CN1524087A - 新的生色底物及其在测定羧肽酶活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生色化合物及其在测定羧肽酶N和羧肽酶U族的酶中的应用。本发明更具体地涉及式(I)化合物，式中A＝(1)或(2)或(3)或(4)或(5)，－R1，R2＝H，－CH3、－CH(CH3)2、－OCH3、－Cl、－CF3、－OCF3、－SCH3，R3＝用羧肽酶A可水解的氨基酸基，R4＝碱性氨基酸基。
Description
本发明涉及生色化合物及其在测定羧肽酶N和羧肽酶U族酶中的应用。更具体地，本发明涉及所述化合物在测定血样的TAFI(凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂)活性中的应用与相应的测定方法。
羧肽酶(CP)构成肽链端解酶族中的一组酶。它们是在最末COOH-端氨基酸处裂开多肽链酰胺键的酶。它们包括丝氨酸羧肽酶、半胱氨酸羧肽酶和金属羧肽酶。
曾从细菌、酵母和植物中分离出许多羧肽酶，并且将其定序。这些酶还存在于各种的哺乳动物组织中。
曾从胰腺和肥大细胞中分离出羧肽酶。还曾克隆、分离与定序过在血浆中循环的其它羧肽酶。
所有这些酶在活体内都具有与它们的定位与物理性质同时相关的作用。因此，羧肽酶根据其底物特异性分为不同的类。羧肽酶A具有较宽的谱：如果氨基酸是疏水的(Phe，Leu，Val，Ala)，它们优先水解最末端氨基酸的C-端肽键。它们水解二羧基氨基酸(Asp，Glu)以及甘氨酸(Gly)比较缓慢，完全不水解碱性氨基酸，例如精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)或鸟氨酸(Orn)、赖氨酸的低级同系物，也不水解仲氨基酸，例如脯氨酸(Pro)或羟基脯氨酸(Hyp)。
羧肽酶B特异性地水解最末C-端碱性氨基酸，例如Arg、Lys。这类酶可再分成由羧肽酶H(也称之脑啡肽转化酶(enlephalincovertase)或羧肽酶E)、M、N和U构成的亚类。
羧肽酶E位于胰岛分泌粒子、肾上腺、脑下腺和脑中。羧肽酶M是一种存在于许多培养组织和细胞中的膜酶。
羧肽酶N(下面有时表示为CPN)是一种在血浆中循环的酶。它可防止器官受到含有C-端碱性氨基酸(优选赖氨酸)的肽的血管活性和炎性作用，这些肽是在循环中释放的。这种酶在血液中以活性形式存在。它还因其自然底物而被称为激肽酶，这些底物是舒缓激肽、激肽、过敏毒素。
最后，羧肽酶U(不稳定的)(下面有时表示为CPU)是也可水解C-端碱性氨基酸，优选精氨酸的酶，但与羧肽酶N相反，它们以活性形式存在时是非常不稳定的。
BOUMA等人(1)发表了有关羧肽酶族酶的最新综述。
TAFI是一种碱性锌金属羧肽酶(1-4)。更确切地说，它是一种羧肽酶U，因为在37℃下它的活性是不稳定的。例如在专利US5 206 161中描述了在人体中的这种酶(包括其cDNA)和相应的氨基酸序列，这种酶是一种血浆蛋白质，通过在活体外观察到在激活TAFI存在下延缓凝块溶解的现象，最初预料到所述蛋白质在调节纤维蛋白溶解中的作用。
激活的TAFI分裂在血纤维蛋白COOH-端位所暴露的精氨酸和赖氨酸残基。这种水解导致在血纤维蛋白凝块表面血纤维蛋白溶酶原和tPA结合部位数的降低，从而导致tPA将血纤维蛋白溶酶原转化成血纤维蛋白溶酶的降低。
由于在精氨酸残基上的羧肽酶活性，TAFI被成功地确认为羧肽酶原B(pro-PCPB)，进而是不稳定的羧肽酶原(pro-CPU：不稳定的羧肽酶原)和羧肽酶原R(CPR)。该酶原形式是一种在肝脏中合成的并在血浆中循环的60kDa单链糖蛋白。
该酶原主要在位arg 92处由凝血酶分裂。这种蛋白水解作用释放出一种含多个糖基化部位的92氨基酸N-端肽。在二价离子存在下凝血调节蛋白可显著增强凝血酶对TAFI的催化作用。凝血酶催化的TAFI激活速度因与凝血调节蛋白生成三元络合物而要快1000倍以上。
激活的TAFI(TAFIa)由酶原C-端催化功能区构成，含有309个氨基酸。
由于它在调节纤维蛋白溶解过程的机制中的关键作用，很快就证明，能够测量不同病理条件下血浆中的构成激活TAFI和可激活TAFI的量是很有用的。
在现有技术中曾描述过几种使用特定底物测定各种羧肽酶活性的方法。
WOLFF等人(5)通过测量UV吸收差，比较了合成底物Hip-Arg、Hip-Lys、Hip-Orn对于采用色谱法提纯的胰腺羧肽酶B的性能。
在1970年，S.SUZUKI等人(6)改进了通过衍生由TT试剂(2，4，6-三氯-5-三嗪)释放的苯甲酰甘氨酸来检测水解产物的方法。这种衍生作用专门针对在唯一的游离酸基的α位上的甘氨酸的CH2进行。这种衍生物变成亮黄色(最大波长为382nm)。
后来许多作者都广泛地采用这种使马尿酰残基显黄色的方法。
在1972年，K.LORENTZ等人(7)使用对-苯醌作为试剂，利用了由羧肽酶B对底物Hip-Arg的作用所释放的精氨酸的显色反应。这样，显色衍生物的最大波长为480nm。
在1980年，Th.H.Plummer等人(8)使用了合成底物：呋喃基丙烯酰-丙氨酸-赖氨酸，用于确定羧肽酶N的量，在324nm读数(近UV，但不是可见光)。
在1985年，G.H.Fischer等人(9)通过待测定羧肽酶的特定肽的N-端丹磺酰基化作用使用了荧光底物。这种测定需要在读数前有一个良好分离各组分的提取水解产物的步骤。
在1986年，H.SARUTA等人采用比色法测定了羧肽酶A的活性(10)。这种方法使用一种特定的酶：“马尿酸酶”，用以水解马尿酸基(hippuricyl)衍生物本身，而马尿酸基衍生物是使用CPA水解羟基-马尿酸基-Phg底物得到的。这个反应最后用4-氨基安替比林显色，得到在505nm吸收的醌亚胺染色剂。
在1998年，NAM JOO HONG等人使用带有精氨酸类似物，即硫代精氨酸的合成底物测定CPB(11)。
不过，上述比色方法或者从未用于专门测定CPN或CPU，特别是TAFI的酶活性，或者具有与采用比色法简单有效测定这类酶的试验不相容的某些缺陷。
事实上，根据所考虑的情况：
-或者得到有色产物的衍生反应不是专门针对水解时释放的物质的，
-或者衍生反应物毒性很强，因此不可能得到工业规模应用，
