CN1749402A - 新的醛缩酶及光学活性ihog及莫那亭的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在莫那亭制备中有用的光学活性IHOG的制备方法，光学活性莫那亭的制备方法，以及用于该方法的醛缩酶。本发明可以从吲哚丙酮酸和丙酮酸(或者草酰乙酸)合成作为光学活性monatin(莫那亭)的合成中有用的中间体的高光学纯度的4－(吲哚－3－基甲基)－4－羟基－2－氧代戊二酸。
Description
技术领域
本发明涉及生成作为莫那亭(音译：monatin)前体的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-氧代戊二酸(IHOG)的新型醛缩酶、以及使用该醛缩酶的4R-IHOG的制备方法、以及4R-莫那亭的制备方法。
背景技术
下述结构式所示的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸(3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁烷-4-基-吲哚)(以下称为“莫那亭”)包含在植物Schlerochiton ilicifolius的根部，并且由于其具有非常高的甜味强度，因而是一种特别值得期待的用作低热量甜味剂的化合物(参阅特开昭64-25757号公报)。
4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸
上述莫那亭存庄2个不对称碳原子(2位、4位)，并且已经报道了其立体异构体为(2S，4S)异构体。还确认了其他3种立体异构体的存在，并且确认其中任何一种都具有数十倍到数千倍于蔗糖的甜味强度(表1)。
表1
| 光学异构体 | 甜味度(相对于蔗糖) |
| 2R，4R | 2700倍 |
| 2R，4S | 1300倍 |
| 2S，4R | 300倍 |
| 2S，4S | 50倍 |
如表1所示，不仅(2S，4S)-莫那亭，其他的立体异构体也均分别具有高倍率的甜味度，尤其是(2R，4R)-莫那亭的甜味度极高(为蔗糖的2700倍)，是一种最值得期待的作为甜味剂或甜味剂组分(甜味料)的异构体。因此，希望开发一种高效地生成(2R，4R)-莫那亭的方法。
本发明者们开发了一种新的莫那亭的合成方法，该方法包括使用可购得的试剂吲哚丙酮酸和丙酮酸，进行下述反应(a)和(b)(专利文献1)。
(a)通过吲哚丙酮酸和丙酮酸(或者草酰乙酸)的羟醛缩合合成前体酮酸(IHOG)的反应步骤
(b)IHOG的2位的氨基化反应步骤
吲哚-3-丙酮酸 IHOG 莫那亭
专利文献1公开了作为可以在上述莫那亭合成路线中(a)的羟醛缩合反应中由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或者草酰乙酸)得到前体酮酸(IHOG)的酶，其是来源于腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)及晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)的醛缩酶。这些醛缩酶，除了IHOG之外，还可以催化生成4-苯甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)等酮酸的反应。
在IHOG中存在4R体和4S体两种异构体，但是为了有效生成甜味度最高的异构体(2R，4R)-莫那亭，优选在上述莫那亭的合成路线的(a)羟醛缩合反应中，优先生成4R异构体的IHOG(以下称为“4R-IHOG”，称4S异构体为“4S-IHOG”。)，从而得到富含4R异构体的IHOG。此外，手性分子往往是每一种异构体显示出不同的生理活性，IHOG，也存在每一种异构体显示出不同生理活性的可能，可以认为分别生成的4R异构体和4S异构体，以用于除莫那亭之外的其他的用途，也是非常有利的。因此，研发优先生成4R-IHOG、4S-IHOG中的一种异构体的方法，在工业上是非常有用的。
[专利文献1]WO03/056026A
[专利文献2]WO04/018672A
发明内容
本发明要解决的问题
但是，在现有的化学合成中，生成的IHOG为4R异构体与4S异构体的混合物(外消旋体)。此外，虽然本发明者得到了作为适合IHOG合成的醛缩酶的、来自腐臭假单胞菌的醛缩酶，但是通过该醛缩酶生成的IHOG并非富含4R异构体，并且可清楚看出通过该反应条件，对生成富含4S体的IHOG的影响甚微。(专利文献1、专利文献2)。并且迄今为止，尚未报道优先生成4R-IHOG的醛缩酶。因此，现状是尚没有确立有效生成4R-IHOG，特别是富含4R异构体的IHOG的方法。
鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种制备PHOG及IHOG，特别是4R-IHOG的新型醛缩酶，以及使用该醛缩酶的IHOG的制备方法，以及莫那亭的制备方法。
解决问题的方法
本发明者们为解决上述问题进行了积极的研究，结果发现，在某些微生物中，存在可以适合用于合成作为目标的4R-IHOG的醛缩酶，以及通过使用该醛缩酶，制备4R-IHOG及4R-莫那亭的制备方法。
即，本发明包含如下内容
[1]一种4R-IHOG或其盐的制备方法，其特征在于：
使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸或草酰乙酸与下述(a)或(b)任何一项所述的蛋白质，或者含有这些蛋白质的微生物作用
(a)由序列号2所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
从而生成光学纯度为70％或以上的下式(1)所示的(4R)-4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(4R-IHOG)或其盐。
[2]一种4R-莫那亭或其盐的制备方法，其特征在于，该方法包括：
第1步使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸或草酰乙酸与下述(a)或(b)任何一项所述的蛋白质，或者含有这些蛋白质的微生物作用
(a)由序列号2所述的氨基酸序列构成的蛋白质，或者，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
从而优先生成4R-IHOG或其盐；以及
第2步将通过上述第1步骤得到的4R-IHOG或其盐的羧基转化为氨基，得到光学纯度为90％或以上的下式(2)所示的4R-莫那亭或其盐。
(式中，波浪线的键表示同时包含R-构型和S-构型的键)
[3]如[2]所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其中在上述第2步骤中，羧基向氨基的转化是在作用于4R-IHOG的酶作用下通过氨基化来进行的。
[4]如[2]所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其中，上述第2步骤中，羧基向氨基的转化采取如下步骤实现：
将反应液中所包含的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸，在中性或碱性条件下，与下述通式(3)所示的胺化合物或其盐反应
H2N-O-R···(3)
(在上述通式(3)中，R表示氢原子、烷基、芳基或芳烷基)
生成下式(4)所示的4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸(IHOG-肟)，将所生成的IHOG-肟或其盐的4R体结晶，还原所得到的IHOG的4R异构体或其盐，生成光学纯度为90％或以上的4R-莫那亭或其盐。
[5]如[4]所述的4R-莫那亭的制备方法，其中上述通式(3)所表示的胺化合物为选自羟基胺、甲氧基胺、苄氧基胺的至少一种胺化合物。
[6]如[4]或[5]所述的4R-莫那亭的制备方法，其特征在于IHOG的4R异构体或其盐是在氢或加氢催化剂存在下实施的。
[7]如[4]～[6]任一项所述的4R-莫那亭及其盐的制备方法，其特征在于在上述第2步骤中，通过结晶提取(2R，4R)-莫那亭。
[8]如[4]～[7]任一项所述的4R-莫那亭及其盐的制备方法，其特征在于在上述第2步骤中，使用水、醇溶剂或含水醇溶剂作为结晶溶剂。
[9]如[4]～[8]任一项所述的制备方法，其中上述方法中所使用的蛋白质为来源于选自鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)或伯克氏菌属(Burkholderia sp.)的细菌的微生物的蛋白质。
[10]如[9]所述的制备方法，其特征在于上述微生物为鞘氨醇单胞菌属鞘氨醇单胞菌AJ 110329株或AJ 110372株、伯克氏菌AJ 110371株。
[11]下述(a)～(c)任一项所述的蛋白质，
(a)包含序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
(c)具有序列表的序列号2所示氨基酸的序列中包含1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位的的氨基酸序列，且具有缩醛活性的蛋白质。
[12]如[11]所述的蛋白质，其中，与序列号2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质为序列号13或者15的任一项所示的蛋白质。
[13]编码[11]或[12]任一项所述的蛋白质的DNA。
[14]下述(d)或(e)的DNA，
(d)包含序列号1所述的碱基序列或该序列中210～1004位的碱基序列的DNA，
(e)与包含序列号1所述的碱基序列或该序列中210～1004位的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA。
[15]如[14]所述的DNA，其中序列号1所述的碱基序列或该序列中210～1004位的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA，是(f)序列号12所述的碱基序列或该序列中399～1253位的碱基序列的DNA，或者由(g)序列号14所述的碱基序列或该序列中531～1385位的碱基序列的DNA中的任何一种DNA。
[16]一种重组DNA，其特征在于：该重组DNA是通过[14]或[15]任一项所述的DNA与载体DNA连接得到的。
[17]由[16]所述的重组DNA转化的细胞。
[18]一种具有醛缩酶活性的蛋白质的制备方法，其特征在于将如[17]所述的细胞在培养基中培养，使具有醛缩酶活性的蛋白质在培养基和/或细胞中积累。
发明的效果
通过使用本发明的醛缩酶，可以由吲哚丙酮酸和丙酮酸(或者草酰乙酸)优先生成4R-IHOG。并且，由于可以通过对生成的4R-IHOG进行氨基化，从而生成4R-莫那亭，因此可以非常有利地用于高甜味度莫那亭的制备中。
并且，在现有技术中，在需要从外消旋的IHOG(4R、4S-IHOG)中分离4R异构体时，必须将4R、4S-IHOG肟化，并使所得到的4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸(以下称为“IHOG-肟”)与手性胺作用以结晶4R异构体的IHOG-肟(以下称为“4R-IHOG-肟”)。与此相反的是，由于根据本发明可以在羟醛缩合阶段生成富含4R异构体的IHOG，因而在结晶时不需要使用手性胺进行光学分辨，并且可以在肟化之后，直接使4R-IHOG-肟结晶。因此，可以减少4R-IHOG的纯化处理过程。
实施本发明的最佳方式
通过本发明者们的研究，确认了存在某些微生物菌株，其产生具有优先合成4R-IHOG活性的醛缩酶，并发现了一种4R-IHOG和4R-莫那亭的制备方法。
下面，依次参照附图对本发明中的
[I]光学活性IHOG的制备方法
[II]光学活性莫那亭的制备方法
进行详细的说明。
[I]光学活性IHOG的制备方法
(1)反应
对本发明的4R-IHOG的制备方法进行说明。本发明的4R-IHOG的制备方法是：
通过使下式(5)所示的吲哚丙酮酸
与下式(6)所示的丙酮酸或者草酰乙酸进行反应，
(式中，R为氢原子或羧基)
优先制备如下式(1)所示的4R-IHOG的方法，
其特征在于，反应在催化该反应的蛋白质存在下进行。
上述所谓的“催化反应的蛋白质”，优选为具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，但也可以是来源于微生物的蛋白质或化学合成的蛋白质。即，所谓4R-醛缩酶活性，是指能够催化通过上述通式(5)所示的吲哚丙酮酸与上述通式(6)所表示的丙酮酸或者草酰乙酸的羟醛缩合，优先生成上述通式(1)所示的4R-IHOG的反应，和/或，由苯基丙酮酸与丙酮酸优先生成4R-PHOG的反应的活性。如果是这样的蛋白质，对其并无特别的限定，均可用于本发明中。在本发明书中，所谓“优先地制备4R-IHOG”，是指所生成的IHOG的4位的光学纯度而言，形成R异构体的比例比形成S异构体比例高，优选R异构体的光学纯度可以达到70％或以上，特别优选90％或以上的反应效率。虽然光学纯度会因为反应的各种条件的不同而改变，但是本领域技术人员可以容易地设定反应的最适合的反应条件，因此，能够在最合适的条件附近达到上述比例的方法包括在本发明的方法中，即使在反应条件被改变的情况下有可能不能达到上述比例。此外，基于适当调整4R异构体与4S异构体混合比例的目的，通过使用可以在本发明中使用的蛋白质、调整反应条件，光学纯度等于或小于上述情况的反应，也包括在本发明的方法中。并且，4R-IHOG的光学纯度可以作为对映体过量率(％e.e)通过([4R-IHOG]-[4S-IHOG])/([4R-IHOG]+[4S-IHOG])*100来确定。
作为催化该反应的蛋白质，优选后述(2)中具有醛缩酶活性的蛋白质一项中的醛缩酶。当反应时，可以使用通过培养生成催化该反应的蛋白质(醛缩酶)的细菌而得到的醛缩酶，也可以使用通过重组DNA技术制备生成催化该反应的蛋白质的转化子，通过培养该转化子得到的醛缩酶。
催化该反应的蛋白质只要能够催化优先合成4R-IHOG的反应，可以以任何形式添加到反应体系中。即，可以将催化该反应的蛋白质以单质形式加入到反应体系中，也可以以具有醛缩酶活性的、包含催化该反应的蛋白质(醛缩酶)的组合物的形式加入到反应体系中。
其中，所谓“具有醛缩酶活性的组合物”，只要是包含催化该反应的蛋白质(醛缩酶)的组合物即可，具体的说，包括可以通过培养物、培养基(从培养物中除去菌体的物质)、菌体(包含培养菌体、洗净菌体的任一种)、破裂菌体得到的或溶菌所得的菌体处理物、以及通过纯化上述培养基和/或细胞得到的具有醛缩酶活性的组合物(粗酶液、纯化酶液)等。例如，在使用通过醛缩酶产生菌或者重组DNA转化的细胞制备光学活性IHOG的情形中，在培养的同时，可以将直接底物添加到培养液中，还可以使用由培养液分离出的菌体、洗净菌体等的任何一种。并且，也可以直接使用经破裂或溶菌得到的处理物，也可以从该菌体处理物中回收醛缩酶，以粗酶液的形式使用，另外，也可以对酶进行纯化后使用。即，只要是具有醛缩酶活性的组分，就可以以任何一种形态用于本发明的4R-IHOG的制备方法中。
在使用醛缩酶或具有醛缩酶活性的组合物进行羟醛缩合反应时，可以将包含吲哚丙酮酸、和丙酮酸或草酰乙酸、催化该反应的蛋白质或醛缩酶的反应液调节到20～50℃的适当温度，保持pH为6～12，可以静置、振荡或搅拌30分钟～5天。
其中，在使其更立体选择性地生成IHOG的情况下，也可以通过抑制自羟醛缩合，达到使其以更高的选择性生成目的4R-IHOG的。其中，作为实例，可以列举的有通过使吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸进行羟醛缩合生成IHOG的情况。在pH值偏碱性，例如在pH为9～12的条件下使其进行反应，自发羟醛缩合。通过该自羟醛缩合生成的IHOG在4位的立体选择性差，得到的是4R与4S的混合物(外消旋体)。因此，在本发明的一个具体实例中，在使催化反应的蛋白质发生作用时，通过将反应pH控制为pH9-pH7，更优选控制在pH8.7-pH8附近，能够抑制自发的IHOG的生成，另一方面，通过该蛋白质4R-IHOG选择性地羟醛缩合，其结果是能够提高所生成的IHOG的4R选择性。对于这种反应条件，本领域技术人员可以通过简单的预检测完成对反应条件的设定。
并且，可以认为本发明所公开的醛缩酶属于通过加入2价阳离子增加酶活性的，所谓II类醛缩酶。其中，加入到反应体系中的2价阳离子的浓度，由于对自羟醛缩合的进行产生影响，因而也能够影响产物IHOG的4位立体选择性。对于加入到反应体系中的2价阳离子的类型和浓度，只要是本领域技术人员，均可以通过简单的预试验决定其适宜的条件。
并且，也可以通过将Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+等2价阳离子加入到该反应液中以提高反应速度。从成本的方面考虑，优选使用Mg2+。其中，在将2价阳离子加入到反应液中时，只要不对反应产生阻碍，可以使用任何一种盐，优选MgCl2、MgSO4、MnSO4等。对于这些2价阳离子的加入浓度，只要是本领域技术人员，均可以通过简单的预试验决定，以加入Mg2+作为2价阳离子的情形为例，优选使所加入的Mg2+为1mM或以下，优选为0.5mM或以下，更优选为0.1mM或以下，从而抑制自发的IHOG的缩合速率，结果是可以提高在醛缩酶作用下生成IHOG4R的选择性。
下面，列举实施本发明的取代IHOG的制备方法时优选的反应条件的一个实例，在100mM缓冲剂、300mM吲哚-3-丙酮酸、600mM丙酮酸、0.1mMMgCl2、1％(v/v)甲苯组成的反应液中，加入10％(v/v)作为酶源的表达醛缩酶的大肠杆菌的洗净菌体，通过在37℃温度下振荡4小时，得到4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。
可以通过公知的方法对所生成的IHOG进行分离纯化。例如，可以列举的有：通过使其与离子交换树脂接触吸附碱性氨基酸、将其洗脱后结晶的方法或者洗脱后，通过活性炭等进行脱色过滤后结晶方法。此外，还可以将包含所生成的IHOG的反应溶液直接用于下面的反应步骤中。
再列举一个实例是：根据本发明的方法生成IHOG的情形中，4S-IHOG与4R-IHOG的生成比是例如，以300mM的吲哚-3-丙酮酸与600mM的丙酮酸作为底物，在0.1mM MgCl2的存在下，在pH值为8.7～8.0的反应条件下，根据SpALD可以确认以4∶96的比例生成4S-IHOG与4R-IHOG(参阅实施例12)。并且，如果将这样得到的含4R-IHOG反应液经后述肟化反应后进行结晶，4R-IHOG-肟4位的光学纯度可以达到90％或以上。并且，由于使用羟胺其将IHOG转化为IHOG-肟的反应不具有4位的光学选择性，因而光学纯度的测定在以任一种方式测定的情况中都是相同的。这样得到的4R-IHOG是一种非常适用于制备4R-莫那亭的中间体。
(2)具有醛缩酶活性的蛋白质(醛缩酶)
本发明的制备方法中所使用的具有4R-醛缩酶活性的蛋白质(以下简称为“4R-醛缩酶”)是具有催化上述反应的性质的物质，4R-醛缩酶还可以由具有4R-醛缩酶活性的微生物得到，该微生物可以通过如下筛选法获得。
(i)具有4R-醛缩酶活性的微生物
(a)具有4R-醛缩酶活性的微生物的筛选方法
具有4R-醛缩酶活性的微生物可以从土壤、水等自然界获得。即，可以将作为目的醛缩酶底物的莫那亭、IHOG、IHOG-肟、PHG、PHOG、PHOG-肟等作为碳源或氮源，优选作为单一碳源或者单一氮源，加入到培养基中，接种作为微生物源的样品，进行培养。此外，这些添加物也可以使用外消旋的混合物，优选使用4R-异构体，更优选使用(2R，4R)-莫那亭。作为除碳源之外的有机营养源，可以适当地选择常规的培养基成分。作为氮源，可以使用有机铵盐、硝酸盐、及蛋白胨、酵母提取物、肉提取物等有机氮化合物及其混合物。除此之外，还可以对无机盐、微量金属盐、维生素类等常用的营养源进行适当混合。可以在这样的富集培养中生长的微生物包含较多醛缩酶活性菌。
接着，从上述培养基富集的菌中得到单克隆，确认所得到的单克隆再次在目标底物作为单一碳源的培养板上生长，评价醛缩酶活性。筛选时的培养条件，除了上述碳源之外，可以使用常规的培养条件，可以列举的一个实例为后述(c)具有醛缩酶活性的微生物的培养方法一项中所述的条件。
作为微生物产生的醛缩酶活性的评价方法，优选由微生物菌体中纯化酶通过使用该酶标准品评价酶反应性。具体来说：i)以IHOG或者PHOG作为底物，检测游离的丙酮酸的方法(检测分解活性)；ii)以吲哚丙酮酸、或者苯基丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)作为底物，使用高效液相色谱(HPLC)检测由羟醛缩合产生的IHOG、或者PHOG的方法(合成活性检测法)。并且优选通过HPLC确认(ii)中羟醛缩合产生的IHOG、或者PHOG的4位存在不对称中心，对4R选择性进行评价。
具体来说，也可以通过向包括100mM缓冲液、300mM吲哚-3-丙酮酸、600mM丙酮酸、0.1mM MgCl2、1％(v/v)甲苯组成的反应液中，加入醛缩酶，在37℃温度下使其振动4小时进行反应，使用HPIC定量所产生的IHOG的量，以估计醛缩酶活性。
可以使用配备了GL Sciences公司制备的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)的HPLC分析进行IHOG的定量。分析条件的一例如下所示：
移动相：40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁基铵溶液
流速：1ml/min
柱温：40℃
检测器：UV210nm
(b)通过筛选得到的微生物
本发明者们发现，上述筛选的结果是，从上述富集的菌中选择属于鞘氨醇单胞菌属或伯克氏菌属的微生物，属于上述两个属的微生物或者与之近源的微生物中能够产生可用于本发明的醛缩酶。因此，作为可用于本发明的具有醛缩酶活性的微生物，可以列举鞘氨醇单胞菌属或伯克氏菌属或与之相近属的微生物。作为与鞘氨醇单胞菌属相近的属，可以列举的有例如根单胞菌属(Rhizomonas)、芽单胞菌属(Blastomonas)、赤微菌属(Erythromicrobium)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)。并且，对于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，在近年来的再分类的提议中，也将其称为Sphingobium属、Novosphingobium属、Sphingopyxics属(International Journal of Systematic and Evolution Microbiology(2001)，51，1405～1417)，在本说明书中，使用包含了这些含义的鞘氨醇单胞菌。
作为属于鞘氨醇单胞菌属的微生物，可以列举的有例如如下微生物：
鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，楚氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonastrueperi)，类少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas parapaucimobilis)，血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis)，少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)，粘连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhasesiva)，李鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas pruni)，苹果鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas mali)，不解糖鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas asaccharolytica)，Sphingomonas echinoids，矢野口鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yanoikuyae)，食除草剂鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas herbicidovorans)，氯酚鞘氨醇单胞菌(Spingomonaschlorophenolica)，Sphingomonas agrestis，玫瑰鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasrosa)，亚北极鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subarctica)，Sphingomonas stygia地下鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subterranean)，食芳香物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromattcivorans)，荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonascapsulate)，解聚乙二醇鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas macrogoltabidus)，土地鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas terrae)，木栓化根单胞菌(Rhizomonassuberifaciens)，泳池芽单胞菌(Blastomonas natatoria)，Blastomonas ursincola，血红土壤杆菌(Agrobacterium sanguineum)，长赤细菌(Erythrobacter longus)，海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)等。
作为属于伯克氏菌属的微生物，可以列举的有例如如下微生物：
伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)，吩嗪伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaphenazinium)，Burkholderia caribensis，草根围伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagraminis)，Burkholderia kururiensis，Burkholderia brasilensis，石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)，格氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glathei)，植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaplantarii)，范氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavandii)，荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)，椰毒伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cocovenenans)，剑形伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)，越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)，杂食伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)，洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderiathailandensis)，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)，须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis)等(CurrentMicrobiology，2001年第42卷，第269～275页)。
特别优选如下微生物。其微生物保藏证明如下所示。
鞘氨醇单胞菌AJ110329株(C77菌株)
(i)保藏号：FERM BP-10027
(ii)原保藏申请的接受日期：2004年5月21日
(iii)保藏单位 独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1街1号1中央6)
鞘氨醇单胞菌AJ110372(C43菌株)
(i)保藏号：FERM BP-10156
(ii)原保藏申请的接受日期：2004年10月28日
(iii)保藏单位 独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1街1号1中央6)
伯克霍尔德氏菌AJ110371(C24菌株)
(i)保藏号：FERM BP-10155
(ii)原保藏申请的接受日期：2004年10月28日
(iii)保藏单位 独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1街1号1中央6)
并且，下述分类试验的结果鉴定AJ110329株(C77菌株，FERM BP-10027)为上述鞘氨醇单胞菌。
使用来自AJ110329株的基因组DNA，通过PCR，在16S核蛋白RNA基因(16S rDNA)中对5’末端一侧约500bp区域进行扩增，测定其碱基序列(序列号为16)。以MicroSeq Bacterial 500Library v.0023(Applied Biosystems，CA，USA)为数据库，使用MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1，对得到的序列的同源性进行分析。结果是不存在与AJ110329株的16S rDNA序列匹配的已知序列，对荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulata)的16SrDNA显示出最高为96.6％的同源性。即使在分子系统树上AJ110329株的16SrDNA也包含在荚膜鞘氨醇单胞菌的16S rDNA形成的簇中。并且，就表2所示的细菌学性质而言，也与16S rDNA的碱基序列分析结果相符，因此断定AJ110329株为鞘氨醇单胞菌。
下述分类试验的结果鉴定AJ110372(C43菌株，FERM BP-10156)为上述鞘氨醇单胞菌。
使用AJ110372的基因组DNA，通过PCR，在16S核蛋白RNA基因(16SrDNA)中，对5’末端一侧约500bp区域进行扩增，测定其碱基序列(序列号为17)。以MicroSeq Bacterial 500Library v.0023(Applied Biosystems，CA，USA)为数据库，使用MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1，对得到的序列的同源性进行分析。结果是不存在与AJ110372的16S rDNA序列匹配的已知序列，对矢野口鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yanoikuyae)的16S rDNA显示出最高为98.94％的同源性。即使在分子系统树上AJ110372的16S rDNA也包含在矢野口鞘氨醇单胞菌的16S rDNA形成的簇中，因此断定AJ110372为鞘氨醇单胞菌。
下述分类试验的结果鉴定AJ110371(C24菌株，FERM BP-10155)为上述Burkholderia sp.。
使用AJ110371的基因组DNA，通过PCR，在16S核蛋白RNA基因(16SrDNA)中，对5’末端一侧约500bp区域进行扩增，测定其碱基序列(序列号为18)。以MicroSeq Bacterial 500Library v.0023(Applied Biosystems，CA，USA)为数据库，使用MicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1，对得到的序列的同源性进行分析。结果是不存在与AJ110371的16S rDNA序列匹配的已知序列，对吩嗪伯克霍尔德氏菌(Burkholderia phenazinium)的16S rDNA显示出最高为95.21％的同源性。即使在分子系统树上AJ110371的16S rDNA也包含在吩嗪伯克霍尔德氏菌的16S rDNA形成的簇中并且，就表3所示的细菌学性质而言，也与16S rDNA的碱基序列分析结果相符，因此断定AJ110371为伯克霍尔德氏菌。
鞘氨醇单胞菌AJ110329株(FERM BP-10027)的细菌学性质如下表2所示。
[表2]
| 1.形态性质 | |
| 培养条件 | 营养琼脂(Oxoid.Hampshire England)培养基，30℃ |
| 细胞的形态 | (0.8-1.0×1.5-3.0μm) |
| 有无细胞的多形态 | - |
| 运动性(鞭毛的吸附状态) | - |
| 有无孢子(孢子的部位) | - | |
| 2.培养的性质 | ||
| 培养条件 | 营养琼脂培养基，30℃ | |
| 颜色 | 黄色 | |
| 光泽 | + | |
| 色素的产生 | + | |
| 培养条件 | 营养肉汤(Oxoid.Hampshire England)培养基，30℃ | |
| 有无表面生长 | - | |
| 有无培养基的混浊 | + | |
| 培养条件 | 明胶穿刺培养30℃ | |
| 发育状态 | - | |
| 明胶液化1) | - | |
| 培养条件 | 石蕊·奶30℃ | |
| 凝固 | - | |
| 液化 | - | |
| 3.生理学性质 | ||
| 革兰氏染色1) | - | |
| 硝酸盐的还原3) | - | |
| 脱氮反应3) | - | |
| MR试验2) | - | |
| VP试验3) | + | |
| 产生吲哚3) | - | |
| 生成硫化氢3) | - | |
| 淀粉的水解2) | - | |
| 柠檬酸的利用 | (Koser) | - |
| (Christensen) | - | |
| 无机氮源的利用 | 硝酸盐 | + |
| 铵盐 | + | |
| 脲酶活性3) | - | |
| 过氧化氢酶活性2) | + | |||
| 氧化酶活性2) | + | |||
| 发育的范围；pH | 4 | - | ||
| 7 | + | |||
| 8 | +W | |||
| 发育的温度范围(℃) | 20 | + | ||
| 25 | + | |||
| 30 | + | |||
| 37 | - | |||
| 厌氧生长 | - | |||
| O-F测试(氧化/发酵)2) | -/- | |||
| 4.由糖产生的酸/气体2) | ||||
| L-阿拉伯糖 | -/- | D-木糖 | -/- | |
| D-葡萄糖 | -/- | D-甘露糖 | -/- | |
| D-果糖 | -/- | D-半乳糖 | +/- | |
| 麦芽糖 | -/- | 蔗糖 | -/- | |
| 乳糖 | -/- | 海藻糖 | -/- | |
| D-山梨糖醇 | -/- | D-甘露糖醇 | -/- | |
| 肌醇 | -/- | 丙三醇 | -/- | |
| 5.其他的生理学性质3) | ||||
| β-半乳糖苷酶活性 | - | |||
| 精氨酸二水解酶活性 | - | |||
| 赖氨酸脱羧酶活性 | - | |||
| 色氨酸脱氨酶活性 | - | |||
| 明胶酶活性 | - | |||
伯克氏菌AJ110371(FERM BP-10155)的细菌学性质如下表3所示。
表3
| 1.形态性质 |
| 培养条件 | 营养琼脂(Oxoid.Hampshire England)培养基，30℃ | |
| 细胞的形态 | (0.5-0.6×0.8-1.0μm) | |
| 有无细胞的多形态 | - | |
| 运动性(鞭毛的吸附状态) | -(极毛) | |
| 有无孢子(孢子的部位) | - | |
| 2.培养的性质 | ||
| 培养条件 | 营养琼脂(Ozoid，Hampshire，England)培养基，30 | |
| 颜色 | 奶白色 | |
| 光泽 | + | |
| 色素的产生 | - | |
| 培养条件 | 营养肉汤(Oxoid.Hampshire England)培养基，30℃ | |
| 有无表面生长 | - | |
| 有无培养基的混浊 | + | |
| 培养条件 | 明胶穿刺培养30℃ | |
| 发育状态 | - | |
| 明胶液化1) | - | |
| 培养条件 | 石蕊·奶30℃ | |
| 凝固 | - | |
| 液化 | - | |
| 3.生理学性质 | ||
| 革兰氏染色1) | - | |
| 硝酸盐的还原3) | - | |
| 脱氮反应3) | - | |
| MR试验2) | - | |
| VP试验3) | - | |
| 产生吲哚3) | - | |
| 生成硫化氢3) | - | |
| 淀粉的水解2) | - | |
| 柠檬酸的利用2) | (Koser) | + |
| (Christensen) | + | |||
| 无机氮源的利用2) | 硝酸盐 | + | ||
| 铵盐 | + | |||
| 脲酶活性3) | + | |||
| 过氧化氢酶活性2) | + | |||
| 氧化酶活性2) | - | |||
| 发育的范围；pH | 5.0 | + | ||
| 7.0 | + | |||
| 8.0 | - | |||
| 发育的温度范围(℃) | 20 | + | ||
| 25 | + | |||
| 30 | + | |||
| 37 | - | |||
| 厌氧生长 | +W | |||
| O-F测试(氧化/发酵)2) | -/- | |||
| 4.由糖产生的酸/气体2) | ||||
| L-阿拉伯糖 | +/- | D-木糖 | -/- | |
| D-葡萄糖 | -/- | D-甘露糖 | -/- | |
| D-果糖 | -/- | D-半乳糖 | -/- | |
| 麦芽糖 | -/- | 蔗糖 | -/- | |
| 乳糖 | -/- | 海藻糖 | -/- | |
| D-山梨糖醇 | -/- | D-甘露糖醇 | -/- | |
| 肌醇 | -/- | 丙三醇 | -/- | |
| 5.其他的生理学性质3) | ||||
| β-半乳糖苷酶活性 | + | |||
| 精氨酸二水解酶活性 | + | |||
| 赖氨酸脱羧酶活性 | + | |||
| 色氨酸脱氨酶活性 | - | |||
| 明胶酶活性 | - | |||
参考文献及所使用的试剂盒
BARROW，(G.I.)和FELTHAM，(R.K.A.)：Cowan and Steel’s Manualfor the Identification of Medical Bacteria，1993年第3版，剑桥大学出版社。
Toshikazu Sakazaki，Etsuro Yoshizaki和Kanji Miki：Shin Saikin BaichigakuKouza II(2nd edition)，1988，Kindai Shuppan，Tokyo。
细菌鉴定试剂盒AP120，NE，
(bioMerieux，France：http：//www.biomerieux.fr/home_en.htm)
(c)具有醛缩酶活性的微生物的培养方法
作为醛缩酶获得源的微生物的培养方式可以是液体培养、固体培养的任意一种。工业上有利的方法为深部通气搅拌培养法。作为营养培养基的营养源，可以使用微生物培养中所通常使用的碳源、氮源、无机盐及其他微量营养源。菌株能够利用的营养源均可使用。
作为通气条件，优选好氧条件。作为培养温度，只要是细菌生长、能够产生醛缩酶的范围即可。因此，并无严格的条件，通常为10～50℃，优选为30～40℃。培养时间随其他的培养条件而改变。例如，可以是培养直至产生最多醛缩酶的时间，通常为5小时～7天，优选为10小时～3天。
(d)从微生物获得醛缩酶的方法
在培养具有醛缩酶活性的微生物之后，离心分离(例如，10000xg，10分钟)收集菌体。由于大部分醛缩酶存在于细菌细胞中，通过破裂或溶解菌体，将醛缩酶溶解。在破裂菌体时，可以使用超声波破裂、法式冲床破裂、玻璃珠破裂等方法，并且在溶菌时，可以使用卵白溶菌酶、及肽酶处理或其适当对其进行组合的方法。
在对由醛缩酶产生菌得到的醛缩酶进行纯化时，以酶可溶性液体作为初始原料进行纯化，如果存在未破裂或者未溶解的残渣，对可溶性液体再次进行离心分离操作，以除去沉淀残渣的方法，对于纯化是有利的。
在醛缩酶的纯化中，可以使用常用于酶纯化中的所有方法，例如硫铵盐析法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、羟磷灰石色谱法等。结果可以得到含有更高比活性的醛缩酶的组分。
在制备纯化的醛缩酶标准品之后，通过采用Edman降解法(Edman，p.，Acta Chem Scand.4，227(1950))利用蛋白质测序仪，可以测得N末端氨基酸的序列。并且，在进行肽酶处理之后，通过反相HPLC分离纯化肽标准品，通过采用Edman分解法，利用蛋白质测序仪，可以测得内部氨基酸序列。
根据所测得的氨基酸序列，可以推导编码该序列的DNA的碱基序列。在推导DNA的碱基序列时，可以采用通用密码子。
根据所推导的碱基序列，合成30个碱基对左右的DNA分子。合成该DNA分子的方法如Tetrahedron Letters，22，1859(1981)所示。并且，可以使用AppliedBiosystems公司制备的合成仪合成该DNA分子。在从醛缩酶产生菌染色体基因库中分离编码该醛缩酶的DNA的全长序列时，该DNA分子可以用作探针。或者，在通过PCR法扩增编码本发明的醛缩酶的DNA时，用作引物。但是，由于还存在使用PCR法扩增的DNA不含编码醛缩酶的生长DNA的情况，所以使用PCR法扩增的DNA作为探针，将编码醛缩酶的全长DNA从醛缩酶产生菌染色体基因库中分离出来。
关于PCR法的操作，如White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989)等中所述。关于制备染色体DNA的方法，以及使用DNA分子为探针，从基因库中分离目的DNA分子的方法，如Molecular Cloning，第2版，Cold SpringHarbor Press(1989)等所述。
测定对分离的编码醛缩酶的DNA分子的碱基序列的方法，如A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons.，Inc.(1985)中所述。此外，可以使用Applied Biosystems公司制备的DNA测序仪测定碱基序列。
作为通过醛缩酶产生菌获取编码醛缩酶的DNA的方法，还可以列举以编码本发明醛缩酶的DNA全长或部分序列为探针，获取杂交DNA的方法。
作为由醛缩酶产生菌获得编码醛缩酶的DNA的方法，可以通过比对本发明的醛缩酶的氨基酸序列，以从高度保守的氨基酸部分推导的DNA序列作为探针DNA的方法。或者可以是用作PCR法的引物的方法。由于还存在使用PCR法扩增的DNA不含编码醛缩酶的DNA全长的情况，所以使用PCR法扩增的DNA作为探针，将编码醛缩酶的DNA全长从醛缩酶产生菌染色体基因库中分离出来。
这样，能够得到具有醛缩酶活性的微生物，并从所得到的微生物中获得醛缩酶及编码醛缩酶的DNA。
(ii)醛缩酶
本发明者们由通过上述筛选方法分离的C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329)获得醛缩酶，并命名为SpALD。通过上述方法获得的特定的编码本发明SpALD的DNA如序列表的序列号1(CDS：210～1004位碱基)所示，SpALD的氨基酸序列如序列号2所示。
本发明者们进一步进行微生物筛选(如实施例中详细所述)，通过以序列号1所述的碱基序列的一部分作为探针进行Southern分析、克隆杂交，从C43菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110372)和C24菌株(Burkholderia sp.AJ110371)得到新的醛缩酶基因(序列号为12和14)，具有序列号13的氨基酸序列的蛋白质(SpALD2)及具有序列号15的氨基酸序列的蛋白质(BuALD)。SpALD、SpALD2、BuALD的序列比较结果如图1所示。3种醛缩酶中共同的醛缩酶的核心序列(序列号23)如图中上段所示。3种醛缩酶中共同的氨基酸残基有200个占全部氨基酸的70.2％，并且，3种醛缩酶中的2种共同的氨基酸残基为76个残基，与核心序列共计占全部的96.8％。此外，SpALD/SpALD2之间的同源性为88.4％，SpALD/BuALD之间的同源性为74.7％。
并且，对与其他已知的序列的同源性进行调查，结果为：序列表中序列号2的氨基酸序列与来自大肠杆菌C株的2，4-二羟基己-2-烯-1，7-二酸醛缩酶(HpcH)(Stringfellow JM等，Gene.，1995，166(1)：73-6)具有20％的同源性。此外，与来源于已知的腐臭假单胞菌的IHOG醛缩酶(基因名PtALD)、来源于Pseudomonas coronafaciens的IHOG醛缩酶(基因名PcALD)(WO03/056026)、来源于Comamonas testeroni ATCC49249的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸酯醛缩酶(基因名proA)或来源于稻草假单胞菌(Pseudomonas strminea)的4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸酯醛缩酶(基因名proA)中的任意一个的同源性都在10％以下，几乎没有同源性，可知本发明等发现的醛缩酶是一种非常新的蛋白质。本发明者们发现的3种醛缩酶，构成本发明的一部分，以下总称为“本发明的醛缩酶”。
