DE60216098T2

DE60216098T2 - Neue chromogenen substrate und deren verwendung zum nachweis der wirkung von carboxypeptidasen

Info

Publication number: DE60216098T2
Application number: DE60216098T
Authority: DE
Inventors: Gerard Quentin
Original assignee: Diagnostica Stago SAS
Current assignee: Diagnostica Stago SAS
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2022-07-06
Also published as: FR2826962A1; HK1065321A1; KR20040011596A; DE60216098D1; EP1406920B1; MXPA03012040A; BR0210809A; AR034748A1; JP4298500B2; CN1283657C; ES2276951T3; CA2450194A1; WO2003004516A1; PL367367A1; RU2003137585A; ATE345351T1; CN1524087A; JP2004533489A; TWI252234B; EP1406920A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Chromogenverbindungen sowie ihre Verwendung für die Dosierung von Enzymen aus der Familie der Carboxypeptidasen U. Sie sieht insbesondere die Verwendung der Verbindungen für die Dosierung der Aktivität von TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) in einer Blutprobe und das entsprechende Dosierungsverfahren vor.
Die Carboxypeptidasen (CP) bilden in der Familie der Exopeptidasen eine Enzymgruppe. Diese Enzyme kappen die Amidverbindungen von Polypeptidketten auf Höhe der letzten COOH-terminalen Aminosäure. Sie umfassen Serin-Carboxypeptidasen, Cystein-Carboxypeptidasen und Metall-Carboxypeptidasen.
Zahlreiche Carboxypeptidasen wurden bei Bakterien, Hefen und Pflanzen isoliert und sequenziert. Die Enzyme sind ebenfalls in großer Anzahl in dem Gewebe von Säugetieren vorhanden.
Die Carboxypeptidasen wurden insbesondere in der Bauchspeicheldrüse und den Mastozyten isoliert. Andere Carboxypeptidasen, die im Plasma zirkulieren, wurden ebenfalls geklont, isoliert und sequenziert.
Alle diese Enzyme spielen sowohl abhängig von ihrem Ort als auch von ihren physischen Eigenschaften IN VIVO eine Rolle. Folglich werden die Carboxypeptidasen unterschiedlich entsprechend ihrer Substrat-Spezifizität klassiert. Die Carboxypeptidasen A weisen ein relativ großes Spektrum auf: Sie hydrolysieren die C-terminale Peptidbindung der letzten Aminosäure, insbesondere wenn diese hydrophob ist (Phe, Leu, Val, Ala). Sie hydrolysieren langsamer die Dicarboxylaminosäuren (Asp, Glu) sowie Glycin (Gly), und sie hydrolysieren auf keinen Fall basische Aminosäuren wie Arginin (Arg), Lysin (Lys), Histidin (His) oder Ornithin (Orn), ein niederes Homologes von Lysin, oder sekundäre Aminosäuren wie Prolin (Pro) oder Hydroxyprolin (Hyp).
Die Carboxypeptidasen B hydrolysieren spezifisch die letzten C-terminalen basischen Aminosäuren, wie beispielsweise Arg, Lys. Diese Klasse von Enzymen wird in Unterklassen aufgeteilt, die von den Carboxypeptidasen H (ebenfalls Encephalin-Konvertase oder Carboxypeptidase E genannt), M, N und U gebildet werden.
Die Carboxypeptidase E wurde in den sekretorischen Granula der Inseln der Bauchspeicheldrüse, den Nebennieren und der Hypophyse und dem Gehirn lokalisiert. Die Carboxypeptidase M ist ein Membranenzym, das in zahlreichen Geweben und in Zellkulturen vorhanden ist.
Die Carboxypeptidase N (nachstehend manchmal CPN genannt) ist ein Enzym, das im Plasma zirkuliert. Es schützt den Organismus gegen die vasoaktive und entzündliche Wirkung von Peptiden mit einer C-terminalen basischen Aminosäure (vorzugsweise Lysin), die in der Zirkulation freigesetzt sind. Das Enzym ist in seiner aktiven Form im Blut vorhanden. Es wird gleichermaßen aufgrund seiner natürlichen Substrate, welche Bradykinin, Kinine, Anaphylatoxine sind, auch Kininase genannt.
Schließlich sind die Carboxypeptidasen U (unstable; instabil) (nachstehend manchmal CPU genannt) Enzyme, die gleichermaßen die C-terminalen basischen Aminosäuren, mit einer Vorliebe für Arginie, hydrolysieren, die aber im Gegensatz zu den Carboxypeptidasen N sehr instabil sind, wenn sie in ihrer aktivierten Form vorliegen.
Ein neuer allgemeiner Überblick über die Enzyme der Familie der Carboxypeptidasen wurde kürzlich von BOUMA et al. (1) gegeben.
TAFI ist eine basische Zink-Metall-Carboxypeptidase (1-4). Es handelt sich genauer um eine Carboxypeptidase U, da seine Aktivität bei 37°C instabil ist. Dieses Enzym, dessen cDNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen beim Menschen beispielsweise in dem Patent US 5,206,161 beschrieben sind, ist ein plasmatisches Protein, dessen Rolle bei der Regulierung der Fibrinolyse anfänglich aufgrund der IN VITRO Beobachtung einer Verzögerung der Lyse eines Gerinnsels in Gegenwart von aktiviertem TAFI erwogen wurde.
Der aktivierte TAFI spaltet die Arginin- und Lysinreste, die an COOH-terminaler Stelle von Fibrin freigelegt sind. Diese Hydrolyse führt zu einer Minderung der Anzahl von Bindungsstellen des Plasminogens und von tPA auf der Oberfläche des Fibringerinnsels, und somit zu einer Minderung der Umwandlung des Plasminogens in Plasmin durch tPA.
TAFI wurde aufeinanderfolgend mit dem Namen Procarboxypeptidase B (pro-PCPB), dann instabile Procarboxypeptidase (proCPU: unstable ProCarboxypeptidase) und Procarboxypeptidase R (CPR) aufgrund einer carboxypeptidasischen Aktivität an Argininresten bezeichnet. Die Zymogenform ist ein Glycoprotein mit Einzelkette mit 60 KDa, in der Leber synthetisiert und im Plasma zirkulierend.
Das Spalten des Zymogens wird größtenteils durch Thrombin auf Ebene der Stelle arg 92 bewirkt. Durch diese Proteolyse wird ein N-terminales Peptid mit 92 Aminosäuren, das mehrere Glykosylierungsstellen aufweist, freigesetzt. Die katalytische Wirkung des Thrombins an TAFI wird beträchtlich durch Thrombomodulin in Gegenwart bivalenter Ionen gesteigert. Die Aktivierungsgeschwindigkeit des durch Thrombin katalysierten TAFI ist somit aufgrund der Bildung eines ternären Komplexes mit Thrombomodulin mehr als 1000-fach gesteigert.
Aktiviertes TAFi (TAFIa) wird durch den C-terminalen Bereich des Zymogens gebildet und weist 309 Aminosäuren auf.
Aufgrund seiner Schlüsselrolle bei den Regulierungsmechanismen für die Fibrinolysevorgänge hat es sich sehr schnell als nützlich erwiesen, die Menge an konstitutionellem TAFI und aktivierbarem TAFI messen zu können, die in dem Plasma in unterschiedlichen pathologischen Zuständen vorhanden ist.
Mehrere Verfahren zur Dosierung der Aktivität unterschiedlicher Carboxypeptidasen unter Verwendung spezifischer Substrate wurden im Stand der Technik beschrieben.
So haben WOLFF et al. (5) die Leistungen der synthetischen Substrate Hip-Arg, Hip-Lys, Hip-Orn an durch Chromatographie gereinigten Carboxypeptidasen B der Bauchspeicheldrüse durch Messen der Unterschiede in der UV-Absorption verglichen.
1970 haben S. SUZUKI et al. (6) die Detektion des Hydrolyseprodukts verbessert, indem durch das Reagenz TT (2, 4, 6 Trichlor-5-triazin) freigesetztes Benzoylglycin derivatisiert wurde. Diese Derivatisierung wirkte spezifisch an dem CH₂ des α-Glycins einer einzigen freien Säurefunktion. Das Derivat wird kräftig gelb (maximale Wellenlänge bei 382 nm).
Dieses Verfahren der Entwicklung einer Gelbfärbung der Hippurylreste wurde in der Folge von vielen Verfassern genutzt.
1972 haben K. LORENTZ et al. (7) eine Reaktion zum Färben von freigesetztem Arginin, dieses Mal durch Wirkung von Carboxypeptidasen B auf einem Hip-Arg-Substrat unter Verwendung von p-Benzochinon als Reagenz verwendet. Auf diese Weise weist das gefärbte Derivat eine maximale Wellenlänge von 480 nm auf.
1980 haben Th. H. Plummer et al. (8) ein synthetisches Substrat verwendet: Furylacryloyl-Ala-Lys zum Quantifizieren von Carboxypeptidasen N, das Lesen wird bei 324 nm (nahes UV, aber nicht sichtbar) durchgeführt.
1985 haben G.H. Fischer et al. (9) ein durch N-terminale Dansylierung eines für die zu dosierende Carboxypeptidase spezifischen Peptids fluoreszierendes Substrat verwendet. Für diese Dosierung war für eine gute Trennung der Spezies vor dem Lesen ein Schritt der Extraktion der Hydrolyseprodukte erforderlich.
1986 haben H. SARUTA et al. durch ein kalorimetrisches Verfahren die Aktivität von Carboxypeptidase A (10) bestimmt. Sie haben ein spezifisches Enzym verwendet: "Hippuricase" zum Hydrolysieren des Hippuricyl-Derivats, welches wiederum durch Hydrolyse des Hydroxy-Hippuricyl-Phg-Substrats durch CPA erhalten wurde. Die Reaktion wurde schließlich mit 4-Aminoantipyrin nachgewiesen, um ein Chinonimid-Farbstoff zu ergeben, der bei 505 nm absorbiert.
1998 haben NAM JOO HONG et al. ein mit einem Arginin-Analogen, Thiaarginin, synthetisiertes Substrat verwendet, um CPB zu dosieren (11).
Jedoch wurden die oben beschriebenen kolorimetrischen Verfahren zum einen nie verwendet, um spezifisch die enzymatische Aktivität von CPN oder CPU, insbesondere TAFI, zu dosieren, und weisen zum anderen bestimmte Nachteile auf, die nicht mit einem einfachen und effizienten Dosierungstest dieser Art Enzym durch Kolorimetrie vereinbar sind.
Je nach Fall ist:

