CN1610749A

CN1610749A - 谷氨酸衍生物的制备方法

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Publication number: CN1610749A
Application number: CNA028263022A
Authority: CN
Inventors: 杉山雅一; 渡部乙比古; 船越直; 网野裕右; 河原滋; 竹本正
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-09
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2022-12-09
Also published as: CN101671707A; JP4301003B2; CA2469012C; RU2325442C2; RU2006108992A; EP1445323A4; CA2469012A1; EP2460884A2; KR100673283B1; RU2004122914A; KR100775778B1; KR20040066830A; ATE497013T1; WO2003056026A1; RU2280078C2; JPWO2003056026A1; DE60239072D1; EP2460884A3; EP2330211A3; KR20060060750A

Abstract

有效地制备可望用作甜味剂成分如莫纳汀等谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)的方法，该方法包括在对由右上述通式(1)的取代α－酮酸生成右下述通式(2)所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，进行该反应。

Description

谷氨酸衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及利用酶反应制备谷氨酸衍生物的方法。本发明还涉及用氨基酸之一的色氨酸作为出发原料，制备可用作甜味剂的莫纳汀(モナテイン)的方法。

背景技术

下述结构式(6)所示的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基谷氨酸(即，3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁烷-4-基)-吲哚)(以下称为“莫纳汀”)是南非的灌木Schlerochitom ilicifolius的根含有的一种氨基酸，因为其甜味为蔗糖的数百倍，所以是有望作为热量特别低的甜味剂的化合物(参照特开昭64-25757号公报)。

4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基谷氨酸

上述的莫纳汀在2位和4位有不对称碳原子，天然型莫纳汀的立体异构体为(2S，4S)型。此外，有关非天然型的立体异构体，已证实存在3种通过合成制备的立体异构体。而且，不仅是上述天然型的莫纳汀，而且任何一种其他立体异构体都具有高倍的甜度，其中的一种或多种的混合物都有望作为甜味剂或甜味剂的成分(甜味料)而利用。

至于莫纳汀的制备方法，以前曾报导过5例。详细如以下(1)-(5)的现有技术文献所述。

(1)美国专利NO.5994559说明书

(2)四面体快报(Tetrahedron Letter)，2001年，42卷39号，6793-6796页

(3)有机快报(Organic Letter)，2000年，2卷19号，2967-2970页

(4)合成通讯(Synthetic Communication)，1994年，24卷22号，3197-3211页

(5)合成通讯(Synthetic Communication)，1993年，23卷、18号，2511-2526页。

但是，所有这些方法都需要多个步骤，而工业制备水平的合成莫纳汀的方法至今尚未建立。因此，需要开发一种更简便，而且收率高的包括上述莫纳汀及其类似物的谷氨酸衍生物的工业制备方法。

因此，本发明的目的是提供一种有效地制备期待作为甜味料成分的莫纳汀及其类似物等的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)的方法。

发明的公开

根据上述的问题，经过反复努力研究的结果，本发明者成功地实现了：在对由下述通式(1)的取代α-酮酸

(通式(1)中，R¹及R²相互独立，各自代表选自氢原子、碳原子数为1-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基的取代基。但是，R¹和R²中之一代表氢原子的场合，另一方不代表氢原子、甲基或乙基。此外，R¹和R²中之一代表羟基的场合，另一方不代表氢原子或甲基。R¹含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)

产生下述通式(2)

(通式(2)中的R¹及R²与通式(1)中的R¹及R²的含意相同。)

所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，通过该反应的进行，生成上述通式(2)的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)。基于此发现，即完成了本发明。

根据本发明的谷氨酸衍生物制备方法，由下述式(7)所示的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(以下称为IHOG)，利用酶反应，能够有效地制备下述式(6)所示的莫纳汀。

4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基谷氨酸

此外，本发明的发明者们利用本发明的谷氨酸衍生物的制备方法，开发了以氨基酸之一的色氨酸作为出发原料，具有下述反应①-③的新的莫纳汀的制备方法。具有下述①-③反应的莫纳汀的制备方法中，本发明的谷氨基衍生物的制备方法相当于反应③。由反应①-③构成的莫纳汀的制备途径如反应式(8)所示。

反应①：在酶的存在下，由色氨酸合成吲哚-3-丙酮酸

反应②：通过吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)的醛醇缩合，合成前体酮酸(IHOG)

反应③：在酶的存在下，使IHOG的2位氨基化，合成莫纳汀。

亦即，本发明如以下所述：

[1]谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，在对由下述通式(1)的取代α-酮酸，

(通式(1)中，R¹及R²相互独立，各自代表选自氢原子、碳原子数为1-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。但是，R¹和R²中之一代表氢原子的场合，另一方不代表氢原子、甲基或乙基。此外，R¹和R²中之一代表羟基的场合，另一方不代表氢原子、甲基。R¹含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)

生成下述通式(2)所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，

(通式(2)中的R¹及R²与通式(1)中的R¹及R²的含意相同。)

通过该反应的进行，生成上述通式(2)的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)。

[2][1]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于上述的R¹为苯甲基或3-吲哚基甲基，上述的R²为羟基。

[3][1]或[2]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的酶为脱氢酶或转氨酶。

[4][3]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的酶为转氨酶，而且反应系统中包含1种或多种的氨基酸作为氨基供体。

[5][4]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸。

[6][3]-[5]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的酶为L-氨基酸转氨酶。

[7][3]-[5]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的酶为D-氨基酸转氨酶。

[8][7]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，反应系统中含有具有对L-氨基酸转换为D-氨基酸的反应进行催化的活性的酶。

[9][6]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的L-氨基酸转氨酶是来源于选自气单胞菌属、土壤杆菌属、产碱菌属、拜叶林克氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属和摩根氏菌属的微生物的酶。

[10][9]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的微生物选自嗜水气单胞菌、根癌土壤杆菌、粪产碱菌、印度拜叶林克氏菌、大肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌(Proteus rettgeri)以及摩氏摩根氏菌。

[11][7]或[8]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的D-氨基酸转氨酶为来源于芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属微生物的酶。

[12][11]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的微生物选自球形芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、幼虫类芽孢杆菌尘埃类芽孢杆菌亚种(Paenibacillus larvaesubsp.pulvifaciens)以及浸麻类芽孢杆菌。

[13][1]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的酶为导入了D-氨基酸转氨酶基因的微生物所产生的酶。

[14][13]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的微生物为大肠杆菌。

[15][13]或[14]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的D-氨基酸转氨酶基因来源于球形芽孢杆菌或浸麻芽孢杆菌。

[16]谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，该方法至少包括下述[1]和[2]的步骤，

[1]在对由下述通式(3)所示的取代α-酮酸、

(通式(3)中，R代表选自碳原子数为2-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。R含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)

和草酰乙酸或丙酮酸生成下述通式(4)所示的取代α-酮酸的反应进行催化的酶存在下，

(通式(4)中的R与通式(3)中的R含意相同。)

通过该反应的进行，生成上述通式(4)的取代α-酮酸的步骤；

[II]在对由上述通式(4)的取代的α-酮酸生成下述通式(5)

(通式(5)中的R与通式(3)中的R含意相同。)

所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，通过该反应的进行，生成上述通式(5)的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)的步骤。

[17][16]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述的R为苯甲基或3-吲哚基甲基。

[18][16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，对上述步骤[1]的反应进行催化的酶来源于选自假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属的微生物。

[19][18]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述微生物为腐臭假单胞菌、晕斑假单胞菌、解韧带假单胞菌、欧文氏菌种、莱茵黄杆菌或柑橘黄单胞菌。

[20][19]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，上述微生物为腐臭假单胞菌ATCC4683或晕斑假单胞菌AJ2791。

[21][16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，对上述步骤[1]的反应进行催化的酶为下述任何一种蛋白质，

(a)具有序列表的序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质

(b)具有在序列表的序列号2所述的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛缩酶活性的蛋白质

(c)具有序列表的序列号3所述的氨基酸序列的蛋白质

(d)具有在序列表的序列号3所述的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛缩酶活性的蛋白质。

[22][16]或[17]所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，对上述步骤[1]中反应进行催化的酶来源于扩增并表达编码下述任何一种蛋白的基因的重组体，

(a)具有序列表的序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质

(c)具有序列表的序列号3所述的氨基酸序列的蛋白质

(d)具有在序列表的序列号3所述的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列、并有醛缩酶活性的蛋白质。

[23]莫纳汀的制备方法，其特征在于该方法至少包括下述[A]-[C]的步骤，

[A]在对色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应进行催化的酶存在下，通过使色氨酸反应，生成吲哚-3-丙酮酸的步骤

[B]由吲哚-3-丙酮酸和草酰乙酸或丙酮酸生成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的步骤

[C]在对由4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸生成莫纳汀的反应进行催化的酶存在下，通过使上述的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸反应，生成莫纳汀的步骤。

[24][23]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的步骤[A]是在对色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应进行催化的酶存在下，通过使色氨酸反应，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反应液，对该反应液进行脱气处理、脱氧处理以及调节pH值至最高为2中的任何一种处理，收集吲哚-3-丙酮酸的步骤。

[25][24]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的脱气处理或脱氧处理是用惰性气体置换上述反应液中所含气体的全部或一部分的方法。

[26][25]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的惰性气体是氮、氩和氯中的任一种。

[27][24]-[26]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的pH调节是在上述反应液中添加酸；还包括因pH调节的结果而使生成的吲哚-3-丙酮酸晶析，以及收集该晶体的步骤。

[28][27]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的酸为硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的任何一种。

[29][23]-[28]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述对步骤[A]的反应进行催化的酶来源于具有氨基酸氧化酶活性和过氧化氢酶活性的微生物。

[30][23]-[29]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述对步骤[A]的反应进行催化的酶来源于无色杆菌属、变形菌属和摩根氐菌属中的任何一个菌属。

[31][30]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述催化步骤[A]的反应的酶来源于无色杆菌属种AJ2425、雷氏普罗威登斯菌IFO13501、以及摩氏摩根氏菌IFO3168中的任何一种。

[32][23]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的步骤[A]是将选自无色杆菌属、变形菌属、摩根氏菌属、假单胞菌属以及链孢霉属的、具有转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培养物作用于色氨酸，生成吲哚-3-丙酮酸，并收集该吲哚-3-丙酮酸的步骤。

[33][23]-[32]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的步骤[B]在对该反应进行催化的酶存在下进行。

[34][23 ]-[32]所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，上述的步骤[B]用化学合成法进行。

实施发明的最佳方式

本发明者开发的谷氨酸衍生物的制备方法是，利用酶反应，由下述通式(1)的取代α-酮酸生成下述通式(2)的谷氨酸衍生物的方法，例如，是涉及利用催化氨基转移反应的酶或产生该酶的微生物的作用，制备谷氨酸衍生物的方法。

此外，本发明者开发的以色氨酸为出发原料的莫纳汀的制备方法具有下述反应①-③。在具有下述反应①-③的莫纳汀的制备方法中，利用了作为反应③的本发明的谷氨酸衍生物的制备方法，

反应①：在酶的存在下，由色氨酸合成吲哚-3-丙酮酸

反应③：在酶的存在下，IHOG的2位进行氨基化，合成莫纳汀。

反应①-③中，反应①和③是用酶进行的反应，而对反应②的实施方法无特定的限制，化学合成系统和酶系统都可以使用。

本发明的莫纳汀的制备方法不限于以色氨酸为出发物质制备莫纳汀的方法，上述反应①-③中，可以将反应③作为必要步骤包含在内。

亦即，以市售的吲哚-3-丙酮酸为出发物质，通过反应②和反应③制备莫纳汀的方法、以及以前体酮酸(IHOG)为出发物质，通过反应③制备莫纳汀的方法等都包括在本发明内。因此，下述(a)-(c)的方法全都符合本发明的莫纳汀的制备方法。

(a)反应①+反应②+反应③

(b)反应②+反应③

(c)只有反应③

此外，上述莫纳汀的制备方法中的反应②，不只是用于合成莫纳汀的前体酮酸(IHOG)，也可以用于制备在本发明的谷氨酸衍生物的制备方法中作为底物使用的取代α-酮酸。亦即，如下述式(10)所示，用由反应②得到的通式(4)的取代α-酮酸，通过反应③制备通式(5)的谷氨酸衍生物的方法(反应②+反应③)也包括在本发明的谷氨酸衍生物的制备方法之内。

以下，按照

[A]反应①

[B]反应②

[C]反应③

的顺序，参照附图，对本发明详细地进行说明。

[A]反应①

下述反应式(11)中所示的反应①是关于制备吲哚-3-丙酮酸的反应。本发明中反应①的特征在于，在对色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应进行催化的酶存在下，通过使色氨酸反应，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反应液，对该反应液进行脱气处理、脱氧处理以及调节pH值至最高为2中的任何一种处理，收集吲哚-3-丙酮酸。

现有的吲哚-3-丙酮酸的化学制备方法已知有Giovanna De Luca等，以色氨酸为出发原料，在用于质子受体脱氢的碱存在下，与吡啶醛反应，得到收率为50-62％的吲哚-3-丙酮酸的方法(参照特表昭62-501912号公报、国际公布第87/00169号文本)。该方法中所必须的碱和吡啶醛非常昂贵，且收率低，结果造成制备成本非常高。另外，已知的方法还有，Politi Vincenzo等，用吲哚和3-溴丙酮酸乙酯肟(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作为原料进行缩合反应后，再通过加酸水解，得到收率为64％的吲哚-3-丙酮酸的方法(参照欧洲专利421946号公报)。该方法中，必须要进行用硅胶精制的步骤，收率低，原料价格也高，存在工业制备成本非常高的问题。

另一方面，作为酶的制备方法，已知有使用转氨酶的方法(参照下述式(12))。

已报导的方法有：使麦芽糖假丝酵母来源的L-色氨酸转氨酶作用于L-色氨酸(L-Trp)，由40mM L-Trp和80mM 2-酮戊二酸生成吲哚-3-丙酮酸，用离子交换树脂等精制后得到收率为72％的产物的方法(参照Bobe Ruediger等，东德专利D D297190)；使天冬氨酸转氨酶作用于L-Trip和2-酮戊二酸，生成吲哚-3-丙酮酸，用石油醚将该反应液抽提后，通过用柱色谱分离，精制并收集吲哚-3-丙酮酸的方法(参照Mario Matterazzi等，特开昭59-95894号公报)。这些采用转氨酶的方法收率低、除了L-Trp以外，还必须用2-酮戊二酸等用作氨基受体的酮酸作为原料，而且还生成与吲哚-3-丙酮酸等摩尔的相应于氨基受体的氨基酸副产物。此外，为了提高收率，在反应系统中投入了相对于L-Trp为过量的酮酸，所以反应后有未反应的酮酸存在。

基于这些理由，为了从反应液中收集目的产物吲哚-3-丙酮酸，必须要进行采用离子交换树脂等的精制步骤，从而使操作变得烦琐、成本提高。

此外，由L-Trp制备吲哚-3-丙酮酸的方法已知有用L-氨基酸氧化酶的方法。但是，利用L-氨基酸氧化酶进行色氨酸的氧化反应(参照下述反应式(13))时，由于副产物过氧化氢将吲哚-3-丙酮酸分解为吲哚乙酸(参照下述反应式(14))，所以提出了在反应系统中添加过氧化氢酶将过氧化氢分解(参照下述反应式(15))的方案(参照美国专利5002963号说明书；四面体快报，1987年28卷12号1277-1280页)。

也就是说，该方法是使用将蛇毒来源的L-氨基酸氧化酶和牛肝脏来源的过氧化氢酶固定在载体上的固定化酶柱，使含L-Trp的溶液通过柱，进行反应，生成的吲哚-3-丙酮酸吸附在离子交换柱上，用甲醇洗脱后，干燥、收集。但是，采用本方法，由起始0.5g的L-Trp只能获得0.2g的吲哚-3-丙酮酸，不仅收率低、仅为40％，而且酶的固定化、离子交换树脂精制等步骤很烦杂，还需要回收、再利用未反应的L-Trp的步骤，所以存在成本高的问题。

另一方面，就微生物来源的L-氨基酸氧化酶而言，John A.Duerre等将雷氏普罗威登斯菌来源的L-氨基酸氧化酶粗精制后，利用检测酶的消耗量的活性测定法，检测L-Trp的氧化活性(参照Journal ofBacteriology，1975年，121卷，No.2，656-663)。此外，古山等利用检测酶的消耗量的活性测定法，证实了假单胞菌属种P-501来源的L-苯基丙氨酸氧化酶也与LTrp作用(参照野田产研，Kiyofumi Maruyama，Journal of Biochemistry，108，327-333，1990)。

但是，这些报告中，都是通过测定酶反应中的L-色氨酸的消耗量、氧的消耗量或过氧化氢的生成量来检测氧化酶的活性，而不能直接测定吲哚-3-丙酮酸的量。这可能是由于通过氨基酸氧化酶反应生成的过氧化氢将吲哚-3-丙酮酸分解为吲哚-乙酸的原因。另一方面，目前尚未有用微生物菌体或菌体处理物生成吲哚-3-丙酮的例子，因此，色氨酸如何通过微生物进行代谢、生成什么样的分解产物等都是未知的。