并且，其中的同源性分析是使用基因分析软件“Genetyx ver.6”(Genetyx公司)，以缺省参数作为初始设定值计算出来的值。
因此，与序列号2的氨基酸)序列具有70％或以上、优选74％或以上、更优选80％或以上、更优选85％或以上、非常优选95％或以上同源性的蛋白质，均具有相同酶活性，可以用于本发明中。并且，非常优选与序列号2所述的氨基酸序列具有70％或以上的同源性，且具有序列23所述的醛缩酶的核心序列的蛋白质。
因此，作为本发明的制备方法中所使用的、具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，包含本发明的醛缩酶，优选例如下述(a)或者(b)的蛋白质。
(a)包含序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％或以上的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
并且，作为上述(b)的蛋白质，还包含如下(c)的蛋白质。
(c)包含序列号13或15任一项所述的氨基酸序列的蛋白质。
并且，作为本发明的醛缩酶，包含如下蛋白质。
(d)包含序列号2、13或15任一项所述的氨基酸序列的蛋白质。
(e)具有序列号2、13或15任一项所述氨基酸的序列中包含1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位得到的氨基酸序列，且具有缩醛酶活性的蛋白质。
其中，所谓“1个或多个”，是指在不明显损害氨基酸的蛋白质的立体结构、和醛缩酶活性的范围内，具体为1～90个，优选1～75个，更优选1～57个，更优选1～43个，非常优选1～15个。但是，在具有序列号2、11或13任一项所述氨基酸的序列中包含1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列中，在33℃、pH＝9的条件下，优选分别保持具有序列表的序列号2、11或13任一项所述的氨基酸序列的蛋白质的10％或以上，优选30％或以上，更优选50％或以上，进一步优选70％或以上的醛缩酶活性，优选4R-醛缩酶的活性。
上述取代、缺失、插入或者附加包括保持醛缩酶活性的保守变异。保守变异，代表性的为保守取代。作为取代醛缩酶本来的氨基酸、且被视为保守取代的氨基酸，包括从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到Gln、His或Lys的取代，从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代，从Asp到Asn、Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代，从Glu到Asn、Gln、Lys或Asp的取代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代，从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代，从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代，从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代，从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代，从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代，从Ser到Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取代，从Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。
其中，所谓醛缩酶活性，在本发明制备方法中使用的情形中，是指上述4R-醛缩酶活性，作为本发明的醛缩酶(蛋白质)的性质，对光学选择性没有严格的要求，更优选4R-醛缩酶活性。下面，在使用“醛缩酶活性”的术语的情形中，在本发明的制备方法中所使用的情况是指4R-醛缩酶活性，如上述(1)反应项中所述，是通过吲哚丙酮酸和丙酮酸或草酰乙酸的羟醛缩合，催化优先生成4R-IHOG的反应的活性。其中，所谓“优先生成4R-IHOG”，是指生成的IHOG的4位光学纯度形成R异构体的比例比形成S异构体的比例更高，优选得到以光学纯度为70％或以上，特别优选90％或以上形成R异构体的反应效率。另一方面，“醛缩酶活性”表示本发明的蛋白质活性时，是指不要求光学选择性的醛缩酶活性，所谓不要求光学选择性的醛缩酶的活性，是指由吲哚丙二酸和丙二酸(或者草酰乙酸)合成IHOG的活性，并不涉及光学选择性。是因为不涉及光学选择性的程度的情况下，本发明的醛缩酶也是可用的。
下面，对所测定的纯化的SpALD、BuALD的酶化学性质进行说明。
SpALD和BuALD催化通过使吲哚丙酮酸与丙酮酸或草酰乙酸反应，从而优先生成4R-IHOG的反应。
SpALD最适合的pH在37℃温度下，大约7.1～8.0左右。并且，在pH为8.0或以下时具有pH稳定性。并且，在50℃或以下时具有温度稳定性，特别是在30℃以下的范围内具有高的温度稳定性。
通过凝胶过滤法测定的SpALD的分子量大约为155kDa，通过SDS-PAGE法测定的分子量大约为30kDa，由此可以断定SpALD是分子量为30kDa的亚单元的6聚体。
因此，本发明的蛋白质另一方面的特征在于：
(A)具有催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸进行羟醛缩合生成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应的活性，和/或催化苯基丙酮醛与丙酮酸进行羟醛缩合生成4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应的活性；
(B)在(A)中记载的活性的最佳pH在37℃下约为7.5～8.0；
(C)在pH＝8或以下时具有pH稳定性；
(D)在50℃或以下具有温度稳定性；
(E)通过凝胶过滤测得分子量大约为155kDa，通过SDS-PAGE法测定的每亚单位分子量大约为30kDa。
BuALD最适合的pH值在37℃的温度下约为6.5～7.5左右；并且在pH＝7.5或以下时具有pH稳定性；并且在37℃或以下时具有温度稳定性，特别是在30℃或以下的范围内具有高的温度稳定性。
通过凝胶过滤测定的BuALD的分子量大约为160kDa，通过SDS-PAGE法测定的分子量大约为30kDa，由此可以断定BuALD是分子量约为30kDa的亚单元的6聚体。
因此，本发明的蛋白质另一方面的特征在于：
(A)具有催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸进行羟醛缩合生成4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应的活性，和/或催化苯基丙酮酸与丙酮酸进行羟醛缩合生成4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸的反应的活性；
(B)在(A)中记载的活性最佳的pH在37℃下约为6.5～7.5；
(C)在pH＝8.5或以下时具有pH稳定性；
(D)在37℃或以下具有温度稳定性；
(E)通过凝胶过滤测得分子量大约为160kDa，通过SDS-PAGE法测定的每个亚单位的分子量大约为30kDa。
(iii)编码醛缩酶的DNA
如上述(i)和(ii)所述，本发明者们从分离的作为醛缩酶产生菌的鞘氨醇单胞菌AJ110329株(C77菌株)中得到具有序列表的序列号1的碱基序列的本发明的醛缩酶基因、从鞘氨醇单胞菌AJ110372(C43菌株)中得到具有序列表的序列号12的碱基序列的本发明的醛缩酶基因、以及从Burkholderia sp.AJ110371(C24菌株)中得到具有序列表的序列号14的碱基序列的本发明的醛缩酶基因。这些基因编码催化本发明的由吲哚丙酮酸与丙酮酸(或草酰乙酸)合成IHOG的反应的醛缩酶，并包含在本发明中。
并且，对编码醛缩酶的DNA并不仅仅为序列表的序列号1、12及14所示的DNA。这是由于在生成醛缩酶(其中该醛缩酶催化由吲哚丙酮酸与丙酮酸合成IHOG的反应)的Sphingomonas属或Burkholderia属中，每一种或株均应该能够观察到不同的碱基序列。
即，只要是编码下述蛋白质的DNA都包含在本发明的DNA中：与序列号2所述的氨基酸序列具有70％或以上、优选74％或以上、更优选80％或以上、更优选85％或以上、非常优选95％或以上的同源性，并具有醛缩酶活性、优选4R-醛缩酶活性的蛋白质，或者，与序列号2所述的氨基酸序列具有70％或以上的同源性，且具有序列号23所述醛缩酶核心序列并具有醛缩酶活性、优选4R-醛缩酶活性的蛋白质。
此外，本发明的DNA不仅是编码分离的醛缩酶的DNA，当然，即使是在对从醛缩酶产生菌的染色体DNA中分离的编码醛缩酶的DNA进行了人工变异所得的DNA，若其编码醛缩酶，也作为本发明的DNA。施加人工变异的方法中最常用的方法，包括Method.in Enzymol.，154(1987)中所述的位点特异性变异导入法。
此外，在严格条件下与包含序列表中序列号1、12或14任一项所述的碱基序列的互补碱基序列杂交的DNA，编码具有醛缩酶活性、优选具有4R-醛缩酶活性的蛋白质的DNA也是本发明的DNA。其中，所谓“严格的条件”是指形成特异性杂交、而不形成非特异性杂交的条件。该条件难以明确数值化，例如，在同源性高的DNA之间，例如在具有50％或以上、更优选80％或以上、进一步优选或90％以上，特别优选95％或以上的同源性的DNA之间杂交，而同源性较低的DNA之间不发生杂交的条件，或者，相当于作为通常的Southern杂交洗涤条件的37℃、0.1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更优选65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下进行杂交的条件。其中，所谓“醛缩酶活性”或者“4R-醛缩酶活性”，与上述(ii)醛缩酶项中所述的说明具有相同的含义。但是，在与序列表的序列号1、12或者14任一项所述的序列互补的碱基序列在严格条件下杂交的碱基的情形中，在33℃、pH为9的条件下，序列表的序列号2、13或15任一项所述的氨基酸序列的蛋白质具有10％或以上、优选30％或以上、更优选50％或以上，进一步优选70％或以上醛缩酶活性、优选4R-醛缩酶活性。
并且，编码序列表的序列号1、12或14任一项所述的DNA编码的醛缩酶基本上同源的蛋白质的DNA也为本发明的DNA。即，
(a)包含序列号1所述的碱基序列中，210～1004位的碱基序列的DNA，
(b)包含序列号12所述的碱基序列中，399～1253位的碱基序列的DNA，
(c)包含序列号14所述的碱基序列中，531～1385位的碱基序列的DNA，
(d)与包含序列号1所述的序列或者该序列中210～1004位的碱基序列、序列号12所述的序列或者该序列中399～1253位的碱基序列、序列号14所述的序列或者与该序列中531～1385位的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA，
(e)编码包含序列号2、13或15任-项所述的氨基酸序列的蛋白质的DNA，
(f)编码具有在序列号2、13或15任一项所述的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA
(g)编码包含与序列号2、13或15任一项所述的氨基酸序列具有70％或以上同源性的氨基酸序列的，并且具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA，
都包含在本发明的DNA中。其中，“1个或多个”的含义与上述(ii)醛缩酶项中所述的内容相同。
(3)醛缩酶的制备方法
下面，对本发明的醛缩酶的制备方法进行说明。作为本发明的醛缩酶的制备方法，包括如下2种方法：(i)通过培养产生醛缩酶的微生物生成并积聚醛缩酶的方法，和，(ii)通过重组DNA技术制备产生醛缩酶的转化子，通过培养该转化子生成并积聚该醛缩酶的方法。关于(i)，作为产生醛缩酶的微生物的获得方法、以及培养方法，如上述(2)(i)项所述。下面，对(ii)进行说明。
(ii)通过重组DNA的制备方法
已知许多利用重组DNA技术制备酶、生理活性物质等有用的蛋白质的实例，通过使用重组DNA技术，可以大量生产在自然界仅存在的蛋白质。
图2为本发明的醛缩酶的制备步骤的流程图。
首先，制备编码本发明对醛缩酶的DNA(步骤S1)。
接着，将制备的DNA连接到载体DNA上，制备重组DNA(步骤S2)，用该重组DNA转化细胞，制备转化子(步骤S3)。接着，在培养基中培养该转化子，在培养基中和/或细胞中生成并积累醛缩酶(步骤S4)。
然后，进入步骤S5，通过回收·纯化该酶制备纯化的醛缩酶。
并且，通过在步骤S5中生产的纯化醛缩酶或步骤S4中的积累了醛缩酶的培养基和/或细胞，可以大量生成目标光学活性IHOG(步骤S6)。
并且，与载体DNA连接的DNA只要是可以表达本发明醛缩酶的DNA即可。
其中，作为与媒物介DNA连接的醛缩酶基因，可以使用上述(2)醛缩酶(iii)DNA项中所述的任意一种DNA。
在使用重组DNA技术大量生产蛋白质时，优选在生成该蛋白的转化子内组装蛋白质，形成蛋白质的包涵体。该表达生产方法的优点在于，可以保护目标蛋白质免受菌体内存在的蛋白酶消化，并且可以通过破碎菌体及其后的离心分离，简单地实现目标蛋白质的纯化。
这样得到的蛋白质包涵体可以通过蛋白质变性剂融解，通过基本上除去该变性剂进行活化再生，然后转化为经正确再折叠的生理活性蛋白质。例如，有很多白介素-2的活化再生的例子(特开昭61-257931)。
为了从蛋白质包涵体中得到活性蛋白质，必须进行融解·活化再生等一系列的操作，与直接生成活化蛋白质的情况相比，操作更复杂。但是，在菌体内大量生成诸如影响菌体的发育的蛋白质时，可以通过在菌体内形成并积累不活性蛋白质包涵体消除负面影响。
将目标蛋白质作为包涵体大量生产的方法，除在强力的启动子的控制下，单独表达目的蛋白质的方法之外，还有作为与已知大量表达的蛋白质相融合的蛋白质表达的方法。
并且，在表达融合蛋白之后，为了切下目标蛋白，在合适的位置设置限制蛋白酶的识别序列也是有效的。
在使用重组DNA技术大量生成蛋白质时，作为基因转化的宿主细胞，可以使用细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞等。具有宿主-载体系统的细菌细胞，包括埃希氏属细菌、假单胞菌属细菌、棒状杆菌属细菌、芽胞杆菌属细菌等，优选使用大肠杆菌。这是由于对于使用大肠杆菌大量生产蛋白质的技术，已有大量的探讨。下面，对使用转化的大肠杆菌制备醛缩酶的方法进行说明。
作为表达编码醛缩酶的DNA的启动子、可以使用常规大肠杆菌中可用于生成不同种蛋白质的启动子，例如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、PL启动子等强启动子。
为了将醛缩酶以融合的蛋白质内含物的形式生产，在醛缩酶基因的上游或者下游，通过连接其他的蛋白质，优选编码亲水性的肽的基因，形成融合蛋白质基因。作为除此之外的蛋白质编码基因，只要是能够增加融合蛋白质的积蓄量、在变性·再生步骤后提高融合蛋白质溶解性的基因均可，可以选择例如T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脱氢叶酸还原酶基因、干扰素γ基因、白介素-2基因、前凝乳酶基因等作为候选物。
当这些基因与对醛缩酶编码基因连接时，密码子的读框架应当匹配。可以通过在适当的限制酶位点连接，或者使用适当序列的合成DNA。
此外，为了增大生产量，优选连接融合蛋白质基因下游的转录终止序列，即终止子。作为该终止子，包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素耐受性基因的终止子、大肠杆菌trpA基因的终止子等。
作为用于将编码醛缩酶或者醛缩酶与其他蛋白质融合的蛋白质的基因导入大肠杆菌中的载体，优选所谓的多拷贝型，例如来源于Col E1的具有复制起始点的质粒，例如pUC类的质粒和pBR322类的质粒，或其衍生物。其中，所谓“衍生物”表示通过碱基的取代、缺失、插入、附加或者反转等在质粒中进行了修饰的物质。并且，其中所谓的修饰，包括通过诱变剂或者UV照射等进行诱变处理、或者自发突变。
此外，为了筛选转化子，优选该载体带有氨苄青霉素耐受性基因等的标记物。作为这种质粒，具有强力启动子的载体通常是可商购的(pUC类(宝酒造株式会社制备)、pPROK类(Clontech株式会社制备)、pKK233-2(Clontech株式会社制备)等)。
将启动子、编码醛缩酶或者醛缩酶与其他蛋白质的融合蛋白质的基因、终止子顺序连接的DNA片段，与载体DNA连接，得到重组DNA。
使用该重组DNA转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌，表达产生醛缩酶或者醛缩酶与其他蛋白质的融合蛋白。转化的宿主可以使用异源基因通常使用的细胞株，特别优选大肠杆菌JM109(DE3)株、JM109株。进行转化的方法，以及筛选转化体的方法如Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor出版社出版(1989)等中所述。
在作为融合蛋白质表达时，也可以使用血液凝固因子Xa、激肽释放酶等的，以醛缩酶内不存在的序列作为识别序列的限制性蛋白酶将醛缩酶切下。
作为生产培养基，也可以使用M9-酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等用于培养大肠杆菌的常用培养基。并且，培养条件、生产诱导条件可以根据所使用的载体的标记物、启动子、宿主菌等的种类进行适当选择。
在回收醛缩酶或者醛缩酶与其他的蛋白质的融合蛋白质时，可以使用以下方法。如果醛缩酶或其融合蛋白质可溶于菌体中，可以在回收菌体之后，破裂菌体或溶菌，将其作为粗酶溶液使用。并且，根据需要，还可以通过常规的沉淀、过滤、柱色谱等方法纯化醛缩酶或其融合蛋白质。这时，可以使用利用醛缩酶或融合蛋白质的抗体的纯化方法。
在形成蛋白质包涵体时，可以通过变性剂将其溶解。也可以与菌体一起溶解，但是如果考虑后续的纯化操作，优选在溶解前分离包涵体。在从菌体回收包涵体时，可以采用已知的方法。例如，通过破碎菌体、离心分离操作等回收包涵体的方法。作为使蛋白质包涵体溶解的变性剂，包括胍盐酸(例如6M、pH5～8)和尿素(例如8M)等。
当通过透析等除去这些变性剂时，可以再生具有活性的蛋白质。作为透析中使用的透析溶液，可以使用Tris-HCl缓冲液和磷酸缓冲液等，其浓度例如为20mM～0.5mM，pH例如为5～8。
再生步骤的蛋白质浓度优选控制在大约500μg/ml或以下。为了抑制再生的醛缩酶的自交联，优选透析温度为5℃或以下。并且，作为除去变性剂的方法，除透析法之外，还有稀释法、超滤法等，使用其中任何一种方法都可以使其活性再生。
作为编码醛缩酶的DNA，在使用序列表序列号为1、12或14所示的DNA，其分别产生具有序列号2、13或15所述的氨基酸序列的醛缩酶。
[II]光学活性莫那亭的制备方法
本发明的光学活性莫那亭的制备方法为[I]中通过光学活性IHOG的制备方法制备光学活性IHOG之后，将该IHOG转化为莫那亭的方法。根据本发明方法生产的IHOG，由于优先产生4R-IHOG，故可以从本发明所制备的IHOG优先生成光学活性的4R-莫那亭，即，优先生成(2R，4R)-莫那亭以及(2S，4R)-莫那亭(以下将(2R，4R)-莫那亭以及(2S，4R)-莫那亭统称为4R-莫那亭)。
为了有效地生产莫那亭的四种异构体中甜味度最高的异构体(2R，4R)-莫那亭，优选使用富含4R异构体的IHOG。这时，4R-IHOG相对于全部IHOG的比例，优选超过55％，更优选超过60％，进一步优选超过70％，特别优选超过80％。
对将IHOG转化为莫那亭的方法并无特别的限制，可以使用化学反应法、酶法等已知的方法。
(1)化学反应法
作为通过化学反应法从光学活性IHOG制备光学活性莫那亭的方法，可以列举的有：将光学活性IHOG肟化，通过化学还原下式(4)所示的IHOG-肟或其盐以生成光学活性莫那亭的方法。
优选将富含4R异构体的IHOG肟化，通过结晶从包含该富含4R异构体的IHOG-肟的溶液中分离4R-IHOG-肟或其盐，通过化学还原该4R-IHOG-肟或其盐，从而生成4R-莫那亭。
IHOG的肟化，是在中性或者碱性条件下，通过使IHOG与下述通式(3)所示的胺化合物或其盐反应进行。
H2N-O-R ···(3)
(在上式(3)中，R表示氢原子、烷基、芳基或者芳烷基)。
其中，R为烷基、芳基或芳烷基时，R优选为具有1～3个碳原子的烷基、或者侧链可以具有取代基的芳基或者芳烷基，并且从结晶化的观点来看，更优选R选自甲基、乙基、苯甲基。
可以通过在包含IHOG的醛缩酶反应液中，直接添加上述通式(3)的胺进行该肟化反应。通过从包含该富含4R异构体的IHOG-肟的溶液中结晶4R-IHOG-肟或其盐，可以分离出4R异构体。作为结晶溶剂，优选使用水、醇溶剂或者含水醇溶剂。
通过还原由结晶得到的4R-IHOG-肟或其盐，可以得到4R-莫那亭。4R-IHOG-肟或其盐的还原是在氢或加氢催化剂的存在下进行的。作为加氢催化剂，优选使用在氧化硅、氧化铝、氧化钛、氧化镁、氧化锆、活性碳等载体上，负载铂、铑、钯、镍、钴等金属催化剂的带有金属的催化剂。
迄今为止，由于不能有效地生成光学活性IHOG，在从消旋体的IHOG(4R、4S-IHOG)中分离4R-IHOG时，需要将4R、4S-IHOG肟化之后，通过手性胺的作用，使4R-IHOG-肟结晶。与此相反，根据本发明，由于能够在羟醛缩合反应阶段生成富4R异构体的IHOG，因而在结晶时，无需使用手性胺进行光学分离，在肟化富含4R异构体IHOG之后，可以直接结晶4R-IHOG-肟。因此，能够降低4R-IHOG纯化所需要的成本。
通过化学还原法得到的4R-莫那亭为(2R，4R)-莫那亭与(2S，4R)-莫那亭的外消旋混合物。在分离(2R，4R)-莫那亭时，可以通过结晶析出(2R，4R)-莫那亭。具体的说，可以使用WO03/059865中所述的方法。
(2)酶法
当使用酶法从4R-IHOG制备4R-莫那亭时，可以在催化4R-IHOG的2位进行氨基化反应的酶的存在下氨基化4R-IHOG。作为催化该反应的酶，可以是例如催化4R-IHOG进行氨基转移反应的氨基转移酶、或催化4R-IHOG还原的进行氨基化反应的脱氢酶等，更优选使用氨基转移酶。
当使用氨基转移酶时，可以在氨基转移酶及氨基供体的存在下，使4R-IHOG反应，从而生成4R-莫那亭。具体来说，可以使用WO03/056026所述的方法。