-或者显色方法时间太长，是受限制的，不容易自动化。
在1996年，W.L.Mock等人描述了一种通过使用在酶水解作用下脱色的合成底物来测定细菌源的细胞外锌内切蛋白酶，嗜热菌蛋白酶的测定方法(12)。为此，这些作者合成了二肽化合物，这些化合物由一种亮氨酸残基和其它一个中性氨基酸(Leu、Ala、Phe或Gly)构成，该亮氨酸残基在胺基处有接枝的N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)基团。
引入芳基偶氮甲酰基(arazoformyl)基团得到高度着色的化合物。在嗜热菌蛋白酶存在下，该染色剂分子按照在(12-13)中充分描述的机理在水解化学反应期间发生重排，产生无色产物(茴香醚片段、N2、CO2和氨基酸)。因此，可以很容易地通过介质脱色速度跟踪酶速率。
同样这些作者还描述了一种采用分光光度计测定的动力学方法，该方法的原理与前面的羧肽酶A(13)和猪胰腺羧肽酶B(14)的原理相同。
在这种情况下，使用的化合物是由已知可由羧肽酶A切断的单一氨基酸(Phe，Leu)或可由羧肽酶B切断的唯一的氨基酸(Lys)构成的，它带有N-芳基偶氮甲酰基团。通过测量介质显色减弱可跟踪这些化合物酶分裂成无色产物。
通过借鉴这些信息，本发明的发明人合成出新的显色化合物，这些化合物可用于用比色法测定羧肽酶N或羧肽酶U的活性，更特别地TAFI的活性。
根据第一个方面，本发明涉及新化合物，它们构成羧肽酶N或羧肽酶U的底物，更特别地构成激活TAFI的底物。这些化合物是生色底物。
本发明化合物的特征在于，它们是下述通式(I)的芳基偶氮甲酰基化合物：
式中：
或
或
或
或
-R1，R2＝H，-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-Cl、-CF3、-OCF3、-SCH3；
-R3＝用羧肽酶A可水解的氨基酸基；
-R4＝碱性氨基酸基。
更特别地，R3选自疏水氨基酸基，例如：
-酪氨酸：
-苯丙氨酸：
-丙氨酸：R3＝-CH3
-缬氨酸：R3＝-CH-(CH3)2
-亮氨酸：R3＝-CH2-CH-(CH3)2
-异亮氨酸：R3＝-CH(CH3)-CH2-CH3
-苯基甘氨酸：
R4更确切地选自氨基酸基，例如：
-精氨酸：
-赖氨酸：R4＝-(CH2)4-NH2
-鸟氨酸：R4＝-(CH2)3-NH2
优选地，R3代表芳族氨基酸残基，特别是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是精氨酸或赖氨酸。
R1优选地选自如下：
-H和-CH3，和
R2优选地选自如下：
-CH3、-O-CH3和-S-CH3。
一组本发明优选化合物可用下述通式表示：
式中：
和
-R1、R2＝-H、-CH3、(CH3)2CH-、CH3-O-、Cl-、-CF3；
-R3＝用羧肽酶A可水解的氨基酸基；
-R4＝碱性氨基酸基。
R3优选地代表苯丙氨酸或酪氨酸，以及
R4优选地代表精氨酸或赖氨酸。
R1优选地选自如下：
-H和-CH3，和
R2优选地选自如下：
-CH3、-O-CH3和-S-CH3。
本发明这组化合物中特别优选的一种化合物是式(I)化合物，其中：
所述化合物选自下述化合物，其中：
R1＝-H R2＝-O-CH3
R1＝-H R2＝-O-CH3
R4＝-(CH2)4-NH2
R1＝-Cl R2＝-CH3
R1＝-H
R1＝-H R2＝-SCH3
R1＝-H R2＝-SCH3
*括号内的数字确定甲基在苯基上的位置。
在上面给出定义的范围内，本发明特别涉及具有式(I)并且通过上文给出优选定义的A、R1、R2、R3和R4基团的可能组合得到的每种化合物。
在下文中，这些如此定义的化合物都毫无差别地称为“式(I)化合物”或“式(I)底物”。
根据第二个方面，本发明涉及一种生物试样中羧肽酶N活性或优选地CPU活性的比色测定方法，其中：
-让所述试样与一种如上面定义的式(I)生色化合物和一种羧肽酶A族的酶接触，其接触条件能够使试样水解，以及
-在由所述化合物吸收光谱所选择的波长下，通过测量所述式(I)化合物显色降低(相应于吸收减少)确定试样中CPN或CPU水解所述式(I)化合物的情况。
这种显色降低一方面是试样中的羧肽酶N或U水解式(I)底物所致，另一方面是羧肽酶A水解所致式(I)底物所致。
优选使用式(I)化合物实施本发明的方法，该化合物中疏水氨基酸是苯丙氨酸，或优选地是酪氨酸，碱性氨基酸是精氨酸或赖氨酸。
优选使用式(I)化合物实施本发明的方法，该化合物中R1选自-H和-CH3，R2选自-CH3、-O-CH3和-S-CH3。有利地，在式(I)化合物中R1是H时，R2是S-CH3。
有利地使用式(I)的如下一组化合物实施本发明的方法，该化合物中：
R1和R2具有前面给出的任何一种意义，R2优选地是-S-CH3。
更特别地，所述式(I)化合物是苯基偶氮甲酰基化合物，其中：
所述化合物选自下述化合物，其中：
R1＝-H R2＝-O-CH3
R1＝-H R2＝-O-CH3
R1＝-Cl R2＝-CH3
R1＝-H
R1＝-H R2＝-SCH3
R1＝-H R2＝-SCH3
括号内的数字确定甲基在苯基上的位置。
使用的羧肽酶A可以有不同的来源，例如胰腺或肥大细胞。它可以是源于人或动物。
在本发明范围内，优选地使用源于牛的胰腺羧肽酶A。
本发明方法的原理是基于通过分析试样中可能存在的羧肽酶N或羧肽酶U的作用，以及添加到该介质中的羧肽酶A的作用，水解如前面所述的式(I)有色底物。这种特定水解使得起始化合物的显色消失，可以用分光光度法跟踪这种显色消失。
更确切地，根据前面公开的羧肽酶N或U和A的水解特异性，以及上述式(I)化合物的结构特征，羧肽酶A和激活的羧肽酶N或U与所述化合物进行接触，由于羧肽酶N或U的作用，在所述化合物第一个氨基酸与第二个氨基酸之间的键产生断裂，接着由于羧肽酶A的作用，几乎同时在偶氮甲酰基与第一个氨基酸之间的键产生断裂。
这两个反应的结果是起始介质脱色。这时易于通过在色料[式(1)化合物]吸收波长，优选在相应于其最大吸收(峰值)波长处观测，来跟踪随时间改变的显色的这种减弱。
这种减弱代表了该水解动力学。测量的光密度与校准曲线光密度进行比较，可以计算开始时试样中存在的活性羧肽酶N或U的量，而这种校准曲线例如可以用溶液中一定浓度范围的纯化的活性羧肽酶N或U确定。