此外，在生成的吲哚-3-丙酮酸的收集方法方面，上述相关技术中，采用转氨酶的方法，以及用蛇毒来源的L-氨基酸氧化酶的方法其反应收率低，副产物酮酸和未反应的L-色氨酸混在反应液中，所以必须通过色谱分离步骤来收集吲哚-3-丙酮酸，因此，存在操作繁锁、成本高的问题。

鉴于上述的状况，本发明者为提供低价、简便的吲哚-3-丙酮酸制备方法而进行了反复研究，结果发现，用具有氨基酸氧化酶和过氧化氢酶活性的微生物作用于色氨酸，即可生成吲哚-3-丙酮酸，并将其收集；并发现可以优选在用惰性气体对生成吲哚-3-丙酮酸的反应液进行置换、或通过调节pH一边抑制目的物分解一边生成吲哚-3-丙酮酸，并将其收集。本发明者在反复研究的过程中，进一步发现并解决了吲哚-3-丙酮酸除了由过氧化氢酶将其分解为吲哚乙酸以外，还受到溶液中的氧等的侵袭，生成结构不明的分解物而使含有吲哚-3-丙酮酸的溶液着色的问题。

亦即，本发明中，在对色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应进行催化的酶存在下，通过使色氨酸反应，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反应液，对该反应液进行脱气处理、脱氧处理以及调节pH值至最高为2中的任何一种处理，收集吲哚-3-丙酮酸。

吲哚-3-丙酮酸在溶液的状态下进行分解和着色，但通过上述的酸添加法，由于在收集生成的吲哚-3-丙酮酸的初期，吲哚-3-丙酮酸产生结晶，与其它的精制、处理法相比，具有可抑制分解、着色的优点。

此外，在酸性条件下，通过直接结晶除去吲哚-3-丙酮酸的分解物吲哚乙酸也未必容易，如采用上述的惰性气体置换，则具有抑制副产物吲哚乙酸生成的效果，因此，将上述在酸性条件下结晶和惰性气体置换结合起来，通过收集高纯度的吲哚-3-丙酮酸，表明其具有高的效果。

另外，作为本发明的反应①另一种方式，其特征是，将具有转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培养物作用于色氨酸，生成吲哚-3-丙酮酸，并收集该吲哚-3-丙酮酸。

迄今为止，尚未见有关使具有转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培养物作用于色氨酸，生成吲哚-3-丙酮酸，并收集该吲哚-3-丙酮酸的报道。因此，上述的方法提供了新的有用的酶法制备吲哚-3-丙酮酸的方法。

下面，按下述顺序对本发明的反应①的实施方式加以说明：

(A-1)反应①中使用的酶

(A-2)反应①的反应条件。

(A-1)反应①中使用的酶

作为反应①中使用的酶，只要是具有转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸的活性的酶就可以使用而没有特别的限定。优选具有氨基酸氧化酶和过氧化氢酶活性的酶用作反应①中使用的酶。

反应①中，所谓“具有氨基酸氧化酶活性”是催化下述反应式(13)所示的反应的活性。一般，L-氨基酸氧化酶催化由L-氨基酸生成对应的酮酸，D-氨基酸氧化酶催化由D-氨基酸生成对应的酮酸。亦即，本发明中，在以L-色氨酸为原料的场合，使用具有L-氨基酸氧化酶活性的微生物，在以D-色氨酸为原料的场合，使用具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物。也可以由DL-色氨酸制备。使D-及L-氨基酸氧化酶作用于DL-色氨酸时，可以定量生成目的吲哚-3-丙酮酸，此外使用D-或L-氨基酸氧化酶作用于DL-色氨酸则可以50％的收率生成目的吲哚-3-丙酮酸。

此外，所谓“过氧化氢酶活性”是催化下述反应式(15)所示的反应的活性。

反应①中具有氨基酸氧化酶活性的酶可以用以下各种方法的任何一种进行选择：检测由氨基酸的氧化活性引起的氧消耗量的测定法(参照例，Journalof Bacteriology 121卷，No.2，656-663，1975)，定量测定通过反应生成的过氧化氢的方法(参照例，M.Gabler等，Emzyme andMicrobial Technology，27，605-611，2000)等各种公知的方法，以及本发明中后面所述的直接定量测定由色氨酸生成的吲哚-3-丙酮酸的方法。

反应①中具有过氧化氢酶活性的酶可以用以下各种公知的方法进行选择：用在230nm-250nm的吸光度变化来测定过氧化氢酶反应引起的过氧化氢减少的方法、用kMnO₄对反应液中残存的过氧化氢进行定量的方法、用气压计测定反应中生成的氧的方法等。例如，在M.Gabler等，Emzyme and Microbial Technology，27，605-611，2000中所述，通过过氧化氢酶的作用，使邻联茴香胺等电子供体氧化，并用光谱法定量测定残留的过氧化氢的方法。上述这些方法都可以用来选择具有过氧化氢酶活性的酶。

此外，反应①中使用的酶也可以按照后述的实施例1所述的方法，通过检测其由色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的活性进行选择。

可产生反应①中使用的酶的微生物可选自例如，无色杆菌属、变形菌属、摩根氏菌属、假单胞菌属、链孢霉属。优选该微生物为具有氨基酸氧化酶和过氧化氢酶活性的微生物，具体优选的微生物的例子可举出无色杆菌属、变形菌属、摩根氏菌属等，其中无色杆菌属种AJ2425、雷氏普罗威登斯菌IFO13501以及摩氏摩根氏菌IFO3168为优选的微生物。

另外说明，无色杆菌属种AJ2425已按下述进行保藏。

无色杆菌属种AJ2425株

(a)堡藏号FERM BP-8244(2002年11月22日由FERM P-18786转移至国际专利生物保藏机构保藏)

(b)保藏日2002年3月20日

(c)保藏地点：独立行政法人工业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))

此外，对于财团法人发酵研究所(IFO)保藏的微生物，可以通过日本大阪市淀川区十三本町2丁目17-85(邮编532-8686)的财团法人发酵研究所出售或购买。

上述这些微生物也可以是从土壤、植物等自然界新分离的菌株，或者也可以是通过导入诱变剂处理或重组技术等人工育种的菌株。

对于产生反应①中使用的酶的微生物的培养方法，通常可以采用该领域所用的培养基，即含有碳源、氮源、无机盐类、微量金属盐类、维生素等的培养基，进行培养。例如，上述微生物能利用的任何碳源都可以用作碳源，具体可以使用葡萄糖、蔗糖、糊精等糖类；山梨醇、乙醇、甘油等醇类；富马酸、柠檬酸、乙酸、丙酸等有机酸类及其盐类；石蜡等烃或者它们的混合物。

硫酸铵、氯化铵、尿素、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物等或它们的混合物可以用作氮源。可举出所含具体的培养基组成如下的培养基等：葡萄糖1.0％，硫酸铵0.3％，粉末酵母提取物1.0％，胨1.0％，KH₂PO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，MnSO₄·4H₂O 0.001％(pH7)。

此外，培养基中添加L-氨基酸或D-氨基酸作为酶诱导剂，有时会得到高能力的转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸的菌体。

还有，为了提高底物进入菌体内部的渗透性，也可以利用TritonX、Tween等表面活性剂和甲苯、二甲苯等有机溶剂。

对于培养温度，通常在所用微生物的生长范围，例如约20-45℃左右，优选在约25-37℃左右的温度范围下进行。优选培养基的pH值为约3-10左右，更优选调节至约4-8的范围。通气条件设定在适合于所用的微生物生长的条件，但优选好气条件。培养时间通常为约12-120小时，优选反应约16-96小时。

(A-2)反应①的反应条件

反应①的特征是，在酶的存在下，由色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，得到反应液，对该反应液进行脱气处理、脱氧处理以及调节pH值至最高为2中的任何一种处理，收集吲哚-3-丙酮酸。

反应①中，所谓“在酶的存在下”意味着在能够将色氨酸转换为吲哚-3-丙酮酸的状态下，该酶存在于反应系统中。也就是说，只要能够将色氨酸转换为吲哚-3-丙酮酸，该酶可以以任何形式存在于反应系统中，例如，可以将单纯的酶加入反应系统中，也可以将具有该酶活性的微生物(产酶的菌，重组DNA转化的细胞)、该微生物的培养物(液体培养，固体培养等)、培养基(培养物除去菌体后所得的培养基)、该培养物的处理物加入反应系统中。使用微生物培养物的场合，可以在培养微生物的同时，使反应①进行；也可以用为了获得酶而预先培养的培养物进行反应①。此外，这里所说的“处理”意味着为了取出菌体内的酶而进行的处理，例如有：用超声波、玻璃珠、French压榨机、冷冻干燥处理，和用溶菌酶、有机溶剂、表面活性剂等处理。此外，经过这些处理的处理物通过常规方法(液体色谱、硫铵分级等)而制备得到的粗酶部分或精制的酶，只要其具有所要求的能力，也可以使用。

在利用上述培养物或其处理物时，也可以进一步将它们包埋在卡拉胶或聚丙烯酰胺内，或者在聚醚砜或再生纤维素等的膜上固定化，然后使用。

对于菌体或菌体处理物的使用量，只要在给定的反应中，该量能发挥出达到目的效果的作用(有效量)即可，该有效量对本领域技术号人员而言，通过简单的预备试验就可求得，例如，使用洗净的湿菌体的场合，每100ml反应液用1-40g。

作为底物的色氨酸，其L-型、D-型、DL-型的任何一种都可以使用，但从容易获得和价格方面考虑，采用L-型。色氨酸可在其不抑制目的反应的浓度范围内，一次性、间歇地、或连续地添加。添加的方法可以是在菌株培养中直接添加；也可以在培养后将菌体分离，然后与该分离所得的菌体或其处理物混合使用。添加时，底物以水溶液或浆状的形式添加，但为了增加其溶解度，及促进其分散，也可以和不影响反应的有机溶剂或表面活性剂混合在一起添加。

本发明所用的反应可以按下述条件在搅拌或静置下进行：

pH范围优选在pH3-10左右，更优选在pH5-9左右；温度范围优选为10-60℃左右，更优选为20-40℃左右；反应时间优选为0.5-120小时左右，更优选为0.5-24小时左右。底物的浓度无特别限制，优选采用约0.1％-10％左右的浓度。

另外，培养液或反应液中的残存色氨酸、生成的吲哚-3-丙酮酸、或副产物吲哚乙酸的定量可以用众所周知的高效液相色谱方法快速、方便地进行测定。

对积累了由此所得的吲哚-3-丙酮酸的培养液(反应液)，通过进行脱气处理或脱氧处理，可以抑制吲哚-3-丙酮酸的分解。脱气处理和脱氧处理的方法可举出：用惰性气体，例如氮和氩等，置换该反应液中含有的气体(全部或部分)。

这里所说的“脱气处理”意味着用惰性气体对该反应液进行置换或者通过使用吸气器或真空泵等使反应液处于减压条件下等的操作，除去反应液中存在的氧、过氧化氢等与吲哚-3-丙酮酸反应的成分，或降低其浓度的操作。此外，所谓的“脱氧处理”是除去反应液中溶解的氧，或使其浓度降低的操作。除去溶液中的氧的方法具体的例子有：用惰性气体除去氧的方法，和在溶液中添加脱氧剂的方法。

通过用惰性气体对该反应液进行置换，除去反应液中残存的氧，使反应停止的同时，还能够防止生成的吲哚-3-丙酮酸和残存色氨酸的分解。这里所说的“惰性气体”是指不与吲哚-3-丙酮酸直接或间接地反应，并能减少与吲哚-3-丙酮酸或色氨酸反应的氧或微量残存的过氧化氢等成分的气体。本发明中能使用的惰性气体举例来说有氮、氩、氦等。惰性气体的置换可以在反应结束后立刻进行，用洗净的菌体进行反应的场合，也可以在菌体分离后进行。

输入惰性气体的方法有：用惰性气体置换气相部分，降低气相部分中氧浓度的方法、将惰性气体导入溶液中，除去溶解的氧的方法等，对该输入方法没有特别的限定。气相部分的氧浓度采用5％或以下，优选在3％或以下，更优选1％或以下。溶液中的氧浓度要求在1ppm或以下，优选在0.1ppm或以下，更优选在0.01ppm或以下。

此外，在反应液中适当添加已知有降低溶解氧浓度效果的亚硫酸钠等已知物质，也有可能停止反应和抑制吲哚-3-丙酮酸的分解。

亚硫酸离子可以用作本发明中的脱氧剂。作为亚硫酸离子的来源，可以采用亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸铵等盐或亚硫酸、或者连二亚硫酸盐。优选亚硫酸离子或连二亚硫酸盐的使用浓度在20ppm～1％，更优选在100ppm～0.5％。

上述的惰性气体置换处理和溶液中添加脱氧剂的方法可以组合起来实施，也可以只实施其中的任一种。

通过反应生成的吲哚-3-丙酮酸可以用常规方法从培养液或反应液中收集使用。从培养液或反应液中的收集是将该场合下该领域通常使用的公知技术，例如过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱、结晶等操作，根据需要适当地组合使用。

本发明的一个优选方案是通过将该反应液调节至酸性条件，使吲哚-3-丙酮酸结晶或沉淀，也可以从反应终了的混合物中直接分离、收集吲哚-3-丙酮酸。对反应液pH的调节，优选将其pH值调至2或以下，更优选调至1或以下为好。由于本发明能够制备吲哚-3-丙酮酸的生成率高，而溶液中副产物酮酸和未反应的L-色氨酸浓度低的反应产物，因此，可以在酸性条件下，使吲哚-3-丙酮酸直接结晶析出，从而简化精制的步骤。

本发明一个更优选的实施方案是在反应液中适当添加硫酸、盐酸等酸，使吲哚-3-丙酮酸可以直接结晶析出。由于该方法能够制备吲哚-3-丙酮酸的生成率高，而溶液中副产物酮酸和未反应的L-色氨酸浓度低的反应产物，因此，利用在酸性条件下，使吲哚-3-丙酮酸直接结晶析出，也可以简化精制步骤。

在调节至酸性条件时，对使用的酸的种类没有特别的限别，只要该方法具有使该反应液变成酸性的效果即可。所使用的酸的例子有：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等。本领域的技术人员可以在不妨碍本发明的实施的范围内，选择适当的结晶温度、酸的用量、结晶时间、酸的添加方法等。

结晶温度可优选为约-20℃-100℃，更优选为约0℃-60℃。酸的用量可以选择为能将反应液的pH值调节至优选为2或以下，更优选为1或以下的量。可添加、使用的酸是，在添加该酸后，能使其溶液中的氢离子浓度达到约0.01-10mol/L，更优选达到约0.1-1mol/L的酸。

结晶时间可选择为：优选约1-100小时，更优选约1-24小时。

[B]反应②

本发明的反应②是由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成莫纳汀的前体酮酸(IHOG)的反应。但是，反应②不仅可用于合成IHOG，还可以用于合成后述的反应③中用作底物的取代α-酮酸。

即，反应②可以广泛用于由下述通式(3)所示的取代α-酮酸

和草酰乙酸或丙酮酸，生成下述通式(4)所示的取代α-酮酸的反应中。

由反应②得到的通式(4)的取代α-酮酸可以用作后述反应③中的底物。

通式(3)、(4)中，R表示选自碳原子数为2-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含有杂环的烃基、羟基中的取代基。R为含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环还可以进一步被卤原子(碘原子，溴原子，氯原子，氟原子等)、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。

优选R为苯基甲基或3-吲哚基甲基，特别优选3-吲哚基甲基。

也就是说，优选通式(3)的取代α-酮酸为苯丙酮酸或吲哚-3-丙酮酸，特别优选吲哚-3-丙酮酸。作为吲哚-3-丙酮酸，优选用[A]反应①项所述的方法制备的吲哚-3-丙酮酸，当然，吲哚-3-丙酮酸的制备方法不限于这种方法。

用吲哚-3-丙酮酸作为通式(3)的取代α-酮酸时，可以制备莫纳汀制备的重要中间体IHOG(反应式(16))。

此外，用苯丙酮酸作为通式(3)的取代α-酮酸时，可以制备莫纳汀的类似物4-苯甲基-4-羟基-谷氨酸(PHG)的中间体酮酸PHOG(4-苯甲基-4-羟基2-氧代戊二酸)(反应式(17))。

对反应②的实施方式无特别限定，化学反应系统和酶反应系统的任何一种都可使用。以下，对反应②的实施方式分成化学反应系统和酶系统，按下述顺序加以说明。

(B-1)化学反应系统

(B-2)酶系统

(I)反应②中使用的酶

(1)编码醛缩酶的DNA

(2)醛缩酶的性质

(3)醛缩酶的制备方法

(II)反应②的反应条件。

(B-1)化学反应系统

利用以下所示的方法，或后述的实施例2，很容易实施采用化学反应系统的反应②，当然，不限定于这种方法。

例如，使上述通式(3)所示的取代α-酮酸与草酰乙酸进行交叉醛醇缩合反应以及脱羧反应，可以制备上述通式(4)所示的取代α-酮酸。上述醛醇缩合反应所得的化合物成为在反应系统中形成的重要中间体，但不必将该化合物分离即可进入下一步的脱羧反应。