这时，作为氨基转移酶，还可以使用L-氨基转移酶以及D-氨基转移酶的任何一种。当使用L-氨基转移酶时，可以通过将L-氨基酸的氨基转移至IHOG的2位，从而选择性地生成2S-莫那亭。并且，当使用D-氨基转移酶时，可以通过将D-氨基酸的氨基转移至IHOG的2位，从而选择性地生成2R-莫那亭。因此，为了选择性地生成甜味度高的(2R，4R)-莫那亭，优选使用D-氨基转移酶使4R-IHOG反应。
使用氨基转移酶生成莫那亭的反应，可以在进行上述羟醛缩合之后对生成的4R-IHOG进行一次分离纯化之后进行，也可以使醛缩酶与氨基转移酶共存于同一体系内实施反应。在同一体系内实施反应时，可以使用同时表达编码醛缩酶的DNA与编码氨基转移酶的DNA的微生物，也可以另外制备酶，并将其加入到反应体系中。可以通过如下方法制备同时表达编码醛缩酶与氨基转移酶的DNA的微生物(宿主细胞)：通过共转染功能性地包含上述编码醛缩酶的DNA的表达载体与功能性地包含编码氨基转移酶的DNA的表达载体、以及通过能够在宿主细胞内以具有活性的状态表达包含编码醛缩酶的DNA与编码氨基转移酶的DNA的表达载体转化进行制备。
[实施例]
下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不仅仅局限于这些实施列中。并且，在实施列中，作为底物使用的IHOG、PHOG以及(2R，4R)-莫那亭是通过参考例1、2和3所述的方法合成的。
且，本实施例的IHOG和PHOG的定量是通过使用GL Sciences公司制备的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)进行HPLC分析而实现的。分析条件如下所示：
移动相：40％(v/v)乙腈/5mM磷酸二氢四丁铵溶液
流速：1ml/min
柱温：40℃
检测：UV210nm
此外，所生成的IHOG或者PHOG的4位不对称分析通过依次直接连接GL Sciences公司制备的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×160mm)与住化分析中心制备的“SUMICHIRAL OA-7100”(5μm，4.6×250mm)的HPLC进行分析。分析条件如下所示：
移动相A：5％(v/v)乙腈20mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)
移动相B：50％(v/v)乙腈20mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)
0～90分钟，使用移动相A洗脱，90～120分钟使用移动相B洗脱·洗涤
流速：0.4ml/min
柱温：17℃
检测：UV210nm
实施例1：天然来源的IHOG醛缩酶活性菌的筛选
通过使用以(2R，4R)-莫那亭(以下称为RR莫那亭)为单一碳源的培养基进行富集培养，从自然界分离·获得对4R-IHOG具有光学选择性的醛缩酶活性菌株。
在包含1ml以RR莫那亭为单一碳源的培养基(RR莫那亭·1钾盐，0.4g/l，不含氨基酸的酵母氮基(Difco)0.67g/l)的试管中接种土壤试料，然后在30℃下振荡7天进行培养。将0.1ml得到的培养液再度接种到含1mlRR莫那亭为单一碳源的培养基的试管中，再在30℃下振荡7天进行培养。使用灭菌生理盐水适当稀释所得到的培养液，然后涂布在DM2G平板(葡萄糖5g/l、酵母提取物10g/l、胨10g/l、NaCl5g/l、琼脂粉20g/l(pH7.0))上，在30℃下培养24小时，分离得到菌落。
从富集得到的菌株中选择醛缩酶活性株。在肉汤琼脂平板培养基(荣研化学)中接种测试的微生物，在30℃下培养24小时。将其接种到包含酶生成培养基的平板中(甘油5g/l、富马酸5g/l、酵母提取物3g/l、胨2g/l、硫酸铵3g/l、K2HPO43g/l、KH2PO41g/l、MgSO4·7H2O0.5g/l、邻苯二甲酸钠2.5g/l、琼脂粉20g/l(pH6.5))，在30℃下培养24小时。为使得到的菌体按湿菌体重量计，为大约1％(w/v)，将其接种到包括Tris-HCl(pH8.0)、50mMPHOG、1mM MgCl2、5mM磷酸钾溶液(KPi)、1％(v/v)甲苯构成的反应液中，在30℃下反应24小时。通过使用乳酸盐脱氢酶(LDH)的酶法定量该反应液中游离的丙酮酸的浓度。在200μl包含了100mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mMNADH、5mMMgCl2、25U/mlLDH构成的反应液中加入10μl样品，在30℃下孵化10分钟。测定反应后340nm的吸光度，从NADH的减少量中测定样品中丙酮酸的量。
并且，所生成的丙酮酸是通过GL Sciences公司制备的“Inertsil ODS-2”(5μm，4.6×250mm)进行HPLC分析而定量。分析条件如下所示：
移动相：20％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟乙酸水溶液
流速：1ml/min
柱温：40℃
检测：UV210nm
通过该条件，可以分别将PHOG在大约9.8分钟的保留时间时洗脱出来、将苯基丙二酸在大约12分钟的保留时间时洗脱出来，进行定量分析。
从测试菌区中由PHOG生成的丙酮酸或者苯基丙酮酸的量减去对照区(无添加菌区)的生成量，将该值得作为醛缩酶的生成量。结果发现了以PHOG为底物的醛缩酶活性菌株。
接着使用收集的醛缩酶活性菌株进行IHOG合成反应。将测试菌株接种到含有3mL酶生产培养基(甘油5g/l、富马酸5g/l、酵母提取物3g/l、胨2g/l、硫酸铵3g/l、K2HPO43g/l、KH2PO41g/l、MgSO4·7H2O0.5g/l、邻苯二甲酸钠2.5g/l(pH6.5))的试管中，在30℃下培养16小时。为使所得到的菌体按湿菌体重量计，大约为1％(w/v)，将其悬浮于下述IHOG合成反应液中进行反应。
IHOG合成反应液：100mM Hepes-KOH(pH8.5)、300mM吲哚丙酮酸、750mM丙酮酸钠、1mMMgCl2、5mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)。
将反应液在37℃下孵化16小时，然后定量生成的IHOG，进而对反应生成物的4位的不对称中心进行分析。结果如表4所示，筛选的C77菌株具有优先生成4R-IHOG的羟醛缩合活性。
表4通过C77菌株菌体反应的IHOG合成反应
| 4R-IHOG(mM) | 4S-IHOG(mM) | 4Re.e.(％) | |
| C77菌株 | 32.5 | 22.1 | 19 |
| 无添加菌区 | 15.6 | 15.6 | 0 |
实施例2：来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的IHOG醛缩
酶(SpALD)的纯化
通过如下方法由来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的可溶性组分纯化IHOG醛缩酶。醛缩酶活性测试以PHOG为底物，在如下条件下测试醛缩酶的分解活性。
反应条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNADH、0.2mMKPi、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，30℃，测定340nm处的吸光度。
(1)可溶性组分的制备
将在30℃温度下，在肉汤平板上培养了24小时的C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)菌体用接种环接种到50ml含有酶生产培养基(5g/l甘油、5g/l富马酸、5g/l硫酸铵、3g/lK2HPO4、1g/lKH2PO4、0.5g/lMgSO4·7H2O、3g/l酵母提取物、2g/l胨、2.5g/l邻苯二甲酸钠(Sigma公司制备)，使用KOH将pH调整到6.5)的500ml烧瓶中，在30℃下振荡24小时进行培养。将0.5ml该培养液接种到20个含有50ml酶培养基的500ml烧瓶中，在30℃下振荡培养24小时。通过离心分离从所得到的培养液中收集菌体，悬浮于缓冲液A(20mMHepes-KOH(pH7.6))中并洗涤后，再次通过离心分离收集菌体。将所得到的洗净菌体悬浮于80ml的缓冲液A中，在4℃下超声破裂30分钟。通过对破裂液进行离心分离(×8000rpm，10分钟×2次)除去菌体残渣，所得到的上清液即为可溶性组分。
(2)阴离子交换色谱：Q-Sepharose FF
将40ml上述可溶性组分放入经缓冲剂A平衡化的阴离子交换色谱-柱Q-Sepharose FF 26/10(Pharmacia公司制备，CV＝20ml)中使其吸附到载体上。使用缓冲液A洗脱未吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，然后使用浓度由0M线性变化到0.7M(总计140ml)的KCl洗脱吸附的蛋白质。检测各个溶出成分中的PHOG醛缩酶的活性，在相当于大约0.4M的组分中检测到PHOG醛缩酶活性的峰。将同样的色谱操作重复进行2次。
(3)疏水性色谱：苯基SepharoseEHP HR 16/10
在4℃下，将检测出醛缩酶活性的溶液相对于缓冲液B(20mM Hepes-KOH、1M硫酸铵，pH7.6)透析一夜，并使用0.45μm的滤膜过滤。将所得到的滤液倒入经缓冲液B平衡化的疏水性色谱柱Sepharose HP HR 16/10中(Pharmacia公司制备)。通过该操作，醛缩酶吸附到载体上。
使用缓冲液B洗脱未吸附到载体上的蛋白质之后，使用浓度由1M线性变化到0M的硫酸铵进行洗脱。测定各个洗脱组分的醛缩酶活性，确认硫酸铵浓度为0.4～0.5M的溶出位置时具有醛缩酶活性。
(4)凝胶过滤色谱：Sephadex 200HP 16/60
分别收集包含醛缩酶的组分，相对于缓冲液A进行透析，使用0.45μm的滤膜过滤。使用超滤膜centriprep 10对得到的滤液进行浓缩。将得到的浓缩液倒入经缓冲液C(20mMHepes-KOH、0.1MKCl，pH7.6)平衡化的凝胶过滤Sephadex 200HP16/60(Pharmacia公司制备)中，以1ml/min的速度洗脱。通过该操作，在大约66ml的组分中醛缩酶被洗脱出来。由活性峰的洗脱位置，预测该醛缩酶的分子量大约为155kDa。
(5)阴离子交换色谱：Mono Q HR 5/5
使用0.45μm的过滤膜过滤得到的组分。其中，将得到的滤液倒入经缓冲液A预平衡的阴离子交换色谱柱Mono Q HR 5/5(Pharmacia公司制备)中。通过该操作，醛缩酶吸附在载体上。通过缓冲液A将非吸附蛋白质洗脱出来，然后通过将KCl的浓度由0mM线性变化到700mM进行蛋白质的洗脱(总共24ml)。测量各个洗脱组分的醛缩酶活性，可以确认KCl浓度大约为0.4M的洗脱位置具有醛缩酶活性。
将得到的组分进行SDS-PAGE，确认在活性组分中有大约10个左右的带。其中，存在有活性轮廓线与SDS-PAGE带强度轮廓线一致的大约30kDa的带，将该带作为醛缩酶的候选物的从SDS-PAGE切下来，用于氨基酸序列分析。
表5来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的IHOG醛缩酶(SpALD)的部分纯化表
| 蛋白质 | 活性 | 比活性 | 纯化 | 产率 | |
| (mg) | (U) | (U/mg) | (倍) | (％) | |
| 粗品 | 964 | 78.7 | 0.082 | 1 | 100 |
| Q-Sepharose HP 26/10 | 58 | 39.9 | 0.69 | 8 | 51 |
| 苯基sepharose HP 16/10 | 1.3 | 13.1 | 9.8 | 119 | 17 |
| Sephadex 200 HP 16/60 | 0.28 | 6.9 | 24.7 | 302 | 9 |
| mono Q HR5/5 | 0.10 | 3.7 | 39.1 | 477 | 5 |
实施例3：IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列的测定
将纯化的醛缩酶组分经SDS-PAGE之后，切下相当于30kDa的带，将SDS-PAGE凝胶中的试料进行胰蛋白酶处理(pH8.5，35℃，20小时)，放入反相HPLC中分离片段化的肽。在分离出的组分中，按如下表6所示，对2种组分分别测定出17个残基、12个残基分的氨基酸序列(序列号3、4)。
表6测定的内部氨基酸序列
| 序列号3序列号4 | GVYGV ITPHV STVEQ AYYWGLS QPEYY AK |
实施例4：来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的IHOG醛缩酶基因的克隆
(1)染色体DNA的制备
在30℃下，使用50ml的CM2G培养基培养C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)一夜(前培养)。将5ml作为种菌，使用50ml的肉汤培养基进行基础培养。培养至对数增殖后期，然后对50ml培养液进行离心分离操作(12000xg，4℃，15分钟)，收集菌体。使用该菌体按照标准方法制备染色体DNA。
(2)通过PCR获得内部序列
根据所测定的IHOG醛缩酶内部氨基酸序列合成如表7所述的混合引物(序列号5、6)。
表7通过内部氨基酸序列设计·合成的混合引物
| 序列号5序列号6 | ATY CAN CCN CAY GTN WSB CAN GTN GAR CAR GCGCR TAR TAY TCN GGY TGV SWV ARN CCC C |
使用所制备的混合引物，以C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的染色体DNA作为模板通过PCR进行扩增。PCR反应是使用PCR ThermalPERSONEL(TaKaRa公司制备)进行的，在如下条件下进行30个循环。
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 1分钟
将PCR产物放入琼脂糖凝胶电泳中，确认扩增的约200bp的片段。将该DNA片段克隆到pT7Blue(Novagen公司制备)中，测定碱基序列，从所得到的DNA片段推测的氨基酸序列与IHOG醛缩酶的内部氨基酸序列一致，可以确认得到了目标的醛缩酶基因。
(3)通过克隆杂交得到全长基因
使用通过PCR扩增的DNA片段，进行Southem分析通过克隆杂交得到全长基因。DNA探针的制备是使用DIGHigh Prime(Roche Diagnostics公司制备)，按照说明书在37℃温度下孵化过夜进行探针的标记。Southem分析是按照如下方法进行的：使用各种限制酶将1μg染色体DNA完全消化，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，然后印迹在尼龙膜上，以下按照手册进行操作。杂交是使用DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics公司制备)进行的，在50℃下进行杂交1小时后加入探针，杂交过夜。使用DIG Nucleotide Detection Kit进行带的检测。结果检测出该PCR片段作为探针强杂交的约3.2kbp的Pst I/BamH I片段。接着，通过克隆杂交获得该Pst I/BamH I片段。将20μg的染色体DNA经PstI/BamH I处理后进行琼脂糖电泳，回收大约3.2kbp大小的片段。将其连接到pUC19中，使用大肠杆菌JM 109制备文库。将克隆印迹到尼龙薄膜(Hybond-N，Amersham公司制备)上，进行碱变性、中和、固定化处理。杂交是使用DIG Easy Hyb进行的。将滤膜浸渍在缓冲液中，在42℃下杂交1小时。然后，加入制备的标记探针，在42℃下杂交16小时。使用SSC洗涤，然后使用DIG Nucleotide Detection Kit(Roche Diagnostics公司制备)检测与探针杂交的克隆。结果得到了与探针强杂交的克隆。
由得到的克隆株回收质粒DNA，测定其碱基序列，清楚看出其具有序列号1中所述的碱基序列。包含与测定的内部氨基酸序列对应的碱基序列(序列号1中第519～569位，以及，666～701位)的855bp的ORF，由此获得了目标醛缩酶的全长。
实施例5：通过大肠杆菌大量表达IHOG醛缩酶(SpALD)
(1)带有trp启动子与rrnB终止子的质粒pTrp4的构建
以表8中所示的寡核苷酸作为引物，通过PCR(序列号7和序列号8的组合)扩增大肠杆菌W3110染色体DNA上的trp操纵子的启动子区域，将所得到的DNA片段连接在pGEM-Teasy载体(Promega制备)上，使用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素耐性株中选择具有反向插入的trp启动子和lac启动子的质粒的菌株。接着，将通过EcoO 109 i/EcoR I处理该质粒得到的包含trp启动子的DNA片段连接到已经过EcoO 109 i/EcoR I处理的pUC19(Takara制备)。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素耐性株中选择出具有目标质粒的株，并将该质粒命名为pTrp1。接着，用HindIII/HincII处理pKK223-3(Amersham Pharmacia公司制备)，将所得到的包含rrnB终止子的DNA片段与经Hind III/Pvu II处理的pTrp1连接在一起。使用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素耐性株中选择出具有目标质粒的株，并将该质粒命名为pTrp2。接着通过以pTrp2为模板、以表8所示的寡核苷酸作为引物进行PCR(序列号7和序列号9的组合)，扩增trp启动子区域。用EcoO 109 i/Nde I处理该DNA片段，与经EcoO 109 i/Nde I处理的pTrp2连接在一起。使用该连接液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素耐性株中选择出具有目标质粒的株，并将该质粒命名为pTrp4。
表8引物序列
| ① | 5’侧 | GTATCACG AGGCCCTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATC 序列EcoO109I 号7 |
| ② | 3’侧 | TTCGGGGATTC CATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGC 序列NdeI 号8 |
| ③ | 3’侧 | GGGGGGGG CATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTG 序列NdeI 号9 |
(2)表达醛缩酶基因的质粒ptrp SpALD的构建与通过E.coli的表达
对使用如表9所示的引物(序列号10和11)从C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的染色体DNA扩增的片段进行NdeI/PstI消化，插入到pTrp4的NdeI/PstI位点构建质粒ptrp SpALD。该质粒表达包含下述SEQ ID NO.2的氨基酸序列的醛缩酶的基因，所述氨基酸序列，通过翻译SEQ D NO.1所述碱基序列中自作为翻译起始密码子的，第210位的ATG至第1004位的核苷酸序列所得。
表9ptrpSpALD构成用引物序列
| C77ALD Nde5’(序列号10)C77ALD Pst3’(序列号311) | GGC CAT ATG ACC CAG ACG CGC CTC AAC GGC ATC ATC CGCG CTG CAG TCA GTA CCC CGC CAG TTC GCG GCC CTGACC |
将所构建的表达质粒导入到大肠杆菌JM109中，将转化子用接种环接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基中，在37℃下振荡16小时。培养结束后，对1ml所得到的培养液进行收集菌体、洗涤，将其悬浮于1ml的20mMHepes-KOH中(pH7.6)，通过超声波破裂破裂菌体。以15000rpm的速度将菌体破碎物离心分离10分钟，将得到的上清液作为粗酶液。
使用该粗酶液测定醛缩酶活性。醛缩酶的活性测试是：以PHOG为底物，在如下条件下测定羟醛的分解活性。
反应条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNADH、0.2mMKPi、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，在30℃下，测定340nm的吸光度。
检测结果：在用pTrp4转化的E.coli(对照组)中没有检出醛缩酶活性，而在转化有ptrp SpALD的细胞株中检测出33.6U/mg蛋白质的醛缩酶活性。这样，可以确认通过与SpALD高表达质粒的构建，克隆了醛缩酶基因。
实施例6：来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的重组醛缩酶
的纯化
按照如下方法从高表达来源于C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329株)的醛缩酶(SpALD)的E.coli的可溶性组分中纯化重组的SpALD。醛缩酶的活性测试是：在如下条件下测定以PHOG为底物的羟醛分解活性。
反应条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNAD、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，在30℃下，测定340nm的吸光度。
(1)可溶性组分的制备
将在37℃下在LB-amp平板培养基上培养了16小时的大肠杆菌JM109/ptrpSpALD细菌由接种环接种到10个含有50mlLB-amp培养基的500ml的烧瓶中，在37℃下振荡16小时。通过离心分离，从得到的培养液中收集菌体，并悬浮于缓冲液A(20mM Hepes-KOH(pH7.6))中并洗涤，再次通过离心分离收集菌体。将所得到的洗净菌体悬浮于20ml的缓冲液A中，在4℃下超声破裂30分钟。通过对破裂液进行离心分离(×8000rpm，10分钟×2次)除去菌体残渣，将得到的上清液作为可溶性组分。
(2)阴离子交换色谱：Q-SepharoseFF
将20ml上述可溶性组分放入经缓冲剂A平衡处理的阴离子交换色谱柱Q-Sepharose FF26/10(Pharmacia公司制备，CV＝20ml)中使其吸附到载体上。使用缓冲液A洗脱未吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，使用浓度由0M线性变化到0.7M(总计140ml)的KCl洗脱吸附的蛋白质。检测各个溶出成分中醛缩酶的活性，在相当于大约0.4M的组分中检测到PHOG醛缩酶活性的峰。
(3)疏水性色谱：苯基Sepharose HP HR 16/10
在4℃下，将检测出醛缩酶活性的溶液相对于缓冲液B(20mMHepes-KOH、1M硫酸铵，pH7.6)透析一夜，并使用0.45μm的滤膜过滤。将所得到的滤液倒入经缓冲液B平衡处理的疏水性色谱柱Sepharose HP HR 16/10(Pharmacia公司制备)。通过该操作，醛缩酶吸附到载体上。