– entweder die Derivatisierungsreaktion, die zu einem gefärbten Produkt führt, nicht für die bei der Hydrolyse freigesetzten Spezies spezifisch,
– oder die Derivatisierungsreagenzien sind sehr toxisch und können nicht in industriellem Maßstab verwendet werden,
– oder das Verfahren zum Färbungsnachweis ist sehr langwierig und weist viele Einschränkungen auf und kann nicht auf einfache Weise automatisiert werden.

1996 haben W.L. Mock et al. ein Verfahren zur Dosierung einer extrazellulären Zink-Endoprotease bakterieller Herkunft, Thermolysin, mittels synthetischer Substrate, die sich unter Wirkung von enzymatischer Hydrolyse einfärben (12), beschrieben. Dazu haben die Verfasser Dipeptidverbindungen synthetisiert, die aus einem Leuzinrest gebildet sind, der eine N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-Gruppe trägt, die auf Höhe der Aminfunktion gepfropft ist, sowie einer anderen neutralen Aminosäure (Leu, Ala, Phe oder Gly).
Das Einbinden einer Arazoformylgruppe ergibt eine stark gefärbte Verbindung. In Gegenwart von Thermolysin reorganisiert sich das Farbstoffmolekül während der chemischen Hydrolysefunktion gemäß einem Mechanismus, der in (12-13) gut beschrieben ist, was nicht gefärbte Produkte ergibt (Anizol-Fragment, N₂, CO₂ und Aminosäure). Es ist somit einfach, der Geschwindigkeit des Enzyms anhand der Entfärbungsgeschwindigkeit des Mediums zu folgen.
Die gleichen Verfasser haben ebenfalls ein kinetisches Verfahren der Dosierung durch Spektrophotometrie beschrieben, das auf den gleichen Grundlagen basiert wie das vorgenannte für Carboxypeptidase A (13) und Carboxypeptidase B aus der Bauchspeicheldrüse eines Schweins (14).
In diesem Fall waren die verwendeten Verbindungen aus einer einzigen Aminosäure gebildet, die dafür bekannt ist, durch Carboxypeptidase A (Phe, Leu) oder Carboxypeptidase B (Lys), die eine N-Arazoformylgruppe trägt, gespalten zu werden. Dem enzymatischen Spalten dieser Verbindungen in nicht gefärbte Produkte schließt sich das Messen der fortschreitenden Entfärbung des Mediums an.
Ausgehend von diesen Erkenntnissen haben die Verfasser der vorliegenden Erfindung neue gefärbte Verbindungen synthetisiert, um mittels kolorimetrischen Verfahrens die Aktivität von Carboxypeptidasen U, und insbesondere die Aktivität von TAFI, zu messen.
Gemäß einem ersten Gegenstand ist es somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen vorzusehen, die Substrate für Carboxypeptidase U, und insbesondere Substrate für aktiviertes TAFI, bilden. Diese Verbindungen sind chromogene Substrate.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Arazoformylverbindungen der folgenden allgemeinen Formel (1) handelt:
in welcher:

– R₁, R₂ = H, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -OCH₃, -Cl, -CF₃, -OCF₃, -SCH₃
– R₃ = die Seitenkette einer durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbaren Aminosäure (oder ein durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbares Aminosäureradikal).
– R₄ = ein basisches Aminosäureradikal.

Insbesondere ist R₃ aus den hydrophoben Aminosäureradikalen gewählt, wie beispielsweise:

– Tyrosin:
– Phenylalanin:
– Alanin: R₃ = -CH₃
– Valin: R₃ = -CH-(CH₃)₂
– Leuzin: R₃ = -CH₂-CH-(CH₃)₂
– Isoleuzin:
– Phenylglyzin:

R₄ wird genauer gewählt aus den Aminosäureradikalen, wie beispielsweise:

– Arginin:
– Lysin (R₄ = -(CH₂)₄-NH₂)
– Ornithin R₄ = -(CH₂)₃-NH₂

Vorzugsweise stellt R₃ einen aromatischen Aminosäurerest dar, und insbesondere Phenylalanin oder Tyrosin, und R₄ Arginin oder Lysin.
R₁ wird vorzugsweise gewählt aus:

– H und -CH₃, und R₂ wird vorzugsweise gewählt aus: -CH₃, -O-CH₃ und -S-CH₃

Eine bevorzugte Familie von Verbindungen gemäß der Erfindung wird dargestellt durch die allgemeine Formel:
in welcher:

– A =
– R₁, R₂ = H, -CH₃, (CH₃)₂CH-, CH₃-O-, -Cl, -CF₃,
– R₃ = ein durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbares Aminosäureradikal.
– R₄ = ein basisches Aminosäureradikal.

R₃ stellt vorzugsweise Phenylalanin oder Tyrosin dar und R₄ stellt vorzugsweise Arginin oder Lysin dar.
R₁ wird vorzugsweise gewählt aus:

– H und -CH₃, und R₂ wird vorzugsweise gewählt aus:
– CH₃, -O-CH₃ und -S-CH₃

Eine besonders bevorzugte Verbindung der Familie der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel (I), in welcher:

– A =

*die Zahlen in Klammern bestimmen die Position der Methylgruppen an dem Phenylradikal.

Die Erfindung betrifft insbesondere, im Rahmen der obenstehenden Definitionen, jede Formel, die der Formel (I) entspricht und mögliche Kombinationen der Gruppen A, R1, R2, R3 und R4, von denen eine bevorzugte Definition oben genannt ist, zum Ergebnis hat.
Nachstehend werden die so definierten Verbindungen unterschiedslos "Verbindungen der Formel (I)" oder "Substrate der Formel (I)" genannt.
Gemäß einem zweiten Gegenstand hat die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein Verfahren zur kolorimetrischen Dosierung der Aktivität einer Carboxypeptidase CPU in einer biologischen Probe vorzusehen, bei welchem:

– die Probe mit einer chromogenen Verbindung der Formel (I) wie oben definiert und einem Enzym der Familie der Carboxypeptidasen A unter Bedingungen, die die Hydrolyse der Probe ermöglichen, in Kontakt gebracht wird, und
– die Hydrolyse der Verbindung der Formel (I) durch CPU der Probe durch Messen des Fortschreitens der Entfärbung (entsprechend einer Minderung der Absorption) bei einer Wellenlänge, die aus dem Absorptionsspektrum der Verbindung gewählt wird, bestimmt wird.