该醛醇缩合反应的条件无特别困难，只需在无机碱或有机碱存在下，在适当的溶剂中使取代的丙酮酸和草酰乙酸相互作用即很容易进行。

所用的溶剂无特别的限制，只要是对该反应无活性的溶剂即可。

对于反应温度、碱的用量、反应时间、出发物质的添加方法，本领域的技术人员可以在不妨碍本发明的实施的范围内，适当地选择。

优选的溶剂包括水、甲醇、乙腈和二甲基甲酰胺等极性溶剂等。

使用碱的场合，优选的碱有：无机碱，如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙等碱金属或碱土金属的氢氧化物或碳酸化物；有机碱，如三乙胺等。

反应温度可优选采用约-20-100℃，更优选采用约0-60℃。

醛醇缩合反应缩合物的脱羧反应可以通过自发的脱羧反应而完成，但在反应液中添加酸或金属离子或两者均添加，可以更有效地进行脱羧反应。在这种情况下使用的酸有：盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、对甲苯磺酸、离子交换树脂等固体酸；使用的金属离子有：镍离子、铜离子和铁离子等过渡金属离子等。反应温度优选为约-10-100℃，更优选为约0-60℃。

(B-2)酶系统

(1)反应②中使用的酶

反应②中使用的酶只要能催化下述的反应就可以使用而无特别的限定：即，通式(3)所示的取代α-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸通过醛醇缩合，合成上述通式(4)所示的取代α-酮酸的反应。也就是说，只要是催化该反应的酶即可，微生物来源的酶、通过基因重组获得的酶都可以使用。

根据本发明者的研究，证实了假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属中，有产生具有分解4-苯甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)活性的酶的菌株。

这些微生物产生的醛缩酶对分解1分子的PHOG，生成1分子的苯基丙酮酸和1分子的丙酮酸的反应进行催化，因此，本发明者们认为，该醛缩酶能催化由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。基于此考虑，本发明者们为了查清新的醛缩酶的存在，由该菌株的培养菌体分离精制了醛缩酶，与此同时，发现了该酶通过吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的醛缩合，合成了IHOG。

以前，曾报导过2例用作催化以2分子的α-酮酸(或取代α-酮酸)为底物的醛醇编合的微生物酶，即来源于假单胞菌属细菌的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶，和存在于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶。前者的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶催化由2分子丙酮酸生成4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸(4-HMG)的反应，以及催化由4-草酰柠苹酸生成1分子草酰乙酸和1分子丙酮酸的反应已有报导(参照Kiyofumi Maruyama，Journal ofBiochemistry，108，327-333，1990)。此外，已知后者的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶催化由1分子乙醛酸和1分子丙酮酸生成4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸(4-HMG)的反应。

但是，尚未见有关任何这些菌株的4-苯甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)的分解活性、由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成莫纳汀的前体酮酸(IHOG)的活性的报告和见识，这些菌株产生的醛缩酶是否能用于上述的莫纳汀的合成路线中尚不清楚。

亦即，在本发明者的发现之前，至今尚未见用微生物酶由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前体酮酸(IHOG)的例子。

此外，本发明者精制了腐臭假单胞菌ATCC4683来源的醛缩酶，确定了醛缩酶的氨基酸序列。进一步合成了由醛缩酶的氨基酸序列推导的约30个碱基对的DNA分子，用此DNA分子通过PCR法，分离、获得编码该醛缩酶的DNA中的一部分。进一步利用该DNA片段作为探针，从腐臭假单胞菌的染色体基因文库成功地分离得到编码腐臭假单胞菌来源的醛缩酶的全长DNA。

按上述方法特定的编码醛缩酶的DNA如序列表的序列号1所示。此外，由序列表的序列号1的碱基序列编码的醛缩酶氨基酸序列如序列表的序列号2和序列号3所示。序列表中的序列号2，是由序列表的序列号1所述的碱基序列中456-1118位碱基序列编码的醛缩酶的氨基酸序列。此外，序列表的序列号3，是由序列表的序列号1所述的碱基序列中444-1118位碱基序列编码的醛缩酶氨基酸序列。序列表的序列号2和3所述的任一种醛缩酶都有醛缩酶活性，催化由1分子吲哚-3-丙酮酸和1分子丙酮酸(或草酰乙酸)合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应。

(1)编码醛缩酶的DNA

具有序列表的序列号1的碱基序列的醛缩酶基因是由以上所述的腐臭假单胞菌ATCC4683株的染色体DNA分离的基因。序列表的序列号1的碱基序列，与已知的赭色假单胞菌细菌来源的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶(基因名proA)(参照Maruyama K.，等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，65(12)，2701-2709，2001)在氨基酸序列上，表现出有29％的同源性。另外说明，这里的同源性是用基因分析软件“genetyx ver.6”(GENETYX公司)，按照初始设定的各种参数算出的值。

以下说明由醛缩酶的产生菌获得编码醛缩酶的DNA的方法。

首先，测定精制的醛缩酶的氨基酸序列。在这种情况下，可以用Edman法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.，4，227页，1950年)测定氨基酸序列。或者可以用Applied Biosystems公司制备的测序仪测定氨基酸序列。本发明腐臭假单胞菌ATCC 4683来源的醛缩酶用蛋白酶进行限制性分解后，通过反相HPLC分离回收肽片段，确定其中的2个片段的内部氨基酸序列，鉴定为序列表的序列号4和5所示的序列。

根据已确定的氨基酸序列，可以推测出编码该氨基酸序列的DNA碱基序列。推测DNA的碱基序列时，采用通用的密码子。

根据推测的碱基序列，合成约30个碱基对的DNA分子。该合成DNA分子的方法已在四面体快报，1981年，22，1859页公开。或者，可以用Applied Biosystems公司制备的合成仪合成该DNA分子。该DNA分子可以用作探针，从醛缩酶产生菌的染色体基因文库中分离出编码醛缩酶的全长DNA。或者，可以用作引物，通过PCR法扩增本发明的编码醛缩酶的DNA。但是，因为用PCR法扩增的DNA不包含编码醛缩酶的全长DNA，所以用PCR法扩增的DNA作为探针，从醛缩酶产生菌的染色体基因文库中分离出编码醛缩酶的全长DNA。

在White，T.J.等，Trends Genet.5，1989年，185页中，描述了PCR法的操作。染色体DNA的制备方法、以及用DNA分子作为探针，从基因文库中分离目的DNA分子的方法在Molecular Cloning，2nddition，Cold Spring Harbor出版，1989年等中有描述。

分离的编码醛缩酶的DNA碱基序列的测定方法在A Practicalguide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons，Inc.，1985年中描述。此外，也可以用Biosystem公司制备的DNA测序仪测定碱基序列。编码腐臭假单胞菌ATCC4683来源的醛缩酶的DNA如序列表的序列号1所示。

另外说明，编码对由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反应进行催化的醛缩酶的DNA不仅只是序列表的序列号1所示的DNA。也就是说，因为产生对由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反应进行催化的醛缩酶的假单胞菌属中，每个种和株的碱基序列都应该存在差异。

当然，即使是由醛缩酶产生菌的染色体DNA分离的编码醛缩酶的DNA加以人工变异后的DNA，在其编码醛缩酶的情况下，也可以用于反应②。人工变异常用的方法有Method.In Enzymol.，1987年，154页所述的位点特异性诱变法。

此外，在严格的条件下，与具有与序列表的序列号1所述碱基序列的互补序列的DNA杂交，并编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA也可以用于反应②中。这里所说的“严格的条件”是指形成所谓特异的杂交，而不形成非特异杂交的条件。该条件很难明确地数值化，但可举例说明：同源性高的DNA之间，例如具有50％或以上，较优选80％或以上，更优选90％或以上，特别优选95％或以上同源性的DNA之间，发生杂交，而比该同源性低的DNA之间不发生杂交的条件(这里所说的同源性，希望是比较序列之间排列成使其一致的碱基数为最大时进行比较的计算值)；或相当于在37℃、0.1×SSC、0.1％SDS的通常Southern杂交的洗涤条件下，优选在60℃、0.1×SSC、0.1％SDS下，更优选在65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下杂交的条件。

另外，所说的“醛缩酶活性”是指由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的活性。但是，对于与序列表的序列号1所述的碱基序列的互补序列在严格条件下杂交的碱基序列，要求在33℃、pH 9的条件下，保持具有序列表的序列号2或3所述的氨基酸序列的蛋白质的10％或以上，优选30％或以上，较优选50％或以上，更优选70％或以上的醛缩酶活性。

还有，DNA所编码的蛋白质与序列表的序列号1所述的DNA编码的醛缩酶实质上相同时，该DNA也可以用于反应②中。亦即，下述DNA都属于本发明的DNA：

(a)编码由序列表的序列号2所述的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA

(b)编码具有在序列表的序列号2所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA

(c)编码由序列表的序列号3所述的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA

(d)编码具有在序列表的序列号3所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA。这里所述的“1个或数个”是指对蛋白质的立体结构、醛缩酶的活性无严重损坏的氨基酸残基数的范围，具体是1-50个，优选1-30个，更优选1-10个。此外，所述的“醛缩酶活性”的含意是，如以上所述，对由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG进行催化的活性。但是在序列表的序列号2所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列的场合，希望在33℃、pH9的条件下，保持具有序列表的序列号2或3所述的氨基酸序列的蛋白质的10％或以上，优选30％或以上，较优选50％或以上，更优选70％或以上的醛缩酶活性。

(2)醛缩酶的性质

下面，对精制的腐臭假单胞菌ATCC4683菌株来源的醛缩酶的性质进行说明。

由上述的基因分离和分析清楚地表明，腐臭假单胞菌ATCC4683菌株来源的醛缩酶具有序列表的序列号2或3所述的氨基酸序列。但是，具有在序列表的序列号2或3所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛缩酶活性的蛋白质当然也可以用于反应②中。

亦即，下述(a)-(d)的蛋白质可以用作催化反应②的酶。

(a)由序列表的序列号2所述的氨基酸序列构成的蛋白质

(b)具有在序列表的序列号2所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛缩酶活性的蛋白质

(c)由序列表的序列号3所述的氨基酸序列构成的蛋白质

(d)具有在序列表的序列号3所述的氨基酸序列中的1个或数个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加、或倒位而得的氨基酸序列、并具有醛缩酶活性的蛋白质。

这里的“数个”和“醛缩酶活性”的定义与(1)编码醛缩酶的DNA的一项中说明的定义相同。

这些醛缩酶对由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)通过醛醇缩合，合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的反应进行催化。

通过高效液相色谱(HPLC)，测定由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成的IHOG量，可以对上述醛缩酶的醛缩酶活性进行测定。

具体的方法是：在含有100mM缓冲液，50mM吲哚-3-丙酮酸，250mM丙酮酸，1mM MgCl₂，1％(v/v)甲苯的反应液中，添加醛缩酶，33℃下振荡反应4小时，用HPLC通过定量测定生成的IHOG，可以估计醛缩酶的活性。

IHOG的定量，例如，可以通过利用GL Sciences制备的“InertsilODS-2”(5μm，4.6×250mm)的HPLC分析定量。分析条件的例子如以下所示。

移动相：40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液

流速：1ml/min

柱温度：40℃

检测：UV 210nm

下面，对用上述方法测定的腐臭假单胞菌来源的醛缩酶的酶化学性质描述如下。

腐臭假单胞菌来源的醛缩酶能催化由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反应。至目前为止，已报道了两例对以2分子的酮酸(或草酰乙酸)为底物的醛醇缩合进行催化的微生物酶，即假单胞菌属细菌来源的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶，和大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等中存在的4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶，就前者

而言，完全未见关于其作用于PHOG或IHOG的报道，因此，根本不清楚用此酶是否能合成PHOG(和IHOG)。另外，对后者来说，未见其有PHOG分解活性，因此，不可能用此酶合成PHOG(和IHOG)。也就是说，腐臭假单胞菌来源的醛缩酶与迄今为止所报道的醛缩酶不同，该醛缩酶的特征是能够对吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)的醛醇缩合而合成IHOG的反应进行催化。

腐臭假单胞菌来源的醛缩酶的最适pH在33℃下为约9左右。

腐臭假单胞菌来源的醛缩酶的分子量用凝胶过滤法测定时约为146kDa，用SDS-PAGE法测定时约为25kDa，因此，推测本发明的醛缩酶是分子量约为25kDa的亚基的六聚体结构。

(3)醛缩酶的制备方法

以下对醛缩酶的制备方法进行说明。本发明的反应②中所用的醛缩酶的制备方法有下述2种：(i)将醛缩酶产生菌通过微生物培养，产生并积累醛缩酶的方法；(ii)利用重组DNA技术制备产生醛缩酶的转化体，通过培养该转化体，产生并积累醛缩酶的方法。

(i)通过微生物培养，产生并积累的方法

将醛缩酶产生菌通过微生物培养，产生并积累醛缩酶的方法中，作为醛缩酶来源的微生物有：假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属。

假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属中，只要该微生物能产生对由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前体酮酸(IHOG)的反应进行催化的醛缩酶，任何一种微生物都可用于本发明中，但优选腐臭假单胞菌ATCC4683、晕斑假单胞菌AJ2791、解韧带假单胞菌AJ1582、欧文氏菌属种AJ2917、柑橘黄单胞菌AJ2797、莱茵黄杆菌AJ2468。其中特别优选腐臭假单胞菌ATCC4683、晕斑假单胞菌AJ2791。这些微生物的保藏地点如以下所示。

(1)晕斑假单胞菌AJ2791株

(a)受理号FERM BP-8246(2002年11月22日由FERM P-18881转移至国际保藏单位)

(b)受理日2002年6月10日

(c)保藏地点独立行政法人工业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)

(2)解韧带假单胞菌AJ1582株

(a)受理号FERM BP-8247(2002年11月22日由FERM P-18882转移至国际保藏单位)

(b)受理日2002年6月10日

(3)欧文氏菌属的种AJ2917株

(a)受理号FERM BP-8245(2002年11月22日由FERM P-18880转移至国际保藏单位)

(b)受理日2002年6月10日

(4)莱茵黄杆菌AJ2468株

(a)受理号FERM BP-1862

(b)受理日1985年9月30日

(5)柑橘黄单胞菌AJ2797株

(a)受理号FERM BP-8250(2002年11月27日由FERM P-4347转移至国际保藏单位)

(b)受理日1985年9月30日

醛缩酶的来源微生物的培养方式可以是液体培养，也可以是固体培养，有利于工业上使用的方式是深部通气搅拌培养法。微生物培养中通常使用的碳源、氮源、无机盐及其他微量营养源可以用作培养基的营养源。只要是所使用的菌株能利用的营养源全都可以使用。

通气条件采用好气条件。培养温度可选择在可使菌生长并产生醛缩酶的范围。因此，没有严格的条件，通常为10-50℃，优选30-40℃。培养时间根据其他培养条件而变化。例如，可以培养至醛缩酶产量为最高的时间，通常为5小时-7天，优选约10小时-3天。

培养后，将菌体离心分离(例如，10,000×g，10分钟)，收集菌。因为醛缩酶的大部分存在于菌体中，所以通过将菌体破碎或溶菌，使醛缩酶可溶化。菌体的破碎可采用超声波破碎、French压机破碎、玻璃珠破碎等方法，另外，在溶菌的场合，采用卵白溶菌酶、肽酶处理，或将这些处理适当组合的方法。

精制醛缩酶产生菌来源的醛缩酶时，采用酶可溶液作为出发材料进行精制，如果存在未破碎或未溶菌的残渣时，将可溶液再次离心分离，除去沉淀的残渣，有利于精制。

醛缩酶的精制时，可以采用通常进行酶的精制所用的所有常规方法，例如硫铵盐析法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、羟基磷灰石色谱法等。结果，可以得到含比活性更高的醛缩酶的级分。

(ii)用重组DNA技术的制备方法

以下，对通过重组DNA技术制备醛缩酶的方法进行说明。已知，利用重组DNA技术制备酶、生理活性物质等有用蛋白质的例子有很多，通过利用重组DNA技术，可以大量制备天然微量存在的有用蛋白质。

与载体连接的DNA只要可能表述醛缩酶，都可以使用。

作为与载体DNA连接的醛缩酶基因的例子，可以使用(1)编码醛缩酶的DNA一项中所说明的DNA等。

用重组DNA技术大量制备蛋白质的场合，优选该蛋白质聚集在产生该蛋白质的转化体内，形成蛋白质的包函体(inclusion body)。这种表达制备方法的优点是保护目的蛋白不被菌体内存在的蛋白酶消化，以及通过菌体破碎后进行高心分离的操作，可以简单地精制目的蛋白。

用蛋白质变性剂使这样所得的蛋白质包函体可溶化，经过以除去变性剂为主的活性再生操作后，转换为正确折叠的生理活性蛋白质。例如人白细胞介素-2的活性再生(特开昭61-257931)等很多例子。

为了从蛋白质包函体得到活性型的蛋白质，必须要进行可溶化、活性再生等一系列操作，与直接制备活性型蛋白质相比，其操作变得更为复杂。但是，在菌体内大量产生影响菌体生长的蛋白时，通过在菌体内积累无活性的蛋白质包函体，可以抑制这种影响。