反过来，如果试样不含有羧肽酶N或U，或如果它是非活性的，则在式(I)化合物第一个氨基酸与第二个氨基酸之间没有断裂，因此羧肽酶A不会对第一个氨基酸上的有色基团的键发生作用。因此，观察不到起始溶液显色的减弱。
本发明更特别地提供一种生物试样中，特别是血液试样例如全血液或纯血浆或稀释血浆中CPN或CPU活性的测定方法，优选地，提供一种血液试样，特别是纯血浆或稀释血浆中TAFI活性的测定方法。
在这种情况下，待测试试样首先置于缓冲溶液中，如果必要，该缓冲溶液含有人们希望测定其活性的羧肽酶激活剂(下面将该溶液叫做激活剂缓冲液)，并培育激活所研究的羧肽酶必须的时间。优选地，这种培育在室温下进行5-20分钟，有利地8-12分钟，优选地10分钟。
根据本发明的一种优选实施方式，羧肽酶激活剂可以是起到激活羧肽酶U，特别是TAFI的作用的激活剂，特别是一种凝固因子。
在这种情况下，然后往这种混合物添加一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，以阻断所述凝固过程。丝氨酸蛋白酶抑制剂例如是PPACK(H-D-Phe-Pro-Arg-氯甲基酮-Bachem-Réf.No.1065)，其使用的最后浓度范围为1-50μM，优选地30μM，这个浓度范围相应于起始浓度10-250μM，优选地150μM。其它化合物，例如Péfabloc[4-(2-氨基乙基)-苯磺酰基氟次氯酸盐-Penthapharm-Réf.399.01](优选地使用浓度为0.1mM)也是适合的。
在加抑制剂同时或在加抑制剂后立刻添加一种本发明式(I)化合物于水溶液中。这种化合物一般使用的最后浓度范围是0.25-10mM，优选地0.25-2.5mM，有利地0.25-1mM。优选使用浓度是0.4mM。
在优选处于室温下的一个新的培育期中，由要研究其活性的试样的CNP或CPU将式(I)底物在其第二个氨基酸处裂开，在这个新的培育期之后，通过加HCl，之后立即加碱重调pH值在7-8的范围内可以停止水解。
首先不往介质中加CPA，测量如此得到的混合物的光密度(OD)。然后往该介质添加CPA，重新测量光密度。光密度降低可用分光光度计跟踪。这种降低显示了由试样中的CPU或N与CPA共同作用的式(I)底物的水解。
测量的德尔塔OD(ΔOD)与校准曲线上的值进行比较，而校准曲线例如可以使用原来不含有所研究的CPN或CPU，而加入这种纯化的酶的试样得到。
上述的方案构成了一种本发明的优选实施方式。不过，这种方式的多种变化方式是可预见的，既涉及不同化合物的加料顺序，还涉及这些化合物的性质。它们也都属于本发明定义的范围。
因此，例如，从该方法开始，与凝固激活剂缓冲液同时加入式(I)底物是可能的。
同样地，可以用同样反应介质的两个等分试样进行测定，其中一份用CPA处理。然后测量这两个等分试样的ΔOD。
在激活剂缓冲液激活凝固作用的情况下，可使用本领域普通技术人员已知的在凝固试验中常规使用的不同方法进行这种激活。
这些激活方法特别是：
-使用凝血酶/凝血调节蛋白复合物的激活方法。这第一个可能性构成了一个本发明的优选实施方式，
-激活因子XI激活方法，在这种情况下，该因子代替激活剂缓冲液中的凝血酶。为了加速该反应，往该介质中添加凝血调节蛋白可能是有利的，
-毒液，特别是蛇毒液的激活方法，还往该介质任选添加凝血酶原和/或凝血调节蛋白。优选的毒液是选自“类凝血酶”毒液族的毒液，例如Arkistrodon rhodostoma或Bathrops atrox毒液，以及凝血酶原激活剂毒液，例如选自Notechis scutatus或Echis carinatus(15-18)的那些毒液，
-在磷脂和钙存在下的组织因子激活方法(根据Quick时间原理的外源法的激活作用)，
-接触期激活方法，
-血浆激活方法。
有利地，本发明的方法能够对同一试样首先测量试样中存在的“组成”CPN和/或CPU，即以“自然”活性形式存在的CPN和/或CPU(即不用激活剂缓冲液诱导激活)的活性，其次测量可激活的CPN和/或CPU，即试样中存在的失活形式的CPN和/或CPU(其活性是在与激活剂缓冲液作用相关的激活过程中诱导或产生的)的活性。
为此，使用在激活剂缓冲液存在下的试样(检测试样中CPN或CPU总活性)，或者在无激活剂的生理缓冲液存在下的试样(检测组成CPN和/或CPU的活性)，采用上述方法比较试样对式(I)底物的水解活性。
两次测量的差值(ΔOD)给出在试样中存在的可激活CPN或CPU的活性。
在一个优选的变化方案中，本发明涉及一种生物试样中，特别是血样中激活TAFI的测定方法，所述的方法使用前面描述的一种式(I)化合物或底物。
通过在有或没有TAFI特异性抑制剂存在情况下如已描述的那样处理试样，测定组成的和/或可激活的TAFI活性。
优选的抑制剂是CPI(源于马铃薯块茎的羧肽酶抑制剂)，它在活体外和活体内研究TAFI功能中的应用在文献(参考文献1)中已充分描述。今天本领域的普通技术人员熟知，CPI特异性地抑制TAFI，不改变其它血浆CP的活性。在本发明方法的范围内，CPI使用浓度范围是0.10-0.50mM(开始浓度)，或以最后浓度表示为2-10μM。优选地使用浓度为7μM(最后浓度)或0.38mM(开始浓度)。
根据这个优选变化方案的原理，试样使用TAFI激活缓冲液，例如使用凝血酶/凝血调节蛋白复合物的凝固激活缓冲液进行激活，再根据前面描述的方法，在有或没有TAFI抑制剂的情况下进行处理。
因此有或没有TAFI抑制剂的介质显色的差异能够测定试样中激活TAFI(TAFIa)的酶活性。
更确切地，可以根据下述方案实施本发明的方法：按照是否希望测定试样中含有的全部TAFI的活性，或是否希望区分组成的TAFI活性与可激活的TAFI活性，可将待测试样分成两个等分试样或如果必要分成多个等分试样。
-含有TAFI抑制剂的第一等分试样按照前面描述的方法进行激活与处理。这样只是造成介质轻微脱色，这是由试样中存在的其它羧肽酶残余水解式(I)底物所致。
-以同样方式处理第二等分试样，但无TAFI抑制剂。这造成介质强脱色，这种脱色与试样中激活TAFI水解式(I)底物相关。
-测量第一等分试样与第二等分试样的显色差(ΔOD)。这个差表示试样中激活TAFI的特定活性。
