CN1872872A

CN1872872A - 肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法

Info

Publication number: CN1872872A
Application number: CNA2006100926763A
Authority: CN
Inventors: 外内尚人; 铃木园子; 横关健三; 野崎博之; 杉山雅一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2006-12-06
Also published as: CN100999753A

Abstract

本发明提供一种使用价格低廉、容易获得的起始原料，通过工业上有利的简便途径生产二肽的方法。用具有由L－氨基酸酯和L－氨基酸生成二肽的活性的微生物的培养物、由该培养物分离的菌体、或该微生物的菌体处理物，由L－氨基酸酯和L－氨基酸生产二肽。

Description

肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法

本申请是国际申请日为2002年7月26日，申请号为02818989.2的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种不必通过复杂的合成方法，即能简便经济地生产二肽的方法，更具体地说是涉及肽生成酶的基因、肽生成酶、以及用该酶生产二肽的方法。

背景技术

二肽应用于医药原料、功能性食品等各种领域。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可用作无血清培养基的成分，并因其比L-谷氨酰胺稳定、水溶性也更好，从而可以用作输液成分。

至目前为止，己知的二肽生产方法是化学合成法，但该生产方法未必是简单的方法。已知使用化学合成法的例子有：用N-苄氧羰基丙氨酸(以下称为Z-丙氨酸)和保护的L-谷氨酰胺的方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)、Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))、用Z-丙氨酸酯和保护的L-谷氨酸-γ-甲酯的方法(Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))、用Z-丙氨酸和无保护的谷氨酸的方法(特开平1-96194号公报)、用2-取代的丙酰卤为原料，合成N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物作为中间体的方法(特开平6-234715号公报)等。

但是，上述的所有方法都必须要引入和脱去保护基，或合成中间体，所以这些生产方法不能充分满足对工业上有利的要求。已知用酶生产二肽的代表性方法有：用N保护、C无保护的羧基成分和N无保护、C保护的胺成分的缩合反应(反应1)，以及用N保护、C保护的羧基成分和N无保护、C保护的胺成分的置换反应(反应2)；作为反应1的例子有由Z-天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法(特开昭53-92729号公报)，作为反应2的倒子有由乙酰苯丙氨酸乙酯和亮氨酰胺生产乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺的方法(Biochemical J.，163，531(1977))。有关用N无保护、C保护的羧基成分的方法的研究报告例很少，在专利WO 90/01555中，描述了用N无保护、C保护的羧基成分和N无保护、C保护的胺成分进行置换反应(反应3)的例子，例如，由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生产精氨酰亮氨酰胺的方法。在专利EP 278787A中，描述了用N无保护、C保护的羧基成分和N无保护、C无保护的胺成分进行置换反应(反应4)的例子，

例如，由酪氨酸乙酯和丙氨酸生产酪氨酰丙氨酸的方法。这些方法中，能成为最廉价的生产方法的，自然是属于保护基团数最少的反应4范畴内的反应。

但是，先前的技术中，反应4(EP278787A)所用的酶是霉菌、植物来源的比较昂贵的羧肽酶制剂，而且所生产的二肽含有疏水度较高的氨基酸。在反应4方面，未见有用细菌或酵母来源的酶的方法，也未知有关生产高亲水性的丙氨酰谷氨酰胺或丙氨酰天冬氨酸的方法。在这样的情况下，希望开发一种该类肽的价格低廉的工业生产方法。

另一方面，脯氨酸亚氨肽酶是一种催化N末端含有脯氨酸的肽裂解出该N末端脯氨酸的反应的酶，已知这种酶存在于多种生物中。例如，已知在豚鼠(脑)(J.Biol.Chem.，258，6147-6154(1983))、鼠(脑、肾)(Eur.J.Biochem.，190，509-515(1990))等高等动物；杏籽(J.Biochem.，92，413-421(1982))等高等植物；细齿木(Trichodermadenticola)(Infect.Immun.，64，702-708(1996))等口腔螺旋体属；青霉菌等丝状菌(特开平1-215288)；香菇等担子菌(特开昭58-36387)；皱褶链霉菌(Biochem.Biophys.Res.Commun.，184，1250-1255(1992))等放线菌类；变异棒杆菌(J.Appl.Microbiol.，90，449-456(2001))等细菌中，存在脯氨酸亚氨肽酶。

此外，有关脯氨酸亚氨肽酶的基因，也已报道了烟草节杆菌(FEMSMicrobiol.Lett.，78，191-197(1999))、大肠杆菌(特开平2-113887)、脑膜脓毒性金黄杆菌(Arch.Biochem.Biophys.，336，35-41(1996))、蜂房哈夫尼菌(J.Bioichem.，119，468-474(1996))、debrueckii乳杆菌(Microbiology，140，527-535(1994))、凝结芽孢杆菌(J.Bacteriol.，174，7919-1925(1994))来源、温和气单胞菌来源(J.Biochem，116，818-825(1994))、野油菜黄单胞菌(特开平9-121860)、淋病奈瑟氏球菌(Mol.Microbiol.，9，1203-1211(1993))、费氏丙酸杆菌(Appl.Environ.Micropbiol.，64，4736-4742(1998))、粘质沙雷氏菌(J.Biochem.，122，601-605(1997))和嗜酸热原体(FEBS Lett.，398，101-105(1996))的基因克隆和碱基序列。

此外，最近根据微生物的全基因组的分析，已报道了多种生物中推测为编码脯氨酸亚氨肽酶的碱基序列。例如，已报道了铜绿假单胞菌的基因组的完整碱基序列(Nature，406，959(2000))，并在其中发现了推测为编码脯氨酸亚氨肽酶的碱基序列。

另一方面，已发现，用脯氨酸亚氨肽酶，使L-脯氨酸或DL-脯氨酸的酯与α-氨基酸反应，即生成含脯氨酸的二肽(特开平3-13391号公报)。然而，脯氨酸亚氨肽酶是一种催化N末端含有脯氨酸的肽裂解出该N末端脯氨酸的反应的酶，根据其底物特异性，自然考虑到脯氨酰氨基酸是由脯氨酸酯和氨基酸生成，而对于用脯氨酸亚氨肽酶，由脯氨酸以外的氨基酸酯和氨基酸来合成肽却完全不清楚。当然，讫今为止，对于由L-丙氨酸乙酯盐酸盐和L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺也是完全未知的。此外，尽管假单胞菌ATCC 12633的脯氨酸亚氨肽酶的部分碱基序列已公开(AF032970)，但对其活性，包括检测，都尚未进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用廉价获得的出发原料和能够廉价提供的酶源(微生物的培养物、微生物菌体、菌体处理物等)，利用对工业上有利而且简便的途径生产二肽的方法。

本发明人根据上述的目的反复努力研究的结果，发现脯氨酸亚氨肽酶具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成肽的能力。此外，本发明人还对该酶的基因进行了克隆和表达，并用精制重组酶证实该酶在生成肽时具有广谱底物特异性，由此而完成了本发明。

亦即，本发明如以下所述：

[1]下述(A)或(B)所示的蛋白质。

(A)具有序列表的序列号5中所述的氨基酸序列的蛋白质。

(B)具有在序列表的序列号5所述的氨基酸序列中，有1个或多个置换、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质。

[2]下述(C)或(D)所示的蛋白质。

(C)具有序列表的序列号15中所述的氨基酸序列的蛋白质。

(D)具有序列表的序列号15所述的氨基酸序列中，有1个或多个置换、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质。

[3]下述(E)或(F)所示的蛋白质。

(E)具有序列表的序列号17中所述的氨基酸序列的蛋白质。

(F)具有在序列表的序列号17所述的氨基酸序列中，有1个或多个置换、缺失、插入、添加、或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质。

[4]下述(a)或(b)所示的DNA。

(a)由序列表的序列号4中所述的碱基号57-1295的碱基序列构成的DNA

(b)与由序列表的序列号4中所述的碱基号57-1295的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，并编码具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA

[5]下述(c)或(d)所示的DNA。

(c)由序列表的序列号14中所述的碱基号486-1496的碱基序列构成的DNA

(d)与由序列表的序列号14中所述的碱基号486-1496的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，并编码具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA

[6]下述(e)或(f)所示的DNA。

(e)由序列表的序列号16中所述的碱基号311-1279的碱基序列构成的DNA

(f)与由序列表的序列号16中所述的碱基号311-1279的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，并编码具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA

[7]上述[4]-[6]中任意一项所述的DNA，其中的严格的条件为在相当于1×SSC及0.1％SDS的盐浓度、60℃下洗涤的条件。

[8]插入了上述[4]-[7]中任意一项所述的DNA的重组DNA。

[9]导入了上述[4]-[7]中任意一项所述的DNA的转化细胞，其中的DNA按照能使其编码的蛋白质表达的方式导入。

[10]一种二肽生成酶的生产方法，其特征在于将上述[9]中所述的转化细胞在培养基中培养，使具有由L-氨基酸酯和L氨基酸生成二肽的活性的蛋白质在培养基中和/或转化细胞中积累。

[11]一种生产二肽的方法，其特征在于用上述[9]中所述的转化细胞生成的、具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽。

[12]上述[11]中所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

[13]上述[11]或[12]中所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

[14]一种生产二肽的方法，其特征在于使具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸而合成二肽。

[15]上述[14]中所述的生产二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质来源于属于棒杆菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属的微生物。

[16]上述[14]中所述的生产二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质来源于谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌和凝结芽孢杆菌中的任何一种。

[17]上述[14]-[16]中任何一项所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

[18]上述[14]或[17]中任何一项所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

[19]一种生产二肽的方法，其特征在于该方法使用属于棒杆菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属，并具有由L-氨基酸酯和L氨基酸生成二肽的活性的微生物培养物、从该培养物分离的微生物细胞或该微生物的菌体处理物，由氨基酸酯和氨基酸生产二肽。

[20]上述[19]中所述的肽的生产方法，其特征在于其中的氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

[21]上述[19]中所述的肽的生产方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

附图简述

图1表示添加抑制剂时的二肽合成活性。

实施发明的最佳方式

本发明提供一种新的具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、以及利用该DNA和蛋白质生产二肽的方法。本发明的二肽生产方法中的反应用以下的反应式表示。如下述化学式的例子所示，本说明书中所说的“二肽”是指有1个肽键的肽聚合物。

(式1)

(R表示取代或无取代的烃链，R₁表示氨基酸酯的侧链，R₂表示氨基酸的侧链)

氨基酸酯是能以廉价获得的化合物。以氨基酸酯和无保护的氨基酸作为出发原料，以细菌、酵母等作为酶源，使其在水中进行反应的本发明所述的方法，是新的前所未有的二肽生产方法，从而有可能提供更廉价二肽，用于医药材料、功能性食品。

以下，按下述顺序对本发明进行详细描述。

[I]具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物

[II]分离编码具有肽生成活性的蛋白质的DNA

[III]肽生成酶的性质

[IV]二肽的生产方法

[I]具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物

作为本发明使用的微生物，没有特别的限定，可以使用具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物。具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物的例子有芽孢杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属，具体可举出以下的例子。

枯草芽孢杆菌ATCC 6633

(Bacillus subtilis)

凝结芽孢杆菌EKO1(J.Bacteriol.，174，7919-7925(1992))

(Bacillus coagulans)

谷氨酸棒杆菌ATCC 13286

(Coryebacterium glutamicum)

恶臭假单胞菌AJ-2402 FERM BP-8101

(Pseudomonas pudida)

恶臭假单胞菌ATCC 12633

(Pseudomonas pudida)