大量制备包函体目的蛋白的方法，除了在强启动子的调控下，使目的蛋白单独表达的方法之外，还有作为与已知高表达蛋白的融合蛋白而表达的方法。

使融合蛋白表达后，为了切出目的蛋白，也可以将限制性蛋白酶的识别序列安排在适当的位置。

用重组DNA技术大量制备蛋白质的场合，细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞、动物细胞等可以用作转化宿主细胞。用作开发宿主-载体系统的细菌细胞有埃希氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、棒杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌等，优选使用大肠杆菌，因为现已掌握了很多有关用大肠杆菌大量制备蛋白质的知识。以下，说明用转化的大肠杆菌制备醛缩酶的方法。

通常在大肠杆菌中制备外源蛋白所用的启动子可以用作使编码醛缩酶的DNA表达的启动子，例如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、PL启动子等强启动子。

为了将醛缩酶以融合蛋白包函体的形式制备，在醛缩酶基因的上游或下游，连接编码其他蛋白的基因，优选连接编码亲水性肽的基因，形成融合蛋白基因，这样的编码其他蛋白的基因只要是能增加融合蛋白的积累量、经变性·再生步骤后能提高融合蛋白的溶解性的基因都可以使用。例如T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脱氢叶酸还原酶基因、干扰素γ基因、白细胞介素-2基因、凝乳酶原基因等可作为侯选基因。

这些基因和编码醛缩酶的基因连结时，要使其密码子读码框一致。可以在适当的限制性酶位点连接，或利用适当序列的合成DNA连接。

此外，为了扩大制备量，优选在融合蛋白基因的下游连接作为终止子的转录终止序列。该终止子有T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、大肠杆菌trpA基因的终止子等。

优选所谓多拷贝型的载体用作将编码醛缩酶、或醛缩酶和其他蛋白质的融合蛋白的基因导入大肠杆菌的载体，例如含有Col E1来源的复制起始点的质粒，如pUC系列的质粒、pBR322系列的质粒、或其衍生物。这里所说的“衍生物”是指通过碱基的置换、缺失、插入、添加或倒位等对质粒加以改变后所得的物质。另外，这里所说的改变是指用诱变剂、UV照射等的诱变处理，或也包括通过自然变异的改变。

此外，为了筛选转化体，优选该载体含有氨苄青霉素抗性基因等标记。这样的质粒有：市售的具有强启动子的表达载体(pUC系列(宝酒造公司制备)、pPROK系列(Clontech Laboratories Inc.制备)、pKK233-2(Clontech Laboratories Inc.制备)等)。

将启动子、编码醛缩酶或醛缩酶和其他蛋白的融合蛋白的基因、终止子依次连接的DNA片段与载体DNA连接，即得到重组DNA。

用该重组DNA转化大肠杆菌、培养该大肠杆菌，即可表达制备醛缩酶或醛缩酶和其他蛋白质的融合蛋白。转化的宿主可以采用外源基因的表达中常用的菌株，特别优选大肠杆菌JM109(DE3)株、JM109株。转化的方法，以及转化体的筛选方法在1989年Molecular Cloning，2nd edition Cold Spring Harbor press中有描述。

以融合蛋白的形式表达的场合，可以采用以血液凝固因子Xa、激肽释放酶等醛缩酶内不存在的序列为识别序列的限制性蛋白酶将醛缩酶切出。

制备培养基可以采用M9-水解酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等培养大肠杆菌通常使用的培养基。此外，培养条件、制备诱导条件，根据所用的载体的标记、启动子、宿主菌等的种类适当地进行选择。

醛缩酶或醛缩酶和其他蛋白的融合蛋白的回收有以下等方法。如果醛缩酶或其融合蛋白在菌体内是可溶化的，菌体回收后，可将菌破碎或溶菌，然后用作粗酶液。根据需要，也可以进一步通过常规的沉淀、过滤、柱色谱等技术精制醛缩酶或其融合蛋白。在这种场合下，也可以采用利用醛缩酶或其融合蛋白的抗体的精制方法。

在形成蛋白质包函体的场合，用变性剂可将其溶化。虽然可以与菌体蛋白质一起溶化，但从后面的精制操作考虑，优选将包函体取出，然后将其溶化。从菌体中回收包函体时，可以采用常规的已知方法进行。例如，通过将菌体破坏、离心分离操作等回收包函体。使蛋白质包函体溶化的变性剂有盐酸胍(例如，6M，pH5-8)、尿素(例如，8M)等。

通过透析将这些变性剂除去后，即再生为有活性的蛋白质。透析中所用的透析溶液可以用Tris-盐缓冲液或磷酸缓冲液等，浓度为20mM-0.5M，pH为5-8。

再生步骤期间的蛋白质浓度优选控制在500μg/ml或以下。为了抑制再生的酶本身发生交联，透析温度优选在5℃或以下。此外，除去变性剂的方法除了上述的透析法以外，还有稀释法、超滤法等。预期用任何一种都可以使酶再生。

另外，该醛缩酶基因来源于假单胞菌属细菌的场合，优选的一个方案是以假单胞菌属细菌作为宿主菌，表达产生醛缩酶。例如Shi-EnLu等报道的使用丁香假单胞菌的重组表达方法(FEMS MicrobiologyLetters，2002年，210，115-121页)。此外，有Olsen，R.H.等报道的使用铜绿假单胞菌的重组表达方法(Journal of Bacteriology，1982年，150，60-69页)。还有，Grapher，S.等报道的使用施氏假单胞菌的重组表达方法(Biomol.Eng.，2000年，17，11-16页)。但是，用作表达醛缩酶的宿主细胞假单胞菌属细菌不限于这些。

关于将醛缩酶基因导入假单胞菌属细菌的载体，可以使用含有在假单胞菌属细菌细胞内有功能的复制起始点的质粒。例如，EzaKalyaeva等报道的含有铜绿假单胞菌属细菌内的功能复制子TFK的质粒pKLH4.05。此外，也可以使用用于革兰氏阴性菌转化的所谓广范围宿主载体。这些载体中，已知RK404(Ditta，G.等，Plasmid，1985年，13，149-153页)、RSF1010(Frey，J.等，Gene，1982年，24，289-296页)等在假单胞菌属细菌中也有功能。

用序列表的序列号1所示的DNA作为编码醛缩酶的DNA时，可产生具有序列号2或3所述氨基酸序列的醛缩酶。

(II)反应②的反应条件

采用酶系统时，反应②的反应条件说明如下。

催化反应②的酶，只要是能够对通式(3)所示的取代α-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸通过醛醇缩合，合成通式(4)所示的取代α-酮酸的反应进行催化的酶，就可以使用而无特别的限定。也就是说，只要是催化该反应的酶，无论是微生物来源的酶或是通过基因重组技术得到的酶都可以使用。

作为这样的酶，优选在(I)反应②中使用的酶一项中说明的醛缩酶。在这种场合，以下两种途径获得的酶都可以使用：培养假单胞菌属、欧文氏属、黄杆菌属、黄单胞菌属中催化反应②、生成醛缩酶的菌体所得到的醛缩酶；通过重组DNA技术，制备产生催化该反应的酶的转化体，然后培养该转化体而获得的醛缩酶。

反应②中，所谓“在酶的存在下”意味着在能够对由通式(3)所示的取代α-酮酸和草酰乙酸或丙酮酸合成通式(4)所示的取代α-酮酸的反应进行催化的状态下，酶存在于反应系统中。例如，可以在反应系统中加入单纯的酶，也可以加入有酶活性的微生物(醛缩酶产生菌、用重组DNA转化的细胞)、该微生物的培养物(液体培养、固体培养等)、培养基(培养物除去菌体后的剩余物)、该培养物的处理物。用微生物的培养物的场合，可以在培养微生物时，同时进行反应②，也可以用预先培养而得到酶的培养物进行反应②。另外，这里所说的“处理”是指以取出菌体内的酶为目的而进行的处理，例如用超声波、玻璃珠、French压机、冷冻干燥处理和用溶菌酶、有机溶剂、表面活性剂等的处理。此外，经过这些处理后的处理物，通过常规方法(液体色谱、硫铵分级等)制备的粗酶级分和精制酶，只要具有所要求的能力，也可以使用。

例如，使用醛缩酶产生菌或通过重组DNA转化的细胞，制备通式(4)所示的取代α-酮酸时，可以在培养的同时，将底物直接加入培养液中；也可以使用从培养液中分离出来的菌体、洗净的菌体等。此外，也可以直接使用菌体经破碎或溶菌后的菌体处理物、从该菌体处理物回收醛缩酶作为粗酶液使用、或进一步将酶精制后使用。

在利用上述培养物或其处理物时，还可以将其包埋在卡拉胶和聚丙烯酰胺中，或者固定在聚醚砜和再生纤维素等的膜上使用。

在酶的存在下进行反应②时，将含有上述通式(3)所示的取代α-酮酸、草酰乙酸或丙酮酸中的至少一种、以及催化反应②的酶的反应液调节至20-50℃的适合温度、保持pH为6-12、静置、振荡、或搅拌30分钟-5天即可。

该反应液中添加Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺等二价阳离子也可以使反应速度提高。从成本考虑，有时优选使用Mg²⁺。

在反应液中添加这些二价阳离子时，在不抑制反应的范围内，任何一种盐都可以用，但优选用MgCl₂、MgSO₄、MnSO₄等。对于这些二价阳离子的添加浓度，本领域的技术人员通过简单的预备试验即可以决定，可以添加0.01mM-10mM，优选0.1mM-5mM，更优选0.5mM-2mM。

以下是实施反应②时，一个优选的反应条件的例子。在含100mM缓冲液、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM MgCl₂、1％(v/v)甲苯的反应液中，添加作为酶源的表达醛缩酶的大肠杆菌洗净菌体，使其含量达到10％(w/v)，33℃下振荡反应4小时后，得到4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。

生成的通式(4)的取代α-酮酸可以用已知的技术分离精制。例如，使其与离子交换树脂接触，吸附碱性氨基酸，洗脱后进行结晶的方法；或洗脱后用活性碳等脱色、过滤，然后结晶的方法等。

通过反应②，由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)可以生成作为合成莫纳汀的中间体的前体酮酸(IHOG)。

[C]反应③

本发明的反应③是关于制备莫纳汀的反应，并被优选用于由前体酮酸(IHOG)合成莫纳汀。但是，反应③不仅可用于合成莫纳汀，而且可广泛用于由下述通式(1)的取代α-酮酸生成通式(2)的谷氨酸衍生物的反应。

其中，R¹及R²相互独立，各自代表选自氢原子、碳原子数为1-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。但是，R¹和R²之一代表氢原子的场合，另一方不代表氢原子、甲基或乙基。此外，R¹和R²之一代表羟基的场合，另一方不代表氢原子、甲基。

该式中的R¹取代基中含有的芳香环或杂环也可进一步含有卤原子、羟基、碳原子可至3的烷基、碳原子可至3的烷氧基和氨基中的至少一种。

其中，优选R¹选自碳原子数为2-4的烷基、碳原子数为2-4的羧烷基、苯甲基和3-吲哚甲基(苯环或吲哚环也可以还含有卤原子(碘原子、溴原子、氯原子、氟原子等)、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基中的至少一种)，优选R²是羟基。更优选R¹为苯甲基或3-吲哚甲基，R²为羟基。

R¹为苯甲基或3-吲哚甲基，R²为羟基的场合，也就是说，在使用IHOG(4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸)作为通式(1)的取代α-酮酸的场合，得到通式(2)的谷氨酸衍生物莫纳汀。

此外，R¹为苯甲基，R²为羟基的场合，也就是说，在使用PHOG(4-苯甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸)作为通式(1)的取代α-酮酸的场合，得到通式(2)的谷氨酸衍生物的莫纳汀类似物4-苯甲基-4-羟基谷氨酸(PHG)。

作为底物的通式(1)所示的取代α-酮酸，优选用在[B]反应②一项中说明的方法所得的通式(4)的取代α-酮酸。更优选采用由按照[A]反应①中说明的方法制备的吲哚-3-丙酮酸，通过[B]反应②的方法制备的IHOG，但是，通式(1)所示的取代α-酮酸的制备方法当然不限于这些方法。

反应③利用对以取代α-酮酸为底物生成相应氨基酸的反应进行催化的酶反应，例如，它涉及通过对氨基转移反应进行催化的蛋白质的作用，或通过产生该蛋白质的微生物的作用，制备谷氨酸衍生物的方法。这里所说的“氨基转移反应”是指将酮化合物前体转化为其对应的氨基化合物、氨基供体底物转化为酮化合物的反应。

下面，按以下顺序对本发明反应③的实施方式详细地说明：

(C-1)反应③中使用的酶

(C-2)反应③的反应条件。

(C-1)对生成氨基酸的反应进行催化的酶

反应③中，对以取代α-酮酸为底物生成相应的氨基酸的反应进行催化的酶例如有：作为催化氨基转移反应的酶，有转氨酶；还有作为催化酮酸还原的氨基化反应的酶，有脱氢酶。反应③中利用的转氨酶只要是对由出发原料取代α-酮酸和氨基供体生成相应的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶即可。利用这样的酶的作用，可以将上述通式(1)所示的取代α-酮酸转化为相应的谷氨酸衍生物(上述通式(2)中所示)。

在这种情况下，所用的氨基供体为含有氨基的化合物。例如，包括天然和非天然的L-氨基酸或D-氨基酸等氨基化合物。亦即，可以举出以下例子：谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸等氨基酸。反应中添加1种氨基供体或多种氨基酸供体的混合物都可以。

一般，L-氨基酸转氨酶通过将L-氨基酸供体的氨基转移至前体酮酸而生成目的L-氨基酸；D-氨基酸转氨酶通过将D-氨基酸供体的氨基转移至前体酮酸而生成目的D-氨基酸。利用这种酶的选择性，也可以对应该生成的谷氨酸衍生物的光学异构体进行选择。例如，在D-丙氨酸、D-谷氨酸、D-天冬氨酸等D-氨基酸存在下，通过D-氨基酸转氨酶的作用，可以由前体酮酸选择性地生成D-谷氨酸衍生物。

如以上所述，作为本发明课题的谷氨酸衍生物之一的莫纳汀，除了天然类型(2S，4S)之外，还存在3种光学异构体，现已证实，任何一种的甜度都为蔗糖的数百倍至数千倍。本发明的一个优选实施方案中，通过用D-氨基酸转氨酶作用于莫纳汀的前体酮酸，可以立体选择性地生成2R型的莫纳汀。另外，通过L-氨基酸转氨酶的作用，可以选择性地生成2S型的莫纳汀。更优选的一个实施方案中，使用D-氨基酸转氨酶，可以选择性地生成高甜度的2R型异构体。

D-氨基酸用作氨基供体时，在反应液中添加相应的L-氨基酸，通过使其与催化该氨基酸消旋化的酶共存，也可以作为D-氨基酸供体提供。这样的消旋酶的优选例有：丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、天冬氨酸消旋酶、苯丙氨酸消旋酶等。在这种情况下，可以在D-谷氨酸衍生物生成过程中，在反应液中添加L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、或上述L-氨基酸的消旋混合物。

上述催化氨基转移反应的酶可以通过培养产生该酶的微生物来制备。这样的微生物例如有：气单胞菌属、土壤杆菌属、产碱菌属、芽孢杆菌属、拜叶林克氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属、摩根氏菌属、类芽孢杆菌属的微生物。

这些微生物具体举例如下。也就是说，具有由上述通式(1)中所述的取代α-酮酸生成上述通式(2)所述的谷氨酸衍生物活性的L-氨基酸转氨酶的产生菌有以下例子。

·嗜水气单胞菌IFO3820

·根癌土壤杆菌IFO3058

·粪产碱菌ATCC8750

·印度拜叶林克氏菌ATCC9037

·大肠杆菌ATCC12814

·雷氏普罗威登斯菌IFO13501

·摩氏摩根氏菌IFO3848

此外，D-氨基酸转氨酶产生菌的例子列举如下。

·球形芽孢杆菌ATCC10208

·尘埃芽孢杆菌AJ1327

·幼虫类芽孢杆菌尘埃芽孢杆菌亚种ATCC13537

·浸麻芽孢杆菌AJ1617

·浸麻类芽孢杆菌ATCC8244

·迟缓芽孢杆菌AJ12699

·迟缓芽孢杆菌ATCC10840

另外，浸麻芽孢杆菌AJ1617已按下述进行保藏。

(a)受理号FERM BP-8243(2002年11月22日由FERM P-18653转移至国际保藏单位)

(b)受理目2001年12月13日

这些微生物可以是由土壤、植物等自然界新分离的菌株，或者也可以是进一步用诱变导入剂处理或重组DNA技术等人工育种的菌株。

在本发明的一个优选实施方案中，也可以将目的基因整合到微生物细胞中，该目的基因编码对氨基从取代α-酮酸转移至谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶。另外，已知利用重组DNA技术制备酶、生理活性物质等有用蛋白质的例子有很多，通过利用重组DNA技术，可以大量制备天然微量存在的有用蛋白质。整合的基因可举出L-氨基酸转氨酶、D-氨基酸转氨酶基因。举例来说，球形芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因可以导入微生物中。

有关球形芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因，在欧洲专利公布0736604中，以及Tayor等在Journal of Bacteriol，1998年，180卷，16号，4319页中都有报道。

此外，作为浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因可以使用序列表序列号17所述的浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因DNA。使用序列表序列号17所述的浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因DNA的场合，得到序列表的序列号18所述的D-氨基酸转氨酶。另外，编码该浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因及氨基酸序列是首先由本发明者们提出的。