Die Minderung der Färbung resultiert aus der Doppelhydrolyse des Substrats der Formel (I) durch die Carboxypeptidasen U der Probe einerseits und durch die Carboxypeptidase A andererseits.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise mittels einer Verbindung der Formel (I) durchgeführt, bei welcher die hydrophobe Aminosäure Phenylalanin oder vorzugsweise Tyrosin ist und die basische Aminosäure Arginin oder Lysin ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise mittels einer Verbindung der Formel (I) durchgeführt, bei der R₁ aus -H und -CH₃ und R₂ aus -CH₃, -O-CH₃ und -S-CH₃ gewählt ist. Vorteilhafterweise ist in der Verbindung der Formel (I), wenn R₁ H ist, R₂ S-CH₃.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorteilhafterweise mit der Familie der Verbindungen der Formel (I) durchgeführt, bei welchen:

– A =

₁

₂

₃

Genauer ist die verwendete Verbindung der Formel (I) eine Phenylazoformylverbindung, bei welcher:

– A =

Die verwendeten Carboxypeptidasen A können aus unterschiedlichen Quellen stammen, wie beispielsweise der Bauchspeicheldrüse oder den Mastozytenzellen. Sie können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
Im Rahmen der Erfindung wird vorzugsweise Carboxypeptidase A aus der Bauchspeicheldrüse des Rinds verwendet.
Das Prinzip des Verfahrens gemäß der Erfindung basiert auf einer Hydrolyse eines gefärbten Substrats der Formel (I) wie oben beschrieben, durch Wirkung der gegebenenfalls in der analysierten Probe vorhandenen Carboxypeptidase U in Verbindung mit der Wirkung der dem Medium hinzugefügten Carboxypeptidase A. Diese spezifische Hydrolyse führt zu einer Löschung der Färbung der Ausgangsverbindung, die mittels eines Spektrophotometers verfolgt werden kann.
Genauer erzeugt, unter Berücksichtigung der Hydrolysespezifizitäten der Carboxypeptidasen N oder U und A wie zuvor ausgeführt und der strukturellen Eigenschaften der Verbindungen der Formel (I) wie oben beschrieben, das in Kontakt Bringen einer Carboxypeptidase A und einer aktivierten Carboxypeptidase U mit einer derartigen Verbindung einen Bruch auf Höhe der Bindung zwischen der ersten und der zweiten Aminosäure der Verbindung aufgrund der Wirkung der Carboxypeptidase U, quasi gleichzeitig gefolgt von einem Bruch auf Höhe der Bindung zwischen der Azoformylgruppe und der ersten Aminosäure aufgrund der Wirkung der Carboxypeptidase A.
Das Ergebnis dieser beiden Reaktionen ist eine Entfärbung des Ausgangsmediums. Es ist somit einfacher, diese Entfärbung als Funktion der Zeit zu verfolgen, indem man sich bei einer Absorptionswellenlänge des Farbstoffs [Verbindung Formel (I)], vorzugsweise bei einer Wellenlänge entsprechend seinem Absorptionsmaximum (Peak) anordnet.
Diese fortschreitende Entfärbung ist für die Kinetik der Hydrolyse repräsentativ. Die Menge der anfänglich in der Probe vorhandenen aktiven Carboxypeptidase U wird berechnet, indem die gemessene optische Dichte mit der einer Eichkurve verglichen wird, die beispielsweise aus einer Skala über die Konzentration von gereinigter aktiver Carboxypeptidase U in Lösung erstellt wurde.
Umgekehrt tritt, wenn die Probe keine Carboxypeptidase U enthält oder wenn diese inaktiv ist, ein Bruch zwischen der ersten und zweiten Aminosäure der Verbindung der Formel (I) nicht auf, und somit kann die Carboxypeptidase A nicht auf Höhe der Bindung der gefärbten Gruppe an der ersten Aminosäure wirken. Somit wird keine Minderung der Färbung der Ausgangslösung beobachtet.
Die Erfindung sieht insbesondere ein Verfahren zur Dosierung der Aktivität einer CPU in einer biologischen Probe, insbesondere einer Blutprobe wie beispielsweise reines oder verdünntes vollständiges Blut oder Plasma, und vorzugsweise ein Verfahren zur Dosierung der Aktivität von TAFI in einer Blutprobe, insbesondere reines oder verdünntes Plasma, vor.
In diesem Fall wird die zu testende Probe zuerst in Gegenwart einer Pufferlösung mit, falls erforderlich, einem Aktivator für die Carboxypeptidase, deren Aktivität gemessen werden soll (Lösung nachstehend Aktivatorpuffer genannt), gebracht und für die Dauer inkubiert gelassen, die erforderlich ist, um die Aktivierung der untersuchten Carboxypeptidase zu erhalten. Das Inkubieren wird vorzugsweise bei Umgebungstemperatur für 5 bis 20 Minuten, vorteilhafterweise 8 bis 12 Minuten, vorzugsweise 10 Minuten, durchgeführt.
Gemäß einem bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsverfahren kann der Aktivator für die Carboxypeptidase ein Aktivator sein, insbesondere ein Koagulationsfaktor, der reagieren gelassen wird, um die Carboxypeptidase U, insbesondere TAFI, zu aktivieren.
In diesem Fall wird dann der Mischung ein Inhibitor für Serin-Proteasen hinzugefügt, um den Vorgang der Koagulation zu blockieren. Der Inhibitor für Serin-Proteasen ist zum Beispiel PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon – Bachem – Art. Nr. 1065), das in einem Bereich der Endkonzentration von 1 bis 50 μM, vorzugsweise 30 μM, entsprechend den Anfangskonzentrationen von 10 bis 250 μM, und vorzugsweise 150 μM verwendet wird. Andere Verbindungen, wie beispielsweise Pefabloc [4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluoridhypochlorid – Pentapharm – Art. 399.01], die vor zugsweise zu einer Konzentration von 0,1 mM verwendet werden, sind gleichermaßen geeignet.
Gleichzeitig mit oder unmittelbar nach dem Hinzufügen des Inhibitors wird eine der Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung in wässriger Lösung hinzugefügt. Die Verbindung wird im Allgemeinen in einem Bereich von Endkonzentrationen zwischen 0,25 und 10 mM, vorzugsweise zwischen 0,25 und 2,5 mM, vorteilhafterweise zwischen 0,25 und 1 mM verwendet. Vorzugsweise wird sie zu 0,4 mM verwendet.
Nach einer erneuten Inkubationsphase, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, während welcher das Substrat der Formel (I) auf Höhe der zweiten Aminosäure durch die CPU der Probe, deren Aktivität untersucht wird, gebrochen werden sollte, kann die Hydrolyse durch Hinzufügen von HCl und unmittelbar danach durch Hinzufügen einer Base zum erneuten Anpassen des pH auf einen Wert zwischen 7 und 8, gestoppt werden.
Dann wird die optische Dichte (OD) der so erhaltenen Mischung zum ersten Mal ohne Hinzufügen von CPA zu dem Medium gemessen. Danach wird dem Medium CPA hinzugefügt und die OD erneut gemessen. Das Fortschreiten des Entfärbens kann mit dem Spektrophotometer verfolgt werden. Dadurch wird die Hydrolyse des Substrats der Formel (I) durch gemeinsame Aktionen der CPU der Probe und der CPA übermittelt.
Die gemessenen delta OD (Δ OD) werden mit den Werten einer Eichkurve verglichen, die zum Beispiel aus einer untersuchten Probe erhalten werden kann, die nur wenig CPU aufweist und einen Überstand dieses gereinigten Enzyms aufweist.
Die oben beschriebene Vorgehensweise stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Jedoch sind mehrere Varianten möglich, besonders hinsichtlich der Abfolge des Hinzufügens der unterschiedlichen verwendeten Verbindungen sowie der Art dieser Verbindungen. Diese gehören ebenfalls zur Definition der vorliegenden Erfindung.
Somit ist es beispielsweise möglich, das Substrat der Formel (I) direkt zu Beginn des Verfahrens zur gleichen Zeit wie den Aktivatorpuffer für die Koagulation einzusetzen.
Ebenfalls kann die Dosierung anhand von zwei Aliquoten des gleichen Reaktionsmediums durchgeführt werden, von denen nur eins mit CPA behandelt wird. Im Anschluss wird die ΔOD der beiden Aliquote gemessen.
In dem Fall, dass der Aktivatorpuffer die Koagulation aktiviert, kann die Aktivierung auf unterschiedliche, dem Durchschnittsfachmann bekannte Wege durchgeführt werden und routinemäßig bei Koagulationstests verwendet werden.
Diese Aktivierungswege sind insbesondere:

– der Aktivierungsweg über den Thrombin/Thrombomodulinkomplex. Diese erste Möglichkeit stellt die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
– der Aktivierungsweg über den aktivierten XI-Faktor, der in diesem Fall das Thrombin in dem Aktivatorpuffer ersetzt. Um die Reaktion zu beschleunigen, kann es vorteilhaft sein, dem Medium gleichermaßen Thrombomodulin hinzuzufügen.
– der Aktivierungsweg über Gifte, insbesondere Schlangengifte, gleichermaßen mit eventuellem Hinzufügen von Prothrombin und/oder Thrombomodulin zu dem Medium. Die vorzugsweise verwendeten Gifte sind die Gifte aus der Familie der "thrombin-like", wie beispielsweise das Gift Arkistrodon rhodostoma oder Bathrops atrox, sowie die Aktivatorgifte für Prothrombin, wie beispielsweise Notechis scutatus oder Echis carinatus (15-18).
– der Aktivierungsweg durch Tissue Factor (Gewebsfaktor) in Gegenwart von Phospholipiden und Calcium (Aktivierung auf exogenem Weg gemäß den Prinzip einer Quickzeit).
– der Aktivierungsweg der Kontaktphase.
– der Aktivierungsweg durch Plasmin.

Vorteilhafterweise ermöglicht das Verfahren gemäß der Erfindung, für dieselbe Probe einerseits die Aktivität der in dieser vorhandenen "konstitutionellen" CPU, zum Bei spiel die CPU, die in "natürlich" aktiver Form vorliegt (das heißt ohne Starten der Aktivierung durch einen Aktivatorpuffer), und andererseits die Aktivität von aktivierbarer CPU, das heißt von in der Probe in inaktiver Form vorhandener CPU, deren Aktivität während des Aktivierungsvorgangs in Verbindung mit der Wirkung des Aktivatorpuffers eingeleitet oder erzeugt wird, zu messen.
Dazu wird die Hydrolyseaktivität auf einem Substrat der Formel (I) einer Probe gemäß dem oben beschriebenen Verfahren verglichen, indem die Probe entweder in Gegenwart eines Aktivatorpuffers (Detektion der Gesamtaktivität der in der Probe vorhandenen CPU) oder in Gegenwart eines physiologischen Puffers ohne Aktivator (Detektion der Aktivität der konstitutionellen CPU) gebracht wird.
Der Unterschied des delta OD zwischen den beiden Messungen ermöglicht es, die Aktivität der aktivierbaren CPU, die in der Probe vorhanden ist, zu erhalten.
Gemäß einer bevorzugten Variante hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Dosierung von aktiviertem TAFI in einer biologischen Probe, insbesondere einer Blutprobe, zum Gegenstand, wobei für das Verfahren eine der Verbindungen oder eins der Substrate der Formel (I) wie zuvor beschrieben verwendet wird.
Die Aktivität von konstitutionellem und/oder aktivierbarem TAFI wird gemessen, indem die Probe wie zuvor beschrieben in Gegenwart oder bei Nichtvorhandensein eines für TAFI spezifischen Inhibitors behandelt wird.
Der Inhibitor, der bevorzugt verwendet wird, ist CPI ("Carboxypeptidase Inhibitor von Potato Tubers), dessen Verwendung in in vitro und in vivo Studien über die Funktion von TAFI in der Literatur (Bezug 1) ausgiebig beschrieben wurde. Dem Durchschnittsfachmann ist heute bekannt, dass CPI spezifisch TAFI inhibiert, ohne die Aktivität anderer plasmatischer CP zu verändern. Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung kann CPI in einem Konzentrationsbereich von 0,10 bis 0,50 mM (Anfangskonzentrationen), oder 2 bis 10 μM (Endkonzentrationen) verwendet werden. Vorzugsweise wird es zu 7 μM (Endkonzentration) oder 0,38 mM (Anfangskonzentration) verwendet.
Gemäß dem Prinzip dieser bevorzugten Variante wird die Probe durch den Aktivierungspuffer für TAFI aktiviert, zum Beispiel einem Aktivierungspuffer für die Koagula tion durch den Thrombin/Thrombomodulinkomplex, und gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren entweder in Gegenwart oder bei Nichtvorhandensein eines Inhibitors für TAFI behandelt.
Der Unterschied in der Färbung des Mediums mit und ohne Inhibitor für TAFI ermöglicht somit, die genaue enzymatische Aktivität des aktivierten TAFI (TAFIa) in der Probe zu bestimmen.
Genauer kann das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der folgenden Vorgehensweise durchgeführt werden: die zu testende Probe wird in zwei oder mehr, falls erforderlich, Aliquote geteilt, je nachdem, ob die Aktivität des gesamten in der Probe enthaltenen TAFI bestimmt werden soll oder ob gewünscht wird, zwischen der Aktivität des konstitutionellen TAFI und jener des aktivierbaren TAFI zu unterscheiden.

– Ein erstes Aliquot, welches den Inhibitor für TAFI enthält, wird aktiviert und gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren behandelt. Dieses wird somit nur eine geringe Entfärbung des Mediums erzeugen, was das Ergebnis einer Resthydrolyse des Substrats der Formel (I) durch andere in der Probe vorhandene Carboxypeptidasen ist.
– Ein zweites Aliquot wird auf identische Weise wie zuvor behandelt, aber bei Nichtvorhandensein eines Inhibitors für TAFI. Daraus entsteht eine starke Entfärbung des Mediums verbunden mit der Hydrolyse des Substrats der Formel (I) durch in der Probe aktiviertes TAFI.
– Der Unterschied der Färbung (Δ OD) zwischen dem ersten und dem zweiten Aliquot wird gemessen. Dieser steht für die spezifische Aktivität des aktivierten TAFI in der Probe.

Wird gewünscht, zwischen der spezifischen Aktivität des aktivierbaren TAFI und jener des konstitutionellen TAFI zu unterscheiden, wird ein drittes Aliquot der gleichen Probe verwendet, von der gleichermaßen die Hydrolyseaktivität an dem Substrat der Formel (I) gemessen wird, aber bei der die Aktivierung nicht ausgelöst wird, indem dem Medium kein Aktivierungspuffer hinzugefügt wird.
Die Δ OD der unterschiedlichen Aliquote ermöglichen es, entweder die Aktivität des gesamten TAFI der Probe zu erhalten oder nur jene des konstitutionellen TAFI, und somit daraus jene des aktivierbaren TAFI abzuleiten.
Gemäß einem dritten Gegenstand hat die Erfindung zum Ziel, ein Diagnose-Kit zum Dosieren einer CPU vorzusehen, wobei das Diagnose-Kit ein Substrat der Formel (I) wie zuvor beschrieben aufweist.
Vorzugsweise ist das Diagnose-Kit gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kit zum Messen der Aktivität von TAFI in einer Blutprobe.
Ein derartiges Diagnose-Kit weist insbesondere auf:

– einen Aktivator für TAFI, insbesondere einen Aktivatorpuffer für TAFI,
– Carboxypeptidase A,
– ein Substrat der Formel (I),
– einen Inhibitor für TAFI.