使用缓冲液B洗脱未吸附到载体上的蛋白质之后，使用浓度由1M线性变化到0M的硫酸铵对醛缩酶进行洗脱。测定各个洗脱组分的醛缩酶活性，确认硫酸铵浓度为0.4～0.5M的溶出位置时具有醛缩酶活性。
(4)凝胶过滤色谱：Sephadex 200 HP 16/60
分别收集包含醛缩酶的组分，相对于缓冲液A进行透析，使用0.45μm的滤膜过滤。使用超滤膜centriprep 10对得到的滤液进行浓缩。将得到的浓缩液倒入经缓冲液C(20mM Hepes-KOH、0.1M硫酸铵，pH7.6)平衡化的凝胶过滤色谱柱Sephadex 200HP 16/60(Pharmacia公司制备)中，以1ml/min的速度洗脱。通过该操作，在大约66ml的组分中，醛缩酶被洗脱出来。
(5)阴离子交换色谱：Mono Q HR5/5
使用0.45μm的过滤膜过滤得到的组分。其中，将得到的滤液倒入经缓冲液A平衡化的阴离子交换色谱柱Mono Q HR 5/5(Pharmacia公司制备)中。通过该操作，醛缩酶吸附在载体上。通过缓冲液A将非吸附蛋白质洗脱出来，然后通过将KCl的浓度由0mM线性变化到700mM进行蛋白质的洗脱(总共24ml)。测量各个洗脱组分的醛缩酶活性确认KCl浓度大约为0.4M的洗脱位置具有醛缩酶活性。
将上述经柱色谱纯化的组分经SDS-PAGE，在相当于大约30kDa的位置检测出经CBB染色的单一带。在4℃下，将得到的重组SpALD溶液相对于缓冲液A透析一夜。通过上述操作，得到1.5ml 452U/ml的SpALD溶液。
实施例7：使用SpALD，从吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸合成4-(吲哚-3
-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)
使用实施例6所制备的SpALD作为酶源，进行从吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸到4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)的合成。向包含100mlHepes-KOH(pH8.5)、300mM吲哚-3-丙酮酸、750mM丙酮酸、1mMMgCl2构成的反应液中加入浓度达7.9mg/ml的SpALD在37℃下反应3分钟。适当稀释酶反应液，对其进行HPLC分析，定量生成的IHOG。结果确认由该醛缩酶生成了IHOG。估计在该条件下IHOG合成反应的最初速度为451U/mg。
实施例8：SpALD的各种酶学性质
使用实施例6制备的SpALD对如下所示的项目进行研究。
基本测试条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、5mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、在30℃下，测定340nm的吸光度的减少量。
(1)以PHOG为底物的动力学常数
从图3所示的结果，分别测定Vmax(PHOG)＝979μmol/min/mg、Km(PHOG)＝0.60mM、Km(MgCl2)＝0.034mM。并且确认，没有因加入KPB，使醛缩酶的活性得到提高。
(2)pH稳定性
测定了pH3～10范围内的稳定性。测定中所使用的缓冲液如下所示。柠檬酸钠缓冲液(pH3、4、4.5)、醋酸钠缓冲液(pH4、4.5、5、5.5、6、6.5)、磷酸钾缓冲液(pH6、6.5、7、7.5、8、8.5)、Hepes-KOH缓冲液(pH7.5、8、8.5、9、9.5)、CAPS-NAOH缓冲液(pH9、9.5、10)。将SpALD分别溶于100mM的各个缓冲液中，在37℃下孵育30分钟后，按照基本测试条件测定残留活性。结果如图4所示。
(3)温度稳定性
以25～70℃的温度将SpALD放在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)以及100mMHepes-KOH缓冲液(pH8.5)中孵育30分钟后，按照基本测试条件测定残留活性。结果如图5所示。
(4)最适pH值
使用比色法测定在30℃下的PHOG分解活性(图6)。结果表明PHOG羟醛分解反应最合适的pH值为pH7.5左右。
并且，以300mMIPA和750mM丙酮酸为底物，在各个pH条件下测定IHOG的合成活性(反应条件：100mMHepes-KOH(pH8.5)、300mMIPA、750mMPA、1mMMgCl2，37℃，16小时)。从酶添加区的IHOG的生成量减去未添加酶的区的IHOG的生成量的值如图7所示。结果清楚可知，通过SpALD进行IHOG羟醛缩合的最合适pH值为pH8.0左右。
实施例9：通过SpALD合成IHOG
将在37℃下在LB-amp平板培养基上培养了16小时的大肠杆菌JM109/ptr pSpALD细菌通过接种环接种到12个含有50mlLB-amp培养基的500ml的烧瓶中，在37℃下振荡16小时。通过离心分离，从得到的培养液中收集菌体，并悬浮于缓冲液A(20mMHepes-KOH，pH7.6)中并洗涤，然后再次通过离心分离集菌。将通过离心分离制备的菌体(湿菌重量约3g)悬浮于300ml如下组成的反应液中。
IHOG合成反应液：50mMHepes-KOH(pH8.5)、300mM吲哚丙酮酸、750mM丙酮酸钠、1mMMgCl2、5mM磷酸钾缓冲液(pH8.5)(使用6NKOH将pH值调整为8.5)。
在悬浮菌体的反应液中通入氩气，然后，在氩气气氛下进行反应。反应在37℃下搅拌进行20小时。反应结束后，通过离心分离除菌，得到300ml羟醛反应液。
实施例10：羟醛反应液的肟化以及4R-IHOG-肟的分离
在实施例9制备的羟醛反应液中，使用8N氢氧化钠水溶液将pH值保持在9，同时加入18.8g羟铵盐酸盐(270mmol)，在25℃下搅拌3小时，并在10℃下搅拌一夜。通过HPLC分析对所得到的反应液中的IHOG-肟的量进行定量。结果发现在反应液中生成了25mmol的4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸(IHOG-肟)。对4位的不对称性进行分析，确认生成21.4mmol的4R-IHOG-肟、3.6mmol的4S-IHOG-肟，4R异构体以71.3％e.e.的光学纯度优先生成。
使用浓盐酸将所得到的反应液的pH值调整为2，使用乙酸乙酯提取有机物。浓缩有机层，从而得到残渣。向残渣中加入12ml28％的氨水以及25ml的水，加入138ml的2-丙醇进行结晶，得到9.76g(湿重)结晶形式的4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的二铵盐。将所得到的结晶溶解于60ml水中，在50℃下加入50ml的2-丙醇，进而在50℃下，在3小时内滴加150ml的2-丙醇。通过对所得到的结晶进行过滤，并减压干燥得到5.38g(15.8mmol)的IHOG-肟·二铵盐。对所得的结晶4位的不对称性进行分析，4R体的光学纯度为99.0％e.e.，通过2-丙醇结晶可分离得到高纯度的4R-IHOG-肟·铵盐。
实施例11：通过化学还原4R-IHOG-肟生成4R-莫那亭
将5.38g(15.8mmol)实施例10中得到的(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐溶解于60ml28％的氨水中，加入2.84g5％的铑碳(50％含水品)，在室温下以及1MPa的氢气压的条件下进行反应。17小时后过滤催化剂(0.2微米过滤器)，然后在该滤液中溶解1.04g(7.5mmol)的碳酸钾。浓缩该滤液，在25℃下，向得到的15.4g浓缩物中加入20ml乙醇搅拌，再在3小时内滴加30ml的乙醇，然后在25℃温度下搅拌17小时。
将得到的2.93g湿结晶溶解于4ml水中，在35℃下加入8ml乙醇，然后在35℃下，在3小时内滴加17ml乙醇。在4小时内将该溶液冷却至10℃，在10℃下搅拌1小时。减压干燥得到的2.30g湿结晶，得到1.99g目标化合物(2R，4R)-莫那亭钾盐。所得到的莫那亭的光学纯度为99.6％d.e.。
1H NMR(400MHz，D2O)δ：2.06(dd，J＝11.8，15.3Hz，1H)，2.67(dd，J＝2.0，15.2Hz，1H)，3.08(d，J＝14.4Hz，1H)，3.28(d，J＝14.4Hz，1H)，3.63(dd，J＝2.2，12.2Hz，1H)，7.12-7.16(m，1H)，7.20-7.24(m，2H)，7.48-7.49(m，1H)，7.17-7.73(m，1H)。
ESI-MS：计算值C14H16N2O5＝292.29，分析值291.28[M-H]-
实施例12：通过SpALD合成IHOG的改进
将在37℃下在LB-amp平板培养基上培养16小时的大肠杆菌JM 109/ptrpSpALD细菌通过接种环接种到12个含有50mlLB-amp培养基的500ml的烧瓶中，在37℃下振荡16小时。通过离心分离，从得到的培养液中，并悬浮于缓冲液A(20mMHepes-KOH，pH7.6)中进行洗涤，再次通过离心分离集菌。将通过离心分离制备的菌体(湿菌重量约3g)悬浮于300ml如下组成的反应液中。
IHOG合成反应液：50mM磷酸缓冲液(pH8.7)、300mM吲哚丙酮酸、600mM丙酮酸钠、0.1mMMgCl2(使用6NKOH将pH值调整为8.5)。
在悬浮菌体的反应液中通入氩气，然后，在氩气气氛下进行反应。反应在37℃下搅拌进行20小时。反应结束后，通过离心分离，得到300ml去除菌体的羟醛反应液。按照与实施例10相同的方法对所得到的反应液进行肟化，之后使用HPLC测定所生成的IHOG。结果发现，以92.2％e.e.的光学纯度生成63.6mM的4R-IHOG，因而可以通过改善SpALD的反应条件提高4R的选择性。
实施例13：来源于C24菌株(Burkholderia sp.AJ110371)的醛缩酶基因
(buald)的克隆以及通过大肠杆菌的大量表达
由在实施例1中收集的、发现具有4R-醛缩酶活性的富集的菌中的C24菌株获得了编码4R-醛缩酶(以下称为BuALD)的基因。并且，将buald基因连接在ptrp4中，使其通过大肠杆菌JM109大量表达。
(1)染色体DNA的制备
在30℃下，使用50ml的CM2G培养基将C24菌株(Burkholderia sp.AJ110371)培养过夜(预培养)。然后以5ml该培养液作为种菌，使用50ml肉汤培养基进行培养。达到对数增殖期之后，对50ml培养液进行离心分离操作(12000xg，4℃，15分钟)，集菌。使用该菌体按照标准方法制备染色体DNA。
(2)通过Southern分析·克隆杂交得到buald基因
使用编码全长SpALD基因的DNA片段作为引物，通过Southern分析·克隆杂交得到buald基因。使用表9所示的引物(序列号10和11)通过PCR从C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329)的染色体DNA扩增全长的spald基因。使用扩增的片段为DNA探针，用DIG High Prime(Roche Diagnostics公司制备)，按照说明书，在37℃下孵育过夜标记探针。Southern分析按照如下方法进行：使用各种限制酶将1μg由C24菌株制备的染色体DNA完全消化，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，然后印迹到尼龙膜上，以下按照手册进行操作。杂交使用DIGEasy Hyb(Roche Diagnostics公司制备)进行，在50℃下预杂交1小时后加入探针，使其杂交过夜。使用DIG Nucleotide Detection Kit进行带的检测。结果检测出与作为探针的该PCR片段强杂交的约2.3kbp的PstI/SamI片段。接着，通过克隆杂交获得该PstI/SamI片段。将20μg的染色体DNA经PstI/SamI处理后进行琼脂糖凝胶电泳中，回收大约2.3kbp大小的片段。将其连接到pUC18中，使用大肠杆菌JM109制备文库。转移到尼龙薄膜(Hybond-N，Amersham公司制备)过滤器，进行碱变性、中和、固定化处理。杂交是使用DIG Easy Hyb进行的。将滤器浸没在缓冲液中，在42℃下杂交1小时。然后，加入制备的标记探针，在42℃下杂交16小时。使用SSC洗涤，然后使用DIG NucleotideDetection Kit(Roche Diagnostics公司制备)检测与探针杂交的克隆。结果得到与探针强杂交的克隆。
由得到的克隆回收质粒DNA，测定其碱基序列，可清楚知道具有序列号14所述的碱基序列，得到全长的目标buald基因。
(3)醛缩酶基因表达质粒ptrpBuALD的构建与通过E.coli的表达
使用如表10所示的引物(序列号19和20)对从C24菌株(Burkholderia sp.AJ110371)的染色体DNA扩增的片段进行NdeI/PstI消化，插入到pTr p4的NdeI/PstI位点构建质粒ptrp BuALD。该质粒表达包含序列号15的氨基酸序列的醛缩酶的基因，所述氨基酸序列是通过翻译序列号14所述碱基序列中由作为翻译起始密码子的第531位的ATG至第1385位的序列所得。
表10ptrpBuALD组成用引物序列
| C24ALD5’Nde(序列号19)C24ALD3’Pst(序列号20) | ATC CAT ATG TCC AAC ATT CGC CTC AAC AGC(30MER)CGC CTG CAG TCA GTA GCC AGC CAT ATC GCG CGC(33MER) |
将所构建的表达质粒转化大肠杆菌JM109，将转化子用接种环接种到包含100μg/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基中，在37℃下振荡16小时。培养结束后，集菌、洗涤1ml所得到的培养液，将其悬浮于1ml的20mMHepes-KOH(pH7.6)中，通过超声波破裂破裂菌体。以15000rpm的速度离心分离10分钟破裂液，将得到的上清液作为粗酶液。
使用该粗酶液测定醛缩酶活性。醛缩酶的活性测试是：以PHOG为底物，在如下条件下测定羟醛分解活性。
反应条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNADH、0.2mMKPi、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，30℃，测定340nm的吸光度。
检测结果：在用pTrp4转化的E.coli(对照组)中没有检出醛缩酶活性，而在用ptrpBuALD转化的细胞株中检测出231U/mg蛋白质的醛缩酶活性。这样，可以确认通过与BuALD高表达质粒的构建，确实克隆了醛缩酶基因。
实施例14：来源于C24菌株(伯克氏菌AJ110371)的重组醛缩酶的纯化
按照如下方法从高表达来源于C24菌株(伯克氏菌AJ110371)的醛缩酶(BuALD)的E.coli的可溶性组分中纯化重组的BuALD。醛缩酶的活性测试是：在如下条件下测定以PHOG为底物的羟醛分解活性。
反应条件：50mMHepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNAD、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，30℃，测定340nm的吸光度。
(1)可溶性组分的制备
将在37℃下，在LB-amp平板培养基上培养了16小时的大肠杆菌JM109/ptr pBuALD细菌通过接种环接种到10个含有50mlLB-amp培养基的500ml的烧瓶中，在37℃下振荡16小时。通过离心分离，从所得到的培养液中集菌，并悬浮于缓冲液A(20mM Hepes-KOH(pH7.6))中并洗涤，再次通过离心分离集菌。将所得到的洗净菌体悬浮于20ml的缓冲液A中，在4℃下超声破裂30分钟。通过对破裂液进行离心分离(×8000rpm，10分钟×2次)除去菌体残渣，将得到的上清液作为可溶性组分。
(2)阴离子交换色谱：Q-Sepharose FF
将20ml的上述可溶性组分放入经缓冲剂A平衡化的阴离子交换色谱柱Q-Sepharose FF 26/10(Pharmacia公司制备，CV＝20ml)中使其吸附到载体上。使用缓冲液A洗脱未吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，使用浓度由0M线性变化到0.7M(总计140ml)的KCl洗脱吸附的蛋白质。检测各个溶出成分中醛缩酶的活性，在相当于大约0.35M的组分中检测到PHOG醛缩酶活性的峰。
(3)疏水性色谱：苯基Sepharose HP HR 16/10
在4℃下，将检测出醛缩酶活性的溶液相对于缓冲液B(20mMHepes-KOH、1M的硫酸铵，pH7.6)透析过夜，并使用0.45μm的滤膜过滤。将所得到的滤液倒入经缓冲液B平衡化的疏水性色谱柱Sepharose HP HR 16/10(Pharmacia公司制备)。通过该操作，醛缩酶吸附到载体上。
使用缓冲液B洗脱未吸附到载体上的蛋白质之后，使用浓度由1M线性变化到0M的硫酸铵进行洗脱。测定各个洗脱组分的醛缩酶活性，确认硫酸铵浓度为0.4～0.5M的溶出位置时具有醛缩酶活性。
(4)凝胶过滤色谱：Sephadex 200HP 16/60
分别收集包含醛缩酶的组分，相对于缓冲液A进行透析，使用0.45μm的滤膜过滤。使用超滤膜centriprep 10对得到的滤液进行浓缩。将得到的浓缩液倒入经缓冲液C(20mM Hepes-KOH、0.1M的KCl，pH7.6)平衡化的凝胶过滤色谱Sephadex 200HP 16/60(Pharmacia公司制备)中，以1ml/min的速度洗脱。由该操作确定，醛缩酶在66ml附近的组分中溶出。
(5)阴离子交换色谱：Mono Q HR 5/5
使用0.45μm的过滤膜过滤所得到的组分。其中，将所得到的滤液倒入经缓冲液A平衡化的阴离子交换色谱柱Mono Q HR 5/5(Pharmacia公司制备)中。通过该操作，醛缩酶吸附在载体上。通过缓冲液A将非吸附蛋白质洗脱出来，然后通过将KCl的浓度由0mM线性变化到700mM进行蛋白质的洗脱(总共24ml)。测量各个洗脱组分的醛缩酶活性确认KCl浓度大约为0.4M的洗脱位置具有醛缩酶活性。
将上述经柱色谱纯化的组分进行SDS-PAGE，检测出在相当于大约30kDa的位置经CBB染色的单一带。将所得到的重组BuALD溶液相对于缓冲液A在4℃下透析过夜。通过上述操作，得到1.5ml1241U/ml的BuALD溶液。
实施例15：BuALD的各种酶学性质
使用实施例14制备的BuALD对如下所示的项目进行研究。
基本测试条件：50mM Hepes-KOH(pH8.5)、2mM PHOG、5mM MgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、在30℃下，测定340nm的吸光度的减少量。
(1)以PHOG为底物的动力学常数
从图8-1和图8-2所示的结果，分别测定Vmax(PHOG)＝483μmol/min/mg、Km(PHOG)＝0.66mM、Km(MgCl2)＝0.021mM。并且确认，没有由于加入KPB，使醛缩酶的活性得到提高。
(2)pH稳定性
测定pH3～10范围内的稳定性。测定中所使用的缓冲液如下所示。柠檬酸钠缓冲液(pH3、4、4.5)、醋酸钠缓冲液(pH4、4.5、5、5.5、6、6.5)、磷酸钾缓冲液(pH6、6.5、7、7.5、8、8.5)、Hepes-KOH缓冲液(pH7.5、8、8.5、9、9.5)、CAPS-NAOH缓冲液(pH9、9.5、10)。将BuALD分别溶于100mM的各个缓冲液中，在37℃下孵育30分钟后，按照使用基本测试条件测定残留活性。结果如图9所示。
(3)温度稳定性
以25～70℃的温度将BuALD放在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)以及100mM Hepes-KOH缓冲液(pH8.5)中孵育30分钟后，按照基本测试条件测定残留活性。结果如图10所示。
实施例16：通过BuALD及SpALD进行IHOG的合成与肟化
将在37℃下在LB-amp平板培养基上培养了16小时的大肠杆菌JM109/ptr BuALD或者大肠杆菌JM 109/ptrpSpALD细菌通过接种环接种到4个含有50ml的LB-amp培养基的500ml的烧瓶中，在37℃下振荡16小时。通过离心分离，从得到的培养液中集菌，并悬浮于缓冲液A(20mM Hepes-KOH，pH7.6)中进行洗涤，再次通过离心分离集菌。将通过离心分离将制备的菌体(湿菌重量约1g)悬浮于100ml如下组成的反应液中。
IHOG合成反应液：50mMKPB(pH8.0)、300mM吲哚丙酮酸、600mM丙酮酸钠、0.1mMMgCl2(使用6NKOH将pH值调整为8.0)。
在悬浮菌体的反应液中通入氩气，然后在37℃下搅拌进行反应18小时。反应结束后，通过离心分离，得到约100ml除菌的羟醛反应液。
在得到的约96ml的羟醛反应液中，使用6N氢氧化钠水溶液将pH值保持在9，同时加入羟胺盐酸盐6.25g(90mmol)，在25℃下搅拌6小时后，在10℃下搅拌过夜。通过HPLC分析定量得到的反应液中的IHOG-肟。结果发现在(表11)BuALD区以及SpALD区内，优先生成4R-IHOG-肟。
表11
| 4R-IHOG(mM) | 4S-IHOG(mM) | 4R收率(％) | 4Re.e.(％) | |
| BuALDSpALD | 70.671.4 | 12.42.1 | 23.523.8 | 70.294.3 |
实施例17：来源于C43菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110372)的醛缩酶基因
(SpALD2)的克隆以及通过大肠杆菌的大量表达
由在实施例1中收集的、发现具有4R-醛缩酶活性的富集菌中的鞘氨醇单胞菌C43菌株获得了编码4R-醛缩酶(以下称为SpALD2)的基因。并且，将spald2基因连接在ptr p4中，使其通过大肠杆菌JM109大量表达。
(1)染色体DNA的制备
在30℃下，使用50ml的CM2G培养基C43菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110372)培养过夜(预培养)。然后以5ml该培养液作为种菌，使用50ml肉汤培养基进行培养。达到对数增殖期之后，对50ml培养液进行离心分离操作(12000xg，4℃，15分钟)，集菌。使用该菌体按照标准方法制备染色体DNA。
(2)通过Southern分析·克隆杂交得到buald基因
使用编码全长SpALD基因的DNA片段作为引物，通过Southern分析·克隆杂交得到spald2基因。使用表9所示的引物(序列号10和11)通过PCR从C77菌株(鞘氨醇单胞菌AJ110329)的染色体DNA扩增全长spald基因。使用扩增的片段的DNA探针，用DIG High Prime(Roche Diagnostics公司制备)，按照说明书，在37℃下孵育过夜标记探针。Southern分析按照如下方法进行：使用各种限制酶将1μg由C43菌株制备的染色体DNA完全消化，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，然后印迹到尼龙膜上，以下按照手册进行操作。杂交使用DIG Easy Hyb(Roche Diagnostics公司制备)进行，在50℃下预杂交1小时后加入探针，使其杂交过夜。使用DIG Nucleotide Detection Kit进行带的检测。结果检测出与作为探针的该PCR片段强杂交的约3kbp的PstI片段。接着，通过克隆杂交获得该PstI片段。将20μg的染色体DNA经PstI处理后进行琼脂糖电泳中，回收大约3kbp大小的片段。将其连接到pUC118中，使用大肠杆菌JM109制备文库。转移到尼龙薄膜(Hybond-N，Amersham公司制备)过滤器，进行碱变性、中和、固定化处理。杂交是使用DIG Easy Hyb进行的。将滤器浸没在缓冲液中，在42℃下杂交1小时。然后，加入制备的标记探针，在42℃下杂交16小时。使用SSC洗涤，然后使用DIG Nucleotide Detection Kit(Roche Diagnostics公司制备)检测与探针杂交的克隆。结果得到与探针及强杂交的克隆。
由得到的克隆回收质粒DNA，测定其碱基序列，可清楚知道具有序列号12所述的碱基序列，得到全长的目标spald2基因。
(3)醛缩酶基因表达质粒pUCSpALD2的构建与通过E.coli的表达
使用如表12所示的引物(序列号21和22)对从鞘氨醇单胞菌C43菌株的染色体DNA扩增的片段进行EcoRI/PstI消化，插入到pUC18的EcoRI/PstI位点构建质粒pUC SpALD2。该质粒表达包含序列号13的氨基酸序列的醛缩酶基因，所述氨基酸序列是通过翻译序列号12所述碱基序列中作为翻译起始密码子的第399位ATG至1253位的序列所得。
表12pUCSpALD2组成用引物序列
| SpALD2_Eco(序列号21)SpALD2_ter_Pst(序列号22) | CCG GAA TTC CAT GAA GGA ATG ATC TGA GAT GAC C(34MER)AAA AAC TGC AGC TAG TAG CCC GCC AGT TCG CGACCC(36MER) |
将所构建的表达质粒转化大肠杆菌JM109中，将转化子用接种环接种到含有100μg/ml氨苄青霉素、0.1mM异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖甙(IPTG)的50ml培养基LB中，在30℃下振荡16小时。培养结束后，集菌、洗涤1ml所得到的培养液，将其悬浮于1ml的20mMHepes-KOH(pH7.6中)，通过超声波破裂破裂菌体。以15000rpm的速度离心分离10分钟破裂液，将得到的上清液作为粗酶液。
使用该粗酶液测定醛缩酶活性。醛缩酶的活性测试是：以PHOG为底物，在如下条件下测定羟醛分解活性。
反应条件：Hepes-KOH(pH8.5)、2mMPHOG、0.25mMNADH、1mMMgCl2、16U/ml乳酸盐脱氢酶、3μl酶/600μl反应液，30℃，测定340nm的吸光度。
检测结果：在用pUC18转化的E.coli(对照组)中没有检出醛缩酶活性，而在用pUC SpALD2转化的细胞株中检测出0.68U/mg蛋白质的醛缩酶活性。这样，可以确认通过与SpALD2高表达质粒的构建，确实克隆了醛缩酶基因。
实施例18：通过SpALD2合成IHOG和IHOG-肟
将在30℃下在LB-amp平板培养基上培养了16小时的大肠杆菌JM109/pUC SpALD2细菌通过接种环上，将其接种到4个含有100μg/ml的氨苄青霉素、0.1mM IPTG的50mlLB培养基的500ml的烧瓶中，在34℃下振荡16小时。通过离心分离，从所得到的培养液中集菌，并悬浮于缓冲液A(20mMHepes-KOH，pH7.6)中进行洗涤，再次通过离心分离集菌。将通过离心分离将所制备的菌体(湿菌重量约1g)悬浮于100ml如下组成的反应液中。
IHOG合成反应液：50mMKPB(pH8.0)、300mM吲哚丙酮酸、600mM丙酮酸钠、0.1mMMgCl2(使用6NKOH将pH值调整为8.0)。
在悬浮菌体的反应液中通入氩气，然后，在37℃下搅拌进行反应18小时。反应结束后，通过离心分离，得到约100ml除菌的羟醛反应液。
在得到的约96ml羟醛反应液中，加入50％羟胺水溶液5.95ml(90mmol)，在25℃下搅拌6小时并在10℃温度下搅拌过夜。通过HPLC分析定量得到的反应液中的IHOG-肟进行。结果发现在反应液中生成了3.84mmol的4R-IHOG-肟，0.15mmol的4S-IHOG-肟，以光学纯度为92.4％e.e.的光学产率优先生成4R异构体。
参考例1：4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-氧代戊二酸(IHOG)的合成
在溶解有18.91g氢氧化钾(286.5mmol，含量85重量％)的64.45ml水中，加入7.50g吲哚-3-丙酮酸(35.8mmol，97.0重量％)和14.18g草酰乙酸(107.4mmol)并使其溶解。在35℃下搅拌该混合溶液24小时。
并且，加入40.0ml的3N-盐酸进行中和(pH7.0)，得到153.5g的反应中和液。在该反应中和液中含有5.55g的4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-氧代戊二酸，产率为53.3％(相对于吲哚丙酮酸而言)。
向该反应中和液中加入水，使其达到168ml，将其导入以840ml合成吸附剂(三菱化学制备DIAION-SP207)填充的树脂塔(直径4.8cm)中。并且以23.5ml每分钟的速度导入纯水，通过收集1.73～2.55(L/L-R)，以54.7％(相对于树脂的加入量)得到含有3.04g高纯度4-羟基-4-(3-吲哚甲基)-2-氧代戊二酸的水溶液。(NMR测定)
1H-NMR(400MHz，D2O)：3.03(d，1H，J＝14.6Hz)，3.11(d.，1H，J＝14.6Hz)，3.21(d，1H，J＝18.1Hz)，3.40(d，1H，J＝18.1Hz)，7.06-7.15(m，3H)，7.39(d，1H，J＝7.8Hz)，7.66(d，1H，J＝7.8Hz)。
13C-NMR(100MHz，D2O)：35.43，47.91，77.28，109.49，112.05，119.44，119.67，121.91，125.42，128.41，136.21，169.78，181.43，203.58。
参考例2：4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(PHOG)的合成
在溶解有13.8g氢氧化钾(纯度85％)的25ml水中，加入5.0g苯基丙酮酸(30.5mmol)、12.1g草酰乙酸(91.4mmol)，并在室温下反应72小时。使用浓盐酸将反应液的pH值调整到2.2，用乙酸乙酯萃取。用饱和食盐水洗涤有机层，以无水硫酸镁干燥，浓缩后得到残渣。使用乙酸乙酯和甲苯对残渣进行再结晶，得到2.8g(11.3mmol)结晶状的4-苯基甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸。
(NMR测试)
1H-NMR(D2O)δ：2.48(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.60(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.85-3.30(m，3.64H)，7.17-7.36(m，5H)。
(分子量测试)
ESI-MS计算值：C12H12O6＝252.23，分析值：251.22(MH-)
参考例3：4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的制备
在917g 1.6重量％的氢氧化钠水溶液中，加入73.8g(352mmol)吲哚-3-丙酮酸并溶解。将反应溶液加热到35℃，使用30％的氢氧化钠水溶液将pH值保持在11.1，同时在2小时时间内滴加310.2g 50％的丙酮酸水溶液(1761mmol)。再反应4.5小时，得到含有4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-氧代戊二酸的水溶液。使用30％的氢氧化钠水溶液将pH值保持在7，同时向其中加入367.2g(2114mmol)的40％羟胺盐酸盐水溶液，在5℃下搅拌17.5小时。使用浓盐酸反应液的pH值调整到2，使用乙酸乙酯萃取出有机物。以饱和食盐水洗涤有机层，浓缩得到残渣。使用60ml28％的氨水和1350ml 2-丙醇将残渣再结晶，得到43.4g(142mmol，相对于吲哚-3-丙酮酸的产率为40％)结晶形式的4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的二胺盐。
参考例4：(4S)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氮基戊二酸的(R)-(+)-1-苯乙胺盐的制备
在25℃下将44.7g(0.131mol)的4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐溶解于500ml的水中，然后，使用25.5g36％的盐酸将该水溶液的pH值调整到2。使用1300ml乙酸乙酯萃取酸性溶液，再以200ml饱和食盐水洗涤该醋酸乙酯溶液。在得到的醋酸乙酯溶液中加入500ml碳酸钠水溶液(碳酸钠13.9g，0.131mol)并搅拌，分离碱水溶液和乙酸乙酯。在得到的碱水溶液中加入23.1g36％的盐酸并将其pH值调节到2。在25℃下滴加6.99g(57.6mmol)(R)-(+)-1-苯乙胺并搅拌1小时。过滤所得到的结晶，减压干燥，从而得到21.8g(47.8mmol)(4S)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的(R)-(+)-1-苯乙铵盐(产率72.7％，光学纯度87.4％)。
(NMR测试)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.48(d，3H，J＝6.8Hz)，2.63(d，1H，J＝14.0Hz)，2.70(d，1H，J＝14.0Hz)，2.90(d，1H，J＝14.1Hz)，3.06(d，1H，J＝14.1Hz)，4.40(q，1H，J＝6.8Hz)，6.91-7.54(m，10H)。
参考例5：(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的(S)-(-)-1-苯乙铵盐的制备
在25℃下，再向参考例4所得到的结晶滤液中，滴加7.12g(58.7mmol)(S)-(-)-1-苯乙胺并搅拌1小时。过滤得到的结晶，减压干燥，从而得到23.8g(53.3mol)(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚胺戊二酸的(S)-(-)-1-苯乙铵盐(产率81.1％，光学纯度92.1％)。
参考例6
(1)(4S)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐的制备
在25℃下，在21.8g(51.0mmol)的(4S)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的(R)-(+)-1-苯乙铵盐中加入200ml水和18.5g28％的氨水使其溶解，然后再加入200ml甲苯并搅拌。将分层得到的水层加热到60℃，在2小时内向该水溶液中滴加900ml2-丙醇。在5小时内将该2-丙醇水溶液冷却到10℃，在10℃温度下搅拌10小时。过滤得到的结晶，减压干燥，从而得到14.75g(4S)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚胺戊二酸的铵盐(产率85.1％，光学纯度99.0％)。
熔点：205℃(分解)
比旋光度[α]20 D+13.4(c＝1.00，H2O)
(2)(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐的制备
和上述参考例一样，从23.8g(53.3mmol)的(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的(R)-(+)-1-苯乙铵盐得到16.2g(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐(产率89.3％，光学纯度99.9％)。
比旋光度[α]20 D-13.6(c＝1.00，H2O)
参考例7：(2R，4R)莫那亭的制备
将13.2g(38.7mmol)参考例6中得到的(4R)-4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸的铵盐溶解于135ml28％的氨水中，加入6.93g5％的铑碳(50％含水品)，在25℃下，在1MPa的氢气压下进行反应。24小时后过滤催化剂(0.2微米滤膜)，在该过滤液中溶解2.54g(18.4mmol)碳酸钾。浓缩该溶液，并在32.7g得到的浓缩物中加入20ml水以及45ml乙醇，并在25℃下搅拌，再在3小时内滴加60ml的乙醇，在25℃下搅拌20小时进行结晶。将9.78g得到的湿结晶溶解在12ml的水中，添加24ml乙醇后，再在3小时内滴加51ml乙醇，在4小时内将乙醇溶液冷却到15℃，然后在15℃下搅拌10分钟。减压干燥7.08g得到的湿结晶，得到5.7g目标产物(2R，4R)莫那亭的钾盐。
工业实用性
如上所述，通过使用本发明的醛缩酶，可以光学选择性地生成IHOG和PHOG。本发明的醛缩酶在莫那亭合成路线的羟醛缩合阶段中，可以有效地引入不对称中心，能够适合用于光学活性IHOG和光学活性莫那亭的制备。
附图说明
图1：本发明醛缩酶同源性比较的示意图。
图2：表示本发明醛缩酶制备步骤的流程图。
图3-1：表示以SpALD的PHOG为底物的反应速度的图表。
图3-2：表示相对于SpALDMgCl2浓度的反应速度的图表。
图4：表示SpALDpH稳定性的测试结果的图表。
图5：表示SpALD温度稳定性的测试结果的图表。
图6：表示SpALD羟醛分解活性中反应最适宜的pH值的图表。
图7：表示SpALD羟醛缩合活性中反应最适合的pH值的图表。
图8-1：表示以BuALD的PHOG为底物的反应速度的图表。
图8-2：表示相对于BuALDMgCl2浓度的反应速度的图表。
图9：表示BuALD的pH稳定性的测试结果的图表。
图10：表示BuALD的温度稳定性的测试结果的图表。
序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>新的醛缩酶及光学活性IHOG及莫那亭的制备方法
<130>PAMA-05075(C-386)
<150>JP 2004-169188
<151>2004-06-07
<150>JP 2004-375769
<151>2004-12-27
<160>23
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1449
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌
<220>
<221>CDS
<222>(210)..(1004)
<223>
<400>1
ggatccccgc cttcgcgggg atgacggact gatttgttga gccgtgggtg atatttctcg 60
cggtcggacg ggagagtgag ggatcactcc cgggcaggtt ccaaaacgga cctgccggtt 120
tttcgatggc ggcggtcgcc ggatcaatcg cgcgatgccg cccgggacga ggtacgggca 180
gagcaagccc gaaaggaaag atccaagca atg acc cag acg cgc ctc aac ggc 233
Met Thr Gln Thr Arg Leu Asn Gly
1 5
atc atc cgc gct ctc gaa gcc ggc aag ccc gct ttc acc tgc ttc tcg 281
Ile Ile Arg Ala Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ala Phe Thr Cys Phe Ser
10 15 20
aag gtc gac aag ctg acc gcg cag gaa ctg acc gat gcc ccc tat gac 329
Lys Val Asp Lys Leu Thr Ala Gln Glu Leu Thr Asp Ala Pro Tyr Asp
25 30 35 40
ggc gtg gtc ttc gag atg gag cac aac ccc tac gat gtc gcg gcg ctg 377
Gly Val Val Phe Glu Met Glu His Asn Pro Tyr Asp Val Ala Ala Leu
45 50 55
ggt gat gct ctc cag tac atg ctc aac cgc aag aag atc gcc gaa agc 425
Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu Asn Arg Lys Lys Ile Ala Glu Ser
60 65 70
ggt tcg gtc gcg ccc tcg gtc acc ccc atc gcg cga atc ccg gcc aat 473
Gly Ser Val Ala Pro Ser Val Thr Pro Ile Ala Arg Ile Pro Ala Asn
75 80 85
ggc ggt gag atg aac cag ttc caa gcc aag cag gtg ctg gat cgc ggc 521
Gly Gly Glu Met Asn Gln Phe Gln Ala Lys Gln Val Leu Asp Arg Gly
90 95 100
gtc tac ggc gtg atc acg ccg cac gtt tcg acc gtg gag cag gcc tac 569
Val Tyr Gly Val Ile Thr Pro His Val Ser Thr Val Glu Gln Ala Tyr
105 110 115 120
aac atg gtc gct tcc gcc cgc tat gcg aag ccg acc ggc gcc gcg ctc 617
Asn Met Val Ala Ser Ala Arg Tyr Ala Lys Pro Thr Gly Ala Ala Leu
125 130 135
tac gaa ccc aag ggc att cgc ggc gac ggc ccg gcc acg gcc gcg cgc 665
Tyr Glu Pro Lys Gly Ile Arg Gly Asp Gly Pro Ala Thr Ala Ala Arg
140 145 150
tat tgg ggc ctg tcg cag ccg gaa tac tac gcc aag gcc gac gtc tgg 713
Tyr Trp Gly Leu Ser Gln Pro Glu Tyr Tyr Ala Lys Ala Asp Val Trp
155 160 165
ccg ctg gcg ccg cat ggc gaa cta ctg gtg ggc atg atg tgc gag agt 761
Pro Leu Ala Pro His Gly Glu Leu Leu Val Gly Met Met Cys Glu Ser
170 175 180
ccc gag gcg atc gag aac ctc gac gac att ctc gcc aat gtc ccc ggc 809
Pro Glu Ala Ile Glu Asn Leu Asp Asp Ile Leu Ala Asn Val Pro Gly
185 190 195 200
atc ggc ctc gtg ctg atc ggt gag ggc gat ctc agc cag gcg ctg ggc 857
Ile Gly Leu Val Leu Ile Gly Glu Gly Asp Leu Ser Gln Ala Leu Gly
205 210 215
tac ccg cgc cag tac gac cac ccg gaa gtg gtc agc gcg atg aac agg 905
Tyr Pro Arg Gln Tyr Asp His Pro Glu Val Val Ser Ala Met Asn Arg
220 225 230
atc gtc gag gtc tgc aag aag cac aac gtc gtc gtc ggc aac ccg cac 953
Ile Val Glu Val Cys Lys Lys His Asn Val Val Val Gly Asn Pro His
235 240 245
acc aac gcc aag aac gtc gag cgc ctg atc ggc gag ggc tac cgc ttc 1001
Thr Asn Ala Lys Asn Val Glu Arg Leu Ile Gly Glu Gly Tyr Arg Phe
250 255 260
ctg atgtccgcgc cgacgcgcag ctacggcgtg gtcggtcagg gccgcgaact 1054
Leu
265
ggcggggtac tgaccatggc caatggtgca gaaaccctcg tcaacacgct ggtcgacaac 1114
ggtgtggagg tttgcttcgc gaaccccggc acttcggaaa tgcacttcct ggcggcgctc 1174
gacaatccgc gcatgaagtc ggtgctgtgc ctttacgaag gcgtctgcac cggcgcggcg 1234
gatggctggt accggatgaa ggacgtgccg gcatcgaccc tgctgcatct ggggccgggt 1294
ctcgccaacg gcctgtccaa catccacaac gccaagcgcg cctcgtccgg catggtcaac 1354
atcgtcggcg agcactcggc atcgcacctg aagtacgatc cgccgctgac ctccgacatc 1414
gaggggctgg ccgcccgctc agccactggg tgcgc 1449
<210>2
<211>265
<212>PRT
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>2
Met Thr Gln Thr Arg Leu Asn Gly Ile Ile Arg Ala Leu Glu Ala Gly
1 5 10 15
Lys Pro Ala Phe Thr Cys Phe Ser Lys Val Asp Lys Leu Thr Ala Gln
20 25 30
Glu Leu Thr Asp Ala Pro Tyr Asp Gly Val Val Phe Glu Met Glu His
35 40 45
Asn Pro Tyr Asp Val Ala Ala Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu
50 55 60
Ash Arg Lys Lys Ile Ala Glu Ser Gly Ser Val Ala Pro Ser Val Thr
65 70 75 80
Pro Ile Ala Arg Ile Pro Ala Asn Gly Gly Glu Met Asn Gln Phe Gln
85 90 95
Ala Lys Gln Val Leu Asp Arg Gly Val Tyr Gly Val Ile Thr Pro His
100 105 110
Val Ser Thr Val Glu Gln Ala Tyr Asn Met Val Ala Ser Ala Arg Tyr
115 120 125
Ala Lys Pro Thr Gly Ala Ala Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Ile Arg Gly
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Thr Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Gln Pro Glu
145 150 155 160
Tyr Tyr Ala Lys Ala Asp Val Trp Pro Leu Ala Pro His Gly Glu Leu
165 170 175
Leu Val Gly Met Met Cys Glu Ser Pro Glu Ala Ile Glu Asn Leu Asp
180 185 190
Asp Ile Leu Ala Asn Val Pro Gly Ile Gly Leu Val Leu Ile Gly 6lu
195 200 205
Gly Asp Leu Ser Gln Ala Leu Gly Tyr Pro Arg Gln Tyr Asp His Pro
210 215 220
Glu Val Val Ser Ala Met Asn Arg Ile Val Glu Val Cys Lys Lys His
225 230 235 240
Asn Val Val Val Gly Asn Pro His Thr Asn Ala Lys Asn Val Glu Arg
245 250 255
Leu Ile Gly Glu Gly Tyr Arg Phe Leu
260 265
<210>3
<211>17
<212>PRT
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>3
Gly Val Tyr Gly Val Ile Thr Pro His Val Ser Thr Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Tyr
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>4
Tyr Trp Gly Leu Ser Gln Pro Glu Tyr Tyr Ala Lys
1 5 10
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>混合引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(32)
<223>y代表c或t/u；n代表a，c，g，t/u；w代表a，
t/u；s代表c，g；b代表c，g，t/u；和r代表
a，g.
<400>5
atycanccnc aygtnwsbca ngtngarcar gc 32
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>混合引物2
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>r代表a，g；y代表c或t/u；v代表a，c，g；s
代表c，g；w代表a，t/u；和n代表a，c，g，
t/u.
<400>6
gcrtartayt cnggytgvsw varncccc 28
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>5′引物
<400>7
gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>3′引物
<400>8
ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>3′引物-2
<400>9
ggggggggca tatgcgacct ccttattacg tgaacttg 38
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>10
ggccatatga cccagacgcg cctcaacggc atcatcc 37
<210>11
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>11
gcgctgcagt cagtaccccg ccagttcgcg gccctgacc 39
<210>12
<211>2470
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌
<220>
<221>CDS
<222>(399)..(1253)
<223>
<400>12
cggcaaggcg ctggtcgatg cggtgaaggc gtggaagagc gatgcccgcg tcgccatcat 60
cgcctcgggc gggctcaccc atttcgtctg cgacccggac ctcgacaagg tcttcatcga 120
tgcgctgggc agctatgatt tcgacacgct ggaggggatc gacaaccgct cctaccagtc 180
gggcacgtcg gaggtgaagc tctattgctc ggtgctggtc gcgatgcagg aatccaacac 240
ccagatgacc ttggtcgact atgtcccctg cctgcgcacg gcggcgggca ccggcgaggg 300
catgggcttc atgtattgga gcccggcggc cgcctgatcc tgacaccctg atacaagatc 360
ccccggccgc atcgccgggc atgaaggaat gatctgag atg acc gac aat cgc ctc 416
Met Thr Asp Asn Arg Leu
1 5
aac ggc gtg atc cgc gcc tgg gaa cag ggc aag ccc gcc ttc gcc gcc 464
Asn Gly Val Ile Arg Ala Trp Glu Gln Gly Lys Pro Ala Phe Ala Ala
10 15 20
ttt tcc aag gtc gac aag ctg acc gcc cag gaa atg acc gac gcc ccc 512
Phe Ser Lys Val Asp Lys Leu Thr Ala Gln Glu Met Thr Asp Ala Pro
25 30 35
tat gac ggc atc gtc ttc gag atg gag cat aac ccc tat gat gtc ggg 560
Tyr Asp Gly Ile Val Phe Glu Met Glu His Asn Pro Tyr Asp Val Gly
40 45 50
ggc ctg ggc gac gcg ctc cag tac atg ctc aac cgc aag aag atc gcc 608
Gly Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu Asn Arg Lys Lys Ile Ala
55 60 65 70
gaa agc gga tcg gtc gcg ccc tcg gtc acg ccg ctg gcg cgc atc cct 656
Glu Ser Gly Ser Val Ala Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Arg Ile Pro
75 80 85
gct aat ggc gcg gaa atg aac cag ttt cag gcc aag cag gtg ctg gac 704
Ala Asn Gly Ala Glu Met Asn Gln Phe Gln Ala Lys Gln Val Leu Asp
90 95 100
cgg ggc gtc tat ggc gtc atc acc ccc cat gtc tcg acc gtc gag cag 752
Arg Gly Val Tyr Gly Val Ile Thr Pro His Val Ser Thr Val Glu Gln
105 110 115
gcg tgg aac gcg gtc gcc tcc tgc cgc tat gcc aag ccc aag ggc gcg 800
Ala Trp Asn Ala Val Ala Ser Cys Arg Tyr Ala Lys Pro Lys Gly Ala
120 125 130
gcc ctc tac gaa ccc aag ggc att cgc ggc gat ggc ccg gcg acg gcg 848
Ala Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Ile Arg Gly Asp Gly Pro Ala Thr Ala
135 140 145 150
gca cgc tat tgg ggc ctg tcg cag ccc gat tat tat gcc agg gcc gac 896
Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Gln Pro Asp Tyr Tyr Ala Arg Ala Asp
155 160 165
gtc tgg ccg ctc gcc ccg cat ggc gaa ttg ctg gtc ggc atg atg tgc 944
Val Trp Pro Leu Ala Pro His Gly Glu Leu Leu Val Gly Met Met Cys
170 175 180
gaa agc ccc gag gcg atc gac aat ctc gac gat atc ctg tcc gac gta 992
Glu Ser Pro Glu Ala Ile Asp Asn Leu Asp Asp Ile Leu Ser Asp Val
185 190 195
ccg ggc atc ggc ctg gtg ctg atc ggc gag ggc gac ctt agc cag gcg 1040
Pro Gly Ile Gly Leu Val Leu Ile Gly Glu Gly Asp Leu Ser Gln Ala
200 205 210
ctc ggc tat ccc cgc cag tac gag cat ccc gag gtg ctc gat gcg atg 1088
Leu Gly Tyr Pro Arg Gln Tyr Glu His Pro Glu Val Leu Asp Ala Met
215 220 225 230
cgc cgg atc gtc gag acc tgc cac aag cac aag gtc gcg gtc ggc aat 1136
Arg Arg Ile Val Glu Thr Cys His Lys His Lys Val Ala Val Gly Asn
235 240 245
ccg cac acc aat gcc aag aat gtc gag cgc ctg ctg ggc gag ggc tac 1184
Pro His Thr Asn Ala Lys Asn Val Glu Arg Leu Leu Gly Glu Gly Tyr
250 255 260
aag ttc ctg atg tcc gcg ccc agc cgc agc tat ggc gtg gtc ggt cag 1232
Lys Phe Leu Met Ser Ala Pro Ser Arg Ser Tyr Gly Val Val Gly Gln
265 270 275
ggt cgc gaa ctg gcg ggc tac tagagcctga tcgtctgagg tggaagcgct 1283
Gly Arg Glu Leu Ala Gly Tyr
280 285
gcttccaccg atggcgtgaa tcaggctcta atcgtagatt cccgaatttc agcacgacga 1343
aaaacaccga ctccggagca gggcgctccg ggaaaggcgg tcggctgccg gtcatcgacc 1403
ggcgccgaag ctatcgccgc aggcggcttt ccgattggcg ggcgcgcgcg gcggaatgga 1463
atgctccccc caagatcatg agaatgggat aggtagatga acggcgcaga gagcctggtg 1523
acgaccctgg tcgaccaagg cgtggatatt tgtttcgcca accccggcac atcggaaatg 1583
cacttcctgt ccgcgctgga aaatccgcgg atgaagagcg tgctctgcct gtatgagggc 1643
gtctgcaccg gcgcggccga cggctggtat cggatgaagg acaagccggc atcgaccctg 1703
ctgcaccttg gcccgggcct cgccaacggc ctgtccaata tccacaatgc caagcgcgcc 1763
agttggcgat ggtcaatatc gtcggcgaac attcggccag ccactcaaat atgatccgcc 1823
gctgacatcg gatatcgagg ggctggcccg gcccttgagc cattgggtgc gccgcgccga 1883
atcctccacc tcgatcgcct gggacacggc gacggcggtg gccaaggcgt cggaacatcc 1943
cggccagatc gcgaccctga tcctgccggg cgacaccgcc tggaaggatg cgggccaggc 2003
gatcaccccc gcgccgatca cgccggtgcg ccgggcgccc gacggcgcgc ggatcgatgc 2063
gatcgcgcag gttctgcgct cgggcgaacc ggcgctcatc atcctcgcca acaagggcac 2123
gcgtggccgg gcgctggaac tggcggggca ggtcgcggcc agcaccggct gtcgcttggg 2183
cacccaattc ttcaccgccc ggatcgagcg cggcgcgggc cgcgtgccgc tggaacgcat 2243
cccctatgcc gtgccgcagg gcgccgcctt cctccagggc ttcaagcatc tcatcacggt 2303
cgagaccagg gaaccggtcg ccttcttcag ctatcccgac aagcccagcc tgctgaaggc 2363
cccgggcacg atcgtccatg aactctgcgc cgcggacgag gacagcacgc tggcgttcga 2423
gatgctggtc gatgcgctgg ggctgggcac cgccgcgccg atcctgc 2470
<210>13
<211>285
<212>PRT
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>13
Met Thr Asp Asn Arg Leu Asn Gly Val Ile Arg Ala Trp Glu Gln Gly
1 5 10 15
Lys Pro Ala Phe Ala Ala Phe Ser Lys Val Asp Lys Leu Thr Ala Gln
20 25 30
Glu Met Thr Asp Ala Pro Tyr Asp Gly Ile Val Phe Glu Met Glu His
35 40 45
Asn Pro Tyr Asp Val Gly Gly Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu
50 55 60
Asn Arg Lys Lys Ile Ala Glu Ser Gly Ser Val Ala Pro Ser Val Thr
65 70 75 80
Pro Leu Ala Arg Ile Pro Ala Asn Gly Ala Glu Met Asn Gln Phe Gln
85 90 95
Ala Lys Gln Val Leu Asp Arg Gly Val Tyr Gly Val Ile Thr Pro His
100 105 110
Val Ser Thr Val Glu Gln Ala Trp Asn Ala Val Ala Ser Cys Arg Tyr
115 120 125
Ala Lys Pro Lys Gly Ala Ala Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Ile Arg Gly
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Thr Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Gln Pro Asp
145 150 155 160
Tyr Tyr Ala Arg Ala Asp Val Trp Pro Leu Ala Pro His Gly Glu Leu
165 170 175
Leu Val Gly Met Met Cys Glu Ser Pro Glu Ala Ile Asp Asn Leu Asp
180 185 190
Asp Ile Leu Ser Asp Val Pro Gly Ile Gly Leu Val Leu Ile Gly Glu
195 200 205
Gly Asp Leu Ser Gln Ala Leu Gly Tyr Pro Arg Gln Tyr Glu His Pro
210 215 220
Glu Val Leu Asp Ala Met Arg Arg Ile Val Glu Thr Cys His Lys His
225 230 235 240
Lys Val Ala Val Gly Asn Pro His Thr Asn Ala Lys Asn Val Glu Arg
245 250 255
Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Phe Leu Met Ser Ala Pro Ser Arg Ser
260 265 270
Tyr Gly Val Val Gly Gln Gly Arg Glu Leu Ala Gly Tyr
275 280 285
<210>14
<211>1458
<212>DNA
<213>伯克氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(531)..(1385)
<223>
<400>14
caaggcatgg gagatgctgg ccgaaactga agctgccgat gtgcatccag accgggccga 60
tcggcctgcc gcaagtgcgc atgctggctg aaacagtttc cggcggtgaa catcatcctc 120
gatcaccttg gccgccctga cgtgctggac ggtccgccgt atgcgaacgc cgccagcctg 180
ttcgcgctcg ccgatctgcc caacatctac ctcaagctca cgccgcgcat tttcggcgat 240
gtgaagaaag agaaggccag cgcagagacc ttctttccgc gtgtggtcga agccttcggc 300
gcgcagcgcc tcgcgtgggg ctcgaacttt ccgacttcgc ccggcacgct caaggagatc 360
ctggcgacgg ctgaagcagg attggccagc ctcggcgaag aagagcgtac ctggatattc 420
ggcaagaccg cgcagaagct gtatccggtt ctgagctgag cctagacaac atgccaaccg 480
cgcgagcggc cgactgaagc ggcgccgtgc agcgagaaag agagatccac atg tcc 536
Met Ser
1
aac att cgc ctc aac agc atc atc cgt gcg ttc gaa tcg ggc aag gct 584
Asn Ile Arg Leu Asn Ser Ile Ile Arg Ala Phe Glu Ser Gly Lys Ala
5 10 15
gcg cac gct gcg ttc gcc aag ctc gac aag cag acg gcc atc gaa atg 632
Ala His Ala Ala Phe Ala Lys Leu Asp Lys Gln Thr Ala Ile Glu Met
20 25 30
agc gat tcg ccc tat gac ggc atc gtc ttc gag atg gag cac aac ccg 680
Ser Asp Ser Pro Tyr Asp Gly Ile Val Phe Glu Met Glu His Asn Pro
35 40 45 50
tac gat gtg agc gcg ctc ggc gac gca ttg cag tac atg ctc agc cgc 728
Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu Ser Arg
55 60 65
aag cag atc gtc gag acg gcg tcg gtg gcg acc aag gtg acg ccg att 776
Lys Gln Ile Val Glu Thr Ala Ser Val Ala Thr Lys Val Thr Pro Ile