如果希望区分可激活的TAFI特定活性与组成的TAFI特定活性，则使用同一样品的第三等分试样，测量该试样对式(I)底物的水解活性，但其中没有往介质中添加任何激活剂缓冲液来启动激活作用。
从这些不同等分试样的ΔOD能够得到样品总TAFI活性，或者只是得到组成的TAFI活性，并由此推导出可激活TAFI的活性。
根据第三个方面，本发明涉及测定CPN或CPU的诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒装有如前面定义的式(I)底物。
优选地，本发明的诊断试剂盒是测量血样中TAFI活性的试剂盒。
所述诊断试剂盒包括：
-TAFI激活剂，特别是TAFI激活剂缓冲液；
-羧肽酶A；
-式(I)底物；
-TAFI的抑制剂。
该试剂盒还任选地包括一种蛋白酶丝氨酸的抑制剂。
这些组分中每种组分优选地为粉末状或冻干状。
下面实施例和附图举例说明本发明。
图1：采用UV-可见光分光光度计测量的具有式(I)的不同合成化合物的吸收光谱。
图2：采用酸水解进行的AAFFR分析。
图3：使用不含TAFI的血浆，向其中加入纯化的TAFI来得到0-26μg/ml的浓度，从而建立校准曲线。
图4：从血浆池获得的浓度范围的校准曲线。以凝血酶产生方法进行校准。使用4-MTPAFYR生色底物进行比色测定。
实施例1
合成一组本发明的偶氮甲酰基化合物
下表1列出了本发明式(I)化合物中的8种优选化合物的化学式。采用UV-可见光分光光度计(UVIKON-KONTRON)测量的它们的吸收光谱列于图1中。
下面详细描述了其中一种化合物，即化合物4(MxPAFFR)的合成方法。下面描述的这种化合物制备步骤与其它每种化合物制备步骤相同，但化合物5(MxPAFFK)除外，对于化合物5来说，赖氨酸去保护补充步骤是必不可少的(参见下面的反应流程与解释)。
表1：
式
化合物1：2，3-DMPAFFR
2，3-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物2：2，4-DMPAFFR
2，4-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物3：2，5-DMPAFFR
2，5-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物4：MxPAFFR
4-甲氧基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物5：MxPAFFK
4-甲氧基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基赖氨酸
化合物6：CITAFFR
3-氯-p-甲苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物7：TFMxPAFFR
4-(三氟甲氧基)偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物8：4-MTPAFFR
4-甲硫基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸
化合物9：4-MTPAFYR
4-甲硫基苯基偶氮甲酰基酪氨酰基精氨酸
A、
合成4-甲氧基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物4)
引言：下面描述的所有步骤对于每种色料都是相同的。通过高效液相色谱法和对于苯丙氨酸和精氨酸偶联反应采用氨基酸分析跟踪每个步骤。
第一步：Grignard试剂
反应流程图
操作方式：准备1当量4-溴茴香醚和1当量镁。将镁和20重量％4-溴茴香醚加入三颈瓶中，并加入无水四氢呋喃(2毫升/毫摩尔)，将装置置于氮气保护下。通过在下面用火焰加热三颈瓶的一点引发该反应，反应混合物变成棕色。反应开始时(在镁表面冒泡)，在90℃回流，然后缓慢添加剩余的4-溴茴香醚在无水THF(2毫升/毫摩尔)中的溶液。1小时后停止回流。所合成的4-甲氧基苯基溴化镁直接用于后续步骤(棕色)。
注意：玻璃器皿和镁需预先在120℃烘箱内烘干，其它产品置于干燥器中干燥。
保留时间：Grignard试剂是一种非常不稳定的，对水敏感的化合物，因此HPLC分析时，得到所生成的降解产物的三个特征保留时间：
保留时间1：2.68分钟
保留时间2：3.32分钟
保留时间3：5.38分钟
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
反应流程图
操作方式：1当量偶氮二羧酸二叔丁酯和1当量4-甲氧基苯基溴化镁(Grignard试剂)溶于无水THF中(2毫升/毫摩尔)。冷却到0-5℃。把Grignard试剂添加到偶氮二羧酸二叔丁酯中。搅拌10分钟，添加1.02当量乙酸，然后自然升温到室温。进行水/乙醚萃取。干燥乙醚相，蒸发至干。得到一种黄色油状物。
保留时间：7.85分钟
第三步：去保护
反应流程图
N，N′-双-(叔丁氧基羰基)-4-(甲氧基)苯肼
操作方式：1当量N，N′-双-(叔丁氧基羰基)-4-(甲氧基)苯肼溶于异丙醇中(10.2毫升/毫摩尔)，然后添加4.8M在二噁烷中的HCl(2毫升/毫摩尔)。升温至回流(80℃)。在15分钟后，冷却，添加乙醚(5毫升/毫摩尔)。沉淀出4-甲氧基苯肼盐酸盐。过滤并干燥。将粉末溶于水中，然后调到pH＝7。进行水/二氯甲烷提取，再将二氯甲烷相蒸发至干。得到4-甲氧基苯基肼(黄色粉末)，它再进行干燥。
保留时间：2.20分钟
第四步：与碳酸二苯酯偶联
反应流程图
操作方式：将1.4当量碳酸二苯酯溶于苯(0.25毫升/毫摩尔)，升温到120℃回流。缓慢添加1当量溶于苯(0.7毫升/毫摩尔)的4-(甲氧基)苯基肼。6小时后停止回流。浓缩反应介质，然后进行己烷/苯结晶(4/1)。过滤并用干燥器干燥微白色晶体。
保留时间：6.74分钟
第五步：与苯丙氨酸偶联
反应流程图
操作方式：将1.2当量溶于二甲基甲酰胺(3.33毫升/毫摩尔)的苯丙氨酸三乙基铵盐的溶液升温(95℃)回流。缓慢添加1当量溶于二甲基甲酰胺(2毫升/毫摩尔)的4-甲氧基苯基肼撑甲酸酯。在1小时30分钟后停止回流，再冷却到室温，浓缩。酸化(pH＝2)。采用色谱法纯化(微白色晶体)。
保留时间：6.12分
第六步：氧化：由“肼撑”形式变到“偶氮”形式
反应流程图
操作方式：1当量N-(4-甲氧基苯基肼撑甲酰基)-L-苯丙氨酸溶于超纯水中(20.8毫升/毫摩尔)，水中含有1当量氢氧化钠和1当量乙酸铵。添加1当量偏高碘酸钠超纯水(4.2毫升/毫摩尔)溶液。在20分钟后，酸化反应介质(pH＝2)，然后采用色谱法纯化(橙色晶体)。
保留时间：6.86分
第七步：与精氨酸偶联 反应流程图
操作方式：1当量精氨酸甲酯盐酸盐溶于二甲基甲酰胺中(3毫升/毫摩尔)。添加1.1当量DIAE(二异丙基乙基胺)，1当量N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)-L-苯丙氨酸，然后加1.1当量TBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐)。添加必需量的DIAE以达到pH7-8。5分钟后，蒸发至干，再采用色谱法纯化(橙色晶体)。
保留时间：6.06分钟。
第八步：皂化
反应流程图
操作方式：1当量N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)-L-苯丙氨酸精氨酸甲酯溶于水/甲醇混合物(比例：1/2；3毫升/毫摩尔)中。添加3当量1N氢氧化钠。在1小时后，酸化反应介质，浓缩，然后进行水/二氯甲烷提取。蒸发二氯甲烷相，然后干燥。得到N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)-L-苯基丙氨酰基精氨酸，它是橙色粉末。
保留时间：5.5分钟
为了确认序列均匀性，在酸水解后进行最终产物的氨基酸分析。这种分析结果列于图2色谱图上。
分析条件：
◎HPLC AAA线；用PITC(异氰酸苯酯)柱前衍生法
◎C18柱；100A；5μ；250×4.6mm
◎在254nm检测；流量＝1毫升/分
◎洗脱剂：
A：pH5.74醋酸盐缓冲液
B：70％CH3CN、30％AcONa缓冲液；32mM；pH＝6.10
C：CH3CN
其它化合物的合成方案都基于上面所描述的同样步骤。下面的反应流程图中概述了这些方案。
这些化合物的每个合成步骤得到的保留时间列于下表II中：
表II：其它合成的色料每个步骤在HPLC上得到的保留时间
| 步骤 | 2，3-DMPAFFR | 2，4-DMPAFFR | 2，5-DMPAFFR | MxAPFFR | MxPAFFK | CITAFFR | TFMxPAFFR |
| 1 | - | - | - | - | - | - | - |
| 2 | 9.12分 | 9.18分 | 9.15分 | 7.85分 | 7.85分 | 9.25分 | 9.26分 |
| 3 | 3.59分 | 3.81分 | 3.73分 | 2.20 | 2.20分 | 3.93分 | 3.94分 |
| 4 | 7.87分 | 7.96分 | 7.82分 | 6.74分 | 6.74分 | 8.06分 | 7.92分 |
| 5 | 7.04分 | 7.13分 | 7.11分 | 6.12分 | 6.12分 | 7.51分 | 7.45分 |
| 6 | 7.82分 | 7.88分 | 7.90分 | 6.86分 | 6.86分 | 7.85分 | 7.79分 |
| 7 | 7.10分 | 7.02分 | 7.10分 | 6.06分 | 9.84分 | 7.13分 | 7.08分 |
| 8 | 6.55分 | 6.54分 | 6.62分 | 5.50分 | 9.23分 | 6.71分 | 6.65分 |
分析条件：
◎C18柱；5μ；100×4.6mm
◎在254nm检测；流量＝1毫升/分
◎梯度：0′10％ B；10′90％ B
◎使用A：1％三氟乙酸水溶液
B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液
B、
合成2，3-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物 1)：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保
护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与苯丙氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式变到“偶氮”形式
第七步：与精氨酸偶联
第八步：皂化
C、
合成2，4-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物 2)：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与苯丙氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
第七步：与精氨酸偶联
第八步：皂化
D、
合成2，5-二甲基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物 3)：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与苯丙氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
第七步：与精氨酸偶联
第八步：皂化
E、
合成4-甲氧基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基赖氨酸：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与苯丙氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
第七步：与赖氨酸偶联
第九步：去保护
这种特定化合物需要一个补充步骤使赖氨酸侧链去保护(ε-Boc：N-ε-叔丁氧基羰基)。