Das Kit weist gleichermaßen optional einen Inhibitor für Serin-Proteasen auf.
Jeder dieser Bestandteile liegt vorzugsweise als Pulver oder in lyophilisierter Form vor.
Die nachstehenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren stellen die vorliegende Erfindung dar.
1: Absorptionspektrum unterschiedlicher synthetisierter Verbindungen der Formel (I), gemessen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer.
2: Analyse von AAFFR, bewirkt durch saure Hydrolyse.
3: Eichkurve, aufgestellt anhand eines an TAFI armen Plasmas, übersättigt mit gereinigtem TAFI, um eine Skala über die Konzentration zu erhalten, die von 0 bis 26 μg/ml reicht.
4: Eichkurve für eine Skala über die Konzentration, erhalten aus einem Plasma-Pool. Die Eichung wird mittels eines Verfahrens zur Erzeugung von Thrombin durch geführt. Die kolorimetrische Dosierung wird mit dem Chromogen-Substrat 4-MTPAFYR durchgeführt.
BEISPIEL Nr. 1:
Synthese einer Gruppe von Azoformyl-Verbindungen gemäß der Erfindung.
Die untenstehende Tabelle 1 gibt die chemischen Formeln von 8 der bevorzugten Verbindungen aus den Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung an. Ihre mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UVIKON-KONTRON) gemessenen Absorptionsspektren sind in 1 zusammengefasst.
Nachstehend wird genau die Synthese einer dieser Verbindungen, der Verbindung Nr. 4 (MxPAFFR), beschrieben. Die für diese Verbindung untenstehend beschriebenen Schritte sind für jede der anderen Verbindungen identisch, mit Ausnahme der Verbindung Nr. 5 (MxPAFFK), für die ein zusätzlicher Schritt des Entschützens des Lysins erforderlich ist (siehe Reaktionsschema und nachstehende Erklärungen). TABELLE 1:
A/ Synthese von 4-Methoxyphenylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 4)
Einleitung: Alle untenstehend beschriebenen Schritte sind für jeden Farbstoff identisch. Jedem Schritt folgt eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und eine Analyse der Aminosäuren für die Kopplungen mit Phenylalanin und Arginin.
1. Schritt: Grignard-Reaktion Reaktionsschema:
Vorgehensweise: Es werden 1 Äq. 4-Bromanisol und 1 Äq. Magnesium vorbereitet. Das Magnesium und 20 Masse-% des 4-Bromanisols werden in einen Dreihalskolben eingebracht, aufgenommen in wasserfreiem Tetrahydrofuran (2 mL/mmol), und die Apparatur wird unter Stickstoff gesetzt. Die Reaktion wird gestartet, indem der Dreihalskolben an einem Punkt mit einem Heißluftgebläse erwärmt wird, das Reaktionsmedium wird braun. Wenn die Reaktion startet (Sprudeln auf der Oberfläche des Magnesiums), wird bei 90°C unter Rückfluss gesetzt, dann langsam der Rest des 4-Bromanisols, aufgenommen in wasserfreiem THF (2 mL/mmol), hinzugefügt. Der Rückfluss wird nach 1 h gestoppt. Das 4-Methoxyphenylmagnesiumbromid wird, wie es ist, für den folgenden Schritt verwendet (Farbe braun).
Anmerkung: Die Gläser und das Magnesium werden zuvor im Wärmeschrank bei 120°C getrocknet und die anderen Produkte im Exsikkator.
Retentionszeit: Da das Grignard-Reagenz eine sehr instabile und gegenüber Wasser empfindliche Verbindung ist, werden drei charakteristische Retentionszeiten für die bei der HPLC-Analyse gebildeten Abbauprodukte erhalten:

Retentionszeit 1: 2,68 min
Retentionszeit 2: 3,32 min
Retentionszeit 3: 5,38 min

2. Schritt: Koppeln mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es werden 1 Äq. Di-t-butylazodicarboxylat und 1 Äq. 4-Methoxyphenylmagnesiumbromid (Grignard-Reagenz) in wasserfreiem THF (2 mL/mmol) aufgenommen. Jeweils zwischen 0-5°C abkühlen. Das Grignard-Reagenz wird zu Di-t-butylazodicarboxylat hinzugefügt. Es wird 10 min gerührt, dann 1,02 Äq. Essigsäure hinzugefügt, dann auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen. Es wird eine Extraktion Wasser/Ether durchgeführt. Die Etherphase wird getrocknet, dann bis zur Trockne verdampft. Es wird ein gelbes Öl erhalten.

Retentionszeit: 7,85 min

3. Schritt: Entschützung Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es werden 1 Äq. N, N'-bis-(t-butoxycarbonyl)-4-(methoxy)phenylhydrazin in Isopropanol (10,2 mL/mmol) aufgenommen, dann HCl in Dioxan zu 4,8 M (2 mL/mmol) hinzugefügt. In Rückfluss bringen (80°C). Nach 15 min abkühlen, dann Ether (5 mL/mmol) hinzufügen. Das 4-Methoxyphenylhydrazinhydrochlorid fällt aus. Filtern und Trocknen. Das Pulver wird in Wasser aufgenommen, dann auf einen pH von 7 gebracht. Es wird eine Extraktion Wasser/Dichlormethan durchgeführt und die Dichlormethanphase bis zur Trockne verdampft. Es wird 4-Methoxyphenylhydrazin (gelbes Pulver) erhalten, das getrocknet ist.

Retentionszeit: 2,20 min

4. Schritt: Koppeln mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es werden 1,4 Äq. Diphenylcarbonat in Benzol (0,25 mL/mmol) aufgenommen, dann bei 120°C in Rückfluss gebracht. Es wird langsam 1 Äq. in Benzol (0,7 mL/mmol) aufgenommenes 4-Methoxyphenylhydrazin hinzugefügt. Der Rückfluss wird nach 6 h gestoppt. Das Reaktionsmedium wird konzentriert, dann eine Kristallisierung Hexan/Benzol (4/1) durchgeführt. Die weißlichen Kristalle werden gefiltert und im Exsikkator getrocknet.

Retentionszeit: 6,74 min

5. Schritt: Koppeln mit Phenylalanin Reaktionsschema
Vorgehensweise: 1,2 Äq. in Dimethylformamid (3,33 mL/mmol) aufgenommenes Triethylammoniumsalz von Phenylalanin werden unter Rückfluss (95°C) gesetzt. Es wird langsam 1 Äq. in Dimethylformamid (2 mL/mmol) aufgenommenes 4-Methoxyphenylhydrazoformat hinzugegeben. Der Rückfluss wird nach 1 h 30 gestoppt, auf Umgebungstemperatur kommen gelassen, konzentriert. Ansäuern (pH = 2). Reinigen durch Chromatographie (weißliche Kristalle).

Retentionszeit: 6,12 min

6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es wird 1 Äq. N-(4-Methoxyphenylhydrazoformyl)-L-phenylalanin in ultrareinem Wasser (20,8 mL/mmol) aufgenommen, welches 1 Äq. Natriumhydroxid und 1 Äq. Ammoniumacetat enthält. Es wird 1 Äq. in ultrareinem Wasser (4,2 mL/mmol) aufgenommenes Natriummetaperiodat hinzugefügt. Nach 20 min wird das Reaktionsmedium angesäuert (pH = 2), dann durch Chromatographie gereinigt (orange Kristalle).

Retentionszeit: 6,86 min

7. Schritt: Koppeln mit Arginin Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es wird 1 Äq. Argininmethylesterhydrochlorid in Dimethylformamid (3 mL/mmol) aufgenommen. Es werden 1,1 Äq. DIAE (Diisopropylethylamin), 1 Äq. N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanin, dann 1,1 Äq. TBTU (O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat hinzugefügt. Es wird die erforderliche Menge DIAE hinzugefügt, um einen pH von 7-8 zu erhalten. Nach 5 min wird bis zur Trockne verdampft und durch Chromatographie gereinigt (orange Kristalle).

Retentionszeit: 6,06 min

8. Schritt: Verseifung Reaktionsschema
Vorgehensweise: Es wird 1 Äq. N-(4-methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanylargininmethylester in einer Mischung Wasser/Methanol (Verhältnis: 1/2; 3 mL/mmol) aufgenommen. Es werden 3 Äq. Natriumhydroxid 1N hinzugefügt. Nach 1 h Ansäuern des RM, Konzentrieren, danach Durchführen einer Extraktion Wasser/Dichlormethan. Die Dichlormethanphase wird verdampft, dann getrocknet. Es wird N-(4-methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanylarginin erhalten, welches ein oranges Pulver ist.