D-氨基酸转氨酶基因的来源不限于这些，只要是编码生成目的D-谷氨酸衍生物的D-氨基酸转氨酶的基因都可以使用。

用重组DNA技术大量制备蛋白质时，可以使用细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞、动物细胞等作为转化的宿主细胞。其中，在重组DNA操作方面已有实践基础的微生物是芽孢杆菌属、假单胞菌属、短状杆菌属、棒杆菌属、链霉菌属、以及大肠杆菌属等。因为在用大肠菌大量制备蛋白的技术方面，已掌握了很多知识，所以一般选用大肠菌，优选大肠杆菌。

可以用携带氨基转移酶目的基因的质粒、噬菌体等载体将该基因导入这些微生物中，也可以通过同源重组，将目的基因整合到该细胞的染色体上。优选所谓的多拷贝型的质粒载体，例如，用于转化大肠杆菌的载体有：含有来源于ColE1的复制起始点的质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322系列的质粒或其衍生物。通常在大肠菌中制备蛋白所用的启动子可以用作这些载体中使氨基转移酶目的基因表达的启动子，例如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、PL启动子等强启动子。此外，为了扩大制备量，优选在蛋白质基因的下游连接作为终止子的转录终止序列。该终止子有T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、大肠菌trpA基因的终止子等。此外，为了筛选转化体，优选该载体含有氨苄青霉素抗性基因等标记。

这样的质粒例如有：pUC系列(宝酒造公司制备)、pPROK系列(Clontech Laboratories Inc.制备)、pKK 233-2(Clontech LaboratoriesInc.制备)等市售的具有强启动子的表达载体。

对于产生反应③中使用的酶的微生物的培养方法，可以采用通常该领域所用的培养基，即含有碳源、氮源、无机盐类、微量金属盐类、维生素等的培养基，进行培养。此外，根据微生物的种类或培养条件，也可以在培养基中添加约0.1-1.0g/dl左右的氨基酸等氨基化合物，提高氨基转移反应活性。

培养基因重组细胞的场合，可以适当添加与载体选择标记对应的氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、氯霉素等药剂。此外，根据载体所携带的启动子，添加适量的诱导剂也可以提高该重组基因的表达量。举例来说，在lac启动子的下游连接目的基因构建载体时，可以适当添加终浓度为0.1mM-5mM的异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，或者也可以适当添加终浓度为0.1-5g/dl、优选0.5g/dl-2g/dl的半乳糖，以代替IPTG。

对于用作上述培养基成分的具体物质，例如碳源，只要是所用的微生物能利用的碳源则没有限制，例如，可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、醋酸等，或它们的混合物。硫酸铵、氯化铵、尿素、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物等，或它们的混合物可以用作氮源。具体的培养基组成举例如下：富马酸0.5g/dl，酵母提取物1g/dl，胨1g/dl，硫酸铵0.3g/dl，K₂HPO₄ 0.3g/dl，KH₂PO₄ 0.1g/dl，FeSO₄·7H₂O 1mg/dl，以及MnSO₄·4H₂O 1mg/dl(pH7.0)。对于培养温度，通常在所用微生物的生长范围，即在10-45℃下进行，优选20℃-40℃。

更优选在25-37℃的范围。另外，培养基的pH值优选为2-12，较优选为3-10，更优选调节至4-8的范围。通气条件设定在适合于所用的微生物生长的条件，优选好气条件。反应时间通常为约12-120小时，优选反应约24-96小时左右。

(C-2)反应③的反应条件

反应③的特征是在酶的存在下，由通式(1)所示的取代α-酮酸生成式(2)的谷氨酸衍生物。

反应③中，所谓“在酶的存在下”意味着在能够由通式(1)所示的取代α-酮酸生成通式(2)所示的谷氨酸衍生物的状态下，使酶存在于反应系统中。换句话说，只要能将通式(1)所示的取代α-酮酸转换为通式(2)所示的谷氨酸衍生物，则可以使酶以任何形式存在于反应系统中。例如，可以在反应系统中加入单纯的酶，也可以加入有该酶活性的微生物(产生酶的菌、用重组DNA转化的细胞)、该微生物的培养物(液体培养、固体培养等)、培养基(培养物除去菌体后的剩余物)、该培养物的处理物。用微生物的培养物的场合，可以在培养微生物时，同时进行反应③，也可以用为得到酶而预先培养的培养物进行反应③。另外，这里所说的“处理”是指以取出菌体内的酶为目的而进行的处理，例如用超声波、玻璃珠、French压机、冷冻干燥处理和用溶菌酶、有机溶剂、表面活性剂等的处理。此外，经过这些处理后的处理物，通过常规方法(液体色谱、硫铵分级等)制备的粗酶级分和精制酶，只要具有所要求的能力，也可以使用。

在利用上述培养物或其处理物时，还可以将其包埋在卡拉胶或聚丙烯酰胺中，或者固定在聚醚砜或再生纤维素的膜上使用。

反应③中，作为底物的取代α-酮酸包括上述通式(1)所示的取代α-酮酸。

反应系统中，也可以含有辅酶、表面活性剂、有机溶剂等促进反应的物质。例如，为了提高底物进入菌体内部的渗透性，也可以使用TritonX、Tween等表面活性剂和甲苯、二甲苯等有机溶剂。此外，也可以在培养基中添加5-磷酸吡哆醛等辅酶类物质。

在产酶的培养和反应③分开地依次进行的场合，后者反应③的步骤不必在好气的环境下进行，而可在进一步通过氮气的置换、氩气的置换、加入亚硫酸钠等除去反应液中溶解氧的系统中，在嫌气的环境下进行。对于反应温度，通常在所用酶具有活性的范围内，即优选在10-50℃下进行，较优选20℃-40℃。更优选在25-37℃的范围进行。反应的pH值通常为2-12，优选为6-11，更优选调节至7-9的范围。反应时间通常为约1-120小时左右，优选反应约1-72小时左右，更优选反应约1-24小时左右。

另外，培养液或反应液中的谷氨酸衍生物或取代α-酮酸的定量，可以用众所周知的方法快速测定。即，简单地，可以用采用Merck公司制备的“Silica gel 60F254”等的薄层色谱法；要获得更高的分析精度，可以通过利用GL Sciences制备的“Inertsil ODS-80A”或Daicel化学工业公司制备的“CROWNPAK CR(+)”等光学离析柱的高压液相色谱法(HPLC)测定。这样，培养液或反应液中积累的谷氨酸衍生物可以通过常规方法收集，然后使用。在这种情况下，从培养液或反应液中收集的方法可根据需要，将该领域中通常使用的众所周知的技术，例如过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换色谱法、吸附色谱法、结晶等操作适当地组合使用。

另外，目的谷氨酸衍生物能以游离态的形式得到，但根据需要，也能以盐的形式获得。盐的形式包括与碱的盐。例如，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等无机碱，铵、各种胺等有机碱。

实施例

以下举出实施例，对本发明作更具体的说明，但本发明不只限于这些实施例。

实施例1

实施例1涉及本发明的反应①。实施例1中的L-色氨酸、吲哚-3-丙酮酸及吲哚醋酸的定量用高压液相色谱法(柱：Inertsil ODS-2(4.6×250mm)，柱温度：40℃，洗脱液：0.1M KH₂PO₄-H₃PO₄(pH＝2.80)/CH₃CN＝1/9-5/5，流速：1.0ml/min，检测：UV 210nm)进行。

(1-1)通过氨基酸氧化酶活性菌的菌体反应，由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸将50ml含有酵母提取物1g/dl、聚胨1g/dl、(NH₄)₂SO₄0.3g/dl、K₂HPO₄ 0.3g/dl、KH₂PO₄0.1g/dl、MgSO₄·7H₂O 0.05g/dl、FeSO₄·7H₂O 1mg/dl、MnSO₄·4H₂O 1mg/dl的培养基(pH7.0)装入500ml坂口氏烧瓶中，110℃灭菌10分钟。

分别取一铂金环将预先在肉汁琼脂培养基上30℃培养24小时的无色杆菌种AJ2425、雷氏普罗威登斯菌IFO13501或摩氏摩根氏菌IFO3168的菌体，接种入上述培养基中，30℃振荡培养24小时。培养后，通过离心分离，收集培养物中的菌体，分别用50ml的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)冼净，再通过离心分离制备洗净菌体。

将上述的这些湿菌体按湿菌体重量为1％(w/v)的量加入含有1g/dlL-色氨酸、20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的反应液中。

取1ml该反应液移至5ml试管中，30℃振荡1小时，使其反应。反应终了后，测定吲哚-3-丙酮酸(IPA)的生成量、L-色氨酸(L-Trp)的残留量以及吲哚醋酸(IAA)副产物的生成量(参照表1)。

表1由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的生成量

L-Trp IPA IAA

菌体 (g/dl) (g/dl) (g/dl)

无色杆菌种AJ 2425 0.02 0.97 0.03

雷氏普罗威登斯菌IFO 13501 0 0.98 0.03

摩氏摩根氏菌IFO 3168 0 0.99 0.02

结果，在实施了洗净菌体反应的任何一组实验中都积累了0.97-99g/dl的吲哚-3-丙酮酸，由1g/dl的L-色氨酸差不多定量地生成吲哚-3-丙酮酸。

(1-2)通过对摩氏摩根氏菌IFO 3168的洗净菌体反应液的氮气置换处理和盐酸结晶，收集吲哚-3-丙酮酸

(a)摩氏摩根氏菌IFO3168的洗净菌体反应液的制备

用与(1-1)同样的方法制备摩氏摩根氏菌IFO3168的洗净菌体。

准备6个装入50ml含有1g/dl L-色氨酸、20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的反应液的坂口氏烧瓶，按湿菌体重量为1％(w/v)的量，分别添加制备好的湿菌体，30℃振荡反应1小时。反应结束后，通过离心分离除去菌体，得到约290ml反应液。

(b)通过对反应液的氮气置换和酸结晶回收吲哚-3-丙酮酸

取74ml(a)所得的反应液转移至茄型烧瓶中，进行氮气置换。加入盐酸，将该反应液的pH调至2或以下。74ml该反应液中，添加15ml 6N的盐酸(盐酸的终浓度约为1N)，20℃下进行搅拌。通过该操作析出结晶。24小时后，将此混合物过滤，用15ml的水洗净结晶。将这样所得的湿结晶在40℃下减压干燥，得到684mg吲哚-3-丙酮酸(相对于起始的色氨酸，收率为79.5％)。该吲哚-3-丙酮酸为黄白色结晶，根据高压液相色谱法(HPLC)分析，其含量为97.2wt％。

(c)通过反应液的酸结晶，回收吲哚-3-丙酮酸

取66ml(a)所得的反应液转移至茄型烧瓶中，加入13ml 6N的盐酸，将该反应液的pH调至2或以下，20℃下进行搅拌。通过该操作析出结晶。24小时后，将此混合物过滤，用13ml的水洗净结晶。将这样所得的湿结晶在40℃下减压干燥，得到538mg吲哚-3-丙酮酸(相对于起始的色氨酸，收率为58.2％)。该吲哚-3-丙酮酸为褐色结晶，根据高压液相色谱法(HPLC)分析，其含量为80.5wt％。

(d)所得的吲哚-3-丙酮酸的比较

比较由(b)及(c)所得的吲哚-3-丙酮酸(IPA)结晶的性质(参照表2)。

由该比较结果可知，很明显，进行氮气置换的组(b)其结晶中的IPA含量多，作为副产物的吲哚醋酸(IAA)不纯物的含量减少，而且，在实施氮气置换的组，还抑制了结晶的着色。将各实验组的结晶稀释至10mg/dl，测定其在450nm及400nm的透射比时，氮气置换组的透射比减少，即证实抑制了通过分解而引起的着色。

表2IPA的结晶性质

有氮气置换无氮气置换

(b) (c)

结晶中的IPA含量 97.30％ 80.50％

结晶中的IAA含量 0.18％ 1.54％

结晶的颜色黄白色褐色

透射比(450nm) 96.9％T 82.9％T

透射比(400nm) 94.1％T 75.9％T

由以上的结果可知，由色氨酸可以有效、简便地制备吲哚-3-丙酮酸。

实施例2

实施例2是用化学合成系统进行反应②的例子。

(2-1)4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的合成在64.45ml溶解了18.91g氢氧化钾(286.5mmol，含量为85wt％)的水中，加入7.50g吲哚-3-丙酮酸(35.8mmol，含量为97.0重量％)和14.18g草酰乙酸(107.4mmol)，使其溶解。该混合溶液在35℃下搅拌24小时。

再加入40.0ml的3N盐酸中和(pH＝7.0)，得到153.5g反应中和液。该反应中和液中含有5.55g IHOG，收率为53.3％(相对于吲哚-3-丙酮酸)。

在该反应中和液中加入水至168ml，将其通过用合成吸附剂(三菱化学公司制备的DIAION-SP207)840ml克填的树脂柱(直径4.8cm)。进一步使纯水以23.5ml/min的流速通过该柱，收集1.73-2.55(L/L-R)，得到含有3.04g高纯度IHOG的水溶液，收率为54.7％(相对于加到树脂上的量)。

(NMR(核磁共振))测定

¹H-NMR(400MHz，D₂O)：3.03(d，1H，J＝14.6Hz)，3.11(d，1H，J＝14.6Hz)，3.21(d，1H，J＝18.1Hz)，3.40(d，1H，J＝18.1Hz)，7.06-7.15(m，3H)，7.39(d，1H，J＝7.8Hz)，7.66(d，1H，J＝7.8Hz)。

¹³C-NMR(100MHz，D₂O)：35.43，47.91，77.28，109.49，112.05，119.44，119.67，121.91，125.42，128.41，136.21，169.78，81.43，203.58

(2-2)4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)的合成

在25ml溶解了13.8g氢氧化钾(纯度85％)的水中，加入5.0g苯丙酮酸(30.5mmol)、12.1g草酰乙酸(91.4mmol)，室温下反应72小时。用浓盐酸将反应液的pH调节至2.2，用醋酸乙酯抽提。用饱和食盐水将有机层洗净、并加入无水硫酸镁干燥后，进行浓缩，得到残渣。该残渣用醋酸乙酯和甲苯进行重结晶，得到PHOG结晶2.8g(11.3mmol)。

(NMR测定)

¹H-NMR(D₂O)δ：2.48(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.60(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.85-3.30(m，3.64H)，7.17-7.36(m，5H)

(分子量测定)

ESI-MS计算值C₁₂H₁₂O₆＝252.23，分析值251.22(MH^-)

实施例3

实施例3是用酶系统进行反应②的例子。另外说明，实施例3中，用作底物的IHOG和PHOG按实施例2中所述方法合成。

(3-1)PHOG醛缩酶活性菌的收集

收集以4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)为底物的醛缩酶活性菌。

在肉汁平板培养基(荣研化学公司制备)上接种被测微生物(细菌、酵母)，30℃下培养24小时。将此培养物接种于含有甘油0.5g/dl、富马酸0.5g/dl、酵母提取物0.3g/dl、胨0.2g/dl、硫酸铵0.3g/dl、K₂HPO₄0.3g/dl、KH₂PO₄ 0.1g/dl、MgSO₄·7H₂O 0.05g/dl、邻苯二甲酸钠0.25g/dl、琼脂粉2g/dl(pH6.5)的平板培养基上，30℃下培养24小时。将所得的菌体按湿菌体重量约为1％(w/v)的量接种于含有100mMTris-HCl(pH8.0)、50mM PHOG、1mM MgCl₂、5mM磷酸钾溶液(KPi)、1％(v/v)甲苯的反应液中，30℃下反应24小时。该反应液中的游离丙酮酸浓度用乳酸脱氢酶(LDH)通过酶法进行定量。在200μl含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM NADH、5mM MgCl₂、25U/ml LDH的反应液中，加入10μl样品，30℃下温育10分钟。测定反应后的340mM的吸光度，由NADH的减少量对测定样品中的丙酮酸量进行定量。

此外，生成的苯丙酮酸量通过使用GL Sciences公司制备的InertsilODS-2”(5μm，4.6×250mm)的HPLC分析进行定量。分析的条件如以下所示。

流动相：20％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液

流速：1ml/min

柱温度：40℃

检测：UV 210nm

按照上述条件，PHOG在保留时间约为9.8分钟时洗脱出来，苯丙酮酸在保留时间约为12分钟时被洗脱，各自分级并可进行定量。

添加被测菌体的组中由PHOG生成的丙酮酸或苯丙酮酸量，与对照组(未添加菌体组)的生成量之差值定义为由醛缩酶所生成的量。结果，可得出表3所示菌株的以PHOG为底物的醛缩酶活性。

表3 PHOG醛缩酶活性菌株的筛选结果

菌株丙酮酸(mM) 苯丙酮酸(mM)