操作方式：1当量N-(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基)-L-苯基丙氨酰基-L-赖氨酸(ε-Boc)溶于装在圆底瓶中的二氯甲烷(3毫升/毫摩尔)。进行搅拌。连接装有三氟乙酸(3毫升/毫摩尔)的滴液漏斗。缓慢加入(滴加)三氟乙酸。15分钟后，浓缩反应介质，采用高效液相色谱纯化。最后得到橙色粉末。
F、
合成3-氯-对-甲苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物 6)：
第一步：Grignard试剂
反应流程图
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
反应流程图
第三步：去保护
反应流程图
第四步：与碳酸二苯酯偶联
反应流程图
第五步：与苯丙氨酸偶联
反应流程图
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
反应流程图
第七步：与精氨酸偶联
反应流程图
第八步：皂化
反应流程图
G、
合成3-氯-p-甲苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物7)：
第一步：Grignard试剂
反应流程图
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
反应流程图
第三步：去保护
反应流程图
第四步：与碳酸二苯酯偶联
反应流程图
第五步：与苯丙氨酸偶联
反应流程图
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
反应流程图
第七步：与精氨酸偶联
反应流程图
第八步：皂化
反应流程图
H、
合成4-甲硫基苯基偶氮甲酰基苯基丙氨酰基精氨酸(化合物 8)：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与苯丙氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
第七步：与精氨酸偶联
第八步：皂化
I、
合成4-甲硫基苯基偶氮甲酰基酪氨酰基精氨酸(化合物9)：
第一步：Grignard试剂
第二步：与偶氮二羧酸二叔丁酯偶联
第三步：去保护
第四步：与碳酸二苯酯偶联
第五步：与酪氨酸偶联
第六步：氧化：由“肼撑”形式到“偶氮”形式
第七步：与精氨酸偶联
第八步：皂化
实施例2
1-
测定原理和使用的主要试剂
TAFIa酶活性测定原理
2-根据本发明方法测定TAFI活性的方案的实施例
a)第一种操作方式：凝血酶-凝血调节蛋白方法
测试血浆试样分成两等份，一份加PIC(Calbiochem-Réf.217359)，另一份加Hépès缓冲液。
然后，这两份等分试样按照下述原则进行同样处理：
TAFI激活
150微升用Hépès缓冲液稀释1/20的血浆(或13微克/毫升在Hépès缓冲液中的纯化TAFI)；
10微升PIC或H2O；
在室温下5分钟；
150微升凝固激活剂缓冲液；
在室温下10分钟；
100微升PPACK+100微升MxPAFFR(底物)(5mM)。
TAFI活性试验
在室温下30分钟；
100微升1M HCl+100微升1M NaOH；
显色
用Hépès缓冲液稀释至1/3；
在382nm读取OD；
25微升羧肽酶A；
在382nm读取OD达1分钟
第一种操作方式的可能变化
-可以在37℃温度下进行测定；
-底物可以在开始时与激活剂缓冲液同时加入；
-可以采用HPLC进行读数。
不同产品的优选最终浓度
-PPACK：H-D-Phe-Pro-Arg-氯甲基酮，MW＝451 30μM(Bachem-Réf.No.1065)。
-Péfabloc：它可代替PPACK使用：0.1mM(Pentapharm-Réf.399.01)。
-底物(MxPAFFR)：1mM
-羧肽酶A：牛胰腺源(Sigma-Réf.C0386)。
5.1毫升瓶为5000单位，21毫克prot/毫升，47单位/毫克蛋白质。
用预过滤器，5微米过滤器和0.45微米过滤器过滤CPA，向其中添加毫升H2O。
-PIC：在7μM下使用
根据制造商(Calbiochem)的提示，1毫克PCI可以抑制约8毫克50％TAFI(50单位/毫克)
PPACK的30μM浓度相应于150μM起始浓度。底物1mM最终浓度相应于5mM起始浓度。CPI的7μM最终浓度相应于0.38mM起始浓度。
本发明人观察到，上面指出的这些浓度可以修改，使用的PPACK最终浓度可降低到4μM，底物最终浓度也可降低。
激活剂缓冲液：
·在本发明范围内优选的凝固激活方法是采用凝血酶-凝血调节蛋白复合物的激活方法。在这种情况下，使用的激活剂缓冲液含有下述组分：
37微升0-80nM，优选地10nM凝血调节蛋白(兔肺凝血调节蛋白-American Diagnostica-Réf.237)；
6微升0.2-10NIH/毫升，优选地0.8NIH/毫升凝血酶(DiagnosticaStago-Produit de recherché)；
750微升0-80nM，优选地40nM氯化钙；
705微升9.4mM hépès缓冲液，pH＝7.6。
这些浓度是激活剂缓冲液最终体积为1498微升时给出的。
附注：hépès缓冲液含有：20mM hépès，4mM KCl和1％ BSA，其它试验使用20mM hépès和150mM NaCl进行。
·如在本说明书中指出的，其它激活方法是可能的，特别是采用XIa因子的激活方法。
在这种情况下，一种激活剂缓冲液实例含有下述组分：
5微升30U/毫升的凝血调节蛋白；
30微升纯XIa因子(Calbiochem-Réf.233483)；
88微升hépès缓冲液，pH＝7.4(20mM hépès和150mM NaCl)。
这些浓度是作为实例给出的，本领域普通技术人员可以再进行调整。
b)第二种操作方式：凝血酶产生方法
另一种凝固激活方法涉及凝血酶，并且需要使用接触期激活剂。
| 凝血酶产生 | |
| 1)TAFI的激活 | 100微升试样±10微升CPI100微升激活剂缓冲液组成如下：-30微升30U/毫升的凝血调节蛋白-165微升接触期的激活剂-800微升20mM的CaCl2 |
| 培育10分钟。TA100微升PPACK | |