70 75 80
gct cgc atc ccc gcc aac ggc atc gag atg aac cag agc ttt gcg aag 824
Ala Arg Ile Pro Ala Asn Gly Ile Glu Met Asn Gln Ser Phe Ala Lys
85 90 95
cag gtg ctc gat cgc ggc gct tac ggc gtg atc tgg cca cac gtg gcg 872
Gln Val Leu Asp Arg Gly Ala Tyr Gly Val Ile Trp Pro His Val Ala
100 105 110
acc gtc gag cag gcg tac aac gcg gtc gca tcg tgt cgc tac gcg cgg 920
Thr Val Glu Gln Ala Tyr Asn Ala Val Ala Ser Cys Arg Tyr Ala Arg
115 120 125 130
ccg aag agc gcg ccg ctg tac gag ccg aag ggc gtg cgc ggc gac ggt 968
Pro Lys Ser Ala Pro Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Val Arg Gly Asp Gly
135 140 145
ccg gcc aat gcg gcg cgc tac tgg ggt ctg tcg atg cag gag tac tac 1016
Pro Ala Asn Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Met Gln Glu Tyr Tyr
150 155 160
gac aag gct gac gta tgg ccg ctc gcg ccg cag ggc gaa att ctc gtc 1064
Asp Lys Ala Asp Val Trp Pro Leu Ala Pro Gln Gly Glu Ile Leu Val
165 170 175
ggc ctg atg tgc gag agc aca cag gcg atc gaa aac ctc gac gac atc 1112
Gly Leu Met Cys Glu Ser Thr Gln Ala Ile Glu Asn Leu Asp Asp Ile
180 185 190
ctc gcc aac gta ccc ggc atc ggc ttc atc ctg atc ggc gag ggc gac 1160
Leu Ala Asn Val Pro Gly Ile Gly Phe Ile Leu Ile Gly Glu Gly Asp
195 200 205 210
ctc agc cag gaa ctg ggc ttc ccg cgc cag tac gaa cac ccc gaa gtc 1208
Leu Ser Gln Glu Leu Gly Phe Pro Arg Gln Tyr Glu His Pro Glu Val
215 220 225
gtc gat gcg atg cgc cag atc gtc gag acc tgc aag aag cac gat gtc 1256
Val Asp Ala Met Arg Gln Ile Val Glu Thr Cys Lys Lys His Asp Val
230 235 240
gtc gtc ggt cat ccg cac gtg acg gcg aag aac cat cga cgt ctg atg 1304
Val Val Gly His Pro His Val Thr Ala Lys Asn His Arg Arg Leu Met
245 250 255
gaa gag ggc tac cgc tac ctg atg tcg gcg ccg cag cgg act tac ggc 1352
Glu Glu Gly Tyr Arg Tyr Leu Met Ser Ala Pro Gln Arg Thr Tyr Gly
260 265 270
gtg gtc ggt ctc gcg cgc gat atg gct ggc tac tgatgaacgg cgccgagacc 1405
Val Val Gly Leu Ala Arg Asp Met Ala Gly Tyr
275 280 285
ctcgtcgcga ctctggtcga ccagggcgtc gacatctgct tcgccaaccc ggg 1458
<210>15
<211>285
<212>PRT
<213>伯克氏菌
<400>15
Met Ser Asn Ile Arg Leu Asn Ser Ile Ile Arg Ala Phe Glu Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ala Ala His Ala Ala Phe Ala Lys Leu Asp Lys Gln Thr Ala Ile
20 25 30
Glu Met Ser Asp Ser Pro Tyr Asp Gly Ile Val Phe Glu Met Glu His
35 40 45
Asn Pro Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu
50 55 60
Ser Arg Lys Gln Ile Val Glu Thr Ala Ser Val Ala Thr Lys Val Thr
65 70 75 80
Pro Ile Ala Arg Ile Pro Ala Asn Gly Ile Glu Met Asn Gln Ser Phe
85 90 95
Ala Lys Gln VAl Leu Asp Arg Gly Ala Tyr Gly Val Ile Trp Pro His
100 105 110
Val Ala Thr Val Glu Gln Ala Tyr Asn Ala Val Ala Ser Cys Arg Tyr
115 120 125
Ala Arg Pro Lys Ser Ala Pro Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Val Arg Gly
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Asn Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Met Gln Glu
145 150 155 160
Tyr Tyr Asp Lys Ala Asp Val Trp Pro Leu Ala Pro Gln Gly Glu Ile
165 170 175
Leu Val Gly Leu Met Cys Glu Ser Thr Gln Ala Ile Glu Asn Leu Asp
180 185 190
Asp Ile Leu Ala Asn Val Pro Gly Ile Gly Phe Ile Leu Ile Gly Glu
195 200 205
Gly Asp Leu Ser Gln Glu Leu Gly Phe Pro Arg Gln Tyr Glu His Pro
210 215 220
Glu Val Val Asp Ala Met Arg Gln Ile Val Glu Thr Cys Lys Lys His
225 230 235 240
Asp Val Val Val Gly His Pro His Val Thr Ala Lys Asn His Arg Arg
245 250 255
Leu Met Glu Glu Gly Tyr Arg Tyr Leu Met Ser Ala Pro Gln Arg Thr
260 265 270
Tyr Gly Val Val Gly Leu Ala Arg Asp Met Ala Gly Tyr
275 280 285
<210>16
<211>471
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>16
tggagagttt gatcctggct cagaacgaac gctggcggca tgcctaacac atgcaagtcg 60
aacgagatct tcggatctag tggcgcacgg gtgcgtaacg cgtgggaatc tgccctttgc 120
ttcggaataa cagtgagaaa ttactgctaa taccggatga tgtcttcgga ccaaagattt 180
atcggcaaag gatgagcccg cgtaggatta gctagttggt ggggtaatgg cctaccaagg 240
cgacgatcct tagctggtct gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagca 360
atgccgcgtg agtgatgaag gccttagggt tgtaaagctc ttttaccagg gatgataatg 420
acagtacctg gagaataagc tccggctaac tccgtgccag cagccgcggt a 471
<210>17
<211>471
<212>DNA
<213>鞘氨醇单胞菌
<400>17
tggagagttt gatcctggct cagaacgaac gctggcggca tgcctaatac atgcaagtcg 60
aacgaactct tcggagttag tggcgcacgg gtgcgtaacg cgtgggaatc tgcccttggg 120
ttcggaataa cttctggaaa cggaagctaa taccggatga tgacgtaagt ccaaagattt 180
atcgcccaag gatgagcccg cgtaggatta gctagttggt gaggtaaagg ctcaccaagg 240
cgacgatcct tagctggtct gagaggatgr tcagccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtagggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagca 360
atgccgcgtg agtgatgaag gccttagggt tgtaaagctc ttttacccgg gatgataatg 420
acagtaccgg gagaataagc tccggctaac tccgtgccag cagccgcggt a 471
<210>18
<211>522
<212>DNA
<213>伯克氏菌
<400>18
tggagagttt gatcctggct cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg 60
gacggcagcg cgggggcaac cctggcggcg agtggcgaac gggtgagtaa tacatcggaa 120
cgtgtcctgg agtgggggat agcccggcga aagccggatt aataccgcat acgctctatg 180
gaggaaagcg ggggatcttc ggacctcgcg ctcaaggggc ggccgatggc agattagcta 240
gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatctgtagc tggtctgaga ggacgaccag 300
ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgg 360
acaatggggg caaccctgat ccagcaatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta 420
aagcactttt gtccggaaag aaaacctccg tcctaatacg gtggggggat gacggtaccg 480
gaagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg ta 522
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>5’引物，C24ALD
<400>19
atccatatgt ccaacattcg cctcaacagc 30
<210>20
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>3’C24ALD
<400>20
cgcctgcagt cagtagccag ccatatcgcg cgc 33
<210>21
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物，SpALD2_Eco
<400>21
ccggaattcc atgaaggaat gatctgagat gacc 34
<210>22
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物，SpALD2_ter_Pst
<400>22
aaaaactgca gctagtagcc cgccagttcg cgaccc 36
<210>23
<211>285
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>core sequence
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(285)
<223>Xaa代表任何氨基酸
<400>23
Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Asn Xaa Xaa Ile Arg Ala Xaa Glu Xaa Gly
1 5 10 15
Lys Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Lys Xaa Asp Lys Xaa Thr Ala Xaa
20 25 30
Glu Xaa Xaa Asp Xaa Pro Tyr Asp Gly Xaa Val Phe Glu Met Glu His
35 40 45
Asn Pro Tyr Asp Val Xaa Xaa Leu Gly Asp Ala Leu Gln Tyr Met Leu
50 55 60
Xaa Arg Lys Xaa Ile Xaa Glu Xaa Xaa Ser Val Ala Xaa Xaa Val Thr
65 70 75 80
Pro Xaa Ala Arg Ile Pro Ala Asn Gly Xaa Glu Met Asn Gln Xaa Xaa
85 90 95
Ala Lys Gln Val Leu Asp Arg Gly Xaa Tyr Gly Val Ile Xaa Pro His
100 105 110
Val Xaa Thr Val Glu Gln Ala Xaa Asn Xaa Val Ala Ser Xaa Arg Tyr
115 120 125
Ala Xaa Pro Xaa Xaa Ala Xaa Leu Tyr Glu Pro Lys Gly Xaa Arg Gly
130 135 140
Asp Gly Pro Ala Xaa Ala Ala Arg Tyr Trp Gly Leu Ser Xaa Xaa Xaa
145 150 155 160
Tyr Tyr Xaa Xaa Ala Asp Val Trp Pro Leu Ala Pro Xaa Gly Glu Xaa
165 170 175
Leu Val Gly Xaa Met Cys Glu Ser Xaa Xaa Ala Ile Xaa Asn Leu Asp
180 185 190
Asp Ile Leu Xaa Xaa Val Pro Gly Ile Gly Xaa Xaa Leu Ile Gly Glu
195 200 205
Gly Asp Leu Ser Gln Xaa Leu Gly Xaa Pro Arg Gln Tyr Xaa His Pro
210 215 220
Glu Val Xaa Xaa Ala Met Xaa Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Xaa Lys His
225 230 235 240
Xaa Val Xaa Val Gly Xaa Pro His Xaa Xaa Ala Lys Asn Xaa Xaa Arg
245 250 255
Leu Xaa Xaa Glu Gly Tyr Xaa Xaa Leu Met Ser Ala Pro Xaa Arg Xaa
260 265 270
Tyr Gly Val Val Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Ala Gly Tyr
275 280 285
Claims (18)
1.一种4R-IHOG或其盐的制备方法，其特征在于：
使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸或草酰乙酸与下述(a)或(b)任何一项所述的蛋白质，或者含有这些蛋白质的微生物作用：
(a)包含序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质，或者，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
从而生成光学纯度为70％或以上的下式(1)所示的(4R)-4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(4R-IHOG)或其盐
2.一种4R-莫那亭或其盐的制备方法，其特征在于，该方法包括：
第1步使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸或草酰乙酸与下述(a)或(b)任何一项所述的蛋白质，或者含有这些蛋白质的微生物作用
(a)包含序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质，或者，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
从而优先生成4R-IHOG或其盐；以及
第2步将通过上述第1步骤得到的4R-IHOG或其盐的羧基转化为氨基，得到光学纯度为90％或以上的下式(2)所示的4R-莫那亭或其盐
(式中，波浪线的键表示同时包含R-构型和S-构型的键)。
3.如权利要求2所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其中在上述第2步骤中，羧基向氨基的转化是在作用于4R-IHOG的酶的作用下通过氨基化来进行的。
4.如权利要求2所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其中，上述第2步骤中，羧基向氨基的转化采取如下步骤实现：
在上述第2步骤中，将反应液中所包含的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸，在中性或碱性条件下，与下述通式(3)所示的胺化合物或其盐反应
H2N-O-R ···(3)
(在上述通式(3)中，R表示氢原子、烷基、芳基或芳烷基)
生成下式(4)所示的4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)-2-羟基亚氨基戊二酸(IHOG-肟)，将所生成的IHOG-肟或其盐的4R体结晶，还原所得到的IHOG的4R异构体或其盐，生成光学纯度为90％或以上的4R-莫那亭或其盐
5.如权利要求4所述的4R-莫那亭的制备方法，其中上述通式(3)所表示的胺化合物为选自羟基胺、甲氧基胺、苄氧基胺的至少一种胺化合物。
6.如权利要求4或5所述的4R-莫那亭的制备方法，其特征在于IHOG的4R异构体或其盐的还原是在氢或加氢催化剂存在下实施的。
7.如权利要求4或5任一项所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其特征在于在上述第2步骤中，通过结晶提取(2R，4R)-莫那亭。
8.如权利要求4或5任一项所述的4R-莫那亭或其盐的制备方法，其特征在于在上述第2步骤中，使用水、醇溶剂或含水醇溶剂作为结晶溶剂。
9.如权利要求1～5任一项所述的制备方法，其中上述方法中所使用的蛋白质为来源于选自鞘氨醇单胞菌属或伯克氏菌属的细菌的微生物的蛋白质。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于上述微生物为鞘氨醇单胞菌AJ 110329株或AJ 110372株、伯克氏菌AJ 110371株。
11.下述(a)～(c)任一项所述的蛋白质，
(a)包含序列号2所述的氨基酸序列的蛋白质，
(b)与序列号2所述的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质，
(c)具有序列号2所示氨基酸的序列中包含1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有缩醛活性的蛋白质。
12.如权利要求11所述的蛋白质，其中，与序列号2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性、且具有4R-醛缩酶活性的蛋白质为序列号13或者15的任一项所述的蛋白质。
13.编码权利要求11或12任一项所述的蛋白质的DNA。
14.下述(d)或(e)的DNA，
(d)包含序列号1所述的碱基序列或该序列中210～1004位的碱基序列的DNA，
(e)与包含序列号1所述的碱性序列或该序列中210～1004位的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA。
15.如权利要求14所述的DNA，其中与包含序列号1所述的碱基序列或该序列中210～1004位的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交，且编码具有醛缩酶活性的蛋白质的DNA，是(f)包含序列号12所述的碱基序列或该序列中399～1253位的碱基序列的DNA，或者(g)包含序列号14所述的碱基序列或该序列中531～1385位的碱基序列的DNA中的任何一个DNA。
16.一种重组DNA，其特征在于：该重组DNA是通过权利要求14或15任一项所述的DNA与载体DNA连接得到的。
17.由权利要求16所述的重组DNA转化的细胞。
18.一种具有醛缩酶活性的蛋白质的制备方法，其特征在于将如权利要求17所述的细胞在培养基中培养，使具有醛缩酶活性的蛋白质在培养基和/或细胞中积累。
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