Retentionszeit: 5,5 min

Eine Aminosäureanalyse des Endprodukts wird nach saurer Hydrolyse durchgeführt, um die Homogenität der Sequenz zu kontrollieren. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in dem Chromatogramm der 2 zusammengefasst.
Analysebedingungen:

– Kette HPLC AAA; Derivatisierung vor Säule mit PITC (Phenylisocyanat)
– Säule C18; 100A; 5 μ; 250 × 4,6 mm
– Detektion bei 254 nm; Durchsatz = 1 mL/min
– Elutionsmittel: A: Acetatpuffer pH 5,74 B: Puffer 70% CH₃CN, 30% AcONa; 32 mM; pH = 6,10 C: CH₃CN

Die Protokolle zur Synthese der anderen Verbindungen basieren auf den gleichen Schritten wie zuvor beschrieben. Diese sind in den folgenden Reaktionsschemen zusammengefasst.
Die bei jedem Schritt der Synthese dieser Verbindungen erhaltenen Retentionszeiten sind in der untenstehenden Tabelle II zusammengefasst: TABELLE II: Bei HPLC bei jedem Schritt erhaltene Retentionszeiten für die anderen synthetisierten Farbstoffe
Analysebedingungen:

– Säule C18; 5 μ; 100 × 4,6 mm
– Detektion bei 254 nm; Durchsatz = 1 mL/min
– Gradient: 0' ⎕ 10%B 10' ⎕ 90%B
– mit A: Wasser zu 0,1% Trifluoressigsäure B: Acetonitril zu 0,1% Trifluoressigsäure

B/ Synthese von 2,3-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 1):
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Arginin
8. Schritt: Verseifung
C/ Synthese von 2,4-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 2):
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Arginin
8. Schritt: Verseifung
D/ Synthese von 2,5-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 3):
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Arginin
8. Schritt: Verseifung
E/ Synthese von 4-Methoxyphenylazoformylphenylalanyllysin:
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Lysin
8. Schritt: Verseifung
9. Schritt: Entschützung
Diese bestimmte Verbindung erfordert einen zusätzlichen Schritt, um die Seitenkette des Lysins zu entschützen (ε-Boc: N-ε-tertiobutoxycarbonyl).
Vorgehensweise: Es wird 1 Äq. N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanyl-L-lysin(ε-Boc) in Dichlormethan (3 mL/mmol) in einem Kolben aufgenommen. Dann wird gerührt. Es wird ein Scheidetrichter, welcher Trifluoressigsäure (3 mL/mmol) enthält, angeschlossen. Es wird langsam (tröpfchenweise) hinzugefügt. Nach 15 min Konzentrieren des Reaktionsmediums und Reinigen durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Schließlich wird ein orangefarbenes Pulver erhalten.
F/ Synthese von 3-Chlor-p-tolylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 6):
1. Schritt: Grignard-Reagenz Reaktionsschema
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
3. Schritt: Entschützung Reaktionsschema
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin Reaktionsschema
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
7. Schritt: Kopplung mit Arginin Reaktionsschema
8. Schritt: Verseifung Reaktionsschema
G/ Synthese von 3-Chlor-p-tolylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 7):
1. Schritt: Grignard-Reagenz Reaktionsschema
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
3. Schritt: Entschützung Reaktionsschema
4. Schritt• Kopplung mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin Reaktionsschema
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
7. Schritt: Kopplung mit Arginin Reaktionsschema
8. Schritt: Verseifung Reaktionsschema
H/ Synthese von 4-Methylthiophenylazoformylphenylalanylarginin (Verbindung 8):
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Arginin
8. Schritt: Verseifung
I/ Synthese von 4-Methylthiophenylazoformyltyrosylarginin (Verbindung 9):
1. Schritt: Grignard-Reagenz
2. Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
3. Schritt: Entschützung
4. Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
5. Schritt: Kopplung mit Tyrosin
6. Schritt: Oxidation; Übergang von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
7. Schritt: Kopplung mit Arginin
8. Schritt: Verseifung
BEISPIEL NR. 2:
1- Prinzip der Dosierung und verwendete Reaktionsprinzipien Prinzip der Dosierung der enzymatischen Aktivität TAFIa
2. Beispiel: Protokoll zur Dosierung der Aktivität von TAFI entsprechend dem Verfahren gemäß der Erfindung
a) 1. Vorgehensweise: Verfahren Thrombin – Thrombomodulin
Die zu testende Plasmaprobe wird in zwei Aliquote geteilt, wobei zu deren einem PIC (Calbiochem – Art. 217359) hinzugefügt wird, zu dem anderen ein Puffer Hepes.
Die beiden Aliquote werden dann auf identische Weise gemäß dem folgenden Prinzip behandelt:
Aktivierung des TAFI

150 μl des Plasmas, verdünnt zu 1/20 in Puffer Hepes (oder gereinigtem TAFI zu 13 μg/ml in Puffer Hepes).
10 μl PIC oder H₂O
5 Minuten bei Umgebungstemperatur
150 μl Aktivatorpuffer für die Koagulation
10 Minuten bei Umgebungstemperatur
100 μl PPACK + 100 μl MxPAFFR (Substrat) (5 mM)

Test der Aktivität von TAFI

30 Minuten bei Umgebungstemperatur
100 μl HCl 1M + 100 μl NaOH 1M

Nachweis

Verdünnung zu 1/3 in Puffer Hepes
Lesen der OD bei 382 nm
25 μl Carboxypeptidase A
Lesen der OD bei 382 nm nach 1 Minute

Mögliche Varianten der ersten Vorgehensweise:

– die Dosierung kann bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt werden
– das Substrat kann von Anfang an eingeschlossen sein, zur gleichen Zeit wie der Aktivatorpuffer
– das Lesen kann mittels HPLC durchgeführt werden

Bevorzugte Endkonzentrationen der unterschiedlichen Produkte:

– PPACK: H-D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon MG = 451 30 μM (Bachem – Art. Nr. 1065.
– Pefabloc: kann anstatt des PPACK verwendet werden: 0,1 mM (Pentapharm – Art. 399.01).
– Substrat (mxPAFFR): 1 mM
– Carboxypeptidase A: von der Bauchspeicheldrüse des Rinds (Sigma – Art. C 0386). Fläschchen von 5,1 ml zu 5000 Einheiten, 21 mg prot/ml, 47 Einheiten/mg Protein Die CPA wurde mit Vorfilter gefiltert, Filter 5 mm und Filter 0,45 μm, dazu werden ml H₂O hinzugefügt.
– PIC: verwendet zu 7 μm 1 mg PCI kann ungefähr 8 mg TAFI (50 U/mg) zu 50% entsprechend den Angaben des Herstellers (Calbiochem) hemmen.

Die Konzentration von 30 μM PPACK entsprach einer Anfangskonzentration von 150 μM. Die Endkonzentration von 1 mM des Substrats entsprach einer Anfangskonzentration von 5 mM. Die Endkonzentration von 7 μM CPI entsprach einer Anfangskonzentration von 0,38 mM.
Die Erfinder haben beobachtet, dass die oben angegebenen Konzentrationen verändert werden können, um eine bis auf 4 μM geminderte Endkonzentration an PPACK und eine geminderte Endkonzentration an Substrat zu verwenden.
Aktivatorpuffer:

– Der bevorzugte Aktivierungsweg für die Koagulation im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Aktivierungsweg durch den Thrombin/Thrombomodulinkomplex. In diesem Fall weist der verwendete Aktivatorpuffer die folgenden Bestandteile auf: 37 μl Thrombomodulin zu 0 bis 80 nM und vorzugsweise zu 10 nM (Rabbit lung thrombomodulin – American Diagnostica – Art. 237). 6 μl Thrombin zu 0,2 bis 10 NIH/ml und vorzugsweise 0,8 NIH/ml (Diagnostica Stago – Forschungsprodukt). 750 μl Calciumchlorid zu 0 bis 80 nM und vorzugsweise zu 40 nM 705 μl Puffer Hepes 9,4 mM pH = 7,6

Die Konzentrationen sind für eine Endmenge von 1498 μl Aktivatorpuffer angegeben.
Anmerkung: Der Puffer Hepes enthält: Hepes 20 mM, KCl 4 mM und BSA 1%. Andere Tests wurden durchgeführt mit Hepes 20 mM und NaCl 150 mM.

– Wie in der Beschreibung angegeben, sind andere Aktivierungswege möglich, darunter insbesondere der Aktivierungsweg durch den Faktor XIa. In diesem Fall enthält ein Beispiel für den Aktivatorpuffer die folgenden Bestandteile: 5 μl Thrombomodulin zu 30 U/ml 30 μl reiner Faktor XIa (Calbiochem – Art. 233483). 88 μl Puffer Hepes pH = 7,4 (Hepes 20 mM und NaCl 150 mM).