| 2)TAFIa活性试验 | 100微升底物培育30分钟，TA100微升1N HCl100微升1N NaOH |
| 3)显色 | 使用500微升缓冲液+50微升H2SO4稀释250微升反应介质读OD1或250微升缓冲液+250微升CPa培育5分钟TA50微升H2SO4读OD2 405nm |
实施例3
在凝血酶-凝血调节蛋白方法中建立校准曲线
下面图3是一个校准曲线，该曲线是通过向不含TAFI的血浆中加入纯TAFI以得到0-26μg/ml的TAFI浓度来建立的。
使用的式I化合物是MxPAAFR，其浓度为5mM。
根据本发明方法测定的ΔOD列于下表III中：
| TAFIa浓度(微克/毫升) | 0 | 1.63 | 3.25 | 6.5 | 13 | 26 |
| 测定的ΔOD | 0.168 | 0.217 | 0.273 | 0.399 | 0.624 | 0.995 |
如图3所示，所研究的浓度范围内的校准曲线是线性的。这充分地包括了规定浓度区，即5-15μg/ml的TAFI在生物体内的浓度。
因此，本发明的方法可检测不足的和异常偏高水平的TAFI。
实施例4
用不同类型的血浆得到的结果
根据实施例2描述的方案，将本发明的方法应用于不同类型的血浆。
新鲜血浆，冻血浆：
可以测定新鲜血浆或冻血浆，但人们观察到两者间的OD缩小。这是解冻时TAFI轻微降解所致(蛋白质降解)。
新鲜血浆
冻血浆
9.4微克/毫升 6.0微克/毫升
11.2微克/毫升 6.5微克/毫升
10.7微克/毫升 5.6微克/毫升
冻血浆，冻干血浆：
对于冻干血浆，测定TAFI是可能的，并且与冻血浆类似。
冻血浆
冻干血浆
ΔOD 0.302 0.354
不同来源的冻血浆：
血栓溶解剂 2.9微克/毫升
CIVD 2.8微克/毫升
Cirhhosis 1.4微克/毫升
Maternity 7.1微克/毫升
hyperfibrinogenemia 4.6微克/毫升
HNF 6.1微克/毫升(未分馏的肝素)
AVK 5.8-8.2-6.5-7.1微克/毫升(抗-维生素K)
实施例5
使用本发明不同底物进行的测定
将本发明的方法应用于含有纯化TAFI的溶液，使用在实施例1中描述的不同化合物。
使用6.5微克/毫升纯化TAFI在hépès缓冲溶液中的溶液进行这个试验。结果列于下面表IV中。
表IV
| 化合物 | 读数 | 起始OD | 最终OD | ΔOD |
| 2，3DMPAFFR5mM | 350nm | 0.318 | 0.089 | 0.229 |
| 2，4DMPAFFR5mM | 330nm | 1.004 | 0.087 | 0.917 |
| 2，5DMPAFFR5mM | 320nm | 0.973 | 0.131 | 0.842 |
| AAFFK5mM | 320nm | 0.973 | 0.131 | 0.842 |
实施例6：
TAFIa对本发明式(I)化合物的特异性
下述实施例的目的在于证明相对于其它基础羧肽酶来说，使用本发明的方法与式(I)化合物来特异性测定CPN或U特别是TAFI活性的必要性。
1、在本例中，使用选自Mock在(14)中描述的化合物组中的底物进行测定。这种底物是由带茴香基偶氮甲酰基发色基(CH3OC6H4-N＝N-CO-部分)的单一氨基酸构成的。选择的氨基酸是精氨酸，一种通常由羧肽酶B水解(1)的碱性氨基酸。
这种底物在下面命名为AAFR(茴香基偶氮甲酰基精氨酸)或MxAFR(4-甲氧基苯基偶氮甲酰基精氨酸)。
将这种底物(0.25mM)加入血浆TAFI试样中，或者浓度为5.2摩尔/升的猪胰腺羧肽酶B(Sigma-Réf.C9584)的溶液中。
采用分光光度计跟踪这两个试样中每个试样的显色减弱情况。每个试样可按照下述方案处理：
a)起始试样：
·血浆TAFI(在普通血浆库中存在的-稀释至1/20)，或
·猪胰腺羧肽酶B，浓度为5.2摩尔/升(在hépès缓冲溶液中)；
b)用凝血酶-凝血调节蛋白-CaCl2复合物激活血浆TAFI试样(见实施例2)
c)加5mM AAFR。
d)在382nm读OD。
结果：
| 在382nm | 起始OD | 最终OD | ΔOD |
| 猪CPB | 1.054 | 0.445 | 0.608 |
| 血浆TAFIa | 1.730 | 1.681 | 0.049 |
结论：
与胰腺CPB相反，激活的TAFI不水解AAFR。
2)本发明的方法然后应用于纯化TAFI的溶液，其中或者有式(I)底物(MxPAFFK)，或者有MxAFR，以证实TAFIa仍然水解式(I)化合物。可用凝血酶-凝血调节蛋白-CaCl2复合物启动凝固激活作用(见实施例2方案)。
采用分光光度计跟踪这两个试样中每个试样的显色减弱情况。
a)起始试样：18微克/毫升的纯化TAFI的溶液(稀释在hépès缓冲溶液中)；
b)凝固激活；
c)加27mM MxAFR或MxPAFFK(对照)，MxAFFK的浓缩物；
d)在含有MxPAFFK的试样中加CPA。
e)在382nm读OD
结果：
| 起始OD | 最终OD | ΔOD | |
| TAFIa+MxAFR | 1.356 | 1.300 | 0.056 |
| TAFIa+MxPAFFK | 1.397 | 0.849 | 0.548 |
结论：
激活的TAFI不水解MxAFR，而它对MxPAFFR是活性的。
实施例7：产生凝血酶的方法
如实施例2的操作方式b)所描述的，通过稀释血浆库得到一个范围(图4)。
| ΔOD | 浓度 微克/毫升 | |
| N对照体系 | 0.848 | 7.69 |
| P对照体系 | 0.670 | 4.90 |
| 正常血浆 | 0.928 | 9.39 |
这个方法能够根据血浆产生凝血酶的能力区分血浆。该方法可较好反映病人高凝固性的病状。
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18.ROSING J.et al.：＂Structural and functional properties of snake venomprothrombin activators＂.Toxicon，30(12)：1515-1527，1992.