恶臭假单胞菌AJ-2048 FERM BP-8123

(Pseudomonas pudida)

上述菌株中，以ATCC号表示的菌株保藏在American Type CultureCollection(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)，并可参照各个号码提供再培养物。

上述菌株中，以FERM号表示的菌株是保藏在独立行政法人产业技术综合研究所国际专利微生物保藏中心(亍305-8566茨城县つくば市东1-1-1中央第6)、并指定保藏号的微生物。恶臭假单胞菌AJ-2402于2001年10月1日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所国际专利微生物保藏中心，并指定其保藏号为FERM P-18544，随后于2002年7月1日转移至国际保藏，保藏号为FERM BP-8101。另外，根据以下的分类实验，FERM BP-8101(AJ-2402)被鉴定为上述的恶臭假单胞菌。此外，恶臭假单胞菌AJ-2048株于2002年7月22日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所国际专利微生物保藏中心，并指定其保藏号为FERM BP-8123。

恶臭假单胞菌FERM BP-8101株是能运动的无孢子杆菌，根据其以下性质，鉴定为假单胞菌属细菌：杆菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)、革兰氏阴性、不生成芽孢、有运动性、菌落形态：圆形，边缘完全光滑，凸状，有光泽，奶油色、在30℃下生长、过氧化氢酶阳性、氧化酶阳性以及OF测试(葡萄糖)阴性。进一步根据以下生理学性质鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudida)：硝酸盐还原阴性、吲哚产生阴性、葡萄糖生成酸阴性、精氨酸二氢酶阳性、脲酶阴性、七叶苷水解阴性、明胶水解阴性、β-半乳糖苷酶阴性、葡萄糖同化阳性、L-阿拉伯糖同化阴性、D-甘露糖同化阳性、D-甘露糖醇同化阳性、N-乙酰-D-葡萄糖胺同化阴性、麦芽糖同化阴性、葡糖酸钾同化阳性、正癸酸同化阳性、己二酸同化阴性、dl-苹果酸同化阳性、柠檬酸钠同化阳性、苯乙酸同化阳性、氧化酶阳性、在King′s B琼脂培养基上产生荧光染料阳性、由蔗糖产生果聚糖阳性，以及山梨糖醇的微弱同化作用。

野生株或变异株的任何一种都可用作上述的微生物，此外，通过细胞融合或基因操作等遗传方法而得到的重组株等也可以使用。

为了得到这些微生物的菌体，可以使该微生物在适当的培养基上培养生长。对所用的培养基无特别限制，只要能使该微生物生长即可，该培养基可以是含有普通的碳源、氮源、磷源、硫源、无机离子、以及根据需要含有有机营养源的普通培养基。

例如，只要可以被上述的微生物利用，任何一种碳源都可使用，具体可以使用的有葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉糖等糖类；山梨糖醇、乙醇、甘油等醇类；富马酸、柠檬酸、乙酸和丙酸等有机酸类及其盐类；石蜡等碳氢化合物类或者它们的混合物等。

作为氮源，可以使用的有硫酸铵、氯化铵等无机酸的铵盐；富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸铵盐；硝酸钠、硝酸钾等硝酸盐；胨、酵母提取物、肉类提取物、玉米浆等有机氮化合物，或它们的混合物。

此外，可以将无机盐、微量金属盐、维生素等用于普通培养基中的营养源适当地混合使用。

在培养条件方面也没有特别的限制，例如，可以在好气的条件下，使pH和温度适当地控制在pH为5-8的范围，和温度为15-40℃的范围内，培养12-48小时。

[II]分离编码具有肽合成酶活性的蛋白质的DNA

[II-1]DNA的分离

本发明人从上述的微生物中，分离出本发明的DNA，并确定其序列，该DNA编码具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸合成二肽的活性的蛋白质。从谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株分离出序列表的序列号4中所述的由碱基号57-1295的碱基序列构成的DNA。此外，从恶臭假单胞菌ATCC 12633株分离出序列表的序列号14中所述的由碱基486-1496的碱基序列构成的DNA。进一步再从恶臭假单胞菌FERMBP-8123株分离出序列表的序列号16中所述的由碱基号311-1279的碱基序列构成的DNA。另外要说明，本说明书中所说的“序列号4中所述的碱基序列”、“序列号14中所述的碱基序列”、“序列号16中所述的碱基序列”，除非预先说明，均指CDS部分。

分离DNA的一个例子如下所述：首先，确定精制的肽生成酶的氨基酸序列。该氨基酸序列可以用Edman法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.4，227(1950))测定。此外，也可以用Applied Biosystems公司生产的测序仪来测定氨基酸序列。测定精制的肽生成酶的N末端、或者测定由精制的肽生成酶通过赖氨酰肽链内切酶处理得到的肽的10-30个残基的氨基酸序列，根据测定清楚的氨基酸序列，可以推测编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列。在推测DNA的碱基序列时，可以采用通用的密码子。

根据所推测的碱基序列，合成约30个碱基对的DNA分子。合成该DNA分子的方法公开在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)中。此外，可以用Applied Biosystems公司生产的合成仪来合成该DNA分子。用该DNA分子作为引物，通过PCR法，由染色体DNA可以扩增编码肽生成酶的DNA。但是，用PCR法扩增的DNA不包含全长的编码肽生成酶的DNA，因此，可以用PCR法扩增的DNA作为探针，由谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或凝结芽孢杆菌等各种菌株的染色体基因库，分离全长的编码肽生成酶的DNA。

或者，在基因的碱基序列的一部分为已知的场合，可以用含有该已知序列的DNA作为探针，由染色体基因库，分离全长的编码肽生成酶的DNA。

还有，在基因的碱基序列与已知的序列有同源性的场合，可以用含有该已知序列的DNA作为探针，由染色体基因库，分离全长的编码肽生成酶的DNA。

有关PCR的操作方法，在White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989)等中描述。有关染色体DNA的生产方法、以及用DNA分子作为探针，由基因库分离目的DNA分子的方法，在MolecularCloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)等中已有描述。

测定分离的编码肽生成酶的DNA碱基序列的方法在A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons，Inc.(1985)等中已有描述。此外，可以用Applied Biosystems公司生产的测序仪来测定碱基序列。按上述方法，由谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株、恶臭假单孢菌ATCC 12633株、恶臭假单孢菌FERM BP-8123株分离的编码肽生成酶的DNA分别在序列表的序列号4、14、16中表示。

可以用于本发明中的DNA不仅是序列表的序列号4、14、16所示的DNA。例如，以下用谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株分离的序列表的序列号4的DNA来说明，即使是经过人工诱变，而变为由谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株染色体DNA分离的编码肽生成酶的DNA，就其编码肽生成酶而言，也属于本发明的DNA。常用的人工诱变法有Method.in Enzymol.，154(1987)中所述的定点诱变法。

此外，在严格条件下，与具有序列表的序列号4所述的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸杂交、并编码具有肽生成酶活性的蛋白质的DNA，也是可用于本发明的DNA。

还有，根据由序列表的序列4所述的CDS构成的DNA制备成探针，通过分离在严格条件下与该探针杂交、而且编码具有肽合成活性的蛋白质的DNA，也可以获得与本发明的DNA基本上相同的DNA。探针可以根据序列表的序列号4所述的碱基序列、按照常规方法制备。此外，一种利用探针挑选出与其杂交的DNA，从而分离出目的DNA的方法，也可以按照常规的方法进行。例如，DNA探针可以用下述方法制备：使克隆在质粒或噬菌体载体中的碱基序列扩增，然后用限制酶切出要用作探针的碱基序列，并进行抽提。酶切的位点可根据目的DNA进行调节。

这里所说的“严格的条件”是指形成所谓特异的杂交、而不形成非特异杂交的条件。虽然该条件很难明确地数值化，但举例来说，这些条件包括：使同源性高的DNA之间，例如具有50％以上、较优选80％以上、更优选90％以上同源性的DNA之间发生杂交，而同源性低于此值的DNA之间不发生杂交；或者，在60℃、1×SSC、0.1％SDS的通常Southern杂交的洗涤条件下，优选在60℃、盐浓度相当于0.1×SSC、0.1％SDS，更优选在65℃、盐浓度相当于0.1×SSC、0.1％SDS的条件下杂交。肽生成酶的活性如上述的说明，但是，碱基序列与序列表的序列号4所述碱基序列的互补序列在严格的条件下杂交时，要求在50℃、pH8的条件下，保持具有序列表的序列号4所述氨基酸序列的蛋白质的10％以上、更优选50％以上的酶活性。

还有，与序列表的序列号4所述DNA编码的肽生成酶基本上相同的蛋白质，也可用于本发明。因此，编码下述蛋白质的DNA也可用于本发明中，即该蛋白质“具有在序列表的序列号5所述氨基酸序列中，包含1个或多个置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列，而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成肽的酶活性”。这里所说的“多个”是指，对含氨基酸残基的蛋白质的立体结构、或肽生成酶活性无明显影响的范围内的个数，具体为2-50个、优选2-30个、更优选2-10个。此外，肽生成酶的活性如上述说明。但是，具有在序列表的序列号5所述氨基酸序列中，包含1个或多个置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列时，要求在50℃、pH8的条件下，保持具有序列表的序列号5所述氨基酸序列的蛋白质的10％以上、更优选50％以上的酶活性。

如以上所述，作为本发明的DNA，除了由谷氨酸棒杆菌ATCC13286株分离的DNA、由恶臭假单胞菌ATCC 12633株分离的DNA、由恶臭假单胞菌FERM BP-8123株分离的DNA之外，与这些DNA基本上相同的DNA也在本发明范围内。亦即，本发明提供的DNA如下：

(i)含有序列表的序列号4、14或16所述的CDS的DNA。

(ii)与含有序列表的序列号4、14或16所述的CDS的互补碱基序列的多核苷酸在严格的条件下杂交、而且编码具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应的肽生成酶活性的蛋白质的DNA。

(iv)编码具有序列表的序列号5、15或17所述的氨基酸序列的蛋白质的DNA。

(v)编码下述蛋白质的DNA：具有在序列表的序列号5所述氨基酸序列中，包含1个或多个置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列、而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应的肽生成酶活性的蛋白质。

[II-2]转化体的生产

下面，对生产表达具有肽生成酶活性的蛋白质的转化体进行说明。已知，利用重组DNA技术生产酶、生理活性物质等有用蛋白质的例子有很多，通过利用重组DNA技术可以大量生产天然微量存在的有用蛋白质。

可以用于本发明的方法中的合适的转化体有，例如，能够表达下述(AA)、(BB)、(CC)等蛋白质的转化体。

(AA)具有序列表的序列号5、15或17所述的氨基酸序列的蛋白质。

(BB)具有在序列表的序列号5所述氨基酸序列中，包含1个或多个置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列、而且具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应的肽生成酶活性的蛋白质。

(CC)由下述DNA编码的蛋白质：与含有序列表的序列号4、16或18的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸、或者根据序列号4、16或18的碱基序列制备的探针，在严格的条件下杂交、而且编码具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽反应的肽生成酶活性的蛋白质的DNA。

为了生产表达上述(AA)-(CC)具有肽生成活性蛋白质的转化体，将上述[II-1]栏中所示的(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的DNA导入宿主细胞即可。即，将(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的DNA插入可能在宿主细胞中表达的重组DNA中、具体是插入表达载体等中，然后将其导入宿主细胞。

