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Die
vorliegende Erfindung betrifft Chromogenverbindungen sowie ihre
Verwendung für
die Dosierung von Enzymen aus der Familie der Carboxypeptidasen
U. Sie sieht insbesondere die Verwendung der Verbindungen für die Dosierung
der Aktivität
von TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor) in einer
Blutprobe und das entsprechende Dosierungsverfahren vor.
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Die
Carboxypeptidasen (CP) bilden in der Familie der Exopeptidasen eine
Enzymgruppe. Diese Enzyme kappen die Amidverbindungen von Polypeptidketten
auf Höhe
der letzten COOH-terminalen Aminosäure. Sie umfassen Serin-Carboxypeptidasen,
Cystein-Carboxypeptidasen und Metall-Carboxypeptidasen.
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Zahlreiche
Carboxypeptidasen wurden bei Bakterien, Hefen und Pflanzen isoliert
und sequenziert. Die Enzyme sind ebenfalls in großer Anzahl
in dem Gewebe von Säugetieren
vorhanden.
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Die
Carboxypeptidasen wurden insbesondere in der Bauchspeicheldrüse und den
Mastozyten isoliert. Andere Carboxypeptidasen, die im Plasma zirkulieren,
wurden ebenfalls geklont, isoliert und sequenziert.
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Alle
diese Enzyme spielen sowohl abhängig
von ihrem Ort als auch von ihren physischen Eigenschaften IN VIVO
eine Rolle. Folglich werden die Carboxypeptidasen unterschiedlich
entsprechend ihrer Substrat-Spezifizität klassiert. Die Carboxypeptidasen
A weisen ein relativ großes
Spektrum auf: Sie hydrolysieren die C-terminale Peptidbindung der
letzten Aminosäure,
insbesondere wenn diese hydrophob ist (Phe, Leu, Val, Ala). Sie
hydrolysieren langsamer die Dicarboxylaminosäuren (Asp, Glu) sowie Glycin
(Gly), und sie hydrolysieren auf keinen Fall basische Aminosäuren wie
Arginin (Arg), Lysin (Lys), Histidin (His) oder Ornithin (Orn), ein
niederes Homologes von Lysin, oder sekundäre Aminosäuren wie Prolin (Pro) oder
Hydroxyprolin (Hyp).
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Die
Carboxypeptidasen B hydrolysieren spezifisch die letzten C-terminalen
basischen Aminosäuren, wie
beispielsweise Arg, Lys. Diese Klasse von Enzymen wird in Unterklassen
aufgeteilt, die von den Carboxypeptidasen H (ebenfalls Encephalin-Konvertase oder Carboxypeptidase
E genannt), M, N und U gebildet werden.
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Die
Carboxypeptidase E wurde in den sekretorischen Granula der Inseln
der Bauchspeicheldrüse,
den Nebennieren und der Hypophyse und dem Gehirn lokalisiert. Die Carboxypeptidase
M ist ein Membranenzym, das in zahlreichen Geweben und in Zellkulturen
vorhanden ist.
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Die
Carboxypeptidase N (nachstehend manchmal CPN genannt) ist ein Enzym,
das im Plasma zirkuliert. Es schützt
den Organismus gegen die vasoaktive und entzündliche Wirkung von Peptiden
mit einer C-terminalen basischen Aminosäure (vorzugsweise Lysin), die
in der Zirkulation freigesetzt sind. Das Enzym ist in seiner aktiven
Form im Blut vorhanden. Es wird gleichermaßen aufgrund seiner natürlichen
Substrate, welche Bradykinin, Kinine, Anaphylatoxine sind, auch
Kininase genannt.
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Schließlich sind
die Carboxypeptidasen U (unstable; instabil) (nachstehend manchmal
CPU genannt) Enzyme, die gleichermaßen die C-terminalen basischen
Aminosäuren,
mit einer Vorliebe für
Arginie, hydrolysieren, die aber im Gegensatz zu den Carboxypeptidasen
N sehr instabil sind, wenn sie in ihrer aktivierten Form vorliegen.
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Ein
neuer allgemeiner Überblick über die
Enzyme der Familie der Carboxypeptidasen wurde kürzlich von BOUMA et al. (1)
gegeben.
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TAFI
ist eine basische Zink-Metall-Carboxypeptidase (1-4). Es handelt
sich genauer um eine Carboxypeptidase U, da seine Aktivität bei 37°C instabil
ist. Dieses Enzym, dessen cDNA und die entsprechenden Aminosäuresequenzen
beim Menschen beispielsweise in dem Patent
US 5,206,161 beschrieben sind, ist
ein plasmatisches Protein, dessen Rolle bei der Regulierung der
Fibrinolyse anfänglich
aufgrund der IN VITRO Beobachtung einer Verzögerung der Lyse eines Gerinnsels
in Gegenwart von aktiviertem TAFI erwogen wurde.
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Der
aktivierte TAFI spaltet die Arginin- und Lysinreste, die an COOH-terminaler
Stelle von Fibrin freigelegt sind. Diese Hydrolyse führt zu einer
Minderung der Anzahl von Bindungsstellen des Plasminogens und von
tPA auf der Oberfläche
des Fibringerinnsels, und somit zu einer Minderung der Umwandlung
des Plasminogens in Plasmin durch tPA.
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TAFI
wurde aufeinanderfolgend mit dem Namen Procarboxypeptidase B (pro-PCPB),
dann instabile Procarboxypeptidase (proCPU: unstable ProCarboxypeptidase)
und Procarboxypeptidase R (CPR) aufgrund einer carboxypeptidasischen
Aktivität
an Argininresten bezeichnet. Die Zymogenform ist ein Glycoprotein
mit Einzelkette mit 60 KDa, in der Leber synthetisiert und im Plasma
zirkulierend.
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Das
Spalten des Zymogens wird größtenteils
durch Thrombin auf Ebene der Stelle arg 92 bewirkt. Durch diese
Proteolyse wird ein N-terminales Peptid mit 92 Aminosäuren, das
mehrere Glykosylierungsstellen aufweist, freigesetzt. Die katalytische
Wirkung des Thrombins an TAFI wird beträchtlich durch Thrombomodulin
in Gegenwart bivalenter Ionen gesteigert. Die Aktivierungsgeschwindigkeit
des durch Thrombin katalysierten TAFI ist somit aufgrund der Bildung
eines ternären
Komplexes mit Thrombomodulin mehr als 1000-fach gesteigert.
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Aktiviertes
TAFi (TAFIa) wird durch den C-terminalen Bereich des Zymogens gebildet
und weist 309 Aminosäuren
auf.
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Aufgrund
seiner Schlüsselrolle
bei den Regulierungsmechanismen für die Fibrinolysevorgänge hat
es sich sehr schnell als nützlich
erwiesen, die Menge an konstitutionellem TAFI und aktivierbarem
TAFI messen zu können,
die in dem Plasma in unterschiedlichen pathologischen Zuständen vorhanden
ist.
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Mehrere
Verfahren zur Dosierung der Aktivität unterschiedlicher Carboxypeptidasen
unter Verwendung spezifischer Substrate wurden im Stand der Technik
beschrieben.
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So
haben WOLFF et al. (5) die Leistungen der synthetischen Substrate
Hip-Arg, Hip-Lys,
Hip-Orn an durch Chromatographie gereinigten Carboxypeptidasen B
der Bauchspeicheldrüse
durch Messen der Unterschiede in der UV-Absorption verglichen.