Claims (41)
1、下式(I)的化合物：
式中：
或
或
·R1，R2＝H，-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-Cl、-CF3、-OCF3、-SCH3；
·R3＝用羧肽酶A可水解的氨基酸基；
·R4＝碱性氨基酸基。
2、权利要求1所述的下式(I)的化合物：
式中：
或
或
·R1，R2＝H，-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-Cl、-CF3、-OCF3、-SCH3；
·R3＝疏水氨基酸基；
·R4＝精氨酸或赖氨酸基。
3、权利要求1或2所述的化合物，其特征在于R1＝H和R2＝-S-CH3。
4、权利要求1或权利要求3所述的化合物，其特征在于R3选自下述的氨基酸：
-酪氨酸，
-苯丙氨酸，
-丙氨酸，
-缬氨酸，
-亮氨酸，
-异亮氨酸，
-苯基甘氨酸。
5、权利要求1或权利要求3所述的化合物，其特征在于R3代表苯丙氨酸。
6、权利要求1或权利要求3所述的化合物，其特征在于R3代表苯丙氨酸或酪氨酸，而R4代表精氨酸或赖氨酸。
7、权利要求1或权利要求3所述的化合物，其特征在于R3代表酪氨酸。
8、权利要求1所述的化合物，其特征在于R1选自-H和-CH3，而R2选自CH3、O-CH3和-S-CH3。
9、权利要求1-8中任一权利要求所述的化合物，其特征在于A是
10、权利要求1所述的式(I)化合物，其中：
所述的化合物选自下述化合物，其中：
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (3)*
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (4)*
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (5)*
R1＝-H R2＝-O-CH3
R1＝-H R2＝-O-CH3
R4＝-(CH2)4-NH2
R1＝-Cl R2＝-CH3
R1＝-H
R1＝-H R2＝-SCH3
R1＝-H R2＝-SCH3
*括号中的数字确定甲基在苯基上的位置。
11、权利要求1所述的化合物，其特征在于它是4-MTPAFYR(4-甲硫基苯基偶氮甲酰基酪氨酸精氨酸)。
12、生物试样中羧肽酶N或羧肽酶U活性的测定方法，其中：
-使所述的试样与权利要求1-11中任一权利要求所述的式(I)化合物和羧肽酶A接触，其接触条件能够使试样水解，以及
-测量含有式(I)底物和羧肽酶A的试样的显色降低，这种降低是试样中的CPN或CPU和CPA双重水解式(I)底物所致。
13、权利要求12所述的方法，其特征在于R1＝H和R2＝-S-CH3。
14、权利要求12或13所述的方法，其特征在于R4是精氨酸或赖氨酸基。
15、权利要求12或13所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中R3选自下述的氨基酸基：
-酪氨酸，
-苯丙氨酸，
-丙氨酸，
-缬氨酸，
-亮氨酸，
-异亮氨酸，
-苯基甘氨酸。
16、权利要求12-15中任一权利要求所述的方法，其特征在于R3是酪氨酸。
17、权利要求12-15所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中R3代表苯丙氨酸。
18、权利要求12-15所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中R3代表苯丙氨酸，而R4代表精氨酸或赖氨酸。
19、权利要求21-18中任一权利要求所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中R1选自-H和-CH3，而R2选自CH3、O-CH3和-S-CH3。
20、权利要求12所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中：
式中：
·R1，R2＝H，-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-Cl、-CF3、-OCF3、-SCH3；
·R3＝用羧肽酶A可水解的氨基酸基；
·R4＝碱性氨基酸基。
21、权利要求21所述的方法，其特征在于底物是式(I)化合物，其中：
所述的化合物选自下述化合物：
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (3)*
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (4)*
R1＝-CH3 (2)* R2＝-CH3 (5)*
R1＝-H R2＝-O-CH3
R1＝-H R2＝-O-CH3
R4＝-(CH2)4-NH2
R1＝-Cl R2＝-CH3
R1＝-H
R1＝-H R2＝-SCH3
R1＝-H R2＝-SCH3
*括号中的数字确定甲基在苯基上的位置。
22、权利要求12、13、15、20或21中任一权利要求所述的方法，其中式(I)化合物是4-MTPAFYR(4-甲硫基苯基偶氮甲酰基酪氨酸精氨酸)。
23、权利要求12-22中任一权利要求所述的方法，其特征在于在不加CPA的情况下测定混合物的光密度，然后在加CPA后测定混合物的光密度。
24、权利要求12-23中任一权利要求所述的方法，其特征在于将所测定的显色降低值与校准曲线上的值进行比较。
25、权利要求12-24中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述试样是血样。
26、权利要求25所述的方法，其特征在于所述试样是血浆。
27、权利要求12-26中任一权利要求所述的方法，其特征在于CPA是胰CPA。
28、权利要求12-27中任一权利要求所述的方法，其特征在于将待测试样加到激活剂缓冲液中，其时间足以激活要测定活性的羧肽酶U，然后加到丝氨酸蛋白酶抑制剂中。
29、权利要求28所述的方法，其特征在于与激活剂缓冲液同时添加式(I)底物，或在加入丝氨酸蛋白酶抑制剂同时或之后立刻添加式(I)底物。
30、权利要求28所述的方法，其特征在于采用凝血酶/凝血调节蛋白复合物方法进行激活。
31、测定试样中组成CPN或CPU的活性和同一试样中可激活CPN或CPU的活性的方法，其特征在于，将试样加入激活剂缓冲液，如必要，其时间足以激活要测定活性的羧肽酶U，然后加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，其后比较试样对式(I)底物的水解活性，所观察的水解活性与没有权利要求21所述的激活剂缓冲液时试样对式(I)底物的水解活性进行比较。
32、权利要求21-28中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述羧肽酶是CPU。
33、权利要求32所述的方法，其特征在于所述CPU是TAFI。
34、权利要求28-33中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在有和没有特异性TAFI抑制剂存在下处理试样。
35、权利要求28-34中任一权利要求所述的方法，其特征在于特异性TAFI抑制剂是CPI。
36、血样中激活TAFI的测定方法，该方法包括下述步骤：
a)使样品的第一等分试样与特异性TAFI抑制剂接触，再使用权利要求28所述的方法处理该试样，
b)在没有特异性TAFI抑制剂存在下，使用权利要求28所述的方法处理该样品的第二等分试样，
c)测量第一等分试样与第二等分试样的ΔOD，该ΔOD表示样品中激活TAFI的活性。
37、权利要求36所述的方法，用于区分同一样品中组成TAFI的活性与可激活TAFI的活性，其特征在于测定同一样品的第三等分试样在没有激活剂缓冲液时对式(I)底物的水解活性。
38、权利要求1-11中任一权利要求所述的式(I)化合物在测定试样中的羧肽酶N或U的酶活性中的应用。
39、权利要求38所述的应用，其特征在于所述羧肽酶是TAFI。
40、测定试样中CPN或CPU活性的试剂盒，该盒包括由权利要求1-11中任一权利要求所述的化合物构成的生色底物。
41、测定生物试样中TAFI活性的试剂盒，该盒包括：
-TAFI激活剂缓冲液；
-羧肽酶A；
-权利要求1-11中任一权利要求所述的式(I)底物；
-TAFI抑制剂。
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