此外，上述(BB)所示的变异可以通过以下方法获得，例如，通过定点诱变法，使该酶基因的特定部位氨基酸发生置换、缺失、插入、添加的碱基序列改变。此外，上述那样改变的DNA也可以通过已知的诱变处理而得到。诱变处理的例子包括，将编码本酶的DNA用羟胺等在体外处理的方法、以及将包含编码本酶的DNA的大肠杆菌属细菌，用紫外照射或者用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、或亚硝酸等通常人工诱变所用的诱变剂处理的方法。

用重组DNA技术大量生产蛋白质时，该蛋白质聚集在生产该蛋白质的转化子体内而形成包涵体，这种方式也作为本发明优选的实施方式。这种表达和生产方法的优点是可防止目的蛋白被菌体内存在的蛋白酶所消化、以及目的蛋白可通过将菌体破碎后离心的方法而简单地进行纯化等。

这样所得到的蛋白质包涵体用蛋白变性剂溶解后，通过以除去该变性剂为主的活性再生操作，即转变为正确折叠的有生理活性的蛋白质。例如，包括白细胞介素-2的活性再生(特开昭61-257931号公报)等许多例子。

为了从蛋白质包涵体得到活性型的蛋白质，必需经过溶解-复性的一系列操作，因而比直接生产活性型蛋白质的方法复杂。但是，在菌体内大量产生的蛋白质影响到菌体的生长时，通过在菌体内积累失活形式的蛋白质包涵体，可以抑制该影响。

大量生产包涵体形式的目的蛋白的方法中，除了在强启动子控制下单独表达目的蛋白的方法以外，还有一种方法是使目的蛋白作为己知大量表达的蛋白质的融合蛋白的形式而表达。

还有，以融合蛋白的形式表达后，为了将目的蛋白切出，将限制酶的识别序列排列在适当的位置也是一种可行的方法。

用重组DNA技术大量生产蛋白质的场合，可用细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、霉菌细胞、植物细胞、动物细胞等作为被转化的宿主细胞，但一般采用大肠杆菌等肠内细菌、优选用大肠杆菌(Escherichia coli)，因为有关用大肠杆菌等肠内菌大量生产蛋白质的技术，积累了很多实践经验。以下，对用转化的大肠杆菌生产肽生成酶的方法中的一种方式加以说明。

通常大肠杆菌中生产异源蛋白所用的启动子可以作为使编码肽生成酶的DNA表达的启动子，例如，T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的P_R启动子、P_L启动子等强启动子。

为了使肽生成酶以融合蛋白包涵体的形式进行生产，在肽生成酶基因的上游或下游，连接编码其他蛋白质，优选连接编码亲水性肽的基因，从而形成融合蛋白基因。其中所说的编码其他蛋白质的基因只要是使融合蛋白的积累量增加、变性-复性过程后提高融合蛋白的溶解性的基因都可以使用，例如，T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脱氢叶酸还原酶基因、干扰素γ基因、白细胞介素-2基因、凝乳酶原基因等侯选基因。

这些基因和编码肽生成酶的基因连接时，按照读码框一致的方式进行连接；可以在合适的限制酶位点连接，或者使用合适的合成DNA序列进行连接。

此外，为了增加产量，优选有时在融合蛋白基因的下游连接终止子形式的转录终止序列。该终止子包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、大肠杆菌trpA基因的终止子等。

优选所谓多拷贝型的载体作为将编码肽生成酶、或编码肽生成酶和其他蛋白质的融合蛋白的基因导入大肠杆菌的载体，例如具有ColE1来源的复制起点的质粒，如pUC系列的质粒、pBR322系列的质粒或其衍生物。这里所说的“衍生物”是指对质粒通过碱基的置换、缺失、插入、添加或倒位加以修饰后所得的质粒。另外，这里所说的修饰包括用诱变剂或紫外照射等诱变处理，或通过自然变异等产生的修饰。更具体地说，可用的载体例如有：pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。其他噬菌体DNA、转座子DNA的载体也可以使用。

此外，为了筛选转化体，优选该载体含有氨苄青霉素抗性基因等标记。市场上可购买到具有强启动子的表达载体(pUC系列(宝酒造公司生产)、pPROK系列(Clontech公司生产)、pKK322-2(Clontech公司生产)及其他)用作这样的质粒。

将由启动子、编码肽生成酶或肽生成酶和另一种蛋白质的融合蛋白的基因、以及根据情况而定的终止子按顺序连接起来的DNA片段与载体DNA连接即可得到重组DNA。

用该重组DNA转化大肠杆菌、并培养该转化的大肠杆菌时，可使肽生成酶或肽生成酶和另一蛋白质的融合蛋白表达和生产。虽然可以使用异源基因表达中通常所用的菌株作为转化的宿主，但优选用，例如，大肠杆菌JM109菌株。转化的方法、以及转化体筛选的方法在Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)等中已有描述。

以融合蛋白形式表达的场合，可以用血液凝固因子Xa、激肽释放酶等肽生成酶内不存在的序列作为限制性蛋白酶的识别序列，通过限制性蛋白酶将融合蛋白中的肽生成酶切出。

M9-酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等培养大肠杆菌通常所用的培养基也可以用作生产培养基。此外，培养条件、生产诱导条件可根据所用的载体的标记、启动子、宿主菌等的种类适当地选择。

肽生成酶或肽生成酶和另一种蛋白质的融合蛋白的回收有以下等方法。如果肽生成酶或其融合蛋白在菌体内是可溶的，回收菌体后，可将菌体破碎或溶菌，作为粗酶液使用。进一步根据需要，也可以通过常规的沉淀、过滤、层析等技术将肽生成酶或其融合蛋白纯化后使用。在这种场合，也可以采用利用肽生成酶或其融合蛋白的抗体的纯化方法。

在形成蛋白质包涵体的场合，可用变性剂将其溶解。虽然可以将该蛋白质包涵体与菌体蛋白一起溶解，但从随后的纯化操作考虑，优选将包涵体取出，然后将其溶解。从菌体中回收包涵体时，可以采用常规的已知方法进行。例如，通过将菌体破坏、离心操作等回收包涵体。使蛋白质包涵体溶化的变性剂有盐酸胍(例如，6M，pH5-8)、尿素(例如，8M)等。

通过透析将这些变性剂除去后，即复性为有活性的蛋白质。透析中所用的透析溶液可以用Tris-盐酸缓冲液和磷酸缓冲液，浓度为20mM-0.5M，pH为5-8。

复性步骤期间的蛋白质浓度优选控制在500μg/ml以下。为了抑制再生的肽生成酶本身发生交联，透析温度优选在5℃以下。此外，除去变性剂的方法除了上述的透析法以外，还有稀释法、超滤法等。预期用任何一种都可以使酶复性。

用序列表的序列号4所示的DNA作为编码肽生成酶的DNA时，产生具有序列号5所示的氨基酸序列的肽生成酶。此外，用序列表的序列号14所示的DNA作为编码肽生成酶的DNA时，产生具有序列号15所示的氨基酸序列的肽生成酶。同样，用序列表的序列号16所示的DNA作为编码肽生成酶的DNA时，产生具有序列号17所示的氨基酸序列的肽生成酶。

另外说明，有关基因工程的技术可以按照Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harborpress(1989)等所述的方法进行。

[III]肽生成酶的性质

下面，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13286菌株作为上述的微生物中的一例，对由其纯化的肽生成酶性质进行说明。

以L-丙氨酸酯和L-谷氨酰胺为原料(底物)的场合为例，该肽生成酶具有用L-丙氨酸酯和L-谷氨酰胺为底物，产生L-丙氨酰L-谷氨酰胺的活性。此外，以L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺为原料的场合为例，该肽生成酶具有用L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺为底物，产生L-丙氨酰-L-天冬酰胺的活性。

就酶的作用而言，以L-丙氨酸酯和L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺为原料的场合为例，该肽生成酶由1分子的L-丙氨酸酯和1分子的L-谷氨酰胺，产生1分子的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1分子的醇；由1分子的L-丙氨酸酯和1分子的L-天冬酰胺，产生1分子的L-丙氨酰-L-天冬酰胺和1分子的醇。

最适pH在6.0-10.0附近，最适温度在30-50℃附近。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时，计算得其亚基的分子量为42,000-46,000。

[IV]二肽的生产方法

本发明的二肽生产方法是用具有合成二肽活性的酶，或含有该酶的物质由L-氨基酸酯和L-氨基酸生产二肽。具体是，用具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的能力的微生物培养物、由该培养物分离的微生物菌体、该微生物的菌体处理物、或者该微生物来源的肽生成酶，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生产二肽。另外，只要具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性，上述或者下述表1等中所示微生物来源的、具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质也可以使用。

上述微生物产生的肽生成酶具有以L-氨基酸酯和L-氨基酸为底物生成二肽的活性。

使上述微生物产生的肽生成酶作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法可以是在培养上述微生物时，直接将底物加入培养液中；也可以在培养结束后，通过离心将菌体与培养液或微生物培养物分离后，将菌体直接或洗净后再悬浮于缓冲液中，然后加入L-氨基酸酯和L-氨基酸使其进行反应。或者，可以使用由聚丙烯酰胺凝胶法、角叉菜胶法、藻酸凝胶法等已知方法固定化的菌体。

此外，破碎的菌体、丙酮处理的菌体、冷冻干燥的菌体也可以作为微生物菌体的处理物使用。菌体的破碎可以采用超声波破碎、French压力破碎、玻璃珠破碎等方法，而在溶菌的场合，采用蛋白溶菌酶、肽酶处理或将其适当组合的方法。

也可以进一步从该微生物菌体处理物回收肽生成酶，作为粗酶液使用，还可以根据需要，将酶纯化后使用。普通的酶纯化方法可以用于由培养物纯化酶。具体是通过以下操作对上述的肽生成酶进行纯化：通过离心分离等收集菌体；用超声波处理、玻璃珠、电动磨等机械方法破碎菌体；离心分离除去细胞碎片等固形物，得到粗酶；然后进行超离心分级、盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析、疏水性层析等。

还要说明，所说的“微生物来源的肽生成酶”，不仅包括由该微生物菌体处理物通过上述纯化步骤所得的酶，还包括通过使该酶的基因在异源或同源的宿主中表达、或通过基因工程的方法所生产的酶。

亦即，只要是具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的部分，酶和含酶物都可使用。这里所说的“含酶物”是指含有酶的物质，具体的形式包括产生该酶的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、菌体处理物等。微生物的培养物是指培养微生物得到的物质，更具体的是指微生物菌体、培养该微生物所用的培养基、以及由培养的微生物所生成的物质的混合物。此外，也可以将微生物菌体洗净，作为洗净的菌体使用。还有，菌体处理物包括将菌体破碎、溶菌、冷冻干燥后的处理物，还包括将菌体等处理后回收的粗酶、进一步纯化的精制酶等。用各种纯化方法所得的部分纯化的酶等也可以作为纯化处理的酶使用，还可以使用通过共价结合法、吸附法、包埋法等固定化的固定化酶。此外，根据所用的微生物，在培养中有一部分发生溶菌现象，所以，在这种情况下，培养液的上清也可以作为含酶物而利用。

另外，在使用培养物、培养菌体、洗净菌体、破碎菌体或溶菌所得的菌体处理物的场合，大多数存在与肽的生成无关的、分解生成的肽的酶，在这种情况下，有时优选添加金属酶抑制剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)的金属蛋白酶抑制剂。添加量为0.1mM-100mM的范围，优选为1mM-50mM。

酶或含酶物的使用量只要是能达到目的效果的量(有效量)就可以，对于本领域的技术人员来说，通过简单的预备实验很容易求得，例如，用于洗净菌体的场合为每升反应液1-500g。