腐臭假单胞菌ATCC4683 34.9 35.0

晕斑假单胞菌AJ2791 33.6 33.9

解韧带假单胞菌AJ1582 1.1 2.9

欧文氏菌种AJ2917 0.8 3.0

莱茵黄杆菌AJ2468 3.0 6.1

柑橘黄单胞菌AJ2797 1.0 3.2

选择腐臭假单胞菌ATCC4683，研究由苯丙酮酸与草酰乙酸或丙酮酸的合成PHOG的反应。在含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM苯丙酮酸、1mM MgCl₂、5mM KPi、100mM草酰乙酸或丙酮酸、1％(w/w)甲苯的反应液中，按终浓度为约1％(w/v)的量，接种腐臭假单胞菌ATCC4683(AJ2212)菌体，30℃反应16小时。反应结束后，用HPLC定量测定生成的PHOG的量。由苯丙酮酸与草酰乙酸或丙酮酸生成PHOG的量如表4所示。

表4由苯丙酮酸与草酰乙酸或丙酮酸生成PHOG的量

草酰乙酸组丙酮酸组

菌体添加组 14.3(mM) 9.3(mM)

对照(添加Mg)组 8.6 1.7

对照(不添加Mg)组痕量未测

由表4可见，菌体添加组的PHOG生成量增加，苯丙酮酸+草酰乙酸和苯丙酮酸+丙酮酸中的任何一种组合都通过该醛缩酶的作用生成PHOG。

(3-2)腐臭假单胞菌ATCC4683株来源的IHOG醛缩酶的精制

从腐臭假单胞菌ATCC4683株的可溶性级分精制IHOG醛缩酶按以下所述进行。醛缩酶活性的测定是按以下条件，测定其以PHOG为底物的醛醇分解活性。

反应条件：50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM PHOG、0.2mMNADH、0.2mM KPi、1mM MgCl₂、16U/ml乳酸脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，30℃下测定340nm的吸光度。

1.可溶性部分的制备：

取一铂金环的在肉汁平板培养基上30℃培养24小时的腐臭假单胞菌ATCC4683菌体，接种于含有50ml产酶培养基(0.5g/dl甘油，0.5g/dl富马酸，0.5g/dl硫酸铵，0.3g/dl K₂HPO₄，0.1g/dl KH₂PO₄，0.05g/dlMgSO₄·7H₂O，0.3g/dl酵母提取物，0.2g/dl胨，0.25g/dl邻苯二甲酸钠，0.005％Antifoam A(Sigma公司制备)，用KOH调节至pH为6.5)的500ml坂口氏烧瓶中，30℃振荡培养24小时。在40个含有50ml制备酶的培养基的500ml坂口氏烧瓶中，每个接种入0.5ml上述培养液，30℃振荡培养24小时。通过离心分离，从所得的培养液收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH 7.6))中洗净后，再次离心分离收集菌体。所得的菌体悬于200ml缓冲液A中，4℃下超声波破碎30分钟。破碎液经离心分离(x8000rpm，10分钟×2次)除去菌体残渣，再次离心分离(x50000rpm，30分钟)，所得的上清即为可溶性部分。

2.阴离子交换色谱：Q-Sepharose FF

将80ml上述可溶性部分加到用缓冲液A平衡的阴离子交换色谱柱Q-Sepharose FF 26/10(Pharcia公司制备，CV＝20ml)上，使其吸附在载体上。用缓冲液A洗出不吸附在载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)后，用0M-0.7M线性浓度梯度的KCl(总体积140ml)洗脱吸附的蛋白质。

检测各洗脱级分的PHOG醛缩酶活性时，在相当于约0.5M的级分检测到PHOG醛缩酶活性的峰。同样的色谱步骤重复进行2次。

3.疏水性色谱：Phenyl Seppharose HP HR 16/10

将检测到有醛缩酶活性的溶液在4℃下对缓冲液B(50mMTris-HCl(pH7.6)，1M硫酸铵，pH7.6)透析一夜，用0.45μm的过滤器过滤。

将所得的滤液加到用缓冲液B平衡的疏水性色谱柱PhenylSepharose(Pharcia公司制备，CV＝20ml)上，通过该操作使其吸附在载体上。

用缓冲液B洗出不吸附在载体上的非吸附蛋白质后，用1M-0M线性浓度梯度的硫酸铵洗脱醛缩酶。检测各洗脱级分的PHOG醛缩酶活性时，在硫酸铵浓度为大约0.2M的洗脱位置观察到有缩醛酶活性。

4.凝胶过滤色谱：Sephadex 200HP 16/60

分别收集含缩醛酶的级分，对缓冲液A透析，用0.45μm的过滤器过滤。将所得的滤液用超滤膜centriprep10浓缩。将所得的浓缩液加到用缓冲液C(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.1M KCl)平衡的凝胶过滤柱Sephadex 200 HP 16/60(Pharcia公司制备)上，以1ml/min的流速洗脱。通过该操作洗脱出66-71ml的缩醛酶级分。根据活性峰的洗脱位置，估计该醛缩酶的分子量为约146kDa。

5.阴离子交换色谱：Mono Q HR 5/5

用0.45μm的过滤器过滤所得的级分。将由此所得的滤液加到用缓冲液A平衡的阴离子交换色谱柱Mono Q HR 5/5(Pharcia公司制备)上。

通过该操作，使醛缩酶吸附到载体上。用缓冲液A将非吸附蛋白质洗出后，用0mM-700mM线性浓度梯度的KCl进行蛋白质的洗脱(总体积24ml)。检测各洗脱级分的醛缩酶活性，在KCl浓度约为0.4M的洗脱位置观察到醛缩酶活性。

6.羟基磷灰石色谱：CHT-II

将所得的级分对缓冲液D(10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0))在4℃下透析一夜，然后用0.45μm的过滤器过滤。将由此所得的滤液加到用缓冲液D平衡的羟基磷灰石色谱柱CHT-II(BioRed公司制备)上。通过该操作，使醛缩酶不吸附在载体上，从而可以与吸附的蛋白质分离。

将上述色谱操作精制的级分用作SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)的测试样时，在相当于约25kDa的位置检测到大致上为单一的条带，因为通过凝胶过滤色谱所推测的分子量为约146kDa，所以推定该醛缩酶形成了6聚体。表5所示为该酶的精制表。

表5腐臭假单胞菌ATCC4683来源的IHOG醛缩酶的精制表

蛋白质比活纯化倍数总活性收率

(mg) (U/mg) (U) (％)

可溶部分 3750 0.014 1 51 100

Q-sepharose HP 26/10 510 0.060 4.4 30.5 59.8

Phenyl sepharose HP 16/10 21.2 0.893 66 19.0 37.2

Sepharose ×200 HP 16/60 1.9 4.843 341 8.66 17.0

mono Q HR 5/5. 0.49 10.89 800 5.33 10.4

羟基磷灰石CHT-11 0.025 28.70 2110 0.71 1.4

(3-3)IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列的测定

将1份约2μg的精制醛缩酶进行SDS-PAGE，然后用色氨酸处理SDS-PAGE的凝胶中的试样(pH8.5，35℃，20小时)，用反相HPLC分离肽片段。确定分离的片段中，2个分别为20个残基、12个残基的氨基酸序列(序列号4、5)如下。

表6测定的内部氨基酸序列。

序列号4 SLLDA FQNVV TPHIS DNLGR

序列号5 AEIAT GALDQ SW

(3-4)腐臭假单胞菌ATCC4683来源的IHOG醛缩酶基因的克隆

1.染色体DNA的制备

腐臭假单胞菌ATCC4683株在50ml肉汁培养基中30℃下培养一夜(预培养)。取5ml该培养液作为种菌，在50ml的肉汁培养基中进行培养，培养至对数生长后期之后，取50ml培养液进行离心操作(12000×g，4℃，15分钟)，收集菌体。用该菌体按常规方法制备染色体DNA。

2.通过PCR得到内部序列

根据测定的IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列，合成以下的混合引物(序列号6、7)。

表7由内部氨基酸序列设计、合成的混合引物

序列号6 TTY CAR AAY GTS GTS ACS CCS C

序列号7 TGR TCR ATN GCN CCS GTN GCR ATY TCN GC

用制备的混合引物，以腐臭假单胞菌ATCC4683的染色体DNA为模板，通过PCR进行扩增。PCR反应用PCR Thermal PERSONEL(TaKaRa公司制备)进行，按下述条件进行30个循环。

94℃ 30秒

55℃ 30秒

72℃ 1分钟

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，观察到约500bp的片段扩增。将该DNA片段克隆到pUC18上，测定碱基序列，根据所得的DNA片段推测的氨基酸序列与IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列一致，证实了已获得目的醛缩酶基因。

3.通过菌落杂交获得全长基因

用PCR扩增的DNA片段，通过Southern分析和菌落杂交获得全长基因。使用DIG High Primer(Roche Diagnostics公司制备)制备DNA探针，按说明书在37℃下温育过夜(O/N)，进行探针的标记。Southern分析是将1μg染色体DNA用各种限制性酶完全消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳后，印迹到尼龙膜上，然后按以下的操作步骤进行：用DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics公司制备)进行杂交，50℃下杂交1小时后加入探针，使其杂交过夜。用DIG核苷酸检测试剂盒(DIG Nucleotide Detection Kit)检测条带。其结果，检测出以该PCR片段为探针的约4kbp的强杂交PstI片段。然后通过菌落杂交获得该PstI片段。将20μg染色体DNA用PstI处理后在琼脂糖凝胶上电泳，回收约4kbp大小的片段。将此片段与pUC18连接，用大肠杆菌JM109制备文库。菌落转移至尼龙膜滤器(Hybon-N，Pharmacia公司制备)上，进行碱变性、中和、固定化处理，用DIG Easy Hyb进行杂交。将滤器浸入缓冲液中，42℃下预杂交1小时。随后加入制备好的探针，42℃下杂交16小时。用SSC洗净后，用DIG核苷酸检测试剂盒(RocheDiaghostics公司制备)检测和探针杂交的菌落。结果，得到与探针强杂交的克隆。

测定由得到的克隆回收的质粒DNA的碱基序列，表明其具有序列号1所示的碱基序列。找出678bp含有对应于确定的内部氨基序列的碱基序列(序列号1的第507-第566位碱基，以及第1046-第1082位碱基)的读码框，获得了全长的目的醛缩酶。

4.IHOG醛缩酶在大肠杆菌中的表达(之一)

用BamHI/HindIII消化用表8所示的引物(序列号8和9)由腐臭假单胞菌ATCC 4683染色体DNA扩增的片段，插入pUC18的BamHI/HindIII位点，构建质粒pUCALD。将构建的表达质粒导入大肠杆菌JM109中，使转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下振荡培养一昼夜(预培养)。取该预培养液按1％的量接种于50mlLB培养液中，37℃下进行正式培养。培养开始约2小时后，添加IPTG至终浓度为1mM，再培养3小时。培养结束后，收集菌体、洗净，悬浮于1ml 20mM的Tris-HCl(pH7.6)中，用Multi-BeadShocker(安井器械公司制备)将菌体破碎。破碎液在15000rpm下离心分离10分钟，所得的上清用作粗酶液。

表8引物

序列号8 ALD-5′Bam (5′-GCC GGA TCC ACA AGG GTT CAG TCA TTC ATG G-3′)

序列号9 ALD-3′Hind(5′-CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C-3′)

用此粗酶液以PHOG为底物，测定其醛缩酶活性时，导入pUC18的大肠杆菌(对照)未检测出PHOG醛缩酶活性，而导入pUCADL的菌株测得其PHOG活性为0.81U/mg蛋白。由此表明，该基因编码目的醛缩酶。

(3-5)用醛缩酶表达株由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)

用(3-4)中制备的表达醛缩酶的大肠杆菌洗净菌体作为酶源，由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸合成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。IHOG的定量通过使用GL Sciences公司制备的“InertsilODS-2”(5μm，4.6×250mm)的HPLC分析进行。

分析条件如下：

流动相：40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液

流速：1ml/min

柱温度：40℃

检测：UV 210nm

在含有100mM缓冲液(Tris-HCl8.0，9.0，或甘氨酸-NaOH10.0)，50mM吲哚-3-丙酮酸，250mM丙酮酸，1mM MgCl₂，1％(v/v)甲苯的反应液中，加入表达醛缩酶的大肠杆菌洗净菌体至含量为10％(w/v)，33℃振荡反应4小时。将反应液适当地稀释，定量测定生成的IHOG。

表9用醛缩酶生成的IHOG的量

pH 醛缩酶 IHOG(mM)

8 + 9.2

8 - 0.42

9 + 12.1

9 - 1.6

10 + 10.7

10 - 5.4

结果，添加表达醛缩酶的大肠杆菌的组其IHOG生成量增加，利用该醛缩酶可以生成IHOG。

(3-6)IHOG在大肠杆菌中的大量表达(之二)

1.携带trp启动子和rrnB终止子的质粒pTrp4的构建

用表10所示的寡核苷酸为引物，通过PCR(序列号10和11的组合)，扩增大肠杆菌W3110染色体DNA上的trp操纵子的启动子区目的基因区域，得到的DNA片段与pGEM-Teasy载体(Promaga公司制备)连接。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中，选择含有trip启动子的插入方向与lac启动子相反的目的质粒的菌株。然后用Eco0109I/EcoRI处理上述质粒，将得到含有trp启动子的DNA片段与pUC19(TaKara公司制备)的Eco0109I/EcoRI处理物连接。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中，选择含有目的质粒的菌株，质粒命名为pTrp1。随后，用HindIII/HincII处理pKK223-3(Amersham Phamacia公司制备)，将所得含有rrnB终止子的DNA片段与pTrp1的HindIII/PvuII处理物连接。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中，选择含有目的质粒的菌株，质粒命名为pTrp2。接着，以pTrp2为模板、表10所示的寡核苷酸为引物，通过PCR(序列号10和12的组合)扩增trp启动子区。用Eco0109I/NdeI处理所得的DNA片段，然后与pTrp2的Eco0109I/NdeI处理物连接。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性株中，选择含有目的质粒的菌株，该质粒命名为pTrp4。

表10

序列号10 5′侧 GTATCACG AGGCCCTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATC

Eco01091

序列号11 3′侧 TTCGGGGATTC CATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGC

Ndel

序列号12 3′侧 GGGGGGGG CATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTG

Ndel

2.醛缩酶表达质粒ptrpALD1、ptrpALD2的构建和在大肠杆菌中的表达

用Ndel/HindIII消化用表11所示的引物(序列号9和13)由腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA扩增的片段，插入pTrp4的Ndel/HindIII位点，构建质粒ptrpALD1。该质粒以序列号1所述的碱基序列中第444位的ATG作为翻译起始密码子，表达序列号3所述的氨基酸序列构成的醛缩酶基因。此外，用Ndel/HindIII消化用引物(序列号9和14)由腐臭假单胞菌ATCC4683染色体DNA扩增的片段，插入pTrp4的Ndel/HindIII位点，构建质粒ptrpALD2。该质粒以序列号1所述的碱基序列中第456位的ATG作为翻译起始密码子，表达序列号2所述的氨基酸序列构成的醛缩酶基因。将构建的每种表达质粒导入大肠杆菌JM109中，使转化体在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃下振荡培养一昼夜(预培养)。将预培养液按1％的量接种于50ml的LB培养基中，在37℃下进行正式培养。培养开始后约2小时，添加IPTG至终浓度为1mM，再培养3小时。培养结束后，收集菌体、洗净，悬浮于1ml的20mM Tris-HCl(pH7.6)中，用Multi-Bead Shocker(安井器械公司制备)将菌体破碎。破碎液在15000rpm下离心分离10分钟，所得的上清用作粗酶液。

表11引物

序列号9 ALD-3′Hind (5′-CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C-3′)

序列号13 ALD-5′Nde-1(5′-GGT TCA GTC ACA TAT GGA GGT CGC TAT GTC-3′)

序列号14 ALD-5′Nde-2(5′-ATG GAB GTC CAT TAG TCA TTG CCC GGT TCA CGC-3′)

用该粗酶液测定其以PHOG为底物的醛缩酶活性时，导入pTrp4的大肠杆菌(对照)未检测出PHOG醛缩酶活性，而导入ptrpADL1的菌株检测出其PHOG醛缩酶活性为16.1U/mg蛋白；导入ptrpADL2的菌株检测出其PHOG醛缩酶活性为36.0U/mg蛋白。由此可知，由序列号2或3所述的氨基酸序列形成的醛缩酶都具有醛缩酶活性。

实施例4

实施例4涉及本发明的反应③。另外，实施例4中，莫纳汀及4-苯甲基-4-羟基谷氨酸(PHG)的定量通过使用GL Sciences公司制备的“Inertsil ODS-80A”(5μm，6×150mm)的高效液相色谱进行。

分析条件如下：

流动相：12％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液；

流速：1.5ml/min；

柱温度：30℃；以及

检测：UV 210nm。

在上述分析条件下，(2S，4S)-莫纳汀和(2R，4R)-莫纳汀、可以在12.1分的保留时间、(2S，4R)-莫纳汀和(2R，4S)-莫纳汀可以在9.7分的保留时间、(2S，4S)-PHG和(2R，4R)-PHG可以在7.2分的保留时间、(2S，4R)-PHG和(2R，4S)-PHG可以在6.0分的保留时间分别进行定量。

此外，根据需要，也可通过利用Daicel化学工业公司制备的光学离析柱“CROWNPAK CR(+)”(4.6×150mm)的高效液相色谱进行分析。分析条件如以下所示。

(莫纳汀的场合)

流动相：过氯酸水溶液(pH1.5)/10％(v/v)甲醇；

流速：0.5ml/min；

柱温度：30℃；以及

检测：UV 210nm

在上述条件下，莫纳汀光学异构体按(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)和(2S，4S)的顺序，可以分别在42分、57分、64分、和125分的保留时间进行定量。

(PHG的场合)

流动相：过氯酸水溶液(pH1.5)；

流速：1ml/min；

柱温度：30℃；以及

检测：UV 210nm

在上述条件下，PHG的光学异构体按(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)、和(2S，4S)的顺序，可以分别在20分、28分、31分、和46分的保留时间进行定量。

(4-1)用L-氨基酸转氨酶制备(2S，4S)-莫纳汀将下述表12所述的微生物接种于肉汁平板培养基(荣研化学公司制备)上，30℃培养24小时后，将菌体取出，按5重量％湿菌体的量接种于1ml含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、30mM IHOG、100mM L-谷氨酸一钠、1mM5′-磷酸吡哆醛，以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，30℃温育16小时。反应结束后定量测定生成的莫纳汀量。结果如表12所示，由IHOG可以生成(2S，4S)-莫纳汀。

表12

菌株生成的莫纳汀(mM)

嗜水气单胞菌IFO3820 1.2

根癌土壤杆菌IFO3058 1.9

粪产碱菌ATCC8750 1.6

印度拜叶林克氏菌ATCC9037 0.2

大肠杆菌ATCC12814 0.6

雷氏普罗威登斯菌IFO13501 0.7

摩氏摩根氏菌IFO3848 1.2

(4-2)用L-氨基酸转氨酶制备(2S，4S)-PHG

将下述表13所述的微生物接种于肉汁平板培养基(荣研化学公司制备)上，30℃培养24小时后，取出菌体，将其按5重量％湿菌体的量接种于1ml含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、30mM PHOG、100Mm L-谷氨酸一钠或L-天冬氨酸一钠、1mM 5′-磷酸吡哆醛，以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，30℃温育16小时。反应结束后定量测定生成的PHG量。结果如表13所示，由PHOG可以生成(2S，4S)-PHG。

表13

生成的PHG(mM)

菌株 L-Glu L-Asp

嗜水气单胞菌IFO3820 8.9 8.9

根癌土壤杆菌IFO3058 8.2 8.0

粪产碱菌ATCC8750 4.9 10.7

印度拜叶林克氏菌ATCC9037 7.4 2.7

大肠杆菌ATCC12814 9.0 3.3

雷氏普罗威登斯菌IFO13501 10.2 9.0

摩氏摩根氏菌IFO3848 10.4 5.2

(4-3)用L-氨基酸转氨酶制备(2S，4S)-PHG

将下述表14所述的微生物接种于肉汁平板培养基(荣研化学公司制备)上，30℃培养24小时。然后在每个500ml坂口氏烧瓶中分装了50ml培养基，在110℃灭菌10分钟的液体培养基中，接种1铂金环该培养的菌体，在30℃下振荡培养16小时，前述培养基含有：富马酸0.5g/dl，酵母提取物1g/dl，胨1g/dl，硫酸铵0.3g/dl，K₂HPO₄ 0.3g/dl，KH₂PO₄ 0.1g/dl，FeSO₄·7H₂O 1mg/dl，以及MnSO₄·4H₂O 1mg/dl(pH7)。

取1ml培养液离心分离，所得的菌体用20mM Tris-HCl(pH7.6)洗净、收集菌体后，将该菌体悬浮于1ml含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM PHOG、100mM L-谷氨酸一钠、1mM 5′-磷酸吡哆醛，以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，然后转移至10ml的试管内，在30℃下振荡反应18小时。反应结束后定量测定生成的PHG量。结果如表14所示，由PHOG可以生成(2S，4S)-PHG。

表14

菌株生成的PHG(mM)

嗜水气单胞菌IFO3820 16.4

粪产碱菌ATCC8750 12.3

雷氏普罗威登斯菌IFO13501 17.5

摩氏摩根氏菌IFO3848 17.2

(4-4)用D-氨基酸转氨酶制备2R-PHG

将下述表15所述的微生物接种于肉汁平板培养基(荣研化学公司制备)上，30℃培养24小时。由此取出菌体，将其按5重量％湿菌体的量接种于1ml含有100Mm Tris-HCl(pH7.6)、50mM PHOG、100mM D-谷氨酸、100mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛，以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，30℃温育16小时。反应结束后定量测定生成的PHG量。结果如表15所示，由PHOG可以生成(2R，4S)-PHG和(2R，4R)-PHG。

表15

生成的PHG(mM)

菌株 (2R，4R) (2R，4S)

球形芽孢杆菌ATCC10208 16.6 16.5

尘埃芽孢杆菌AJ1327 2.8 2.6

幼虫类芽孢杆菌尘埃芽孢杆菌亚种

ATCC13537 3.0 2.8

浸麻芽孢杆菌AJ1617^* 7.1 7.0

浸麻类芽孢杆菌ATCC8244 6.5 6.5

迟缓芽孢杆菌AJ12699 4.6 4.6

迟缓芽孢杆菌ATCC10840 4.2 4.3

*FERM P-18653

(4-5)表达球形芽孢杆菌来源的DAT(以下称为BSDAT)的大肠杆菌的制备和用洗净菌体反应制备2R-PHG

1.表达质粒的构建

为了使球形芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因(以下简称为“bsdat”)在大肠杆菌中表达，按以下所速，构建在pUC18的lac启动子下游连接bsdat基因的质粒pUCBSDAT。首先，以球形芽孢杆菌ATCC10208株的染色体DNA为模板，下述表16所示的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增该基因。由此扩增得到相当于欧洲专利公布0736604文本中，序列号2所述的bsdat碱基序列中的第8-第1278位碱基的DNA片段。该片段用BamHI、PstI处理，并与pUC18的BamHI、PstI的切断物连接后，导入大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性株中选择携带目的质粒的菌株，构建了表达质粒pUCBSDAT。

表16

序列号15 5′-CCG GGA TTC GTT AAT CCA AAC GTT AGC TG

序列号16 5′-GGG GTG CAG TTA GGC ATT AAT TGA AAT TGG

2.表达BSDAT的大肠杆菌的制备

将携带pUCBSDAT的大肠杆菌转化体在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1g/dl bacto胰酶解胨，0.5g/dl酵母提取物，1g/dlNaCl)中，37℃下进行16小时的种子培养。取1ml该种子培养液加入装有50ml LB培养基的500ml坂口氏烧瓶中，37℃下进行正式培养。在培养开始后2.5小时，添加异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，再培养4小时。由所得的培养液收集菌体、洗净，制备成表达BSDAT的大肠杆菌。

3.用表达BSDAT的大肠杆菌的洗净菌体反应

将上述2制备的菌体按5重量％湿菌体的量接种于1ml含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM PHOG、100mM氨基酸供体(D-Glu，D-Ala，L-Glu，L-Ala)、1mM 5’-磷酸吡哆醛以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，然后转移至10ml的试菅内，在30℃下振荡反应18小时。反应结束后定量测定生成的PHG量。结果如表17所示，由PHOG可以生成(2R，4R)、(2R，4S)、以及(2S，4S)-PHG。

表17通过用表达BSDAT的大肠杆菌洗净菌体反应生成的PHG(mM)

添加的氨基酸供体

生成的PHG D-Glu D-Ala L-Glu L-Ala

(2R，4R) 20.7 25.1 N.D. 15.4

(2R，4S) 17.5 17.0 22.7 7.0

(2S，4S) 痕量痕量 22.7 痕量

(4-6)表达浸麻芽孢杆菌AJ1617来源DAT(以下称为BMDAT)的大肠杆菌的制备和用洗净菌体反应制备2R-莫纳汀

1.染色体DNA的制备

用50ml的肉汁培养基在30℃下将浸麻芽孢杆菌AJ1617株培养一夜(预培养)。取5ml该培养液作为种子菌，用50ml的肉汁培养基进行正式培养。培养至对数生长后期后，将50ml培养液进行离心分离操作(12000×g，4℃，15分钟)，收集菌体。用该菌体按常规方法制备染色体DNA。

2.由基因文库分离浸麻芽孢杆菌来源的D-氨基酸转氨酶基因(以下称为bmdat)

首先，在30μg浸麻芽孢杆菌AJ1617株的染色体DNA中加入1U限制性酶EcoRI，37℃下使其反应3小时部分消化。然后由该DNA通过琼脂糖凝胶电泳回收3-6kbp的片段。将此片段与1μg质粒pUC118的EcoRI酶切产物(BAP处理后、宝酒造公司制备)连接，制成转化大肠杆菌JM109的基因文库。将其在含氨苄青霉素的LB培养基(1％胰酶解胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，2％琼脂，pH7.0)上涂板，形成菌落。将形成的菌落在含有氨苄青霉素和异丁基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)0.1mM的LB液体培养基中，37℃下培养一夜，然后离心、收集菌体，即获得菌体。将所得的菌体接种于含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM丙酮酸钠、100mM D-谷氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛、1％(v/v)甲苯的反应液中，30℃下反应30分钟。反应结束后，将5μl由反应液离心分离所得的上清加入含有200μl丙酮酸定量反应液(100mM Tris-HCl(pH7.6)，1.5mM NADH，5mMMgCl₂，16U/ml乳酸脱氢酶(Oriental Yeast公司制备))的96孔板中，30℃下反应10分钟后，用平板读数器(SPECTRA MAX190，MolecularDevice公司制备)测定340nm的吸光度。加入终浓度为0.2mM-1mM的丙酮酸钠进行与上述同样的反应，以此为标准，定量测定丙酮酸的减少量，检测D-氨基酸转氨酶的活性。

通过DAT活性克隆的筛选，收集具有DAT活性的克隆。由此转化体制备含有bmdat的质粒，命名为pUCBMDAT。用EcoRI处理pUCBMDAT质粒，然后进行琼脂糖凝胶电泳，估计插入片段的长度为约3.3kbp。

3.插入片段的碱基序列

根据用双脱氧法测定的质粒pUCBMDAT插入片段的碱基序列，得到对应于序列表的序列号17所示序列中第630-第1481位碱基的约850bp的读码框。该读码框与已知序列的同源性检索表明，与球形芽孢杆菌ATCC10208株来源的D-氨基酸转氨酶基因在氨基酸序列上的同源性为91％，与芽孢杆菌属种YM-1来源的D-氨基酸转氨酶基因在氨基酸序列上的同源性为66％，与地衣芽孢杆菌ATCC10716株来源的D-氨基酸转氨酶基因在氨基酸序列上的同源性为42％。由此结果清楚表明，该读码框编码D-氨基酸转氨酶基因。另外，这里所说的同源性是用基因分析软件“genetyx ver.6(GENETYX公司)”，按初始设定的各种参数计算的值。

4.表达BMDAT的大肠杆菌的制备

将携带pUCBMDAT的大肠杆菌转化体在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1g/dl bacto胰酶解胨，0.5g/dl酵母提取物，1g/dlNaCl)中，在37℃下，进行16小时的种子培养。取1ml该种子培养液加入装有50ml LB培养基的500ml坂口氏烧瓶中，37℃下进行正式培养。在培养开始后2.5小时，添加异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，再培养4小时。由所得的培养液收集菌体、洗净，制备成表达BSDAT的大肠杆菌。

5.用表达BSDAT的大肠杆菌的洗净菌体反应

将上述4制备的菌体按5重量％湿菌体的量悬浮于1ml含有100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM IHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛以及0.5(v/v)甲苯的反应液中，然后转移至10ml的试管内，在33℃下振荡反应20小时。反应结束后定量测定生成的2R-莫纳汀的量。

结果，可以产生22mM的2R-莫纳汀。

工业上应用的可能性

根据本发明，有关本发明的谷氨酸衍生物的制备方法能够利用酶反应，有效地制备包括有望用作甜味剂的莫纳汀的上述特定的谷氨酸衍生物，所以在工业上非常有用。

此外，有关本发明的莫纳汀的制备方法，利用了有关本发明的谷氨酸衍生物的制备方法，能够由氨基酸之一的色氨酸为出发原料，利用酶反应，有效地制备莫纳汀，因此，在工业上，尤其是在食品领域非常有用。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>谷氨酸衍生物的制备方法

<130>PAMA-14278

<140>

<141>

<150>JP2001-396471

<151>2001-12-27

<150>JP2002-095760

<151>2002-03-29

<160>18

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1296

<212>DNA

<213>腐臭假单胞菌

<220>

<221>发明者：杉山雅一；渡部乙比古；船越直：纲野裕古；河原滋；竹本正

<220>

<221>CDS

<222>(456)..(1118)

<223>ALD1

<220>

<221>CDS

<222>(444)..(1118)

<223>ALD2

<400>1

gtacaccgtc ctgactcagg gcgcgctcgg cacgggttga tctatgagcg ctgtttgccc 60

agaatgacgt cggggtcacg tacgatcaaa gcaactacct gatcgcccag tgggcctgac 120

ctgtccggtg tcggcatcag ctacctgcct cgccaagtgt ctctcgccat tggtggacca 180

gggtcgggct actagtcatc gaaaccgagc ctgcgctgcc tcccatccaa tacatcgccg 240

tacaccgcgc cgatcgtctt cagggcctca gcgtcgaggt tgcacgtctg gcagctcgtt 300

gctgtgattt cagccgcatg gtgtggtaac acaggcgctg gatacgagaa aaaaagcgat 360

gtattttcat agataaatat cgctaatagt gccaagcgac ctttcttact atgaacgcat 420

agcccacaag ggttcagtca ttc atg gag gtc gct atg tca ttg ccc ggt tca 473

Met Glu Val Ala Met Ser Leu Pro Gly Ser

1 5 10

cgc atc tac cct tct ccg ccc cag gca cca cgc tca ctg ctg gac gcg 521

Arg Ile Tyr Pro Ser Pro Pro Gln Ala Pro Arg Ser Leu Leu Asp Ala

15 20 25

ttt cag aac gta gtg acg ccg cat atc agt gat aac ctc ggg cgt cac 569

Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser Asp Asn Leu Gly Arg His

30 35 40

atc ggt gcc cgg ggg ctg acg cgc tat aac cac acc ggc aaa ctg gtg 617

Ile Gly Ala Arg Gly Leu Thr Arg Tyr Asn His Thr Gly Lys Leu Val

45 50 55

ggc acc gcc ctg acg gtg aag act cgc ccc ggc gac aac ctc tac atc 665

Gly Thr Ala Leu Thr Val Lys Thr Arg Pro Gly Asp Asn Leu Tyr Ile

60 65 70

tac aaa gca ctg acg ctg atc gaa ccc gga cac gtg ctg gtg atc gac 713

Tyr Lys Ala Leu Thr Leu Ile Glu Pro Gly His Val Leu Val Ile Asp

75 80 85 90

gct cag ggt gac gcg acc aac gcg gtc att ggt gag ctg atc aag ctc 761

Ala Gln Gly Asp Ala Thr Asn Ala Val Ile Gly Glu Leu Ile Lys Leu

95 100 105

tac gcg cag caa cgt ggc tgt gtc ggc ttc gtc gtc gac ggc gcc atc 809

Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Cys Val Gly Phe Val Val Asp Gly Ala Ile

110 115 120

cgc gat gtc gcc agt ttt gaa gat acg cct tgc tat gcc cgt agc gtg 857

Arg Asp Val Ala Ser Phe Glu Asp Thr Pro Cys Tyr Ala Arg Ser Val

125 130 135

gtg cat tgc ggt ccc tac aaa agc ggc cca ggg gaa atc aat gtc ccg 905

Val His Cys Gly Pro Tyr Lys Ser Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro

140 145 150

gtg tca atc ggc ggg atg atc atc aat ccg ggc gac atc att gtc ggt 953

Val Ser Ile Gly Gly Met Ile Ile Asn Pro Gly Asp Ile Ile Val Gly

155 160 165 170

gac gag gat ggg ctg gtt gcc ttc tcg ccc gac cat gcc gag cag gtg 1001

Asp Glu Asp Gly Leu Val Ala Phe Ser Pro Asp His Ala Glu Gln Val

175 180 185

ttg gtc aag gcg cga gag cat gac gcg cat gaa cag cag gtc aaa gcc 1049

Leu Val Lys Ala Arg Glu His Asp Ala His Glu Gln Gln Val Lys Ala

190 195 200

gaa atc gcc act ggc gcc atc gat cag tca tgg ctg gac aaa gtg ctg 1097

Glu Ile Ala Thr Gly Ala Ile Asp Gln Ser Trp Leu Asp Lys Val Leu

205 210 215

gaa aag gct ggc ctg gcg aac tgaaaaacac tgtgtaatcg ccttgctgca 1148

Glu Lys Ala Gly Leu Ala Asn

220 225

gcgacattgc tgtcggacag gatgatctga cgcttcagtt acgcgttctt gggtgcaccg 1208

cgccacgtca ggaagtggct gctgccgcat gcaggtgaca tgtcatgtac catggcagca 1268

gcacgtgaca tgcacgatgt gctcacgc 1296

<210>2

<211>225

<212>PRT

<213>腐臭假单胞菌

<400>2

Met Glu Val Ala Met Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ile Tyr Pro Ser Pro