Die Konzentrationen sind zu Beispielzwecken angegeben und können vom Durchschnittsfachmann neu angepasst werden.
b) Zweite Vorgehensweise: Verfahren zur Erzeugung von Thrombin
Ein anderer Aktivierungsweg für die Koagulation setzt Thrombin ein und erfordert die Verwendung eines Aktivators für die Kontaktphase.
Beispiel Nr. 3:
Erstellen einer Eichskala mit dem Verfahren Thrombin/Thrombomodulin
Die nachstehende 3 stellt eine Eichkurve dar, die anhand eines an TAFI armen Plasmas, übersättigt mit gereinigtem TAFI, erstellt wurde, um eine Skala über die Konzentration von TAFI zu erhalten, die von 0 bis 26 μg/ml geht.
Die verwendete Verbindung der Formel I ist MxPAAFR zu einer Konzentration von 5 mM.
Die entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessenen Δ OD sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefasst: Tabelle III
Wie aus 3 hervorgeht, ist die Eichkurve für die untersuchten Skalen an Konzentrationen linear. Dies deckt weitestgehend die normale Zone ab, wobei TAFI in dem Organismus zu Konzentrationen von 5 bis 15 μg/ml vorhanden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit, sowohl einen schwachen TAFI-Gehalt als auch unnatürlich hohe TAFI-Gehalte nachzuweisen.
Beispiel Nr. 4:
Erhaltene Ergebnisse bei unterschiedlichen Plasmaarten
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf unterschiedliche Plasmaarten entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll angewendet.
Frisches Plasma, eingefrorenes Plasma:
Die Dosierung kann sowohl an frischem als auch an eingefrorenem Plasma durchgeführt werden, jedoch wird eine Minderung der OD zwischen den beiden beobachtet.
Dies resultiert aus einer leichten Verschlechterung des TAFI beim Auftauen (das Protein baut sich ab).

Frisches Plasma Eingefrorenes Plasma

9,4 μg/ml 6,0 μg/ml

11,2 μg/ml 6,5 μg/ml

10,7 μg/ml 5,6 μg/ml
Eingefrorenes Plasma, lyophilisiertes Plasma
An lyophilisiertem Plasma ist die Dosierung von TAFI möglich und ähnlich zu eingefrorenem Plasma.
Eingefrorenes Plasma verschiedener Herkunft:
Beispiel Nr. 5:
Durchgeführte Dosierung mit unterschiedlichen Substraten gemäß der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auf eine Lösung, die gereinigtes TAFI enthält, mit unterschiedlichen, in Beispiel 1 beschriebenen Verbindungen angewendet.
Der Test wurde mit einer Lösung zu 6,5 μg/ml gereinigtem TAFI in einem Puffer Hepes durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengefasst. Tabelle IV:
Beispiel Nr. 6:
Spezifizität von TAFI für die Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung
Mit dem nachstehenden Beispiel wird beabsichtigt, die Notwendigkeit aufzuzeigen, das Verfahren und die Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung anzuwenden, um spezifisch die Aktivität von CPN oder U, und insbesondere TAFI, bezogen auf andere basische Carboxypeptidasen anzuwenden.

1. Die Dosierung wird in diesem Fall mit einem Substrat der Familie der von Mock in (14) beschriebenen Verbindungen durchgeführt. Dieses Substrat ist aus einer einzigen Aminosäure hergestellt, die Träger eines Anizylazoformylchromophorradikals (Abschnitt CH₃OC₆H₄-N = N-CO-) ist. Die gewählte Aminosäure ist Arginin, eine basische Aminosäure, die normalerweise durch den Carboxypeptidasen B (1) hydrolysiert wird. Das Substrat wird nachstehend AAFR (AnizylAzoFormylArginin) oder MxAFR (4-MethoxyphenylAzoformylarginin) genannt. Dieses Substrat (0,25 mM) wird in Gegenwart entweder einer Plasmaprobe TAFI oder einer Lösung aus Carboxypeptidase B aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins (Sigma – Art. C9584) zu 5,2 mol/l gebracht.

Die Minderung der Färbung der beiden Proben wird mit einem Spektrophotometer verfolgt. Jede der Proben wird gemäß dem folgenden Protokoll behandelt:

a) Probe vom Ausgang: – plasmatisches TAFI (vorhanden in einem normalen Pool von Plasmas – verdünnt zu 1/20) oder – Carboxypeptidase B aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins 5,2 mol/l (im Puffer Hepes)
b) Aktivierung mit dem Thrombin/Thrombomodulinkomplex-CaCl2 (siehe Beispiel 2) für die Probe von plasmatischem TAFI
c) Hinzufügen von AAFR zu 5 mM.
d) Lesen der OD bei 382 nm

Ergebnisse:
Schlussfolgerung:
Das aktivierte TAFI hydrolysiert das AAFR nicht, im Gegensatz zur CPB vom Schwein.

2. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann auf eine Lösung aus gereinigtem TAFI angewendet, entweder mit einem Substrat der Formel (I) (MxPAFFK), oder mit MxAFR, um zu überprüfen, dass das TAFIa dennoch eine Verbindung der Formel (I) hydrolysiert. Die Aktivierung der Koagulation wird durch den Komplex Thrombin/Thrombomodulin-CaCl2 nachgewiesen (siehe Protokoll Beispiel 2).

Die Minderung der Färbung jeder der zwei Proben wird durch Spektrophotometrie verfolgt.

a) Probe vom Ausgang: Lösung aus gereinigtem TAFI zu 18 μg/ml (verdünnt in Puffer Hepes)
b) Aktivierung der Koagulation
c) Hinzufügen von MxAFR 27 mM oder MxPAFFK (Vergleich) Konzentration von MxAFFK.
d) Hinzufügen von CPA zu der Probe, die MxPAFFK enthält.
e) Lesen der OD bei 382 nm.

Ergebnisse:
Schlussfolgerung:
Das aktivierte TAFI hydrolysiert das MxAFR nicht, obwohl es bei dem MxPAFFK aktiv ist.
BEISPIEL NR. 7: VERFAHREN ERZEUGEN VON THROMBIN
Eine Skala wird, wie in Beispiel 2, Vorgehensweise b) beschrieben, durch Verdünnen eines Plasmapools erstellt (4).
Dieses Verfahren ermöglicht, die Plasmas entsprechend ihrer Fähigkeit, Thrombin zu erzeugen, zu unterscheiden. Es ist ein besseres Abbild des Hyperkoagulabilitätszustands des Patienten.
Literaturverzeichnis:

1. BOUMA. B.N. et al: "Thrombin-Activatable Fibrionolysis Inhibitor (TAFI, Plasma Procarboxypeptidase B, Procarboxypeptidase R, Procarboxypeptidase U)". Thromb. Research, 101:329-354, 2001.
2. BAJZAR L.: "Purification and Characterization of TAFI, a Thrombin-activable Fibrinolysis Inhibitor". J. of Biol. Chem., 270, 24:14477-14484, 1995.
3. JUHAN-VAGUE I., ALESSI M.-C.: "TAFI: lien moléculaire entre les processus de coagulation et de Fibrinolyse". Sang Thrombose Veineuse, 5, 10:314-6, 1998.
4. SCHATTEMAN K. et al.: " Carboxypeptidase U at the interface between coagulation and fibrinolysis". Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 7(2):93-101, 2001.
5. WOLF M. et al.: "The kinetics of carboxypeptidase B activity". J. of Biol.
Chem., 237, Nr. 10, Oktober 1962.
6. SUZUKI S. et al.: "Spectrophotometric determination of glycine with 2,4,6-Trichloro-s-Triazine". Analytical Chemistry, Bd. 42, Nr. 1, Januar 1970.
7. LORENTZ K. et al.: "Determination of carboxypeptidase B in duodenal contents". Clinica Chimica Acta, 37:515-517, 1972.
8. PLUMMER Th. H. et al.: "An improved spectrophotometric assay for human plasma carboxypeptidase N". Analytical Biochemistry, 108:348-353, 1980.
9. FISCHER G.H. et al.: "Synthetic inhibitors of carboxypeptidase N", Adv. Experimental Med. Biol., 198, Teil A, 405-410, 1986.
10. SURATA H. et al.: "Colorimetric determination of carboxypeptidase A activity in serum". Clin. Chem. 32:5, 748-751, 1986.
11. NAM-JOO HONG et al.: "Development of substrate for carboxypeptidase B by employing Thiaarginine peptides". Bull Korean Chem. Soc., Bd. 19, Nr. 2, 189-93, 1998.
12. MOCK W. L. et al.: "Arazoformyl Dipeptide Substates for Thermolysin. Confirmation of a Reverse Protonation Catalytic Mechanism". Biochemistry, 35:7369-7377, 1996.
13. MOCK W. L. et al.: "Arazoformyl Peptide Surrogates as Spectrophotometric Kinetic Assay Substrates for Carboxypeptidase A". Analytical Biochemistry, 239:218-222, 1996.
14. MOCK W. L. et al.: "Catalytic avtivity of carboxypeptidase B and of carboxypeptidase Y with anisylazoformyl substrates". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9:187-192, 1999.
15. HATTON M.W.: "Studies on the coagulant enzyme from Agkistrodon rhodostoma venom. Isolation and some properties of the enzyme". Biochem. J., 131(4):799-807, 1973.
16. STOCKER K. et al.: "The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (batroxobin)". Methods Enzymol. 45:214-223, 1976.
17. DENSON K.W.E.: "Clot-inducing substances prevent in such venoms with particular reference to Echis carinatus venom". Thromb. Res., 8:351-360, 1976.
18. ROSING J. et al.: "Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators". Toxicon, 30(12):1515-1527, 1992.