在该肽生成酶的底物特异性方面，只要能与L-氨基酸生成二肽，任何一种L-氨基酸酯都可使用，例如，L-氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯、正丁酯、异丁酯和叔丁酯。此外，不仅对应于天然型的L-氨基酸的氨基酸酯可以使用，而且对应于非天然型的氨基酸或其衍生物的L-氨基酸酯也可以使用。本发明中，可优选用作L-氨基酸酯的有：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-酯二甲基酯、L-谷氨酰胺-γ-酯。

在该肽生成酶的底物特异性方面，对于L-氨基酸无特别的限定，只要是能与L-氨基酸酯生成二肽的L-氨基酸，已知的L-氨基酸都可以使用。优选用于本发明的L-氨基酸有：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸等，特别优选L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。

每种用作出发原料的L-氨基酸酯和L-氨基酸的浓度为1mM-10M，优选0.05M-2M，但有时优选L-氨基酸对L-氨基酸酯的添加量之比为等量以上。此外，必要时，例如，在高浓度的底物抑制反应的场合，可以将反应中的底物调至无抑制的浓度，然后逐步添加。

反应温度为3-70℃、优选5-50℃，反应pH为2-12、优选3-11。这样，通过进行约2-48小时的反应，反应混合物中生成并积累了二肽。生成的二肽按常规的方法回收，并根据需要进行纯化。

实施例

以下，通过实施例进一步说明，但本发明不受这些实施例的限制。另外，实施例中的L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-天冬酰胺用高效液相色谱法(柱：Inertsil ODS-2(GL Science公司生产)，洗脱液：磷酸水溶液(pH2.2，5.0mM 1-辛烷磺酸钠溶液/甲醇＝100/15)，流量：1.0ml/min，检测：210nm)进行定量。

(实施例1)添加EDTA对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成的影响

在500ml的坂口氏烧瓶中，加入50ml每升含有5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g胨的培养基(pH7.0)，在115℃下灭菌15分钟。然后接种1铂金环已在含有同样组成的斜面培养基(琼脂：20g/L，pH7.0)上，30℃下培养了24小时的恶臭假单胞菌FERM BP-8101株，在30℃、120次往复/分钟下振动培养17小时。培养后，离心分离菌体，然后悬浮于100mM的硼酸缓冲液(pH9.0)中，制备成100g/L的湿菌体。分别取1ml，加入1ml未添加EDTA，或含20mM EDTA的含有200mML-丙氨酸乙酯盐酸盐、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)(底物溶液)中，使总量为2ml，然后在30℃反应1小时。结果，在未添加EDTA的区域，生成4.9mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在添加EDTA的区域，生或10.1mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

另外说明，在上述反应体系中，用1ml100mM的硼酸缓冲液(pH9.0)代替菌体悬浮液加入1ml底物溶液中(未添加菌体区域)；和用1ml不含L-丙氨酸乙酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的、未添加EDTA或含有20mMEDTA的100mM的硼酸缓冲液(pH9.0)代替底物溶液，加入菌体悬浮液中(未添加底物区域)，任何一种条件下都未见生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

(实施例2)用氨基酸酯作为底物

在1ml含有20mMEDTA和200mM下述的L丙氨酸酯盐酸盐、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH 9.0)中，分别加入1ml与实施例1同样地制备的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)FERM BP-8101株的菌体悬浮液湿菌体(100g/L)，总量调整至2ml后，在30℃反应1小时。结果，用L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物时，生成14.9mM的L-丙氨酰L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸乙酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物时，生成11.4mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物时，生成0.5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

(实施例3)用L-氨基酸作为底物

在1ml含有20mM EDTA和200mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐、以及400mM L-谷氨酰胺或L-天冬酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)中，分别加入1ml与实施例1同样地制备的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)FERM BP-8101株的菌体悬浮液湿菌体(100g/L)，总量调整至2ml后，在30℃反应1小时。结果，用L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺为底物时，生成12.7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-天冬酰胺为底物时，生成4.8mM的L-丙氨酰-L-天冬酰胺。

(实施例4)生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的微生物

用下述的培养基进行微生物培养：1升中1含有5g葡萄糖、5g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10g酵母提取物和10g胨的培养基(pH7.0)，取50ml加入500ml的坂口氏烧瓶中，在115℃下灭菌15分钟。在上述培养基中接种1铂金环表1所示的已在1升中含有5g葡萄糖、10g酵母提取物和10g胨的斜面琼脂培养基(琼脂2g/L，pH7.0)上、30℃下培养了24小时的细菌，在30℃、120次往复/分下振动培养17小时。培养后，离心分离菌体，然后悬浮于含10mM EDTA的0.1M的硼酸缓冲液(pH9.0)中，制备成100g/L的湿菌体。在0.1ml的这些微生物菌体悬浮液中，分别加入0.1ml含有10mM EDTA、200mM L-丙氨酸甲基酯盐酸盐、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)，总量调整为0.2ml后，在25℃下反应2小时。这时的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的生成量(mM)如表1所示。

表1

微生物	Ala-Gln(mM)
微生物	Ala-Gln(mM)	枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13286恶臭假单胞菌(Psudomonas putida)FERM BP-8101	1.17.214.8

(实施例5)温度对L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)生成的影响

在1ml含有10mM EDTA、200mML-丙氨酸甲酯盐酸盐、以及400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)中，分别加入1ml按照实施例4的微生物培养法制备的恶臭假单胞菌FERM BP-8101株的菌体悬浮液(100g/L)，将总量调至2ml后，分别在20℃、30℃、40℃下反应1小时，结果如表2所示。在用恶臭假单胞菌FERM BP-8101株的场合，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的生成量在40℃下为最高值。

表2

微生物	生成的Ala-Gln(mM)
	生成的Ala-Gln(mM)			20℃	30℃	40℃
	恶臭假单胞菌(Psudomonas putida)FERM BP-8101	8.2	16.9	20℃	30℃	40℃	20.8

(实施例6)谷氨酸棒杆菌(Corynebavterium glutamicum)ATCC13286菌株的肽生成酶的纯化和用纯化的酶生产L-丙氨酰L-谷氨酰胺

在5L的坂口氏烧瓶中，加入500ml每升含有5g甘油、5g酵母提取物、5g胨、5g氯化钠、5g L-丙氨酰胺盐酸盐的培养基，在120℃下灭菌20分钟。然后按5％(V/V)接种已在含有同样组成的培养基中培养了20小时的谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株的培养液，在30℃、120次往复/分钟下振动培养20小时。通过离心分离，从8升该培养液收集菌体。然后在冰上或4℃下进行以下的操作。用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)将菌体洗净后，用直径为0.1mm的玻璃珠破碎处理约10分钟。将玻璃珠与菌体破碎液分离，在20,000×g下离心30分钟，除去菌体碎片，得到无细胞提取液。进一步在200,000×g下超离心60分钟，除去不溶部分，得到可溶性的上清液部分。在所得的可溶性部分中，加入硫酸铵，使其达到60％饱和的浓度，通过20,000×g下离心30分钟，回收沉淀。用少量的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)溶解沉淀，并对50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析。将此酶溶液加到用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)预平衡的Q-Sepharose HP柱上，然后用含0-1.0M氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度将酶洗脱。收集活性部分，加到用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)预平衡的Superdex 200pg柱上，然后用同样的缓冲液将酶洗脱。收集活性部分，对含0.5M磷酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析后，加到用含有0.5M硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)预平衡的Phenyl-Sepharose HP柱上，用含0.5-0M硫酸铵的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度将酶洗脱。收集活性部分，对50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行透析，并将其加到用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)预平衡的MonoQ柱上，然后用含0-1.0M氯化钠的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)的线性浓度梯度将酶洗脱。这样，纯化得到电泳纯的精制的肽生成酶。

本精制酶的比活性为9.841U/mg，通过这些纯化步骤，该精制的肽生成酶的比活性提高至约246倍。此外，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定本精制酶标准品的结果，在计算分子量为42,000-46,000的位置，检测到均一的条带。另外，酶的滴度按以下所述进行。加入200μmol Tris-HCl缓冲液(pH9.0)、50μmol L-丙氨酰胺和适量的酶液，使总体积为1ml，并混合，30℃反应60分钟后，加入4ml磷酸水溶液(pH2.1)终止反应。生成的丙氨酸通过高效液相色谱进行定量，在1分钟内生成1μmol L-丙氨酸的酶量定义为1个单位(U)。

将上述精制的酶加入含有EDTA、L-丙氨酸甲酯盐酸盐以及L-谷氨酰胺(或L-天冬酰胺)的硼酸缓冲液中，使其总体积为1ml，并混合(终浓度：酶的添加量按丙氨酰胺分解活性计为2单位(U)、EDTA10mM、L-丙氨酸甲酯盐酸盐100mM、L-谷氨酰胺200mM(或L-天冬酰胺200mM)、硼酸缓冲液100mM)，30℃反应4小时(另外说明，酶的单位数不表示由L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性，而是简单地表示分解L-丙氨酰胺的活性)。此时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成量为50.2mM，L-丙氨酰-L-天冬酰胺的生成量为49.8mM。

(实施例7)谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株的肽生成酶基因的分离及其在大肠杆菌(E.coli)中的表达

以下，对谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株的肽生成酶基因的分离及其在大肠杆菌中的表达进行描述。基因的分离、表达都用大肠杆菌JM109作为宿主，pUC18用作载体。

1.根据确定的氨基酸序列制备PCR引物

根据实施例1所得的谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株的肽生成酶的N末端氨基酸序列(序列表的序列号1)，制备分别示于序列表的序列号2、3的引物的混合引物。

2.菌体的获得

将谷氨酸棒杆菌ATCC 13286株在CM2Gly琼脂培养基(0.5g/dl甘油、1.0g/dl酵母提取物、1.0g/dl胨、0.5g/dlNaCl、2g/dl琼脂、pH7.0)上，30℃培养24小时，使菌活化。然后将1白金环的该菌接入含有50mlCM2Gly液体培养基的坂口氏烧瓶中，30℃下好气振荡培养16小时。

3.由菌体获得染色体DNA

将50ml培养液离心(12,000rpm，4℃，15分钟)，收集菌体。将该菌体悬浮于10ml含20mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，通过离心回收菌体。再将该菌体悬浮于10ml含20mMEDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。在该悬浮液中加入0.5ml20mg/ml的溶菌酶溶液、1ml 10％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液后，在55℃温育20分钟。然后在该温育的溶液中，加入等量用含1mMEDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)饱和的酚，以除去蛋白。在分离的水层中，加入等量的异丙醇，使DNA沉淀并回收。沉淀的DNA溶于0.5ml含20mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)后，加入5μl 10mg/ml的RNase、5μl 10mg/ml的蛋白酶K，55℃反应2小时。反应后，该溶液中加入等量用含1mM EDTA的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)饱和的酚，以除去蛋白。再在分离的水层中加入等量24∶1的氯仿/异戊醇并搅拌，回收水层。该操作再进行2次后，在所得的水层中，加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)，使其终浓度为0.4M，再加入2倍体积的乙醇。回收生成的DNA沉淀，用70％的乙醇洗净后使其干燥，然后溶于1ml含1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。

4.用序列盒式PCR法获得含有肽生成酶基因的一部分的DNA片段

采用TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(宝酒造公司生产)，用盒式PCR法分离、扩增含有编码肽生成酶的基因(aah)的DNA分子。以下，除非预先说明，否则实验按照说明书的方法进行。序列盒式PCR法中，以引物1(第1轮PCR，序列表的序列号2)和引物2(第2轮PCR，序列表的序列号3)作为引物的场合，扩增与EcoR I序列盒之间的约0.5kb的条带(片段1)。通过测定该片段的碱基序列，证实片段1为aah的一部分。