1 5 10 15

Pro Gln Ala Pro Arg Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr

20 25 30

Pro His Ile Ser Asp Asn Leu Gly Arg His Ile Gly Ala Arg Gly Leu

35 40 45

Thr Arg Tyr Asn His Thr Gly Lys Leu Val Gly Thr Ala Leu Thr Val

50 55 60

Lys Thr Arg Pro Gly Asp Asn Leu Tyr Ile Tyr Lys Ala Leu Thr Leu

65 70 75 80

Ile Glu Pro Gly His Val Leu Val Ile Asp Ala Gln Gly Asp Ala Thr

85 90 95

Asn Ala Val Ile Gly Glu Leu Ile Lys Leu Tyr Ala Gln Gln Arg Gly

100 105 110

Cys Val Gly Phe Val Val Asp Gly Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Phe

115 120 125

Glu Asp Thr Pro Cys Tyr Ala Arg Ser Val Val His Cys Gly Pro Tyr

130 135 140

Lys Ser Gly Pro Gly Glu Ile Asn Val Pro Val Ser Ile Gly Gly Met

145 150 155 160

Ile Ile Asn Pro Gly Asp Ile Ile Val Gly Asp Glu Asp Gly Leu Val

165 170 175

Ala Phe Ser Pro Asp His Ala Glu Gln Val Leu Val Lys Ala Arg Glu

180 185 190

His Asp Ala His Glu Gln Gln Val Lys Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala

195 200 205

Ile Asp Gln Ser Trp Leu Asp Lys Val Leu Glu Lys Ala Gly Leu Ala

210 215 220

Asn

225

<210>3

<211>221

<212>PRT

<213>腐臭假单胞菌

<400>3

Met Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ile Tyr Pro Ser Pro Pro Gln Ala Pro

1 5 10 15

Arg Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser

20 25 30

Asp Asn Leu Gly Arg His Ile Gly Ala Arg Gly Leu Thr Arg Tyr Asn

35 40 45

His Thr Gly Lys Leu Val Gly Thr Ala Leu Thr Val Lys Thr Arg Pro

50 55 60

Gly Asp Asn Leu Tyr Ile Tyr Lys Ala Leu Thr Leu Ile Glu Pro Gly

65 70 75 80

His Val Leu Val Ile Asp Ala Gln Gly Asp Ala Thr Asn Ala Val Ile

85 90 95

Gly Glu Leu Ile Lys Leu Tyr Ala Gln Gln Arg Gly Cys Val Gly Phe

100 105 110

Val Val Asp Gly Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Phe Glu Asp Thr Pro

115 120 125

Cys Tyr Ala Arg Ser Val Val His Cys Gly Pro Tyr Lys Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Glu Ile Asn Val Pro Val Ser Ile Gly Gly Met Ile Ile Asn Pro

145 150 155 160

Gly Asp Ile Ile Val Gly Asp Glu Asp Gly Leu Val Ala Phe Ser Pro

165 170 175

Asp His Ala Glu Gln Val Leu Val Lys Ala Arg Glu His Asp Ala His

180 185 190

Glu Gln Gln Val Lys Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala Ile Asp Gln Ser

195 200 205

Trp Leu Asp Lys Val Leu Glu Lys Ala Gly Leu Ala Asn

210 215 220

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>腐臭假单胞菌

<400>4

Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gln Asn Val Val Thr Pro His Ile Ser Asp

1 5 10 15

Asn Leu Gly Arg

20

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>腐臭假单胞菌

<400>5

Ala Glu Ile Ala Thr Gly Ala Leu Asp Gln Ser Trp

1 5 10

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列；混合引物1的描述

<400>6

ttycaraayg tsgtsacscc sc 22

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：混合引物2的描述

<400>7

tgrtcratng cnccsgtngc ratytcngc 29

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：ALD-5′Bam的描述

<400>8

gccggatcca caagggttca gtcattcatg g 31

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：ALD-5′Hind的描述

<400>9

ocgaagcttt cagttcgcca ggccagcc 28

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：混合引物的描述

<400>10

gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：混合引物的描述

<400>11

ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：混合引物的描述

<400>12

ggggggggca tatgcgacct ccttattacg tgaacttg 38

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：ALD-5′Nde1的描述

<400>13

ggttcagtca catatggagg tcgctatgtc 30

<210>14

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：ALD-5′Nde2的描述

<400>14

atggaggtcc attagtcatt gcccggttca cgc 33

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：BMDAT1的描述

<400>15

ccgggattcg ttaatccaaa cgttagctg 29

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：BMDAT2的描述

<400>16

ggcctgcagt taggcattaa ttgaaattgg 30

<210>17

<211>1709

<212>DNA

<213>浸麻芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(630)..(1481)

<400>17

tacatcaggt agcgccatgc atgacagaaa gggatcatga gcgttatctg ctgcgtttac 60

aacagagtga cgactgagtc agagcaattg tcgactttat cgcagaggtt tttatcagga 120

tcattatgcc atcagcttga gttgcaattc gaggatgcca tgtctggtca gacaacatta 180

aatccaggca ttgttagcta tgatgtcagt aaaggtggca gtttagtgat tagtatgcgc 240

tattctgtgt cctatccatt cgatgaaaaa ttacggaggc tcaacgttta gttgtaaaaa 300

gaggattttc attagatatt caagacgact ccaagcccca ttatgtcagt gaagatgatc 360

catttatcca aacattagcg gctatttata gacgtcaatc aggagataca gaaacaccgt 420

tattatctac aggtggtgga acgtatgcac gtgtgctgaa aaaaggcgtg gcctttggca 480

tgctattccc tggggagcag gatgtggcgc atcgggcgga tgagtttgta gtgattgaaa 540

atcttgtaaa agcagcggct atttatgcgg aagcaattgt tgagcttgcg ggaaaaaaat 600

aacataaaga cgaaaaggat gaacggaaa atg gca tat tca tta tgg aat gat 653

Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp

1 5

caa att gtt gaa gaa gga tct att gca atc tca cca gaa gac aga ggt 701

Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile Ala Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly

10 15 20

tat cag ttt ggt gac ggt att tat gaa gta att aaa gtt tat aac gga 749

Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly

25 30 35 40

aat atg ttt aca gca caa gag cac att gat cgt ttc tat gcg agc gcc 797

Asn Met Phe Thr Ala Gln Glu His Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala

45 50 55

gaa aaa att cgc ctt gtt atc cct tat aca aaa gat gtt tta cac aag 845

Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys

60 65 70

tta cta cat gag cta att gaa aag aat aat cta gaa aca gga cat gtt 893

Leu Leu His Glu Leu Ile Glu Lys Ash Asn Leu Glu Thr Gly His Val

75 80 85

tat ttt caa atc act cgt ggg gct aat tca cgt aat cac gtt ttc ccg 941

Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala Asn Ser Arg Ash His Val Phe Pro

90 95 100

gat gca agt att cct gct gta tta act gga aat gta aaa gcg ggt gaa 989

Asp Ala Ser Ile Pro Ala Val Leu Thr Gly Asn Val Lys Ala Gly Glu

105 110 115 120

cgt gca tat gaa aac ttt gaa aaa ggt gtt aaa gcc act ttt gtt gag 1037

Arg Ala Tyr Glu Asn Phe Glu Lys Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu

125 130 135

gat att cgt tgg ttg cgt tgt gac att aaa tct tta aac ttg ctt ggt 1085

Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly

140 145 150

gca gta tta gca aaa caa gaa gct gcg gag aaa ggt tgt tat gaa gcg 1133

Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala Ala Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala

155 160 165

atc tta cat cgc gga gat atc gtg aca gaa tgc tct tca gct aat gtt 1181

Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Val Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val

170 175 180

tac gga att aaa gat gga aaa ctt tat aca cat cca gct aat aat ttc 1229

Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe

185 190 195 200

atc tta aat ggt att aca cgt caa gtc att tta aaa tgt gcg gaa gaa 1277

Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln Val Ile Leu Lys Cys Ala Glu Glu

205 210 215

att aat tta cca gta atc gaa gag cca atg acg aaa gct gat tta cta 1325

Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu Pro Met Thr Lys Ala Asp Leu Leu

220 225 230

aca atg gat gaa atc att gtg tcg tct gta tct tct gag gtt acg cca 1373

Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro

235 240 245

gtc att gat gtg gac ggc aac caa att ggg gct gga gtt ccc ggt gaa 1421

Val Ile Asp Val Asp Gly Asn Gln Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu

250 255 260

tgg act cgt caa tta cag caa tca ttt gaa gcg aaa tta cca ctt tca 1469

Trp Thr Arg Gln Leu Gln Gln Ser Phe Glu Ala Lys Leu Pro Leu Ser

265 270 275 280

atg aat acc aaa taaaagaacc ttgtagagaa ctatctgtat ggatagttct 1521

Met Asn Thr Lys

ctttatttat gggtgtaatg ttgggtctcg tcatgtaaaa taaaaaggat agtagaataa 1581

tcttacagat tgaaatttgt agagcaatgt cgatgtaatg aatacataag aatgcataga 1641

ctctttttac aaaggggatc gagaaaaaag agaactaaag agatggtaag taagaatgga 1701

gtgacctt 1709

<210>18

<211>284

<212>PRT

<213>浸麻芽孢杆菌

<400>18

Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile

1 5 10 15

Ala Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr

20 25 30

Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly Asn Met Phe Thr Ala Gln Glu His

35 40 45

Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro

50 55 60

Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Glu Leu Ile Glu Lys

65 70 75 80

Asn Asn Leu Glu Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala

85 90 95

Asn Ser Arg Asn His Val Phe Pro Asp Ala Ser Ile Pro Ala Val Leu

100 105 110

Thr Gly Asn Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Tyr Glu Asn Phe Glu Lys

115 120 125

Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp

130 135 140

Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala

145 150 155 160

Ala Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Val

165 170 175

Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu

180 185 190

Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln

195 200 205

Val Ile Leu Lys Gys Ala Glu Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu

210 215 220

Pro Met Thr Lys Ala Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser

225 230 235 240

Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Asn Gln

245 250 255

Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Gln Leu Gln Gln Ser

260 265 270

Phe Glu Ala Lys Leu Pro Leu Ser Met Asn Thr Lys

275 280

权利要求书

(按照条约第19条的修改)

1.(修改后)谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，在对由下述通式(1)

(通式(1)中，R¹及R²相互独立，各自代表选自氢原子、碳原子数为1-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。但是，R¹和R²中之一代表氢原子的场合，另一方不代表氢原子、甲基、乙基、丙基或亚甲基。此外，R¹和R²中之一代表羟基的场合，另一方不代表氢原子或甲基。此外，R¹和R²中的一方为甲基时，另一方不表示甲基。R¹含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)的取代α-酮酸生成下述通式(2)

(通式(2)中的R¹及R²与通式(1)中的R¹及R²的含意相同。)所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，通过该反应的进行，生成所述通式(2)的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的R¹为苯甲基或3-吲哚基甲基，R²为羟基。

3.根据权利要求1或2所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酶为脱氢酶或转氨酶。

4.根据权利要求3所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于所述的酶为转氨酶，而且，反应系统中含有1种或多种氨基酸作为氨基供体。

5.根据权利要求4所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨

Claims

1.谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，在对由下述通式(1)

(通式(1)中，R¹及R²相互独立，各自代表选自氢原子、碳原子数为1-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。但是，R¹和R²中之一代表氢原子的场合，另一方不代表氢原子、甲基或乙基。此外，R¹和R²中之一代表羟基的场合，另一方不代表氢原子或甲基。R¹含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)的取代α-酮酸生成下述通式(2)

5.根据权利要求4所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸。

6.根据权利要求3-5所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酶为L-氨基酸转氨酶。

7.根据权利要求3-5所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酶为D-氨基酸转氨酶。

8.根据权利要求7所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，反应系统中包含具有对L-氨基酸转换为D-氨基酸的反应进行催化的活性的酶。

9.根据权利要求6所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的L-氨基酸转氨酶是来源于选自气单胞菌属、土壤杆菌属、产碱菌属、拜叶林克氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属和摩根氏菌属的微生物的酶。

10.根据权利要求9所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的微生物选自嗜水气单胞菌、根癌土壤杆菌、粪产碱菌、印度拜叶林克氏菌、大肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌以及摩氏摩根氏菌。

11.根据权利要求7或8所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的D-氨基酸转氨酶为来源于芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属微生物的酶。

12.根据权利要求11所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的微生物选自球形芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、幼虫类芽孢杆菌尘埃芽孢杆菌亚种以及浸麻类芽孢杆菌。

13.根据权利要求1所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酶为导入了D-氨基酸转氨酶基因的微生物所产生的酶。

14.根据权利要求13所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的微生物为大肠杆菌。

15.根据权利要求13或14所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的D-氨基酸转氨酶基因来源于球形芽孢杆菌或浸麻芽孢杆菌。

16.谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，该方法至少包括下述[I]和[II]的步骤，

[I]在对由下述通式(3)所示的取代α-酮酸

(通式(3)中，R代表选自碳原子数为2-8的烷基、碳原子数为1-8的烷氧基、碳原子数为2-9的羧烷基、碳原子数可至20的芳基、碳原子数可至20的芳烷基、含杂环的烃基、羟基中的取代基。R含有芳香环或杂环的场合，该芳香环或杂环也可进一步被卤原子、羟基、碳原子数可至3的烷基、碳原子数可至3的烷氧基和氨基所取代。)和草酰乙酸或丙酮酸生成下述通式(4)所示的取代α-酮酸的反应进行催化的酶存在下，

(通式(4)中的R与通式(3)中的R含意相同。)

通过该反应的进行，生成所述通式(4)的取代的α-酮酸的步骤；

[II]在对由所述通式(4)的取代的α-酮酸生成下述通式(5)所示的谷氨酸衍生物的反应进行催化的酶存在下，

(通式(5)中的R与通式(3)中的R含意相同。)

通过该反应的进行，生成所述通式(5)的谷氨酸衍生物(包括其盐的形式)的步骤。

17.根据权利要求16所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述的R为苯甲基或3-吲哚基甲基。

18.根据权利要求16或17所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述对步骤[1]的反应进行催化的酶为来源于选自假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、黄单胞菌属的微生物的酶。

19.根据权利要求18所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述微生物为腐臭假单胞菌、晕斑假单胞菌、解韧带假单胞菌、欧文氏菌种、莱菌黄杆菌或柑橘黄单胞菌。

20.根据权利要求19所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述微生物为腐臭假单胞菌ATCC 4683或晕斑假单胞菌AJ 2791。

21.根据权利要求16或17所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述对步骤[I]的反应进行催化的酶为下述任何一种蛋白质，

(a)具有序列表的序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质

(b)具有在序列表的序列号2所述的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列，并有醛缩酶活性的蛋白质

(c)具有序列表的序列号3所述的氨基酸序列的蛋白质

(d)具有在序列表的序列号3所述的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸残基经置换、缺失、插入、添加和/或倒位而得的氨基酸序列，并有醛缩酶活性的蛋白质。

22.根据权利要求16或17所述的谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述对步骤[I]中反应进行催化的酶是由扩增并表达编码下述任何一种蛋白质的基因的重组体获得，

(a)具有序列表的序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质

(c)具有序列表的序列号3所述的氨基酸序列的蛋白质

23.莫纳汀的制备方法，其特征在于该方法至少包括下述[A]-[C]的步骤，

[C]在对由4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸生成莫纳汀的反应进行催化的酶存在下，通过使所述的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸反应，生成莫纳汀的步骤。

24.根据权利要求23所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的步骤[A]是在对色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应进行催化的酶存在下，通过使色氨酸反应，得到吲哚-3-丙酮酸，做成反应液，对该反应液进行脱气处理、脱氧处理以及调节pH值至最高为2中的任何一种处理，收集吲哚-3-丙酮酸的步骤。

25.根据权利要求24所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的脱气处理或脱氧处理是用惰性气体置换所述反应液中所含气体的全部或一部分的方法。

26.根据权利要求25所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的惰性气体是氮、氩和氦中的任一种。

27.根据权利要求24-26所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的pH调节是在所述反应液中添加酸进行调节，并包括因pH调节的结果而使生成的吲哚-3-丙酮酸晶析、以及收集该结晶的步骤。

28.根据权利要求27所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的酸为硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的任何一种。

29.根据权利要求23-28所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述对步骤[A]的反应进行催化的酶来源于具有氨基酸氧化酶活性和过氧化氢酶活性的微生物。

30.根据权利要求23-29所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述对步骤[A]的反应进行催化的酶来源于土壤杆菌属、变形菌属和摩根氏菌属中的任何一种。

31.根据权利要求30所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述对步骤[A]的反应进行催化的酶来源于土壤杆菌属种AJ 2425、雷氏普罗威登斯菌IFO 13501以及摩氏摩根氏菌IFO 3168中的任何一种。

32.根据权利要求23所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的步骤[A]是将选自土壤杆菌属、变形菌属、摩根氏菌属、假单胞菌属、链孢霉属、并具有转化色氨酸为吲哚-3-丙酮酸能力的微生物培养物作用于色氨酸，生成吲哚-3-丙酮酸，并收集该吲哚-3-丙酮酸的步骤。

33.根据权利要求23-32所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的步骤[B]在对该反应进行催化的酶存在下进行。

34.根据权利要求23-32所述的莫纳汀的制备方法，其特征在于，所述的步骤[B]用化学合成法进行。