilalanina.
18. Procedimiento según las reivindicaciones 12
a 15, caracterizado porque el sustrato es un compuesto de
fórmula (I) en el que R_{3} representa la cadena lateral de la
fenilalanina y R_{4} la de la arginina o de la lisina.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 18, caracterizado porque el sustrato es
un compuesto de fórmula (I) en el que R_{1} se selecciona de
entre: -H y -CH_{3} y R_{2} se selecciona de entre CH_{3},
O-CH_{3} y -S-CH_{3}.
20. Procedimiento según la reivindicación
12, caracterizado porque el sustrato es un compuesto de
fórmula (I) en el que:
en la
que:
- -
- R1, R2 = H, -CH_{3}, -CH(CH_{3})_{2}, -OCH_{3}, -Cl, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}.
- -
- R_{3} = la cadena lateral de un aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A.
- -
- R_{4} = la cadena lateral de aminoácido básico.
21. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque el sustrato es un compuesto de fórmula
(I) en la que:
dicho compuesto se selecciona de
entre el grupo constituido por los compuestos siguientes, en los
que:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* los números entre paréntesis determinan la
posición de los grupos metilo sobre el radical fenilo.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12, 13, 15, 20 ó 21, en el que el compuesto de
fórmula (I) es el 4-MTPAFYR
(4-metiltiofenilazoformiltirosina arginina).
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 22, caracterizado porque la densidad
óptica de la mezcla se mide sin adición de CPA, y después de la
adición de CPA.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 23, caracterizado porque la disminución
de coloración medida se compara con unos valores presentes en una
curva de calibrado.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 24, caracterizado porque la muestra es
una muestra sanguínea.
26. Procedimiento según la reivindicación 25,
caracterizado porque la muestra es plasma.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 26, caracterizado porque la CPA es la
CPA pancreática.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 27, caracterizado porque la muestra que
se va a ensayar se pone en presencia de un tampón activador el
tiempo necesario para obtener la activación de la carboxipeptidasa
U de la que se quiere medir la actividad, después en presencia de un
inhibidor de las serina-proteasas.
29. Procedimiento según la reivindicación 28,
caracterizado porque el sustrato de fórmula (I) se añade al
mismo tiempo que el tampón activador, o simultáneamente o
inmediatamente después del inhibidor de las
serina-proteasas.
30. Procedimiento según la reivindicación 28,
caracterizado porque la activación se realiza por la vía del
complejo trombina/trombomodulina.
31. Procedimiento para dosificar la actividad
de la CPU constitucional de una muestra y la de la CPU activable de
la misma muestra, caracterizado porque se compara la
actividad de hidrólisis de la muestra sobre un sustrato de fórmula
(I) después de poner en contacto la muestra con un tampón activador,
si es necesario el tiempo necesario para obtener la activación de
la carboxipeptidasa U de la que se quiere medir la actividad,
después en presencia de un inhibidor de las
serina-proteasas, la actividad de la hidrólisis
observada se compara con la actividad de hidrólisis de la muestra
sobre un sustrato de fórmula (I) en ausencia de tampón activador
según la reivindicación 21.
32. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 28, caracterizado porque la
carboxipeptidasa es el TAFI.
33. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 32, caracterizado porque la muestra se
trata en presencia y en ausencia de un inhibidor específico del
TAFI.
34. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque el inhibidor
específico del TAFI es el CPI.
35. Procedimiento de dosificación del TAFI
activado en una muestra sanguínea, que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- puesta en contacto de una alícuota nº 1 de la muestra con un inhibidor específico del TAFI, y tratamiento del mismo según el procedimiento de la reivindicación 28,
- b)
- tratamiento de una alícuota nº 2 de la muestra según el procedimiento de la reivindicación 28, en ausencia de inhibidor específico del TAFI.
- c)
- medición de la \Delta DO entre la alícuota nº 1 y la alícuota nº 2, representativo de la actividad del TAFI activado en la muestra.
36. Procedimiento según la reivindicación 35
para diferenciar la actividad del TAFI constitucional y la del TAFI
activable de la misma muestra, caracterizado porque se mide
la actividad de hidrólisis de una tercera alícuota de la muestra
sobre un sustrato de fórmula (I) en ausencia del tampón
activador.
37. Utilización de un compuesto de fórmula (I)
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para dosificar la
actividad enzimática de una carboxipeptidasa U en una muestra.
38. Utilización según la reivindicación 37
caracterizada porque la carboxipeptidasa es el TAFI.
39. Kit para dosificar la actividad de una CPU
en una muestra que comprende un sustrato cromógeno constituido por
un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
40. Kit para dosificar la actividad del TAFI en
una muestra biológica, que comprende:
- -
- un tampón activador del TAFI,
- -
- carboxipeptidasa A,
- -
- un sustrato de fórmula (1), según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
- -
- un inhibidor del TAFI.
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