5.由基因库克隆肽生成酶的基因

下面，为了获得全长的aah，首先以片段1作为探针进行Southern杂交。将用作探针的DNA片段调整至50ng/μl，使用DIG High Prime(Boehring Mannheim)、按照其提供的方案在37℃温育24小时，对16μl的该DNA溶液进行探针标记。

1μg染色体DNA用各种限制酶的组合进行消化、并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳后，印迹在带正电的尼龙膜(Boehring Mannheim，带正电的尼龙膜)上。按照以下常规的方法进行Southern杂交。杂交用DIG Easy Hyb(Boehring Mannheim)进行，50℃、30分钟进行预杂交后，加入探针，然后在50℃杂交18小时。用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehring Mannheim)进行检测。

结果，BglII的酶切产物中，在约7kb的位置检测出条带。回收该7kb范围的片段并连接到pUC18上，用大肠杆菌JM109生产成文库(120株)，按照以下的常规方法进行菌落杂交：将菌落转印至尼龙膜(Boehring Mannheim，用于菌落和噬菌斑杂交的尼龙膜)上，然后进行碱变性、中和、固定化的处理。杂交用DIG Easy Hyb进行。将滤膜浸入缓冲液中，42℃下预杂交30分钟，然后加入上述标记的标记探针，42℃杂交18小时。用SSC缓冲液洗净后，用DIG NucleotideDetetion Kit选出1株阳性克隆。

6.谷氨酸棒杆菌ATCC 13286来源的肽生成酶基因的碱基序列

按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)中所述的方法，制备选出的转化体中含有的质粒，测定其与探针杂交部分及其附近部分的碱基序列，其中存在编码含有肽生成酶氨基酸序列N末端30个残基的蛋白质的读码框(ORF)，证实为编码肽生成酶的基因aah。肽生成酶基因全长的碱基序列如序列表的序列号4所示。所得的ORF与已知的丙酸杆菌属(Propionibacterium)细菌来源的脯氨酸亚氨肽酶(Proline iminopeptidase)的碱基序列有57.6％的同源性。另外说明，同源性的数值是用Genetyx所得的值(以下同本实施例)。

7.肽生成酶基因在大肠杆菌中的表达

为了使aah在大肠杆菌中表达，构建了将aah连接在pUC18的lac启动子下游的质粒pUCAAH。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13286的染色体DNA为模板、表3所示的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增得到片段，用Sac I、Sma I处理该片段并与pUC18的Sac I、Sma I的酶切物连接后，转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性株中选出含有目的质粒的菌株，构建的表达质粒命名为pUCAAH。

表3 由于构建肽生成酶基因的表达载体的引物

引物	序列
引物	序列	5’端	GGC GAGCTCGGGCAGTGGTGGGGGTGGTGTSac I 序列号6
3’端	CGG GGGCCCTCAGCGTACCTCTCGGCCGTGSma I 序列号7	5’端	GGC GAGCTCGGGCAGTGGTGGGGGTGGTGTSac I 序列号6

将含有pUCAAH并表达肽生成酶的大肠杆菌转化体接种于含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃培养16小时。在装入50mlLB培养基的500ml坂口氏烧瓶中，接种上述预培养液1ml，在37℃培养。培养2小时后，加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，再继续培养3小时。

培养结束后，收集菌体、洗净、悬浮于10ml的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，180W、超声破碎30分钟。回收溶液，12,000g离心10分钟，其上清为无细胞提取液。

(实施例8)肽生成酶活性的测定

1.谷氨酸棒杆菌ATCC 13286来源的酶活性

按以上所述完成培养后，制备无细胞提取液用作酶源，测定肽生成酶的活性。肽生成酶活性的测定方法如下：含100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐、150mM L-谷氨酰胺、100mM硼酸缓冲液(pH9.0)、10mMEDTA和酶溶液的反应液，在30℃温育60分钟后，添加4倍体积的磷酸(pH1.5)使其停止反应。用HPLC定量测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量。对于酶活性的单位(U)，1单位(U)定义为在该条件下，1分钟内产生1μmol的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性。

分析所用的HPLC的条件如下：

柱：Inertsil ODS-2

移动相：(磷酸水溶液(pH 2.1))，2.5mM 1-辛磺酸钠/甲醇＝10/1

柱温度：40℃

流速：1.0ml/分

检测：UV 210nm

结果，在导入了pUC18AAH的情况下，检测出由L-丙氨酸甲酯盐酸盐合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性为0.54U/mg，证实克隆的aah基因在大肠杆菌中表达。另外，作为对照，在仅导入pUC18的情况下，未检测到活性。

2.His-Tag肽生成酶基因在大肠杆菌中的表达

为了使aah在大肠杆菌中表达，构建了在pUC18的启动子下游以His-Tag蛋白的形式表达肽生成酶的质粒pQEAAH。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13286的染色体DNA为模板、表4所示的寡核苷酸为引物，通过PCR扩增得到片段，用Sac I、Sma I处理该片段并与pQE-30(Qiagen公司)的Sac I、Sma I的酶切物连接后，转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性株中选出含有目的质粒的菌株，构建的表达质粒命名为pQEAAH。

表4 用于构建His-Tag肽生成酶表达载体的引物

引物	序列
引物	序列	5’端	GGC GAG CTC ATG ACT AAA ACA CTT GGT TCCSac I 序列号6
3’端	CGG GGG CCC TCA GCG TAC CTC TCG GCC GTGSma I 序列号7	5’端	GGC GAG CTC ATG ACT AAA ACA CTT GGT TCCSac I 序列号6

用实施例8同样的方法测定含有pQEAAH并表达肽生成酶的大肠杆菌转化体的活性时，所显示的肽生成酶活性为5.28U/mg。

3.His-Tag精制酶的生产

按上述的方法破碎由150ml含有pQEAAH的大肠杆菌JM109的培养液得到的菌体，用His Trap Kit(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)，按照其提供的方案纯化His-TagL-丙氨酰胺水解酶。得到24mg SDS-PAGE上单一条带的蛋白质。该精制酶由L-丙氨酸甲酯盐酸盐合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的比活为148.3U/mg，相对于L-丙氨酸甲酯盐酸盐为50.7％。

4.用His-Tag精制酶进行的底物特异性研究

用His-Tag精制酶进行由获得的肽生成酶合成除L-丙氨酰-L-谷氨酰胺之外的肽的研究。

由L-丙氨酸甲酯和其他L-氨基酸合成肽合成反应按下述方法进行：含100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐、150mM被测氨基酸、100mM硼酸缓冲液(pH9.0)、10mMEDTA和酶溶液(0.05U/ml)的反应液在25℃下温育3小时，生成的肽用HPLC定量。结果，用L-天冬酰胺作为L-氨基酸时，生成22.34mM的L-丙氨酰-L-天冬酰胺；用甘氨酸时，生成5.66mM的L-丙氨酰-甘氨酸；用L-丙氨酸时，生成10.63mM的L-丙氨酰-L-丙氨酸；用L-亮氨酸时，生成13.73mM的L-丙氨酰-L-亮氨酸；用L-蛋氨酸时，生成48.80mM的L-丙氨酰-L-蛋氨酸；用L-脯氨酸时，生成1.02mM的L-丙氨酰-L-脯氨酸；用L-苯丙氨酸时，生成16.13mM的L-丙氨酰-L-苯丙氨酸；用L-色氨酸时，生成15.31mM的L-丙氨酰-L-色氨酸；用L-丝氨酸时，生成26.14mM的L-丙氨酰-L-丝氨酸；用L-苏氨酸时，生成24.23mM的L-丙氨酰-L-苏氨酸；用L-酪氨酸时，生成0.96mM的L-丙氨酰-L-酪氨酸；用L-赖氨酸时，生成7.91mM的L-丙氨酰-L-赖氨酸；用L-精氨酸时，生成24.87mM的L-丙氨酰-L-精氨酸；用L-组氨酸时，生成23.16mM的L-丙氨酰-L-组氨酸；以及用L-谷氨酸时，生成1.11mM的L-丙氨酰-L-谷氨酸。

(2)由其他L-氨基酸甲酯和L-谷氨酰胺合成肽

用L-丙氨酸甲酯以外的氨基酸甲酯进行反应。

合成反应按下述方法进行：含100mM被测氨基酸甲酯、150mM L-谷氨酰胺、100mM硼酸缓冲液(pH9.0)、10mM EDTA和酶溶液(0.05U/ml)的反应液在25℃下温育3小时，生成的肽用HPLC定量。结果，用甘氨酸甲酯作为L-氨基酸甲酯时，生成52.19mM的甘氨酰-L-谷氨酰胺；用L-缬氨酸甲酯时，生成5.94mM的L-缬氨酰-L-谷氨酰胺；用异亮氨酸甲酯时，生成0.59mM的L-异亮氨酰-L-谷氨酰胺；用L-蛋氨酸甲酯时，生成4.31mM的L-蛋氨酰-L-谷氨酰胺；用L-苯丙氨酸甲酯时，生成3.67mM的L-苯丙氨酰-L-谷氨酰胺；用L-丝氨酸甲酯时，生成40.44mM的L-丝氨酰-L-谷氨酰胺；用L-苏氨酸甲酯时，生成3.85mM的L-苏氨酰-L-谷氨酰胺；用L-谷氨酰胺甲酯时，生成0.23mM的L-谷氨酰-L-谷氨酰胺；用L-酪氨酸甲酯时，生成1.24mM的L-酪氨酰-L-谷氨酰胺；用L-精氨酸甲酯时，生成6.52mM的L-精氨酰-L-谷氨酰胺；用L-天冬氨酸-α-甲酯时，生成8.22mM的L-天冬氨酰-α-L-谷氨酰胺。此外，也证实了L-亮氨酸甲酯、或L-天冬酰胺甲酯、或L-赖氨酸甲酯、或L-天冬氨酸-β-甲酯、或L-天冬氨酸-α，β-二甲酯、或L-谷氨酸-γ-甲酯用作氨基酸甲酯的场合，生成了由对应的氨基酸和L-谷氨酰胺形成的肽(因为未能获得标准品，所以未进行定量)。

(3)脯氨酸亚氨肽酶(pepI)活性的测定方法

用反应液(组成：50mM硼酸缓冲液(pH9.0)，5mM EDTA，1mM脯氨酸2-萘酰胺(proline-pNA))，在30℃下进行反应。萘酰胺的释放速度按照405nm的吸光度增加来测定(ε＝9.83)。1分钟内释放出1μmol萘酰胺的活性定义为1单位(U)。

精制的脯氨酸亚氨肽酶的活性为5.83×10³U/mg。

(实施例9)恶臭假单胞菌ATCC 12633株脯氨酸亚氨肽酶(pepI)基因的分离和在大肠杆菌中的表达

1.脯氨酸亚氨肽酶(pepI)基因部分片段的获得

用实施例的3同样的方法，由恶臭假单胞菌ATCC 12633的培养菌体(50ml培养)分离DNA。

另一方面，根据在Genbank中公开的恶臭假单胞菌ATCC12633株脯氨酸亚氨肽酶的部分碱基序列(AF032970)制备合成的DNA寡聚物

(序列号10：GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A、和序列号11：GGC GGA TC AGG TCG CCG CGT TCT TC)，用此寡聚物作为引物，用TaKaRa LA(宝酒造公司生产)通过PCR法扩增基因的部分片段。