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1970
haben S. SUZUKI et al. (6) die Detektion des Hydrolyseprodukts verbessert,
indem durch das Reagenz TT (2, 4, 6 Trichlor-5-triazin) freigesetztes
Benzoylglycin derivatisiert wurde. Diese Derivatisierung wirkte
spezifisch an dem CH2 des α-Glycins
einer einzigen freien Säurefunktion.
Das Derivat wird kräftig
gelb (maximale Wellenlänge
bei 382 nm).
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Dieses
Verfahren der Entwicklung einer Gelbfärbung der Hippurylreste wurde
in der Folge von vielen Verfassern genutzt.
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1972
haben K. LORENTZ et al. (7) eine Reaktion zum Färben von freigesetztem Arginin,
dieses Mal durch Wirkung von Carboxypeptidasen B auf einem Hip-Arg-Substrat unter
Verwendung von p-Benzochinon als Reagenz verwendet. Auf diese Weise
weist das gefärbte
Derivat eine maximale Wellenlänge
von 480 nm auf.
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1980
haben Th. H. Plummer et al. (8) ein synthetisches Substrat verwendet:
Furylacryloyl-Ala-Lys zum Quantifizieren von Carboxypeptidasen N,
das Lesen wird bei 324 nm (nahes UV, aber nicht sichtbar) durchgeführt.
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1985
haben G.H. Fischer et al. (9) ein durch N-terminale Dansylierung
eines für
die zu dosierende Carboxypeptidase spezifischen Peptids fluoreszierendes
Substrat verwendet. Für
diese Dosierung war für
eine gute Trennung der Spezies vor dem Lesen ein Schritt der Extraktion
der Hydrolyseprodukte erforderlich.
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1986
haben H. SARUTA et al. durch ein kalorimetrisches Verfahren die
Aktivität
von Carboxypeptidase A (10) bestimmt. Sie haben ein spezifisches
Enzym verwendet: "Hippuricase" zum Hydrolysieren
des Hippuricyl-Derivats, welches wiederum durch Hydrolyse des Hydroxy-Hippuricyl-Phg-Substrats
durch CPA erhalten wurde. Die Reaktion wurde schließlich mit
4-Aminoantipyrin nachgewiesen, um ein Chinonimid-Farbstoff zu ergeben, der bei 505 nm
absorbiert.
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1998
haben NAM JOO HONG et al. ein mit einem Arginin-Analogen, Thiaarginin,
synthetisiertes Substrat verwendet, um CPB zu dosieren (11).
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Jedoch
wurden die oben beschriebenen kolorimetrischen Verfahren zum einen
nie verwendet, um spezifisch die enzymatische Aktivität von CPN
oder CPU, insbesondere TAFI, zu dosieren, und weisen zum anderen
bestimmte Nachteile auf, die nicht mit einem einfachen und effizienten
Dosierungstest dieser Art Enzym durch Kolorimetrie vereinbar sind.
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Je
nach Fall ist:
- – entweder die Derivatisierungsreaktion,
die zu einem gefärbten
Produkt führt,
nicht für
die bei der Hydrolyse freigesetzten Spezies spezifisch,
- – oder
die Derivatisierungsreagenzien sind sehr toxisch und können nicht
in industriellem Maßstab
verwendet werden,
- – oder
das Verfahren zum Färbungsnachweis
ist sehr langwierig und weist viele Einschränkungen auf und kann nicht
auf einfache Weise automatisiert werden.
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1996
haben W.L. Mock et al. ein Verfahren zur Dosierung einer extrazellulären Zink-Endoprotease bakterieller
Herkunft, Thermolysin, mittels synthetischer Substrate, die sich
unter Wirkung von enzymatischer Hydrolyse einfärben (12), beschrieben. Dazu
haben die Verfasser Dipeptidverbindungen synthetisiert, die aus einem
Leuzinrest gebildet sind, der eine N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-Gruppe
trägt,
die auf Höhe
der Aminfunktion gepfropft ist, sowie einer anderen neutralen Aminosäure (Leu,
Ala, Phe oder Gly).
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Das
Einbinden einer Arazoformylgruppe ergibt eine stark gefärbte Verbindung.
In Gegenwart von Thermolysin reorganisiert sich das Farbstoffmolekül während der
chemischen Hydrolysefunktion gemäß einem
Mechanismus, der in (12-13) gut beschrieben ist, was nicht gefärbte Produkte
ergibt (Anizol-Fragment, N2, CO2 und
Aminosäure).
Es ist somit einfach, der Geschwindigkeit des Enzyms anhand der
Entfärbungsgeschwindigkeit
des Mediums zu folgen.
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Die
gleichen Verfasser haben ebenfalls ein kinetisches Verfahren der
Dosierung durch Spektrophotometrie beschrieben, das auf den gleichen
Grundlagen basiert wie das vorgenannte für Carboxypeptidase A (13) und
Carboxypeptidase B aus der Bauchspeicheldrüse eines Schweins (14).
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In
diesem Fall waren die verwendeten Verbindungen aus einer einzigen
Aminosäure
gebildet, die dafür
bekannt ist, durch Carboxypeptidase A (Phe, Leu) oder Carboxypeptidase
B (Lys), die eine N-Arazoformylgruppe trägt, gespalten zu werden. Dem
enzymatischen Spalten dieser Verbindungen in nicht gefärbte Produkte
schließt
sich das Messen der fortschreitenden Entfärbung des Mediums an.
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Ausgehend
von diesen Erkenntnissen haben die Verfasser der vorliegenden Erfindung
neue gefärbte Verbindungen
synthetisiert, um mittels kolorimetrischen Verfahrens die Aktivität von Carboxypeptidasen
U, und insbesondere die Aktivität
von TAFI, zu messen.
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Gemäß einem
ersten Gegenstand ist es somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
neue Verbindungen vorzusehen, die Substrate für Carboxypeptidase U, und insbesondere
Substrate für
aktiviertes TAFI, bilden. Diese Verbindungen sind chromogene Substrate.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Arazoformylverbindungen
der folgenden allgemeinen Formel (1) handelt:
in welcher:
- – R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3
- – R3 = die Seitenkette einer durch eine Carboxypeptidase
A hydrolysierbaren Aminosäure
(oder ein durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbares Aminosäureradikal).
- – R4 = ein basisches Aminosäureradikal.
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Insbesondere
ist R3 aus den hydrophoben Aminosäureradikalen
gewählt,
wie beispielsweise:
- – Tyrosin:
- – Phenylalanin:
- – Alanin:
R3 = -CH3
- – Valin:
R3 = -CH-(CH3)2
- – Leuzin:
R3 = -CH2-CH-(CH3)2
- – Isoleuzin:
- – Phenylglyzin:
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R4 wird genauer gewählt aus den Aminosäureradikalen,
wie beispielsweise:
- – Arginin:
- – Lysin
(R4 = -(CH2)4-NH2)
- – Ornithin
R4 = -(CH2)3-NH2
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Vorzugsweise
stellt R3 einen aromatischen Aminosäurerest
dar, und insbesondere Phenylalanin oder Tyrosin, und R4 Arginin
oder Lysin.
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R1 wird vorzugsweise gewählt aus:
- – H und
-CH3, und
R2 wird
vorzugsweise gewählt
aus:
-CH3, -O-CH3 und
-S-CH3
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Eine
bevorzugte Familie von Verbindungen gemäß der Erfindung wird dargestellt
durch die allgemeine Formel:
in welcher:
- – A
=
- – R1, R2 = H, -CH3, (CH3)2CH-,
CH3-O-, -Cl, -CF3,
- – R3 = ein durch eine Carboxypeptidase A hydrolysierbares
Aminosäureradikal.
- – R4 = ein basisches Aminosäureradikal.
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R3 stellt vorzugsweise Phenylalanin oder Tyrosin
dar und R4 stellt vorzugsweise Arginin oder
Lysin dar.
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R1 wird vorzugsweise gewählt aus:
- – H und
-CH3, und
R2 wird
vorzugsweise gewählt
aus:
- – CH3, -O-CH3 und -S-CH3
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Eine
besonders bevorzugte Verbindung der Familie der vorliegenden Erfindung
ist eine Verbindung der Formel (I), in welcher:
wobei die Verbindung
aus der Gruppe gewählt
ist, die aus den folgenden Verbindungen gewählt ist, bei welchen: - *die
Zahlen in Klammern bestimmen die Position der Methylgruppen an dem
Phenylradikal.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere, im Rahmen der obenstehenden Definitionen,
jede Formel, die der Formel (I) entspricht und mögliche Kombinationen der Gruppen
A, R1, R2, R3 und R4, von denen eine bevorzugte Definition oben
genannt ist, zum Ergebnis hat.
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Nachstehend
werden die so definierten Verbindungen unterschiedslos "Verbindungen der
Formel (I)" oder "Substrate der Formel
(I)" genannt.
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Gemäß einem
zweiten Gegenstand hat die vorliegende Erfindung zum Ziel, ein Verfahren
zur kolorimetrischen Dosierung der Aktivität einer Carboxypeptidase CPU
in einer biologischen Probe vorzusehen, bei welchem:
- – die
Probe mit einer chromogenen Verbindung der Formel (I) wie oben definiert
und einem Enzym der Familie der Carboxypeptidasen A unter Bedingungen,
die die Hydrolyse der Probe ermöglichen,
in Kontakt gebracht wird, und
- – die
Hydrolyse der Verbindung der Formel (I) durch CPU der Probe durch
Messen des Fortschreitens der Entfärbung (entsprechend einer Minderung
der Absorption) bei einer Wellenlänge, die aus dem Absorptionsspektrum
der Verbindung gewählt
wird, bestimmt wird.
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Die
Minderung der Färbung
resultiert aus der Doppelhydrolyse des Substrats der Formel (I)
durch die Carboxypeptidasen U der Probe einerseits und durch die
Carboxypeptidase A andererseits.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wird vorzugsweise mittels einer Verbindung der Formel
(I) durchgeführt,
bei welcher die hydrophobe Aminosäure Phenylalanin oder vorzugsweise
Tyrosin ist und die basische Aminosäure Arginin oder Lysin ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird vorzugsweise mittels einer Verbindung der Formel (I) durchgeführt, bei
der R1 aus -H und -CH3 und
R2 aus -CH3, -O-CH3 und -S-CH3 gewählt ist.
Vorteilhafterweise ist in der Verbindung der Formel (I), wenn R1 H ist, R2 S-CH3.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wird vorteilhafterweise mit der Familie der Verbindungen
der Formel (I) durchgeführt,
bei welchen:
wobei R1 und R2 eine beliebige
der oben genannten Bedeutungen haben und R2 vorzugsweise
-S-CH3 ist.
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Genauer
ist die verwendete Verbindung der Formel (I) eine Phenylazoformylverbindung,
bei welcher:
wobei die Verbindung
aus der Gruppe gewählt
ist, die aus den folgenden Verbindungen gebildet ist, bei denen: - *die
Zahlen in Klammern bestimmen die Position der Methylgruppen an dem
Phenylradikal.
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Die
verwendeten Carboxypeptidasen A können aus unterschiedlichen
Quellen stammen, wie beispielsweise der Bauchspeicheldrüse oder
den Mastozytenzellen. Sie können
menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
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Im
Rahmen der Erfindung wird vorzugsweise Carboxypeptidase A aus der
Bauchspeicheldrüse
des Rinds verwendet.
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Das
Prinzip des Verfahrens gemäß der Erfindung
basiert auf einer Hydrolyse eines gefärbten Substrats der Formel
(I) wie oben beschrieben, durch Wirkung der gegebenenfalls in der
analysierten Probe vorhandenen Carboxypeptidase U in Verbindung
mit der Wirkung der dem Medium hinzugefügten Carboxypeptidase A. Diese
spezifische Hydrolyse führt
zu einer Löschung
der Färbung
der Ausgangsverbindung, die mittels eines Spektrophotometers verfolgt
werden kann.
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Genauer
erzeugt, unter Berücksichtigung
der Hydrolysespezifizitäten
der Carboxypeptidasen N oder U und A wie zuvor ausgeführt und
der strukturellen Eigenschaften der Verbindungen der Formel (I)
wie oben beschrieben, das in Kontakt Bringen einer Carboxypeptidase
A und einer aktivierten Carboxypeptidase U mit einer derartigen
Verbindung einen Bruch auf Höhe
der Bindung zwischen der ersten und der zweiten Aminosäure der
Verbindung aufgrund der Wirkung der Carboxypeptidase U, quasi gleichzeitig
gefolgt von einem Bruch auf Höhe
der Bindung zwischen der Azoformylgruppe und der ersten Aminosäure aufgrund
der Wirkung der Carboxypeptidase A.
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Das
Ergebnis dieser beiden Reaktionen ist eine Entfärbung des Ausgangsmediums.
Es ist somit einfacher, diese Entfärbung als Funktion der Zeit
zu verfolgen, indem man sich bei einer Absorptionswellenlänge des
Farbstoffs [Verbindung Formel (I)], vorzugsweise bei einer Wellenlänge entsprechend
seinem Absorptionsmaximum (Peak) anordnet.
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Diese
fortschreitende Entfärbung
ist für
die Kinetik der Hydrolyse repräsentativ.
Die Menge der anfänglich
in der Probe vorhandenen aktiven Carboxypeptidase U wird berechnet,
indem die gemessene optische Dichte mit der einer Eichkurve verglichen wird,
die beispielsweise aus einer Skala über die Konzentration von gereinigter
aktiver Carboxypeptidase U in Lösung
erstellt wurde.
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Umgekehrt
tritt, wenn die Probe keine Carboxypeptidase U enthält oder
wenn diese inaktiv ist, ein Bruch zwischen der ersten und zweiten
Aminosäure
der Verbindung der Formel (I) nicht auf, und somit kann die Carboxypeptidase
A nicht auf Höhe
der Bindung der gefärbten
Gruppe an der ersten Aminosäure
wirken. Somit wird keine Minderung der Färbung der Ausgangslösung beobachtet.
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Die
Erfindung sieht insbesondere ein Verfahren zur Dosierung der Aktivität einer
CPU in einer biologischen Probe, insbesondere einer Blutprobe wie
beispielsweise reines oder verdünntes
vollständiges
Blut oder Plasma, und vorzugsweise ein Verfahren zur Dosierung der
Aktivität
von TAFI in einer Blutprobe, insbesondere reines oder verdünntes Plasma,
vor.
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In
diesem Fall wird die zu testende Probe zuerst in Gegenwart einer
Pufferlösung
mit, falls erforderlich, einem Aktivator für die Carboxypeptidase, deren
Aktivität
gemessen werden soll (Lösung
nachstehend Aktivatorpuffer genannt), gebracht und für die Dauer
inkubiert gelassen, die erforderlich ist, um die Aktivierung der untersuchten
Carboxypeptidase zu erhalten. Das Inkubieren wird vorzugsweise bei
Umgebungstemperatur für 5
bis 20 Minuten, vorteilhafterweise 8 bis 12 Minuten, vorzugsweise
10 Minuten, durchgeführt.
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Gemäß einem
bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsverfahren
kann der Aktivator für
die Carboxypeptidase ein Aktivator sein, insbesondere ein Koagulationsfaktor,
der reagieren gelassen wird, um die Carboxypeptidase U, insbesondere
TAFI, zu aktivieren.
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In
diesem Fall wird dann der Mischung ein Inhibitor für Serin-Proteasen
hinzugefügt,
um den Vorgang der Koagulation zu blockieren. Der Inhibitor für Serin-Proteasen
ist zum Beispiel PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon – Bachem – Art. Nr.
1065), das in einem Bereich der Endkonzentration von 1 bis 50 μM, vorzugsweise
30 μM, entsprechend
den Anfangskonzentrationen von 10 bis 250 μM, und vorzugsweise 150 μM verwendet
wird. Andere Verbindungen, wie beispielsweise Pefabloc [4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluoridhypochlorid – Pentapharm – Art. 399.01],
die vor zugsweise zu einer Konzentration von 0,1 mM verwendet werden,
sind gleichermaßen
geeignet.
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Gleichzeitig
mit oder unmittelbar nach dem Hinzufügen des Inhibitors wird eine
der Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung in wässriger
Lösung
hinzugefügt.
Die Verbindung wird im Allgemeinen in einem Bereich von Endkonzentrationen
zwischen 0,25 und 10 mM, vorzugsweise zwischen 0,25 und 2,5 mM, vorteilhafterweise
zwischen 0,25 und 1 mM verwendet. Vorzugsweise wird sie zu 0,4 mM
verwendet.
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Nach
einer erneuten Inkubationsphase, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur,
während
welcher das Substrat der Formel (I) auf Höhe der zweiten Aminosäure durch
die CPU der Probe, deren Aktivität
untersucht wird, gebrochen werden sollte, kann die Hydrolyse durch
Hinzufügen
von HCl und unmittelbar danach durch Hinzufügen einer Base zum erneuten
Anpassen des pH auf einen Wert zwischen 7 und 8, gestoppt werden.
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Dann
wird die optische Dichte (OD) der so erhaltenen Mischung zum ersten
Mal ohne Hinzufügen
von CPA zu dem Medium gemessen. Danach wird dem Medium CPA hinzugefügt und die
OD erneut gemessen. Das Fortschreiten des Entfärbens kann mit dem Spektrophotometer
verfolgt werden. Dadurch wird die Hydrolyse des Substrats der Formel
(I) durch gemeinsame Aktionen der CPU der Probe und der CPA übermittelt.
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Die
gemessenen delta OD (Δ OD)
werden mit den Werten einer Eichkurve verglichen, die zum Beispiel aus
einer untersuchten Probe erhalten werden kann, die nur wenig CPU
aufweist und einen Überstand
dieses gereinigten Enzyms aufweist.
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Die
oben beschriebene Vorgehensweise stellt eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung dar. Jedoch sind mehrere Varianten möglich, besonders
hinsichtlich der Abfolge des Hinzufügens der unterschiedlichen
verwendeten Verbindungen sowie der Art dieser Verbindungen. Diese
gehören
ebenfalls zur Definition der vorliegenden Erfindung.
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Somit
ist es beispielsweise möglich,
das Substrat der Formel (I) direkt zu Beginn des Verfahrens zur gleichen
Zeit wie den Aktivatorpuffer für
die Koagulation einzusetzen.
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Ebenfalls
kann die Dosierung anhand von zwei Aliquoten des gleichen Reaktionsmediums
durchgeführt
werden, von denen nur eins mit CPA behandelt wird. Im Anschluss
wird die ΔOD
der beiden Aliquote gemessen.
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In
dem Fall, dass der Aktivatorpuffer die Koagulation aktiviert, kann
die Aktivierung auf unterschiedliche, dem Durchschnittsfachmann
bekannte Wege durchgeführt
werden und routinemäßig bei
Koagulationstests verwendet werden.
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Diese
Aktivierungswege sind insbesondere:
- – der Aktivierungsweg über den
Thrombin/Thrombomodulinkomplex. Diese erste Möglichkeit stellt die bevorzugte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar.
- – der
Aktivierungsweg über
den aktivierten XI-Faktor, der in diesem Fall das Thrombin in dem
Aktivatorpuffer ersetzt. Um die Reaktion zu beschleunigen, kann
es vorteilhaft sein, dem Medium gleichermaßen Thrombomodulin hinzuzufügen.
- – der
Aktivierungsweg über
Gifte, insbesondere Schlangengifte, gleichermaßen mit eventuellem Hinzufügen von
Prothrombin und/oder Thrombomodulin zu dem Medium. Die vorzugsweise
verwendeten Gifte sind die Gifte aus der Familie der "thrombin-like", wie beispielsweise
das Gift Arkistrodon rhodostoma oder Bathrops atrox, sowie die Aktivatorgifte
für Prothrombin,
wie beispielsweise Notechis scutatus oder Echis carinatus (15-18).
- – der
Aktivierungsweg durch Tissue Factor (Gewebsfaktor) in Gegenwart
von Phospholipiden und Calcium (Aktivierung auf exogenem Weg gemäß den Prinzip
einer Quickzeit).
- – der
Aktivierungsweg der Kontaktphase.
- – der
Aktivierungsweg durch Plasmin.
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Vorteilhafterweise
ermöglicht
das Verfahren gemäß der Erfindung,
für dieselbe
Probe einerseits die Aktivität
der in dieser vorhandenen "konstitutionellen" CPU, zum Bei spiel
die CPU, die in "natürlich" aktiver Form vorliegt
(das heißt
ohne Starten der Aktivierung durch einen Aktivatorpuffer), und andererseits
die Aktivität
von aktivierbarer CPU, das heißt
von in der Probe in inaktiver Form vorhandener CPU, deren Aktivität während des
Aktivierungsvorgangs in Verbindung mit der Wirkung des Aktivatorpuffers
eingeleitet oder erzeugt wird, zu messen.
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Dazu
wird die Hydrolyseaktivität
auf einem Substrat der Formel (I) einer Probe gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren verglichen, indem die Probe entweder in
Gegenwart eines Aktivatorpuffers (Detektion der Gesamtaktivität der in
der Probe vorhandenen CPU) oder in Gegenwart eines physiologischen
Puffers ohne Aktivator (Detektion der Aktivität der konstitutionellen CPU)
gebracht wird.
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Der
Unterschied des delta OD zwischen den beiden Messungen ermöglicht es,
die Aktivität
der aktivierbaren CPU, die in der Probe vorhanden ist, zu erhalten.
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Gemäß einer
bevorzugten Variante hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Dosierung von aktiviertem TAFI in einer biologischen Probe,
insbesondere einer Blutprobe, zum Gegenstand, wobei für das Verfahren
eine der Verbindungen oder eins der Substrate der Formel (I) wie
zuvor beschrieben verwendet wird.
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Die
Aktivität
von konstitutionellem und/oder aktivierbarem TAFI wird gemessen,
indem die Probe wie zuvor beschrieben in Gegenwart oder bei Nichtvorhandensein
eines für
TAFI spezifischen Inhibitors behandelt wird.
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Der
Inhibitor, der bevorzugt verwendet wird, ist CPI ("Carboxypeptidase
Inhibitor von Potato Tubers), dessen Verwendung in in vitro und
in vivo Studien über
die Funktion von TAFI in der Literatur (Bezug 1) ausgiebig beschrieben
wurde. Dem Durchschnittsfachmann ist heute bekannt, dass CPI spezifisch
TAFI inhibiert, ohne die Aktivität
anderer plasmatischer CP zu verändern.
Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung kann
CPI in einem Konzentrationsbereich von 0,10 bis 0,50 mM (Anfangskonzentrationen),
oder 2 bis 10 μM (Endkonzentrationen)
verwendet werden. Vorzugsweise wird es zu 7 μM (Endkonzentration) oder 0,38
mM (Anfangskonzentration) verwendet.
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Gemäß dem Prinzip
dieser bevorzugten Variante wird die Probe durch den Aktivierungspuffer
für TAFI aktiviert,
zum Beispiel einem Aktivierungspuffer für die Koagula tion durch den
Thrombin/Thrombomodulinkomplex, und gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren
entweder in Gegenwart oder bei Nichtvorhandensein eines Inhibitors
für TAFI
behandelt.
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Der
Unterschied in der Färbung
des Mediums mit und ohne Inhibitor für TAFI ermöglicht somit, die genaue enzymatische
Aktivität
des aktivierten TAFI (TAFIa) in der Probe zu bestimmen.
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Genauer
kann das erfindungsgemäße Verfahren
gemäß der folgenden
Vorgehensweise durchgeführt werden:
die zu testende Probe wird in zwei oder mehr, falls erforderlich,
Aliquote geteilt, je nachdem, ob die Aktivität des gesamten in der Probe
enthaltenen TAFI bestimmt werden soll oder ob gewünscht wird,
zwischen der Aktivität
des konstitutionellen TAFI und jener des aktivierbaren TAFI zu unterscheiden.
- – Ein
erstes Aliquot, welches den Inhibitor für TAFI enthält, wird aktiviert und gemäß dem zuvor
beschriebenen Verfahren behandelt. Dieses wird somit nur eine geringe
Entfärbung
des Mediums erzeugen, was das Ergebnis einer Resthydrolyse des Substrats
der Formel (I) durch andere in der Probe vorhandene Carboxypeptidasen
ist.
- – Ein
zweites Aliquot wird auf identische Weise wie zuvor behandelt, aber
bei Nichtvorhandensein eines Inhibitors für TAFI. Daraus entsteht eine
starke Entfärbung
des Mediums verbunden mit der Hydrolyse des Substrats der Formel
(I) durch in der Probe aktiviertes TAFI.
- – Der
Unterschied der Färbung
(Δ OD) zwischen
dem ersten und dem zweiten Aliquot wird gemessen. Dieser steht für die spezifische
Aktivität
des aktivierten TAFI in der Probe.
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Wird
gewünscht,
zwischen der spezifischen Aktivität des aktivierbaren TAFI und
jener des konstitutionellen TAFI zu unterscheiden, wird ein drittes
Aliquot der gleichen Probe verwendet, von der gleichermaßen die
Hydrolyseaktivität
an dem Substrat der Formel (I) gemessen wird, aber bei der die Aktivierung
nicht ausgelöst
wird, indem dem Medium kein Aktivierungspuffer hinzugefügt wird.
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Die Δ OD der unterschiedlichen
Aliquote ermöglichen
es, entweder die Aktivität
des gesamten TAFI der Probe zu erhalten oder nur jene des konstitutionellen
TAFI, und somit daraus jene des aktivierbaren TAFI abzuleiten.
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Gemäß einem
dritten Gegenstand hat die Erfindung zum Ziel, ein Diagnose-Kit
zum Dosieren einer CPU vorzusehen, wobei das Diagnose-Kit ein Substrat
der Formel (I) wie zuvor beschrieben aufweist.
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Vorzugsweise
ist das Diagnose-Kit gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Kit zum Messen der Aktivität von TAFI in einer Blutprobe.
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Ein
derartiges Diagnose-Kit weist insbesondere auf:
- – einen
Aktivator für
TAFI, insbesondere einen Aktivatorpuffer für TAFI,
- – Carboxypeptidase
A,
- – ein
Substrat der Formel (I),
- – einen
Inhibitor für
TAFI.
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Das
Kit weist gleichermaßen
optional einen Inhibitor für
Serin-Proteasen auf.
-
Jeder
dieser Bestandteile liegt vorzugsweise als Pulver oder in lyophilisierter
Form vor.
-
Die
nachstehenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren stellen die vorliegende
Erfindung dar.
-
1: Absorptionspektrum unterschiedlicher
synthetisierter Verbindungen der Formel (I), gemessen mit einem
UV-Vis-Spektrophotometer.
-
2:
Analyse von AAFFR, bewirkt durch saure Hydrolyse.
-
3:
Eichkurve, aufgestellt anhand eines an TAFI armen Plasmas, übersättigt mit
gereinigtem TAFI, um eine Skala über
die Konzentration zu erhalten, die von 0 bis 26 μg/ml reicht.
-
4:
Eichkurve für
eine Skala über
die Konzentration, erhalten aus einem Plasma-Pool. Die Eichung wird mittels eines
Verfahrens zur Erzeugung von Thrombin durch geführt. Die kolorimetrische Dosierung
wird mit dem Chromogen-Substrat 4-MTPAFYR durchgeführt.
-
BEISPIEL Nr. 1:
-
Synthese einer Gruppe
von Azoformyl-Verbindungen gemäß der Erfindung.
-
Die
untenstehende Tabelle 1 gibt die chemischen Formeln von 8 der bevorzugten
Verbindungen aus den Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung
an. Ihre mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UVIKON-KONTRON) gemessenen
Absorptionsspektren sind in 1 zusammengefasst.
-
Nachstehend
wird genau die Synthese einer dieser Verbindungen, der Verbindung
Nr. 4 (MxPAFFR), beschrieben. Die für diese Verbindung untenstehend
beschriebenen Schritte sind für
jede der anderen Verbindungen identisch, mit Ausnahme der Verbindung
Nr. 5 (MxPAFFK), für
die ein zusätzlicher
Schritt des Entschützens
des Lysins erforderlich ist (siehe Reaktionsschema und nachstehende
Erklärungen). TABELLE
1:
-
A/ Synthese von 4-Methoxyphenylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 4)
-
Einleitung:
Alle untenstehend beschriebenen Schritte sind für jeden Farbstoff identisch.
Jedem Schritt folgt eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und
eine Analyse der Aminosäuren
für die
Kopplungen mit Phenylalanin und Arginin.
-
1.
Schritt: Grignard-Reaktion Reaktionsschema:
-
Vorgehensweise:
Es werden 1 Äq.
4-Bromanisol und 1 Äq.
Magnesium vorbereitet. Das Magnesium und 20 Masse-% des 4-Bromanisols
werden in einen Dreihalskolben eingebracht, aufgenommen in wasserfreiem
Tetrahydrofuran (2 mL/mmol), und die Apparatur wird unter Stickstoff
gesetzt. Die Reaktion wird gestartet, indem der Dreihalskolben an
einem Punkt mit einem Heißluftgebläse erwärmt wird,
das Reaktionsmedium wird braun. Wenn die Reaktion startet (Sprudeln
auf der Oberfläche
des Magnesiums), wird bei 90°C
unter Rückfluss
gesetzt, dann langsam der Rest des 4-Bromanisols, aufgenommen in wasserfreiem
THF (2 mL/mmol), hinzugefügt.
Der Rückfluss
wird nach 1 h gestoppt. Das 4-Methoxyphenylmagnesiumbromid wird, wie
es ist, für
den folgenden Schritt verwendet (Farbe braun).
-
Anmerkung:
Die Gläser
und das Magnesium werden zuvor im Wärmeschrank bei 120°C getrocknet und
die anderen Produkte im Exsikkator.
-
Retentionszeit:
Da das Grignard-Reagenz eine sehr instabile und gegenüber Wasser
empfindliche Verbindung ist, werden drei charakteristische Retentionszeiten
für die
bei der HPLC-Analyse gebildeten Abbauprodukte erhalten:
- Retentionszeit
1: 2,68 min
- Retentionszeit 2: 3,32 min
- Retentionszeit 3: 5,38 min
-
2.
Schritt: Koppeln mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
Es werden 1 Äq.
Di-t-butylazodicarboxylat und 1 Äq.
4-Methoxyphenylmagnesiumbromid
(Grignard-Reagenz) in wasserfreiem THF (2 mL/mmol) aufgenommen.
Jeweils zwischen 0-5°C
abkühlen.
Das Grignard-Reagenz wird zu Di-t-butylazodicarboxylat hinzugefügt. Es wird
10 min gerührt,
dann 1,02 Äq.
Essigsäure
hinzugefügt,
dann auf Umgebungstemperatur erwärmen
gelassen. Es wird eine Extraktion Wasser/Ether durchgeführt. Die
Etherphase wird getrocknet, dann bis zur Trockne verdampft. Es wird
ein gelbes Öl
erhalten.
-
3.
Schritt: Entschützung Reaktionsschema
-
-
Vorgehensweise:
Es werden 1 Äq.
N, N'-bis-(t-butoxycarbonyl)-4-(methoxy)phenylhydrazin
in Isopropanol (10,2 mL/mmol) aufgenommen, dann HCl in Dioxan zu
4,8 M (2 mL/mmol) hinzugefügt.
In Rückfluss
bringen (80°C).
Nach 15 min abkühlen,
dann Ether (5 mL/mmol) hinzufügen.
Das 4-Methoxyphenylhydrazinhydrochlorid
fällt aus.
Filtern und Trocknen. Das Pulver wird in Wasser aufgenommen, dann
auf einen pH von 7 gebracht. Es wird eine Extraktion Wasser/Dichlormethan
durchgeführt
und die Dichlormethanphase bis zur Trockne verdampft. Es wird 4-Methoxyphenylhydrazin
(gelbes Pulver) erhalten, das getrocknet ist.
-
4.
Schritt: Koppeln mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
Es werden 1,4 Äq.
Diphenylcarbonat in Benzol (0,25 mL/mmol) aufgenommen, dann bei
120°C in
Rückfluss
gebracht. Es wird langsam 1 Äq.
in Benzol (0,7 mL/mmol) aufgenommenes 4-Methoxyphenylhydrazin hinzugefügt. Der
Rückfluss
wird nach 6 h gestoppt. Das Reaktionsmedium wird konzentriert, dann
eine Kristallisierung Hexan/Benzol (4/1) durchgeführt. Die
weißlichen
Kristalle werden gefiltert und im Exsikkator getrocknet.
-
5.
Schritt: Koppeln mit Phenylalanin Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
1,2 Äq.
in Dimethylformamid (3,33 mL/mmol) aufgenommenes Triethylammoniumsalz
von Phenylalanin werden unter Rückfluss
(95°C) gesetzt.
Es wird langsam 1 Äq.
in Dimethylformamid (2 mL/mmol) aufgenommenes 4-Methoxyphenylhydrazoformat hinzugegeben.
Der Rückfluss
wird nach 1 h 30 gestoppt, auf Umgebungstemperatur kommen gelassen,
konzentriert. Ansäuern
(pH = 2). Reinigen durch Chromatographie (weißliche Kristalle).
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
Es wird 1 Äq.
N-(4-Methoxyphenylhydrazoformyl)-L-phenylalanin in ultrareinem Wasser
(20,8 mL/mmol) aufgenommen, welches 1 Äq. Natriumhydroxid und 1 Äq. Ammoniumacetat
enthält. Es
wird 1 Äq.
in ultrareinem Wasser (4,2 mL/mmol) aufgenommenes Natriummetaperiodat
hinzugefügt.
Nach 20 min wird das Reaktionsmedium angesäuert (pH = 2), dann durch Chromatographie
gereinigt (orange Kristalle).
-
7.
Schritt: Koppeln mit Arginin Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
Es wird 1 Äq.
Argininmethylesterhydrochlorid in Dimethylformamid (3 mL/mmol) aufgenommen.
Es werden 1,1 Äq.
DIAE (Diisopropylethylamin), 1 Äq.
N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanin, dann 1,1 Äq. TBTU
(O-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
hinzugefügt.
Es wird die erforderliche Menge DIAE hinzugefügt, um einen pH von 7-8 zu
erhalten. Nach 5 min wird bis zur Trockne verdampft und durch Chromatographie
gereinigt (orange Kristalle).
-
8.
Schritt: Verseifung Reaktionsschema
-
Vorgehensweise:
Es wird 1 Äq.
N-(4-methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanylargininmethylester
in einer Mischung Wasser/Methanol (Verhältnis: 1/2; 3 mL/mmol) aufgenommen.
Es werden 3 Äq.
Natriumhydroxid 1N hinzugefügt.
Nach 1 h Ansäuern
des RM, Konzentrieren, danach Durchführen einer Extraktion Wasser/Dichlormethan.
Die Dichlormethanphase wird verdampft, dann getrocknet. Es wird
N-(4-methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanylarginin erhalten, welches
ein oranges Pulver ist.
-
Eine
Aminosäureanalyse
des Endprodukts wird nach saurer Hydrolyse durchgeführt, um
die Homogenität
der Sequenz zu kontrollieren. Die Ergebnisse dieser Analyse sind
in dem Chromatogramm der 2 zusammengefasst.
-
Analysebedingungen:
-
- – Kette
HPLC AAA; Derivatisierung vor Säule
mit PITC (Phenylisocyanat)
- – Säule C18;
100A; 5 μ;
250 × 4,6
mm
- – Detektion
bei 254 nm; Durchsatz = 1 mL/min
- – Elutionsmittel:
A:
Acetatpuffer pH 5,74
B: Puffer 70% CH3CN,
30% AcONa; 32 mM; pH = 6,10
C: CH3CN
-
Die
Protokolle zur Synthese der anderen Verbindungen basieren auf den
gleichen Schritten wie zuvor beschrieben. Diese sind in den folgenden
Reaktionsschemen zusammengefasst.
-
Die
bei jedem Schritt der Synthese dieser Verbindungen erhaltenen Retentionszeiten
sind in der untenstehenden Tabelle II zusammengefasst: TABELLE
II: Bei HPLC bei jedem Schritt erhaltene Retentionszeiten für die anderen
synthetisierten Farbstoffe
-
Analysebedingungen:
-
- – Säule C18;
5 μ; 100 × 4,6 mm
- – Detektion
bei 254 nm; Durchsatz = 1 mL/min
- – Gradient:
0' ⎕ 10%B
10' ⎕ 90%B
- – mit
A: Wasser zu 0,1% Trifluoressigsäure
B:
Acetonitril zu 0,1% Trifluoressigsäure
-
B/ Synthese von 2,3-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 1):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin
-
-
-
C/ Synthese von 2,4-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 2):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin
-
-
D/ Synthese von 2,5-Dimethylphenylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 3):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
-
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin
-
-
-
E/ Synthese von 4-Methoxyphenylazoformylphenylalanyllysin:
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Lysin
-
-
-
9. Schritt: Entschützung
-
Diese
bestimmte Verbindung erfordert einen zusätzlichen Schritt, um die Seitenkette
des Lysins zu entschützen
(ε-Boc:
N-ε-tertiobutoxycarbonyl).
-
Vorgehensweise:
Es wird 1 Äq.
N-(4-Methoxyphenylazoformyl)-L-phenylalanyl-L-lysin(ε-Boc) in Dichlormethan (3 mL/mmol)
in einem Kolben aufgenommen. Dann wird gerührt. Es wird ein Scheidetrichter,
welcher Trifluoressigsäure
(3 mL/mmol) enthält,
angeschlossen. Es wird langsam (tröpfchenweise) hinzugefügt. Nach
15 min Konzentrieren des Reaktionsmediums und Reinigen durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie.
Schließlich
wird ein orangefarbenes Pulver erhalten.
-
F/ Synthese von 3-Chlor-p-tolylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 6):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz Reaktionsschema
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
-
3.
Schritt: Entschützung Reaktionsschema
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin Reaktionsschema
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin Reaktionsschema
-
8.
Schritt: Verseifung Reaktionsschema
-
G/ Synthese von 3-Chlor-p-tolylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 7):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz Reaktionsschema
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat Reaktionsschema
-
3.
Schritt: Entschützung Reaktionsschema
-
4.
Schritt• Kopplung
mit Diphenylcarbonat Reaktionsschema
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin Reaktionsschema
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo" Reaktionsschema
-
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin Reaktionsschema
-
8.
Schritt: Verseifung Reaktionsschema
-
H/ Synthese von 4-Methylthiophenylazoformylphenylalanylarginin
(Verbindung 8):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Phenylalanin
-
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin
-
-
I/ Synthese von 4-Methylthiophenylazoformyltyrosylarginin
(Verbindung 9):
-
1.
Schritt: Grignard-Reagenz
-
2.
Schritt: Kopplung mit Di-t-butylazodicarboxylat
-
-
4.
Schritt: Kopplung mit Diphenylcarbonat
-
5.
Schritt: Kopplung mit Tyrosin
-
-
6.
Schritt: Oxidation; Übergang
von der Form "hydrazo" in die Form "azo"
-
7.
Schritt: Kopplung mit Arginin
-
-
BEISPIEL NR. 2:
-
1-
Prinzip der Dosierung und verwendete Reaktionsprinzipien Prinzip
der Dosierung der enzymatischen Aktivität TAFIa
-
2. Beispiel: Protokoll
zur Dosierung der Aktivität
von TAFI entsprechend dem Verfahren gemäß der Erfindung
-
a) 1. Vorgehensweise:
Verfahren Thrombin – Thrombomodulin
-
Die
zu testende Plasmaprobe wird in zwei Aliquote geteilt, wobei zu
deren einem PIC (Calbiochem – Art.
217359) hinzugefügt
wird, zu dem anderen ein Puffer Hepes.
-
Die
beiden Aliquote werden dann auf identische Weise gemäß dem folgenden
Prinzip behandelt:
-
Aktivierung
des TAFI
-
- 150 μl
des Plasmas, verdünnt
zu 1/20 in Puffer Hepes (oder gereinigtem TAFI zu 13 μg/ml in Puffer
Hepes).
- 10 μl
PIC oder H2O
- 5 Minuten bei Umgebungstemperatur
- 150 μl
Aktivatorpuffer für
die Koagulation
- 10 Minuten bei Umgebungstemperatur
- 100 μl
PPACK + 100 μl
MxPAFFR (Substrat) (5 mM)
-
Test der Aktivität von TAFI
-
- 30 Minuten bei Umgebungstemperatur
- 100 μl
HCl 1M + 100 μl
NaOH 1M
-
Nachweis
-
- Verdünnung
zu 1/3 in Puffer Hepes
- Lesen der OD bei 382 nm
- 25 μl
Carboxypeptidase A
- Lesen der OD bei 382 nm nach 1 Minute
-
Mögliche Varianten der ersten
Vorgehensweise:
-
- – die
Dosierung kann bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt werden
- – das
Substrat kann von Anfang an eingeschlossen sein, zur gleichen Zeit
wie der Aktivatorpuffer
- – das
Lesen kann mittels HPLC durchgeführt
werden
-
Bevorzugte Endkonzentrationen
der unterschiedlichen Produkte:
-
- – PPACK:
H-D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon MG = 451 30 μM (Bachem – Art. Nr. 1065.
- – Pefabloc:
kann anstatt des PPACK verwendet werden: 0,1 mM (Pentapharm – Art. 399.01).
- – Substrat
(mxPAFFR): 1 mM
- – Carboxypeptidase
A: von der Bauchspeicheldrüse
des Rinds (Sigma – Art.
C 0386).
Fläschchen
von 5,1 ml zu 5000 Einheiten, 21 mg prot/ml, 47 Einheiten/mg Protein
Die
CPA wurde mit Vorfilter gefiltert, Filter 5 mm und Filter 0,45 μm, dazu werden
ml H2O hinzugefügt.
- – PIC:
verwendet zu 7 μm
1
mg PCI kann ungefähr
8 mg TAFI (50 U/mg) zu 50% entsprechend den Angaben des Herstellers
(Calbiochem) hemmen.
-
Die
Konzentration von 30 μM
PPACK entsprach einer Anfangskonzentration von 150 μM. Die Endkonzentration
von 1 mM des Substrats entsprach einer Anfangskonzentration von
5 mM. Die Endkonzentration von 7 μM
CPI entsprach einer Anfangskonzentration von 0,38 mM.
-
Die
Erfinder haben beobachtet, dass die oben angegebenen Konzentrationen
verändert
werden können,
um eine bis auf 4 μM
geminderte Endkonzentration an PPACK und eine geminderte Endkonzentration
an Substrat zu verwenden.
-
Aktivatorpuffer:
-
- – Der
bevorzugte Aktivierungsweg für
die Koagulation im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Aktivierungsweg
durch den Thrombin/Thrombomodulinkomplex. In diesem Fall weist der
verwendete Aktivatorpuffer die folgenden Bestandteile auf:
37 μl Thrombomodulin
zu 0 bis 80 nM und vorzugsweise zu 10 nM (Rabbit lung thrombomodulin – American Diagnostica – Art. 237).
6 μl Thrombin
zu 0,2 bis 10 NIH/ml und vorzugsweise 0,8 NIH/ml (Diagnostica Stago – Forschungsprodukt).
750 μl Calciumchlorid
zu 0 bis 80 nM und vorzugsweise zu 40 nM
705 μl Puffer
Hepes 9,4 mM pH = 7,6
-
Die
Konzentrationen sind für
eine Endmenge von 1498 μl
Aktivatorpuffer angegeben.
-
Anmerkung:
Der Puffer Hepes enthält:
Hepes 20 mM, KCl 4 mM und BSA 1%. Andere Tests wurden durchgeführt mit
Hepes 20 mM und NaCl 150 mM.
-
- – Wie
in der Beschreibung angegeben, sind andere Aktivierungswege möglich, darunter
insbesondere der Aktivierungsweg durch den Faktor XIa.
In diesem
Fall enthält
ein Beispiel für
den Aktivatorpuffer die folgenden Bestandteile:
5 μl Thrombomodulin
zu 30 U/ml
30 μl
reiner Faktor XIa (Calbiochem – Art.
233483).
88 μl
Puffer Hepes pH = 7,4 (Hepes 20 mM und NaCl 150 mM).
-
Die
Konzentrationen sind zu Beispielzwecken angegeben und können vom
Durchschnittsfachmann neu angepasst werden.
-
b) Zweite Vorgehensweise:
Verfahren zur Erzeugung von Thrombin
-
Ein
anderer Aktivierungsweg für
die Koagulation setzt Thrombin ein und erfordert die Verwendung
eines Aktivators für
die Kontaktphase.
-
Beispiel Nr. 3:
-
Erstellen einer Eichskala
mit dem Verfahren Thrombin/Thrombomodulin
-
Die
nachstehende 3 stellt eine Eichkurve dar,
die anhand eines an TAFI armen Plasmas, übersättigt mit gereinigtem TAFI,
erstellt wurde, um eine Skala über
die Konzentration von TAFI zu erhalten, die von 0 bis 26 μg/ml geht.
-
Die
verwendete Verbindung der Formel I ist MxPAAFR zu einer Konzentration
von 5 mM.
-
Die
entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren
gemessenen Δ OD
sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefasst: Tabelle
III
-
Wie
aus 3 hervorgeht, ist die Eichkurve für die untersuchten
Skalen an Konzentrationen linear. Dies deckt weitestgehend die normale
Zone ab, wobei TAFI in dem Organismus zu Konzentrationen von 5 bis 15 μg/ml vorhanden
ist.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
somit, sowohl einen schwachen TAFI-Gehalt als auch unnatürlich hohe
TAFI-Gehalte nachzuweisen.
-
Beispiel Nr. 4:
-
Erhaltene Ergebnisse bei
unterschiedlichen Plasmaarten
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde auf unterschiedliche Plasmaarten entsprechend dem in Beispiel
2 beschriebenen Protokoll angewendet.
-
Frisches Plasma, eingefrorenes
Plasma:
-
Die
Dosierung kann sowohl an frischem als auch an eingefrorenem Plasma
durchgeführt
werden, jedoch wird eine Minderung der OD zwischen den beiden beobachtet.
-
Dies
resultiert aus einer leichten Verschlechterung des TAFI beim Auftauen
(das Protein baut sich ab).
Frisches
Plasma | Eingefrorenes
Plasma |
9,4 μg/ml | 6,0 μg/ml |
11,2 μg/ml | 6,5 μg/ml |
10,7 μg/ml | 5,6 μg/ml |
-
Eingefrorenes Plasma,
lyophilisiertes Plasma
-
An
lyophilisiertem Plasma ist die Dosierung von TAFI möglich und ähnlich zu
eingefrorenem Plasma.
-
-
Eingefrorenes
Plasma verschiedener Herkunft:
-
Beispiel Nr. 5:
-
Durchgeführte Dosierung
mit unterschiedlichen Substraten gemäß der Erfindung
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde auf eine Lösung,
die gereinigtes TAFI enthält,
mit unterschiedlichen, in Beispiel 1 beschriebenen Verbindungen
angewendet.
-
Der
Test wurde mit einer Lösung
zu 6,5 μg/ml
gereinigtem TAFI in einem Puffer Hepes durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
der nachstehenden Tabelle IV zusammengefasst. Tabelle
IV:
-
Beispiel Nr. 6:
-
Spezifizität von TAFI
für die
Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung
-
Mit
dem nachstehenden Beispiel wird beabsichtigt, die Notwendigkeit
aufzuzeigen, das Verfahren und die Verbindungen der Formel (I) gemäß der Erfindung
anzuwenden, um spezifisch die Aktivität von CPN oder U, und insbesondere
TAFI, bezogen auf andere basische Carboxypeptidasen anzuwenden.
- 1. Die Dosierung wird in diesem Fall mit einem
Substrat der Familie der von Mock in (14) beschriebenen Verbindungen
durchgeführt.
Dieses Substrat ist aus einer einzigen Aminosäure hergestellt, die Träger eines Anizylazoformylchromophorradikals
(Abschnitt CH3OC6H4-N = N-CO-) ist. Die gewählte Aminosäure ist Arginin, eine basische
Aminosäure,
die normalerweise durch den Carboxypeptidasen B (1) hydrolysiert
wird.
Das Substrat wird nachstehend AAFR (AnizylAzoFormylArginin)
oder MxAFR (4-MethoxyphenylAzoformylarginin) genannt.
Dieses
Substrat (0,25 mM) wird in Gegenwart entweder einer Plasmaprobe
TAFI oder einer Lösung
aus Carboxypeptidase B aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins (Sigma – Art. C9584)
zu 5,2 mol/l gebracht.
-
Die
Minderung der Färbung
der beiden Proben wird mit einem Spektrophotometer verfolgt. Jede
der Proben wird gemäß dem folgenden
Protokoll behandelt:
- a) Probe vom Ausgang:
– plasmatisches
TAFI (vorhanden in einem normalen Pool von Plasmas – verdünnt zu 1/20)
oder
– Carboxypeptidase
B aus der Bauchspeicheldrüse
des Schweins 5,2 mol/l (im Puffer Hepes)
- b) Aktivierung mit dem Thrombin/Thrombomodulinkomplex-CaCl2
(siehe Beispiel 2) für
die Probe von plasmatischem TAFI
- c) Hinzufügen
von AAFR zu 5 mM.
- d) Lesen der OD bei 382 nm
-
-
Schlussfolgerung:
-
Das
aktivierte TAFI hydrolysiert das AAFR nicht, im Gegensatz zur CPB
vom Schwein.
- 2. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird dann auf eine Lösung
aus gereinigtem TAFI angewendet, entweder mit einem Substrat der
Formel (I) (MxPAFFK), oder mit MxAFR, um zu überprüfen, dass das TAFIa dennoch
eine Verbindung der Formel (I) hydrolysiert. Die Aktivierung der
Koagulation wird durch den Komplex Thrombin/Thrombomodulin-CaCl2
nachgewiesen (siehe Protokoll Beispiel 2).
-
Die
Minderung der Färbung
jeder der zwei Proben wird durch Spektrophotometrie verfolgt.
- a) Probe vom Ausgang: Lösung aus gereinigtem TAFI zu
18 μg/ml
(verdünnt
in Puffer Hepes)
- b) Aktivierung der Koagulation
- c) Hinzufügen
von MxAFR 27 mM oder MxPAFFK (Vergleich) Konzentration von MxAFFK.
- d) Hinzufügen
von CPA zu der Probe, die MxPAFFK enthält.
- e) Lesen der OD bei 382 nm.
-
-
Schlussfolgerung:
-
Das
aktivierte TAFI hydrolysiert das MxAFR nicht, obwohl es bei dem
MxPAFFK aktiv ist.
-
BEISPIEL NR. 7: VERFAHREN
ERZEUGEN VON THROMBIN
-
Eine
Skala wird, wie in Beispiel 2, Vorgehensweise b) beschrieben, durch
Verdünnen
eines Plasmapools erstellt (
4).
-
Dieses
Verfahren ermöglicht,
die Plasmas entsprechend ihrer Fähigkeit,
Thrombin zu erzeugen, zu unterscheiden. Es ist ein besseres Abbild
des Hyperkoagulabilitätszustands
des Patienten.
-
Literaturverzeichnis:
-
- 1. BOUMA. B.N. et al: "Thrombin-Activatable
Fibrionolysis Inhibitor (TAFI, Plasma Procarboxypeptidase B, Procarboxypeptidase
R, Procarboxypeptidase U)".
Thromb. Research, 101:329-354, 2001.
- 2. BAJZAR L.: "Purification
and Characterization of TAFI, a Thrombin-activable Fibrinolysis
Inhibitor". J. of
Biol. Chem., 270, 24:14477-14484, 1995.
- 3. JUHAN-VAGUE I., ALESSI M.-C.: "TAFI: lien moléculaire entre les processus
de coagulation et de Fibrinolyse".
Sang Thrombose Veineuse, 5, 10:314-6, 1998.
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