Claims

Verbindung der folgenden Formel (I):
in welcher:
– R₁, R₂ = H, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -OCH₃, -Cl, -CF₃, -OCF₃, -SCH₃ – R₃ = die Seitenkette einer durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbaren Aminosäure. – R₄ = die Seitenkette einer basischen Aminosäure.
Verbindung gemäß Anspruch 1 der folgenden Formel (I):
in welcher:
– R1, R2 = H, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -OCH₃, -Cl, -CF₃, -OCF₃, -SCH₃ – R₃ = die Seitenkette einer hydrophoben Aminosäure. – R₄ = die Seitenkette von Arginin oder Lysin.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 = H und R2 = -S-CH₃.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ aus den Seitenketten der folgenden Aminosäuren gewählt ist: – Tyrosin, – Phenylalanin, – Alanin, – Valin, – Leucin, – Isoleucin, – Phenylglycin.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ die Seitenkette von Phenylalanin darstellt.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ die Seitenkette von Phenylalanin oder von Tyrosin und R₄ die von Arginin oder von Lysin darstellt.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R3 die Seitenkette von Tyrosin darstellt.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ gewählt ist aus: -H und -CH₃ und R₂ gewählt ist aus CH₃, O-CH₃ und -S-CH₃.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass A ist:
Verbindung gemäß Anspruch 1 der Formel (I), in welcher
wobei die Verbindung aus der Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Verbindungen gebildet ist:

*wobei die Zahlen in Klammern die Position der Methylgruppen an dem Phenylradikal bestimmen.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 4-MTPAFYR (4-Methylthiophenylazoformyltyrosinarginin) handelt.
Verfahren zur Dosierung der Aktivität einer Carboxypeptidase U in einer biologischen Probe, bei welchem: – die Probe mit einer Verbindung der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und einer Carboxypeptidase A unter Bedingungen, die die Hydrolyse der Probe ermöglichen, in Kontakt gebracht werden, und – die Minderung der Färbung der Probe, welche das Substrat der Formel (I) und die Carboxypeptidase A enthält, gemessen wird, die sich aus der zweifachen Hydrolyse des Substrats der Formel (I) durch CPU der Probe und durch CPA ergibt.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass R1 = H und R2 = -S-CH₃.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass R₄ die Seitenkette von Arginin oder von Lysin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher R₃ aus den Seitenketten der folgenden Aminosäuren gewählt ist: – Tyrosin, – Phenylalanin, – Alanin, – Valin, – Leucin, – Isoleucin, – Phenylglycin.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass R3 die Seitenkette von Tyrosin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher R₃ die Seitenkette von Phenylalanin darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher R₃ die Seitenkette von Phenylalanin und R₄ die von Arginin oder von Lysin darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher R₁ aus -H und -CH₃ gewählt ist und R₂ gewählt ist aus CH₃, O-CH₃ und -S-CH₃.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher
in welcher R1, R2 = H, -CH₃, -CH(CH₃)₂, -OCH₃, -Cl, -CF₃, -OCF₃, -SCH₃ R₃ = die Seitenkette einer durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbaren Aminosäure. R₄ = die Seitenkette einer basischen Aminosäure.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Verbindung der Formel (I) ist, in welcher
wobei die Verbindung aus der Gruppe gewählt ist, die aus den folgenden Verbindungen gebildet ist:
*wobei die Zahlen in Klammern die Position der Methylgruppen an dem Phenylradikal bestimmen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12, 13, 15, 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel (I) 4-MTPAFYR (4-Methylthiophenylazoformyltyrosinarginin) ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Dichte der Mischung ohne Zusatz von CPA gemessen wird, dann nach Zusatz von CPA
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die gemessene Färbungsminderung mit den Wertespannen auf einer Eichkurve verglichen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Blutprobe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Plasma ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das CPA Bauchspeicheldrüsen-CPA ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testende Probe für die Zeit, die zum Erhalten der Aktivierung der Carboxypeptidase U, deren Aktivität gemessen werden soll, erforderlich ist, in Gegenwart eines Aktivatorpuffers, dann in Gegenwart eines Inhibitors für Serin-Proteasen gebracht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat der Formel (I) zur gleichen Zeit hinzugefügt wird wie der Aktivatorpuffer oder gleichzeitig mit oder unmittelbar nach dem Inhibitor für Serin-Proteasen.
Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung auf dem Weg des Thrombin-/Thrombomodulinkomplexes durchgeführt wird.
Verfahren zum Dosieren der Aktivität von CPU, welche die Probe bildet, und jener von aktivierbarer CPU der gleichen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyseaktivität der Probe auf einem Substrat der Formel (I) nach In-Gegenwart-Bringen der Probe mit einem Aktivatorpuffer verglichen wird, gegebenenfalls für die Zeit, die erforderlich ist, um die Aktivierung der Carboxypeptidase U, deren Aktivität gemessen werden soll, zu erhalten, dann in Gegenwart eines Inhibitors für Serin-Proteasen, wobei die beobachtete Hydrolyseaktivität mit der Hydrolyseaktivität der Probe auf einem Substrat der Formel (I) bei Fehlen eines Aktivatorpuffers gemäß Anspruch 21 verglichen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxypeptidase TAFI ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in Gegenwart und bei Fehlen eines für TAFI spezifischen Inhibitors behandelt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der für TAFI spezifische Inhibitor CPI ist.
Verfahren zur Dosierung aktivierten TAFIs in einer Blutprobe, welches die folgenden Schritte aufweist: a) In-Gegenwart-Bringen eines Aliquots Nr. 1 der Probe mit einem für TAFI spezifischen Inhibitor und dessen Behandlung entsprechend dem Verfahren gemäß Anspruch 28, b) Behandeln eines Aliquots Nr. 2 der Probe entsprechend dem Verfahren gemäß Anspruch 28 bei Fehlen des für TAFI spezifischen Inhibitors, c) Messung des Δ DO zwischen Aliquot Nr. 1 du Aliquot Nr. 2, welches für die Aktivität des aktivierten TAFIs in der Probe repräsentativ ist.
Verfahren gemäß Anspruch 35 zur Unterscheidung des konstitutionellen TAFIs und des aktivierbaren TAFIs der gleichen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyseaktivität eines dritten Aliquots der Probe auf einem Substrat der Formel (I) bei Fehlen des Aktivatorpuffers gemessen wird.
Verwendung der Verbindung der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, um die enzymatische Aktivität einer Carboxypeptidase U in einer Probe zu dosieren.
Verwendung gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Carboxypeptidase TAFI ist.
Kit zum Dosieren der Aktivität einer CPU in einer Probe, welches ein Chromogensubstrat aufweist, das aus einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 gebildet ist.
Kit zum Dosieren der Aktivität von TAFI in einer biologischen Probe, welches aufweist: – einen Aktivatorpuffer für TAFI, – Carboxypeptidase A – ein Substrat der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, – einen TAFI-Inhibitor.