2.由基因库克隆全长的脯氨酸亚氨肽酶基因

为了获得全长的恶臭假单胞菌ATCC 12633的脯氨酸亚氨肽酶基因(pepI)，首先，用上述部分片段作为探针，用实施例7的第5部分所述的方法同样进行Southern杂交。结果，在XhoI的酶切物中检测出位于约2.8kb的条带。然后，回收该条带范围的片段并与pUC18的SalI位点连接，制备大肠杆菌JM109文库(100株)。按实施例同样的方式进行菌落杂交，筛选出1株阳性克隆。

3.恶臭假单胞菌ATCC 12633的脯氨酸亚氨肽酶基因的碱基序列

按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)所述的方法，制备筛选出的转化体所含有的质粒，测定其与探针杂交部分及其附近部分的碱基序列，其中存在编码由337个氨基酸构成的蛋白的读码框(ORF)，证实已获得了全长的该基因。脯氨酸亚氨肽酶基因全长的碱基序列示于序列表的序列号14。

另外，所得的ORF显示出与已知的棒杆菌属细菌来源的脯氨酸亚氨肽酶碱基序列有46.3％的同源性；与恶臭假单胞菌PA01的脯氨酸亚氨肽酶有82.4％的同源性。

4.脯氨酸亚氨肽酶基因在大肠杆菌中的表达

为了使脯氨酸亚氨肽酶(pepI)在大肠杆菌中表达，构建了将pepI连接在pUC18的lac启动子下游的质粒pUCPPPEPI。以染色体DNA为模板、序列号9、11所示的寡核苷酸(序列号9：GGC GGA TCC GGTGCT CAA AGC GCA A；序列号11：CAC GCG CTG CAG CAA ACCCCT CAT)

为引物，通过PCR扩增得到片段，对该片段进行处理并与pUC18的酶切物连接后，转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素的抗性株中筛选出含有目的质粒的菌株，构建的表达质粒命名为pUCPPPEPI。

将含有pUCPPPEPI的大肠杆菌转化体接种于含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下培养16小时。在装入50ml LB培养基的500ml坂口氏烧瓶中，接种入1ml该预培养液，37℃下进行正式培养。在培养开始2小时后，加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，再继续培养3小时。

培养结束后，收集菌体、洗净、悬浮于10ml的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，180W、超声破碎30分钟。回收溶液，12,000g离心10分钟，其上清为无细胞提取液。结果，只有导入pUCPPPEPI的场合才能检测出脯氨酸亚氨肽酶的活性(1.21×10³U/mg)，证实克隆的pepI已在大肠杆菌中的表达。

(实施例10)用恶臭假单胞菌ATCC 12633菌株的脯氨酸亚氨肽酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

1.恶臭假单胞菌ATCC 12633株中的脯氨酸亚氨肽酶的检测

将恶臭假单胞菌ATCC 12633株在L液体培养基中30℃下培养过夜，得到菌体。将所得的菌体悬浮于0.1M硼酸缓冲液(pH9.0)、10mMEDTA中，用作酶液。另外，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性按下述的酶活性测定法进行测定。用含有0.1M硼酸缓冲液(pH9.0)、10mMEDTA、100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐、以及150mM L-谷氨酰胺的反应溶液在30℃进行酶反应，通过HPLC定量测定反应过程中生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。1分钟内生成1μmol L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活性定义为1单位(U)。

检测得每1ml培养液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性为0.051U。

2.由表达脯氨酸亚氨肽酶的大肠杆菌合成L-丙氨酰L-谷氨酰胺

用上述的无细胞提取液测定其L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性。结果，在导pUCPPPEPI的场合，检测出7.88U/mg的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性，由此证实克隆的pepI基因是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶的基因。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大积累量为25mM。

(实施例11)恶臭假单胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亚氨肽酶(pepI)基因的分离和在大肠杆菌中的表达

1.脯氨酸亚氨肽酶(pepI)基因片段的获得

为了获得恶臭假单胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亚氨肽酶基因(pepI)，按实施例1同样的方法，由恶臭假单胞菌FERM BP-8123株的培养菌体(50ml培养)分离DNA。

另一方面，用实施例9中扩增的恶臭假单胞菌ATCC 12633株的pepI基因部分片段作为探针，首先，按实施例9第5部分的同样的方法进行Southern杂交。结果，在pstI的酶切物中，检测到位于约6.5kb的条带。

随后，回收该6.5kb范围的片段并与pUC18的pstI位点连接，用大肠杆菌JM109制成文库(200株)。用与实施例同样的方法进行菌落杂交，选出2株阳性克隆。

2.恶臭假单胞菌FERM BP-8123株脯氨酸亚氨肽酶基因的碱基序列

按照Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor press(1989)所述的方法，制备选出的转化体所含有的质粒，测定其与探针杂交及其附近部分的碱基序列，其中存在编码由323个氨基酸组成的蛋白质的读码框(ORF)，由此证实己获得了全长的该基因。脯氨酸亚氨肽酶基因全长的碱基序列如序列表的序列号16所示。所得的ORF与恶臭假单胞菌ATCC 12633株的脯氨酸亚氨肽酶基因有83％的同源性，氨基酸序列有85％的同源性。

3.脯氨酸亚氨肽酶基因在大肠杆菌中的表达

为了使pepI在大肠杆菌中表达，构建了将pepI连接在pUC18的lac启动子的下游的质粒pUCAAH。以染色体DNA为模板、序列号12、13所示的寡核苷酸(序列号12：CCC GAA TTC TTA CGG AGCGCG CAA TG，序列号13：CGG GGA TCC CTT CAT GCT TCT TCAGG)为引物，通过PCR扩增得到片段，对该片段进行处理并与pUC18的酶切物连接后，转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性株中筛选出含有目的质粒的菌株，构建的表达质粒命名为pUCPGPEPI。

按照与实施例8同样的方法，用含有pUCPGPEPI的大肠杆菌转化体制成无细胞提取液、测定其脯氨酸亚氨肽酶活性时，检测到活性(3.48×10¹U/mg)，证实了克隆的pepI基因已在大肠杆菌中表达。

(实施例12)用恶臭假单胞菌FERM BP-8123菌株的脯氨酸亚氨肽酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

1.恶臭假单胞菌FERM BP-8123菌株的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性的检测

与实施例10同样地培养恶臭假单胞菌FERM BP-8123株，测定其酶活性。测得每1ml培养液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性为0.054U。

2.L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶活性的检测

用含有pUCPGPEPI的大肠杆菌转化体的无细胞提取液，测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性。结果，在导入pUCPGPEPI的场合，测得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性为0.470U/mg，证实了pepI基因是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成酶基因。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大积累量为30mM。

(实施例13)用凝结芽孢杆菌EK01株的具有脯氨酸亚氨肽酶活性的酶合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺

用东洋纺公司的市售凝结芽孢杆菌EK01株的精制酶(3.93×105U/mg)，按实施例10所公开的方法测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性。结果，测得活性为52.0U/mg，证实该脯氨酸亚氨肽酶是具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成活性的酶。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的最大积累量为18mM。

(实施例14)抑制剂对获得的酶活性的影响

研究了抑制剂对获得的脯氨酸亚氨肽酶的影响。用含有0.1M硼酸缓冲液(pH9.0)、10mM EDTA、100mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐、150mML-谷氨酰胺、以及1mM抑制剂的反应溶液在30℃进行30分钟的酶反应，然后测定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成。对凝结芽孢杆菌EK01株、恶臭假单胞菌ATCC12633株、恶臭假单胞菌FERM BP-8123株，在加入1mM的NEM(N-乙基马来酰亚胺)时，酶活性即儿乎完全被抑制。此外，加入1mM IAA(碘乙酰胺)时，酶活性会降低至某种程度。另一方面，添加1mM的PMSF(苯基甲基磺酰氟)时，对活性没有影响。对于谷氨酸棒杆菌ATCC 13286，其活性不受所研究的任何一种抑制剂的影响。

(序列表说明)

序列号1：谷氨酸棒杆菌来源的肽生成酶的N末端氨基酸序列

序列号2：PCR引物

序列号3：PCR引物

序列号4：谷氨酸棒杆菌来源的肽生成酶的编码序列

序列号5：谷氨酸棒杆菌来源的肽生成酶的氨基酸序列

序列号6：引物

序列号7：引物

序列号8：引物

序列号9：引物

序列号10：引物

序列号11：引物

序列号12：引物

序列号13：引物

序列号14：恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的肽生成酶的编码序列

序列号15：恶臭假单胞菌ATCC 12633来源的肽生成酶的氨基酸序列

序列号16：恶臭假单胞菌FERM BP-8123来源的肽生成酶的编码序列

序列号17：恶臭假单胞菌FERM BP-8123来源的肽生成酶的氨基酸序列

产业上的应用可能性

根据本发明的二肽生产方法，不必通过复杂的合成方法，即可用价格低廉且容易获得的L-氨基酸酯和L-氨基酸生产二肽，有可能降低用作医药原料、功能性食品等的二肽的生产成本。此外，根据本发明的二肽生产方法，用各种不同种类的氨基酸酯和氨基酸为原料，可以生成各种类型的二肽。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法

<130>PAMA-14174

<150>JP Patent Application 2001-226568

<151>2001-07-26

<150>JP Patent Application 2001-310547

<151>2001-10-05

<160>17

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>1

Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu

1 5 10 15

Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Xaa Arg Xaa Glu Xaa

20 25 30

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：盒式PCR引物1

<400>2

gghwsnytbc arytbgarga ratyac 26

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：盒式PCR引物2

<400>3

carytbgarg aratyacbyt bacbytb 27

<210>4

<211>1307

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(57)..(1295)

<400>4

ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt ccacccctgc gcgtaacctg ggaagc atg 59

Met

1

act aaa aca ctt ggt tcc ctt caa ctt gaa gaa att acc ttg acg ctc 107

Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr Leu

5 10 15

cct ctg act gaa gat gtg gcc gat gaa cgc acc att gat gtg ttc gca 155

Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe Ala

20 25 30

cgc att gcc aca cgc gtc ggt ggg gaa gac ctt cca tat tta gta ttc 203

Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val Phe

35 40 45

ctg cag ggt ggg cct ggc aat gaa gct cca cgt cca agc ctt aat ccc 251

Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn Pro

50 55 60 65

ctc aac ccc aat tgg ttg ggc gtg gcc ttg gag gaa tac cgc gtg gtc 299

Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val Val

70 75 80

atg ttg gat caa cgt ggc acc ggc cgt tcc acc cca gtg ggt aat gat 347

Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn Asp

85 90 95

att ttg gaa aaa ccc aca gca gaa gta gtg gag tac tta tcc cac ctg 395

Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His Leu

100 105 110

cgc gca gat ggc att gtg cga gat gct gaa gcc ctg cgt aag cat ttg 443

Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His Leu

115 120 125

ggt gtg aat cag tgg aac ctt tta ggc cag tcc ttc gga ggt ttc acc 491

Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe Thr

130 135 140 145

acc ctg cat tac ttg tcc cgg cac gcc gat tcc ttg gac aac gtg ttt 539

Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val Phe

150 155 160

att acc ggc ggt ctc agc gct att gat cgc cca gca gaa gac gtg tat 587

Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val Tyr

165 170 175

gcc aac tgt tac aac cgc atg cgc cga aac tct gag gaa ttc tac cgt 635

Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr Arg

180 185 190

cgc ttc ccg caa tta cgg gaa act ttc cga ggg ttg gtt aat cgt gct 683

Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg Ala

195 200 205

cgc gcc ggg gag att gtg ctt ccc acc ggc gaa gtt gtg tca gaa acc 731

Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu Thr

210 215 220 225

agg ctg cga tcc ctt ggt cac ttg ttg ggt agc aat gac ggc tgg ttt 779

Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Phe

230 235 240

gat ctg tac aac ctg ctg gaa tta gat ccc acc tcc aac gct ttt gtc 827

Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe Val

245 250 255

cat gac ctg gca gga ctt ttg cct ttc ggc aac cgc aac cca att tat 875

His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile Tyr

260 265 270

tac gtg ctc cat gag tcc tct tac gcc gac ggt gtg gtg aca aat tgg 923

Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn Trp

275 280 285

gca gca gag cgt gtg ctt cca gag gat ttc cgc gag gat cca aca ctg 971

Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr Leu

290 295 300 305

ctc acc ggt gag cac gtg ttc cag gag tgg aca gac acc gtg ccg tcg 1019

Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro Ser

310 315 320

ctc aag ccg tgg aag gac gtt gcc ctg gca ttg gct cag cag gaa tgg 1067

Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu Trp

325 330 335

ccc aag ctt tat gat gcg aag gca ttg gaa aac tca cag gcc aag ggc 1115

Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys Gly

340 345 350

gct gca gca gtg tat ghc aat gac gtt ttc gtc cca gtg gat tac tct 1163

Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr Ser

355 360 365

ctg gaa acc gca caa cac ctg ccc ggt gtg cag ctg ttt atc acc agc 1211

Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr Ser

370 375 380 385

cag cat gaa cac aat gga ctt cgt gcc agc tca ggc gca gta ctg rag 1259

Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu Xaa

390 395 400

cac ctt ttc gat ctg gcc cac ggc cga gag gta cgc tgagggcccc cg 1307

His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg

405 410

<210>5

<211>413

<212>PRT

<213>谷氨酸棒杆菌

<400>5

Met Thr Lys Thr Leu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Glu Ile Thr Leu Thr

1 5 10 15

Leu Pro Leu Thr Glu Asp Val Ala Asp Glu Arg Thr Ile Asp Val Phe

20 25 30

Ala Arg Ile Ala Thr Arg Val Gly Gly Glu Asp Leu Pro Tyr Leu Val

35 40 45

Phe Leu Gln Gly Gly Pro Gly Asn Glu Ala Pro Arg Pro Ser Leu Asn

50 55 60

Pro Leu Asn Pro Asn Trp Leu Gly Val Ala Leu Glu Glu Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Met Leu Asp Gln Arg Gly Thr Gly Arg Ser Thr Pro Val Gly Asn

85 90 95

Asp Ile Leu Glu Lys Pro Thr Ala Glu Val Val Glu Tyr Leu Ser His

100 105 110

Leu Arg Ala Asp Gly Ile Val Arg Asp Ala Glu Ala Leu Arg Lys His

115 120 125

Leu Gly Val Asn Gln Trp Asn Leu Leu Gly Gln Ser Phe Gly Gly Phe

130 135 140

Thr Thr Leu His Tyr Leu Ser Arg His Ala Asp Ser Leu Asp Asn Val

145 150 155 160

Phe Ile Thr Gly Gly Leu Ser Ala Ile Asp Arg Pro Ala Glu Asp Val

165 170 175

Tyr Ala Asn Cys Tyr Asn Arg Met Arg Arg Asn Ser Glu Glu Phe Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Pro Gln Leu Arg Glu Thr Phe Arg Gly Leu Val Asn Arg

195 200 205

Ala Arg Ala Gly Glu Ile Val Leu Pro Thr Gly Glu Val Val Ser Glu

210 215 220

Thr Arg Leu Arg Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp

225 230 235 240

Phe Asp Leu Tyr Asn Leu Leu Glu Leu Asp Pro Thr Ser Asn Ala Phe

245 250 255

Val His Asp Leu Ala Gly Leu Leu Pro Phe Gly Asn Arg Asn Pro Ile

260 265 270

Tyr Tyr Val Leu His Glu Ser Ser Tyr Ala Asp Gly Val Val Thr Asn

275 280 285

Trp Ala Ala Glu Arg Val Leu Pro Glu Asp Phe Arg Glu Asp Pro Thr

290 295 300

Leu Leu Thr Gly Glu His Val Phe Gln Glu Trp Thr Asp Thr Val Pro

305 310 315 320

Ser Leu Lys Pro Trp Lys Asp Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln Gln Glu

325 330 335

Trp Pro Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asn Ser Gln Ala Lys

340 345 350

Gly Ala Ala Ala Val Tyr Xaa Asn Asp Val Phe Val Pro Val Asp Tyr

355 360 365

Ser Leu Glu Thr Ala Gln His Leu Pro Gly Val Gln Leu Phe Ile Thr

370 375 380

Ser Gln His Glu His Asn Gly Leu Arg Ala Ser Ser Gly Ala Val Leu

385 390 395 400

Xaa His Leu Phe Asp Leu Ala His Gly Arg Glu Val Arg

405 410

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

ggcgagctcg ggcagtggtg ggggtggtgt 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>7

cgggggccct cagcgtacct ctcggccgtg 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>8

ggcgagctca tgactaaaac acttggttcc 30

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>9

ggcggatccg gtgctcaaag cgcaa 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>10

ggcggatcag gtcgccgcgt tcttc 25

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>11

cacgcgctgc agcaaacccc tcat 24

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>12

cccgaattct tacggagcgc gcaatg 26

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>13

cggggatccc ttcatgcttc ttcagg 26

<210>14

<211>2078

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌

<220>

<221>CDS

<222>(486)..(1496)

<400>14

agatctggcg cccgtatcac ggcacccttc ggcgcgaact ggaccggttg cgcgagcagt 60

ttggctatgc cctgttgtgg gatgcccact cgatccgctc gcacatcccg cacctgttcg 120

atggcaagtt gccggacttc aacctgggta ccttcaatgg cgccagctgc gatccggtgc 180

tggccgagcg gttgcagggc gtgtgcgccg aagcgacagg ttacagtcat gtgttgaatg 240

gtcggttcaa aggcggacac atcacccggc actatggtga ccccgcgaag catatccatg 300

cggtgcagct ggagttggcg caaagcacgt acatggagga aaccgagccg tttacctacc 360

gggaagacct ggcgcaaccg acgcaggtgg ttctgaagca gcttttgcaa gcgctgctgg 420

cttggggggc agaacgatac cagcgttgag tggaagaggc ggtgctcaaa gcgcaattca 480

ggttt atg atg ccc aac ggc agt caa tat cct cac acg gag tgc gca atg 530

Met Met Pro Asn Gly Ser Gln Tyr Pro His Thr Glu Cys Ala Met

1 5 10 15

cag acc ctc tac ccg cag atc aaa ccc tac gcc cgg cac gat ctg gcc 578

Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Arg His Asp Leu Ala

20 25 30

gtg gaa gcg ccg cat gtg ctg tat gtc gat gaa agc ggc tcg ccg gaa 626

Val Glu Ala Pro His Val Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro Glu

35 40 45

ggt ctg ccc gtg gta ttc atc cac ggt ggc ccg ggt gct ggc tgc gac 674

Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys Asp

50 55 60

gcc cag agc cgt tgc tac ttt gac ccc aac ctg tac cgc atc atc acc 722

Ala Gln Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Ile Thr

65 70 75

ttc gac cag cgc ggc tgt ggc cgc tcc acg ccc cat gcc agc ctg gag 770

Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro His Ala Ser Leu Glu

80 85 90 95

aac aac aca acc tgg cac ctg gtc gag gac ctg gag cgc atc cgc gag 818

Asn Asn Thr Thr Trp His Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ile Arg Glu

100 105 110

cac ctg ggc atc gac aaa tgg gtg ctg ttc ggc ggc tcg tgg ggt tcg 866

His Leu Gly Ile Asp Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly Ser

115 120 125

acc ctg gcc ctg gcc tac gcc cag acc cac ccc gag cgt gtg cat ggg 914

Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Glu Arg Val His Gly

130 135 140

ctg atc ctg cgg ggc atc ttc ctg tgc cgg ccg cag gag atc gag tgg 962

Leu Ile Leu Arg Gly Ile Phe Leu Cys Arg Pro Gln Glu Ile Glu Trp

145 150 155

ttc tac cag gag ggc gcc agc cgc ctg ttc ccc gac tac tgg cag gac 1010

Phe Tyr Gln Glu Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln Asp

160 165 170 175

tac atc gcg ccg att ccg ccg gaa gaa cgc ggc gac ctg gtc aag gcc 1058

Tyr Ile Ala Pro Ile Pro Pro Glu Glu Arg Gly Asp Leu Val Lys Ala

180 185 190

ttc cac aag cgc ctc acc ggt aac gat cag att gcc cag atg cac gcc 1106

Phe His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His Ala

195 200 205

gcc aag gcg tgg tct acc tgg gag ggc cgt acc gcc acc ctg cgc ccg 1154

Ala Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Pro

210 215 220

aac ccg ctg gtg gtc gac cgc ttc tcc gag ccg cag cgg gcg ctg tcg 1202

Asn Pro Leu Val Val Asp Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu Ser

225 230 235

atc gcc cgg atc gag tgc cac tac ttc atg aac aac gcc ttc ctc gaa 1250

Ile Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Met Asn Asn Ala Phe Leu Glu

240 245 250 255

ccg gac cag ttg atc cgc gac ctg ccg aag atc gcc cac ctg cca gcg 1298

Pro Asp Gln Leu Ile Arg Asp Leu Pro Lys Ile Ala His Leu Pro Ala

260 265 270

gtg atc gtg cac ggt cgc tat gac gtg atc tgt ccg ctg gac aac gcc 1346

Val Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Val Ile Cys Pro Leu Asp Asn Ala

275 280 285

tgg gcc ctg cac cag gcc tgg ccg aac agc gaa ctg aag gtg atc cgc 1394

Trp Ala Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Lys Val Ile Arg

290 295 300

gac gcc ggc cac gcc gcg tcc gag ccg ggc atc acc gat gcc ctg gtg 1442

Asp Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu Val

305 310 315

cgg gca gcc gac cag atg gcc cgg cgc ctg ctc gac ctg ccc ctg gaa 1490

Arg Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Leu Glu

320 325 330 335

gaa gca tgaggggttt gctgcagcgc gtgcgcggtg cgcgggttga agtggcgggg 1546

Glu Ala

caggtggttg gcgcgatcga ccagggtttg ctggtgctgg tggccgtcga gcctgaagat 1606

tcccgcgagc aggccgataa gctgttgcac aagctgctga actaccgtgt attcagcgat 1666

gagcacggca agatgaacct gtcgctcaag gatgtcgggg gtggtttgtt gctggtgtcg 1726

cagttcacct tggcggcgga cacccgcaac ggcatgcgtc cgagcttctc gacggcagcg 1786

ccgccggccc tcggggctga attgttcgac tatcttttgc agcaagcgaa gcgccagcat 1846

gccgacgtgg cgagcgggca attcggggca gacatgcagg tgcatctggt caatgatggc 1906

cccgtaacat ttatgttaca aatatgaggt caaaaaaccc tttgtttata ggaaaacaag 1966

gggttttgta cgataaatag ttgttccagc ctgatgcgtt gtcacgcgac ctgctggata 2026

atcgcgcgct gcatggacct gcgttcgcag gttcgtttca ctctgactcg ag 2078

<210>15

<211>337

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>15

Met Met Pro Asn Gly Ser Gln Tyr Pro His Thr Glu Cys Ala Met Gln

1 5 10 15

Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Ala Arg His Asp Leu Ala Val

20 25 30

Glu Ala Pro His Val Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro Glu Gly

35 40 45

Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys Asp Ala

50 55 60

Gln Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Ile Thr Phe

65 70 75 80

Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro His Ala Ser Leu Glu Asn

85 90 95

Asn Thr Thr Trp His Leu Val Glu Asp Leu Glu Arg Ile Arg Glu His

100 105 110

Leu Gly Ile Asp Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly Ser Thr

115 120 125

Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Glu Arg Val His Gly Leu

130 135 140

Ile Leu Arg Gly Ile Phe Leu Cys Arg Pro Gln Glu Ile Glu Trp Phe

145 150 155 160

Tyr Gln Glu Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln Asp Tyr

165 170 175

Ile Ala Pro Ile Pro Pro Glu Glu Arg Gly Asp Leu Val Lys Ala Phe

180 185 190

His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His Ala Ala

195 200 205

Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Pro Asn

210 215 220

Pro Leu Val Val Asp Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu Ser Ile

225 230 235 240

Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Met Asn Asn Ala Phe Leu Glu Pro

245 250 255

Asp Gln Leu Ile Arg Asp Leu Pro Lys Ile Ala His Leu Pro Ala Val

260 265 270

Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Val Ile Cys Pro Leu Asp Asn Ala Trp

275 280 285

Ala Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Lys Val Ile Arg Asp

290 295 300

Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu Val Arg

305 310 315 320

Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Leu Glu Glu

325 330 335

Ala

<210>16

<211>1360

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌

<220>

<221>CDS

<222>(311)..(1279)

<400>16

ctggaagggt tcttggcgtg gggccagaag cactacacct gagtcaacga ggatcaaaat 60

gtgggagcgg gcttgtcagg tcgccgcatc gccgcgatgg cggtctgtca gttcccaata 120

tgtcgactga tccgccgcta tcgcgagcaa gcccgctccc acacgtggtg cgcgaacctt 180

cctggctgat cactgacaca ggtctaagtc ctcaaggaca tgctcattgc acaattcggg 240

tttatgatgc cagacggcaa aataatagac gtccccccag ggatggaccc gaccccttac 300

ggagcgcgca atg cag act ttg tac ccg cag atc aaa ccc tac gtc cgg 349

Met Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Val Arg

1 5 10

cac gat ctg gcc gtc gat gaa acc cac acg ctg tat gtc gac gaa agt 397

His Asp Leu Ala Val Asp Glu Thr His Thr Leu Tyr Val Asp Glu Ser

15 20 25

ggt tcc ccg caa ggt ttg ccc gtg gtc ttc atc cat ggc ggt ccc ggc 445

Gly Ser Pro Gln Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly

30 35 40 45

gcc ggc tgc gat gcc aat agc cgc tgc tat ttc gat ccg aac ctg tac 493

Ala Gly Cys Asp Ala Asn Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr

50 55 60

cgc atc gtc acc ttt gac cag cgc ggc tgc ggg cgc tcc act ccg cgg 541

Arg Ile Val Thr Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro Arg

65 70 75

gcc agc ctg gaa aac aac acc acc tgg gac ctg gtt gcc gac ctt gag 589

Ala Ser Leu Glu Asn Asn Thr Thr Trp Asp Leu Val Ala Asp Leu Glu

80 85 90

cgc att cgc gag cac ctg ggg att gaa aaa tgg gtg ctg ttc ggt ggt 637

Arg Ile Arg Glu His Leu Gly Ile Glu Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly

95 100 105

tcc tgg ggc tcg acc ctg gcc ctg gcc tat gca caa acc cac cct gat 685

Ser Trp Gly Ser Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Asp

110 115 120 125

cgc gtg ctt ggc ctg att gtg cgc ggc atc ttc ctg gcc cgc ccc cag 733

Arg Val Leu Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Phe Leu Ala Arg Pro Gln

130 135 140

gat atc cag tgg ttc tac cag gcc ggc gcg agc cgc ctg ttc ccg gac 781

Asp Ile Gln Trp Phe Tyr Gln Ala Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp

145 150 155

tac tgg cag gac tac atc gcg cca atc ccg gcg gaa gag cgc cac gac 829

Tyr Trp Gln Asp Tyr Ile Ala Pro Ile Pro Ala Glu Glu Arg His Asp

160 165 170

atg atc agc gcc tac cac aag cgc ctg acc ggc aat gac cag atc gcc 877

Met Ile Ser Ala Tyr His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala

175 180 185

cag atg cat gcc gcc aag gcc tgg tcc acc tgg gaa ggc cgc atg ctc 925

Gln Met His Ala Ala Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Met Leu

190 195 200 205

ggc ctg tgc ccc agc ccg cag ctg atc gag cgc ttc tcc gag ccc cag 973

Gly Leu Cys Pro Ser Pro Gln Leu Ile Glu Arg Phe Ser Glu Pro Gln

210 215 220

cgc gcg ttg tcg att gcg cgc atc gag tgc cac tac ttc acc aat aac 1021

Arg Ala Leu Ser Ile Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Thr Asn Asn

225 230 235

tcg ttc ctg gag ccc aac cag ctg att cgc gat atg cac aag atc gcc 1069

Ser Phe Leu Glu Pro Asn Gln Leu Ile Arg Asp Met His Lys Ile Ala

240 245 250

cat ctg ccg ggg atc atc gtg cat ggc cgc tac gat atg atc tgc ccg 1117

His Leu Pro Gly Ile Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Met Ile Cys Pro

255 260 265

ctg gat aat gcc tgg gag ctg cac cag gcc tgg ccg aac agt gag ttg 1165

Leu Asp Asn Ala Trp Glu Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu

270 275 280 285

cag gtg atc cgc gag gcg ggc cac gcg gcg tcc gag ccg ggc atc acc 1213

Gln Val Ile Arg Glu Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr

290 295 300

gat gcg ctg gtg cgt gcg gcg ggc gat atg gca cga cgc ctg ctt gat 1261

Asp Ala Leu Val Arg Ala Ala Gly Asp Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp

305 310 315

ctg ccc cct gaa gaa gca tgaagggcct ttttgccnna cgggtgcgtg 1309

Leu Pro Pro Glu Glu Ala

320

gcgccgggtc agtggcgggc aagtggtggg cgcgatagac cagggttgca g 1360

<210>17

<211>323

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<400>17

Met Gln Thr Leu Tyr Pro Gln Ile Lys Pro Tyr Val Arg His Asp Leu

1 5 10 15

Ala Val Asp Glu Thr His Thr Leu Tyr Val Asp Glu Ser Gly Ser Pro

20 25 30

Gln Gly Leu Pro Val Val Phe Ile His Gly Gly Pro Gly Ala Gly Cys

35 40 45

Asp Ala Asn Ser Arg Cys Tyr Phe Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Val

50 55 60

Thr Phe Asp Gln Arg Gly Cys Gly Arg Ser Thr Pro Arg Ala Ser Leu

65 70 75 80

Glu Asn Asn Thr Thr Trp Asp Leu Val Ala Asp Leu Glu Arg Ile Arg

85 90 95

Glu His Leu Gly Ile Glu Lys Trp Val Leu Phe Gly Gly Ser Trp Gly

100 105 110

Ser Thr Leu Ala Leu Ala Tyr Ala Gln Thr His Pro Asp Arg Val Leu

115 120 125

Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Phe Leu Ala Arg Pro Gln Asp Ile Gln

130 135 140

Trp Phe Tyr Gln Ala Gly Ala Ser Arg Leu Phe Pro Asp Tyr Trp Gln

145 150 155 160

Asp Tyr Ile Ala Pro Ile Pro Ala Glu Glu Arg His Asp Met Ile Ser

165 170 175

Ala Tyr His Lys Arg Leu Thr Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln Met His

180 185 190

Ala Ala Lys Ala Trp Ser Thr Trp Glu Gly Arg Met Leu Gly Leu Cys

195 200 205

Pro Ser Pro Gln Leu Ile Glu Arg Phe Ser Glu Pro Gln Arg Ala Leu

210 215 220

Ser Ile Ala Arg Ile Glu Cys His Tyr Phe Thr Asn Asn Ser Phe Leu

225 230 235 240

Glu Pro Asn Gln Leu Ile Arg Asp Met His Lys Ile Ala His Leu Pro

245 250 255

Gly Ile Ile Val His Gly Arg Tyr Asp Met Ile Cys Pro Leu Asp Asn

260 265 270

Ala Trp Glu Leu His Gln Ala Trp Pro Asn Ser Glu Leu Gln Val Ile

275 280 285

Arg Glu Ala Gly His Ala Ala Ser Glu Pro Gly Ile Thr Asp Ala Leu

290 295 300

Val Arg Ala Ala Gly Asp Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp Leu Pro Pro

305 310 315 320

Glu Glu Ala

Claims

1.下述(E)或(F)所示的蛋白质：

(E)具有序列表的序列号17所述的氨基酸序列的蛋白质；

(F)具有在序列表的序列号17所述的氨基酸序列中，有1个或多个置换、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸的氨基酸序列，并具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质。

2.下述(e)或(f)所述的DNA：

(e)由序列表的序列号16所述的碱基号311-1279的碱基序列构成的DNA；

(f)在严格的条件下，与由序列表的序列号16所述的碱基序列中碱基号311-1279的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交，并且编码具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA。

3.根据权利要求2所述的DNA，其中严格的条件是在相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度、60℃下进行洗涤的条件。

4.一种重组DNA，其中插入了根据权利要求2-3的任何一项所述的DNA。

5.一种导入了根据权利要求2-3的任何一项所述的DNA的转化细胞，其中的DNA按照能使其编码的蛋白质表达的方式导入。

6.一种二肽生成酶的生产方法，其特征在于将权利要求5中所述的转化细胞在培养基中培养，使具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质在培养基和/或转化细胞中积累。

7.一种生产二肽的方法，其特征在于用权利要求5所述的转化细胞生成的，具有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽。

8.根据权利要求7所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

9.根据权利要求7所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

11.一种生产二肽的方法，其特征在于使具有如权利要求1所述的由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽活性的蛋白质作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸，合成二肽。

12.根据权利要求11所述的生产二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质来源于属于棒杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属中的任何一种微生物。

13.根据权利要求11所述的生产二肽的方法，其特征在于其中具有脯氨酸亚氨肽酶活性的蛋白质来源于谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌、凝结芽孢杆菌中的任何一种微生物。

14.根据权利要求11所述的生产二肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

15.根据权利要求12所述的生产肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

16.根据权利要求13所述的生产肽生产方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述1种或2种的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α、β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

17.根据权利要求11-16的任何一项所述的生产肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述的1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。

18.一种生产二肽的方法，其特征在于该方法使用属于棒杆菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属，并具有如权利要求1所示的有由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的微生物培养物、从该培养物分离的菌体、该微生物的菌体处理物，由L-氨基酸酯和L-氨基酸生产二肽。

19.根据权利要求18所述的生产肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸酯选自下述的1种或2种以上的L-氨基酸酯：L-丙氨酸酯、甘氨酸酯、L-缬氨酸酯、L-异亮氨酸酯、L-蛋氨酸酯、L-苯丙氨酸酯、L-丝氨酸酯、L-苏氨酸酯、L-谷氨酰胺酯、L-酪氨酸酯、L-精氨酸酯、L-天冬氨酸-α-酯、L-天冬氨酸-β-酯、L-亮氨酸酯、L-天冬酰胺酯、L-赖氨酸酯、L-天冬氨酸-α，β-二甲酯和L-谷氨酰胺-γ-酯。

20.根据权利要求18所述的生产肽的方法，其特征在于其中的L-氨基酸选自下述的1种或2种以上的L-氨基酸：L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸。