CN1886505A - 参与大环内酯类化合物的羟化作用的dna - Google Patents

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CN1886505A CNA2004800350546A CN200480035054A CN1886505A CN 1886505 A CN1886505 A CN 1886505A CN A2004800350546 A CNA2004800350546 A CN A2004800350546A CN 200480035054 A CN200480035054 A CN 200480035054A CN 1886505 A CN1886505 A CN 1886505A
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Abstract

本发明提供了参与大环内酯类化合物11107B的羟化作用的DNA、以及大环内酯类化合物11107D的新产生方法。详细地说，本发明涉及参与式(I)所示的大环内酯类化合物11107B生物学转化为式(II)所示的16位羟化大环内酯类化合物11107D的DNA，其为编码具有16位羟化酶活性的蛋白质或铁氧还蛋白的DNA、其分离方法、自该DNA编码的蛋白质、携带该DNA的质粒、经该质粒转化的转化体和使用该转化体产生16位羟化大环内酯类化合物的方法。

Description

参与大环内酯类化合物的羟化作用的DNA
技术领域
本发明涉及参与大环内酯类化合物的羟化作用的DNA、其分离方法、由该DNA编码的蛋白质、携带该DNA的质粒、经该质粒转化的转化体、以及使用该转化体产生16位羟化的大环内酯类化合物的方法。
现有技术
式(II)
Figure A20048003505400131
所示的12元环大环内酯类化合物11107D是一种具有良好抗肿瘤活性的12元环大环内酯类化合物，其与式(I)
Figure A20048003505400132
所示的12元环大环内酯类化合物11107B一起自链霉菌(Streptomyces sp.)Mer-11107株的培养物中发现(WO 02/060890)。大环内酯类化合物11107D相当于大环内酯类化合物11107B的16位羟化体，但其产量低于大环内酯类化合物11107B的产量，因此期望建立一种高效的制备方法。
发明内容
本发明的课题是发现了参与大环内酯类化合物11107B的羟化作用的DNA，提供了大环内酯类化合物11107D的新的产生方法。
本发明涉及以下的[1]～[15]项内容。
[1]：经分离的纯DNA，其为参与将式(I)
所示的大环内酯类化合物(以下称为大环内酯类化合物11107B)生物学转化为式(II)
Figure A20048003505400142
所示的16位羟化的大环内酯类化合物(以下称为大环内酯类化合物11107D)的DNA，包含编码部分或全长的具有16位羟化酶活性的蛋白质或铁氧还蛋白的DNA或其变体。
[2]：如下述(a)、(b)或(c)所示的[1]所述DNA。
(a)编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质的DNA，所述DNA选自由序列编号1的碱基1322位至碱基2548位的连续碱基序列、序列编号2的碱基420位至碱基1604位的连续碱基序列和序列编号3的碱基172位至碱基1383位的连续碱基序列组成的组。
(b)上述(a)所示DNA的变体，为这样的DNA：
(i)与上述(a)所示的DNA在严格的条件下杂交，且
(ii)编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质。
(c)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(a)所示的DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(a)或(b)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
[3]：自[2]所述的DNA编码的蛋白质。
[4]：携带[2]的DNA的自我复制型或整合复制型重组质粒。
[5]：经[4]的重组质粒转化的转化体。
[6]：编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质的DNA的分离方法，其特征在于以包含[2]所述的DNA或其部分的DNA作为探针或引物使用。
[7]：下述(d)、(e)或(f)所示的[1]所述DNA。
(d)编码铁氧还蛋白的DNA，所述DNA选自由序列编号1的碱基2564位至碱基2761位的连续碱基序列、序列编号2的碱基1643位至碱基1834位的连续碱基序列和序列编号3的碱基1399位至碱基1593位的连续碱基序列组成的组。
(e)上述(d)所示DNA的变体，为这样的DNA：
(i)与上述(d)所示的DNA在严格的条件下杂交，且
(ii)编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质。
(f)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(d)所示的DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(d)或(e)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
[8]：自[7]所述的DNA编码的蛋白质。
[9]：携带[7]的DNA的自我复制型或整合复制型重组质粒。
[10]：经[9]所述的重组质粒转化的转化体。
[11]：编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA的分离方法，其特征在于以包含[7]所述的DNA或其部分的DNA作为探针或引物使用。
[12]：16位羟化的大环内酯类化合物的产生方法，其特征在于：使用培养基培养[5]或[10]所述的转化体，在培养中或培养后，将经增殖的转化体与式(III)
〔式中，
W表示
R12、R16b、R17a、R17b、R18、R20a、R20b、R21a和R21b相同或不同，表示
(1)氢原子，
(2)可具有取代基的C1-22烷基，
(3)-OR(式中R表示
1)氢原子，
可以有取代基的
2)C1-22烷基，
3)C7-22芳烷基，
4)5元环至14元环的杂芳氧基烷基，
5)C2-22烷酰基，
6)C7-15芳酰基，
7)C3-23不饱和烷酰基，
8)-CORco(式中Rco可以有取代基，表示
8-1)5元环至14元环的杂芳基，
8-2)C1-22烷氧基，
8-3)不饱和C2-22烷氧基，
8-4)C6-14芳氧基，
8-5)5元环至14元环的杂芳氧基，
或
8-6)3元环至14元环的含氮非芳族杂环)，
9)C1-22烷基磺酰基，
10)C6-14芳基磺酰基，
或
11)-SiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2、Rs3相同或不同，表示C1-6烷基或C6-14芳基))，
(4)卤素原子
或
(5)-RM-NRN1RN2
{式中RM表示单键或-O-CO-；
RN1和RN2
1)相同或不同，表示
1-1)氢原子或
1-2)可以有取代基的
(i)C1-22烷基，
(ii)不饱和C2-22烷基，
(iii)C2-22烷酰基，
(iv)C7-15芳酰基，
(v)不饱和C3-23烷酰基，
(vi)C6-14芳基，
(vii)5元环至14元环的杂芳基，
(viii)C7-22芳烷基，
(ix)C1-22烷基磺酰基或
(x)C6-14芳基磺酰基；
或
2)RN1和RN2与结合的氮原子一起形成可具有取代基的3元环至14元环含氮非芳族杂环}；
但是，
R21a和R21b一起可形成(i)酮结构(＝O)或(ii)肟结构{＝NORox(式中Rox表示可具有取代基的C1-22烷基、不饱和C2-22烷基、C6-14芳基、5元环至14元环的杂芳基或C7-22芳烷基)}；
R16a表示氢原子；
R21c表示
(1)氢原子或
(2)
Figure A20048003505400181
(式中R22a、R22b和R22c相同或不同，表示
1)氢原子，
2)C1-6烷基，
3)-OR(式中R具有上述的含义)，
4)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含义)或
5)卤素原子；
或
R21a和R21b中的任一方与R22a和R22b中的任一方一起可形成部分结构
R22a或R22b
Gm表示
(1)式(GM-I)所示的基团
{式中
R2和R10相同或不同，表示氢原子或C1-22烷基；R3a、R3b、R5a、R5b、R6a和R6b相同或不同，表示
1)氢原子，
2)羟基，
3)可具有取代基的
3-1)C1-22烷基，
3-2)C1-22烷氧基，
3-3)C6-14芳氧基，
3-4)5元环至14元环的杂芳氧基，
3-5)C2-22烷酰氧基，
3-6)C7-15芳酰氧基，
3-7)C3-23不饱和烷酰氧基，
3-8)-OCORco(式中Rco具有上述的含义)，
3-9)C1-22烷基磺酰氧基，
3-10)C6-14芳基磺酰氧基，
或
3-11)-OSiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3具有上述的含义)，
4)卤素原子，
或
5)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含义)；
或者
R5a和R5b可一起形成酮结构(＝O)；
或者
R6a和R6b可一起形成螺环氧乙烷基或环外亚甲基(exomethylene)；或者，
R7a和R7b相同或不同，表示氢原子或-ORH(式中RH表示氢原子、C1-22烷基或C2-22烷酰基)}、
(2)式(GM-II)所示的基团
(式中R2、R3a、R3b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)，
(3)式(GM-III)所示的基团
Figure A20048003505400202
(式中R2、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)，
(4)式(GM-IV)所示的基团
Figure A20048003505400211
(式中R2、R6a、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)；
或
(5)式(GM-V)所示的基团
(式中R2、R3a、R6a、R6b和R10与式(GM-I)的定义相同)〕所示的大环内酯类化合物接触，转化为式(IV)
(式中W、R12、R16b、R17a、R17b、R20a、R20b、R21a、R21b、R21c和Gm表示与式(III)的定义相同)
所示的16位羟化的大环内酯类化合物，收集如此转化的16位羟化的大环内酯类化合物。
[13]：[12]所述的产生方法，其中转化体为[5]所述的转化体，且为具有编码铁氧还蛋白的DNA的转化体。
[14]：[12]所述的产生方法，其特征在于：将式(III-a)
(式中54表示双键或单键、W’表示双键或
R5’表示氢原子或乙酰氧基，R6’表示氢原子或羟基，R7’表示氢原子或乙酰基)所示的化合物转化为式(IV-a)
(式中54、W’、R5’、R6’和R7’与式(III-a)的定义相同)所示的化合物。
[15]：[14]所述的产生方法，向式(IV-a)的化合物转化中的式(III-a)的化合物选自由以下化合物组成的组中：
(1)
54是单键、W’是
R5’、R6’和R7’是氢原子的化合物，
(2)
54是单键、W’是
Figure A20048003505400232
R5’和R6’是氢原子，R7’是乙酰基的化合物，
(3)
54是单键、W’是
R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(4)
54是单键、W’是
R5’是氢原子，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物，
(5)
54是单键、
W’是双键，R5’、R6’和R7’是氢原子的化合物，
(6)
54是单键、
W’是双键，R5’和R6’是氢原子，R7’是乙酰基的化合物，
(7)
54是单键、
W’是双键，R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(8)
54是单键、
W’是双键、R5’是氢原子、R6’是羟基、R7’是乙酰基的化合物、
(9)
54是双键、W’是
R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(10)
54是双键、W’是
R5’是氢原子，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物，
(11)
54是单键、W’是
R5’是乙酰氧基，R6’是羟基，R7’是氢原子的化合物，和
(12)
54是单键、W’是
R5’是乙酰氧基，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物。
[16]：[5]或[10]所述的转化体的用途，用于产生16位羟化的大环内酯类化合物。
根据本发明，可以分离编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质或铁氧还蛋白的DNA，确定其碱基序列，进一步地，可以制备携带该DNA的质粒、经该质粒转化的转化体，利用该转化体，有效产生16位羟化的大环内酯类化合物。
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
具有自大环内酯类化合物11107B转化为大环内酯类化合物11107D的能力的微生物
在本发明中，通过培养具有自大环内酯类化合物11107B转化为大环内酯类化合物11107D的能力的微生物，自经培养的培养液收集的菌体分离编码部分或全部具有16位羟化酶活性的蛋白质或铁氧还蛋白的DNA，可确定其碱基序列。然后，构建携带该DNA的自我复制型或整合复制型的重组质粒，使用该质粒制备转化体。
如此制备的转化体在培养基中培养，在培养中或培养后，通过使增殖的转化体与上述式(III)所示的大环内酯类化合物接触，转化为式(IV)所示的16位羟化的大环内酯类化合物，通过收集所转化的16位羟化的大环内酯类化合物，可获得16位羟化的大环内酯类化合物。
作为具有自大环内酯类化合物11107B转化为大环内酯类化合物11107D的能力的微生物，不管其种和株的种类如何，只要具有这个能力均可使用，但作为优选的微生物，可列举任一自土壤分离的链霉菌(Streptomyces sp.)Mer-11107、A-1544株、或未鉴定的放线菌A-1560株。
另外，链霉菌Mer-11107作为FERM P-18144于2000年12月19日保藏在日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番3的工业技术院生命工学工业技术研究所，然后于2001年11月27日移管至日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD)，为国际保藏FERM BP-7812。A-1544株作为FERM P-18943于2002年7月23日保藏于日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，然后于2003年7月30日移管至日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD)，为国际保藏FERM BP-8446。A-1560株作为FERM P-19585于2003年11月13日保藏在日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番3号的工业技术院生命工学工业技术研究所，然后于2004年8月19日移管至日本305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(IPOD)，为国际保藏FERMBP-10102。
上述菌株的菌学性状如下：
[Mer-11107株的菌学性状]
(1)形态
自营养菌丝伸长螺旋状(Spirales)的气生菌丝。在成熟的气生菌丝顶部形成由10～20个左右的圆筒状孢子组成的孢子链。孢子的大小约为0.7×1.0μm，孢子表面表现为平滑(smooth)，没有观察到孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在多种培养基中的生长状态
在多种培养基上于28℃培养2周后的培养性状如下所示。将色调以Tresner’s Color wheels的颜色名称和括号内的符号表示。
1)酵母·麦芽琼脂培养基
观察到生长良好，其表面着生有气生菌丝、灰色孢子(Light gray；d)。培养的下面是浅瓜黄色(Light melon yellow)(3ea)。不产生可溶性色素。
2)燕麦粉琼脂培养基
观察到生长为中等程度，其表面着生有少量气生菌丝、灰色孢子(Gray；g)。培养的下面是肉褐色(Nude tan)(4gc)或油灰色(Putty)(11/2ec)。不产生可溶性色素。
3)淀粉·无机盐琼脂培养基
观察到生长良好，其表面着生有气生菌丝、灰色孢子(Gray；e)。培养的下面是浅黄褐色(Fawn)(4ig)或灰色(Gray)(g)。不产生可溶性色素。
4)甘油·天冬酰胺琼脂培养基
观察到生长良好，其表面着生有气生菌丝、白色孢子(White；a)。培养的下面是珍珠粉红色(Pearl pink)(3ca)。不产生可溶性色素。
5)蛋白胨·酵母·铁琼脂培养基
观察到生长不好，其表面未着生有气生菌丝。培养的下面是浅瓜黄色(3ea)。不产生可溶性色素。
6)酪氨酸琼脂培养基
观察到生长良好，其表面着生有气生菌丝、白色孢子(White；a)。培养的下面是珍珠粉红色(3ca)。不产生可溶性色素。
(3)对多种碳源的同化性
将不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂培养基中并在28℃培养两周，菌株的生长情况如以下所示。
1)L-阿拉伯糖       ±
2)D-木糖           ±
3)D-葡萄糖         +
4)D-果糖           +
5)蔗糖             +
6)肌醇             +
7)L-鼠李糖         -
8)D-甘露醇         +
9)棉子糖           +
(+表示同化，±表示轻微同化，-表示几乎不同化。)
(4)生理学的性质
本菌的生理学性质如下。
(a)生长温度范围(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：12℃～37℃
(b)最适温度范围(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：21℃～33℃
(c)明胶的液化(葡萄糖·蛋白胨·明胶培养基)：阴性
(d)牛奶的凝固(脱脂乳培养基)：阴性
(e)牛奶的胨化(脱脂乳培养基)：阴性
(f)淀粉的加水分解(淀粉·无机盐琼脂培养基)：阳性
(g)类黑素色素的产生(蛋白胨·酵母·铁琼脂培养基)：阴性
                   (酪氨酸培养基)：阴性
(h)硫化氢的产生(蛋白胨·酵母·铁琼脂培养基)：阴性
(i)硝酸盐的还原(含0.1％硝酸钾的肉汤)：阴性
(j)食盐的耐性(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：在食盐含有量4％以下生长
(5)菌体成分
自本菌的细胞壁检测到LL-二氨基庚二酸和甘氨酸。
[A-1544株的菌学性状]
(1)形态
自营养菌丝伸长螺旋状(Spira type)的气生菌丝。在成熟的气生菌丝顶部形成由10～20个左右的圆筒状孢子组成的孢子链。孢子的大小约为1.0×1.2～1.4μm，孢子表面表现为多刺状(spiny)，没有观察到孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在多种培养基中的生长状态
在多种培养基上于28℃培养2周后的培养性状如表1所示。将色调以Tresner’s Color wheels的颜色名称和括号内的符号表示。
表1
  培养基   生长   气生菌丝  营养菌丝颜色   可溶性色素
  酵母·麦芽琼脂培养基(ISP-2) 良好   厚的银灰色(3fe) 浅瓜黄色(3ea) 无
燕麦粉琼脂培养基(ISP-3) 良好   丰富的浅灰色-银灰色(d-3fe) 浅瓜黄色(3ea) 无
  淀粉·无机盐琼脂培养基(ISP-4) 良好   丰富的银灰色(3fe) 浅瓜黄色(3ea) 无
  甘油·天冬酰胺琼脂培养基(ISP-5) 良好   丰富的灰(5fe) 浅瓜黄色(3ea) 无
  蛋白胨·酵母提取物·铁琼脂培养基(ISP-6) 良好 无 浅瓜黄色(3ea) 淡黑褐色
  酪氨酸琼脂培养基(ISP-7) 良好   丰富的暗灰色(2fe) 浅瓜黄色(3ea) 无
(3)对多种碳源的同化性
将不同碳源加入到Pridham-Gottlieb琼脂培养基中并在28℃培养2周，菌株的生长情况如表2所示。
表2
  D-葡萄糖   +   肌醇   -
  L-阿拉伯糖   +   L-鼠李糖   +
  D-木糖   +   D-甘露醇   +
  D-果糖   +   棉子糖   -
  蔗糖   -
+表示同化，±表示轻微同化，-表示几乎不同化
(4)生理学性质
本菌的生理学性质如下。
(a)生长温度范围(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：15℃～41℃
(b)最适生长温度(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：20℃～37℃
(c)明胶的液化(葡萄糖·蛋白胨·明胶培养基)：阳性
(d)牛奶的凝固(脱脂乳培养基)：阳性
(e)牛奶的胨化(脱脂乳培养基)：阳性
(f)淀粉的加水分解(淀粉·无机盐琼脂培养基)：阳性
(g)类黑素色素的产生(蛋白胨·酵母·铁琼脂培养基)：阳性
                   (酪氨酸培养基)：阴性
(h)硫化氢的产生(蛋白胨·酵母·铁琼脂培养基)：阳性
(i)硝酸盐的还原(含有0.1％硝酸钾的肉汤)：阴性
(j)食盐的耐性(酵母·麦芽琼脂培养基，2周培养)：在食盐含有量7％以下生长
(5)菌体成分
自本菌的细胞壁检测到LL型二氨基庚二酸。
本发明的DNA
本发明者们自上述微生物分离到参与大环内酯类化合物的16位羟化的DNA，即编码具有16位羟化酶活性的蛋白质的DNA和编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA，确定了其碱基序列。下文中，有时将编码具有16位羟化酶活性的蛋白质的DNA和编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA总称为“16位羟化酶相关的DNA”。
本发明的编码具有16位羟化酶活性的蛋白质的DNA为下述(1-1)、(1-2)或(1-3)所示的DNA。
(1-1)选自由序列编号1的碱基1322位至碱基2548位的连续碱基序列、序列编号2的碱基420位至碱基1604位的连续碱基序列和序列编号3的碱基172位至碱基1383位的连续碱基序列组成的组中的DNA。
(1-2)上述(1-1)所示DNA的变体，其
(i)为与上述(1-1)所示的任一DNA在严格的条件下杂交的碱基序列，且
(ii)为编码具有大环内酯类化合物的16位羟化酶活性的蛋白质的DNA。
(1-3)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(1-1)所示的任一DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(1-1)或(1-2)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
另外，“16位羟化酶活性”是指将上述式(I)所示的大环内酯类化合物11107B的16位羟化，转化为上述式(II)所示的大环内酯类化合物11107D的酶活性。
而本发明的编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA为下述(2-1)、(2-2)或(2-3)所示的DNA。
(2-1)编码铁氧还蛋白的DNA，其选自由序列编号1的碱基2564位至碱基2761位的连续碱基序列、序列编号2的碱基1643位至碱基1834位的连续碱基序列和序列编号3的碱基1399位至碱基1593位的连续碱基序列组成的组中。
(2-2)上述(2-1)所示DNA的变体，其
(i)与上述(2-1)所示的DNA在严格的条件下杂交，且
(ii)为编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA。
(2-3)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(2-1)所示的DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(2-1)或(2-2)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
另外，“铁氧还蛋白功能”是指向上述16位羟化酶转移电子，与上述16位羟化酶一起负责羟化反应的蛋白质功能。
在上述DNA的说明中“在严格条件下杂交的碱基序列”是指以上述(1-1)或(2-1)的任一DNA作为探针使用时，通过集落杂交法、噬斑杂交法或Southern印迹杂交法等获得的DNA的碱基序列，例如可列举通过使用固定有来自集落或噬斑的DNA或所述DNA的片段的滤膜，在0.7～1.0MNaCl存在下，于65℃杂交后，使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC溶液为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，于65℃条件下洗净滤膜而可鉴定的DNA等。杂交可根据Molecular Cloning：A laboratory Mannual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以下简称为分子克隆第2版)等所述的方法进行。
作为在严格条件下杂交的DNA，可例举与作为探针使用的DNA的碱基序列具有特定或以上的同源性的DNA，例如具有80％或以上，优选地85％或以上，更优选地90％或以上，更优选地95％或以上，最优选地98％或以上的同源性的DNA。
对获得本发明的16位羟化酶相关DNA的方法没有特别的限定。可基于本说明书序列表的序列编号1、序列编号2或序列编号3所示碱基序列的情报，制备合适的探针或引物，使用它们筛选放线菌属微生物的DNA文库而分离本发明的DNA。DNA文库可自表达上述16位羟化酶活性的微生物通过常规方法制备。
另外，通过PCR法可获得本发明的16位羟化酶相关DNA。将上述微生物来源的DNA文库作为模板使用，以可扩增序列编号1、序列编号2或序列编号3所述任一碱基序列为目的而设计的1对引物进行PCR。PCR的反应条件可合理设定，可例举例如以由94℃ 30秒(变性)、55℃ 30秒～1分钟(退火)、72℃ 2分钟(延伸)组成的反应步骤作为1个循环，如进行30个循环后，72℃反应7分钟的条件等。接下来，可将所扩增的DNA片段克隆入可在合适的宿主中扩增的载体中。
上述探针或引物的制备、DNA文库的构建、DNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作为本领域技术人员已知，例如可根据分子克隆第2版；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1～38，JohnWiley & Sons(1987-1997)等所述的方法进行。
对获得本发明的蛋白质的方法没有特别的限制，可以是通过化学合成而合成的蛋白质，也可以是通过基因重组技术而制备的重组蛋白质。制备重组蛋白质时，首先获得编码本说明书的上述蛋白质的DNA。可通过将该DNA导入合适的表达体系而产生本发明的蛋白质。关于使用表达体系表达蛋白质见本说明书中的后述内容。
本发明的重组载体
可将本发明的DNA插入合适的载体使用。对本发明使用的载体的种类没有特别的限制，如可为自我复制的载体(如质粒等)或为导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，与所整合的染色体共同复制的载体。在表达载体中，本发明的DNA与转录所必需的元件(如启动子等)功能性连接。启动子为宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可根据宿主的种类而进行合适的选择。
本发明的转化体以及使用所述转化体制备重组蛋白质
通过将本发明的DNA或重组载体导入合适的宿主可制备转化体。本发明的DNA或重组载体所导入的宿主细胞可为任一细胞，只要其可表达本发明的基因即可，可例举如细菌、酵母、真菌和高等真核细胞等。作为细菌细胞的例子，可例举芽孢杆菌属或链霉菌属等革兰氏阳性菌或大肠杆菌等革兰氏阴性菌。这些细菌的转化可通过使用感受态细胞采用原生质体法、电穿孔法或其它公知的方法进行。例如，电穿孔法可如下进行。将插入有外源基因的质粒加至感受态细胞的悬浮液，将该悬浮液放入电穿孔法专用杯，对所述杯施用高压的电脉冲。然后使用选择培养基培养，在平板琼脂培养基上分离转化体。
作为酵母细胞的例子，可例举酵母属或裂殖酵母属细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)等。作为向酵母宿主导入重组载体的方法，可例举如电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。其它的真菌细胞例子有例如丝状菌如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)细胞。使用丝状菌作为宿主细胞时，可通过将DNA构建体整合入宿主染色体，获得重组宿主细胞，从而可实施转化。将DNA构建体向宿主染色体的整合可按照公知方法通过如同源重组或异种重组实施。
将上述转化体在可表达所导入基因的条件下，于合适的营养培养基中培养。对于自转化体的培养物分离纯化本发明的蛋白质，可使用常规的蛋白质分离、纯化法。
例如，当本发明的蛋白质在细胞内以可溶形式表达时，在培养结束后，通过离心分离回收细胞，并悬浮于含水缓冲液后，使用超声破碎仪等破碎细胞，获得无细胞提取液。自离心分离该无细胞提取液得到的上清，通过单独使用或组合使用常规的蛋白质分离纯化法，即溶剂提取法、通过硫酸铵等的盐析法、脱盐法、通过有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)琼脂糖凝胶等树脂的阴离子交换层析法、使用SP-Sepharose FF(AmashamBioscience公司生产)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦色谱法、等电点电泳等电泳法等操作，可获得纯化的制品。
16位羟化的大环内酯类化合物的产生方法
本发明包含上述式(IV)所示16位羟化的大环内酯类化合物的产生方法，所述方法包括使用导入了这样的DNA的转化体，所述DNA为编码具有16位羟化酶活性的蛋白质的DNA或为编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA；在该转化体存在下使上述式(III)所示的大环内酯类化合物羟化。
使用本发明的转化体可羟化的大环内酯类化合物为上述式(III)所示的大环内酯类化合物(上述式(IV)所示的大环内酯类化合物)，优选地为上述式(III-a)所示的大环内酯类化合物(上述式(IV-a)所示的大环内酯类化合物)，更优选地为大环内酯类化合物11107B(大环内酯类化合物11107D)。另外，括号内为作为羟化产物的16位羟化的大环内酯类化合物。
在转化体存在下使大环内酯类化合物羟化的条件如下所述。
首先，根据需要添加诱导物，使转化体中与16位羟化酶相关的DNA在菌体内表达。已表达这些DNA的菌体与作为底物的上述式(III)所示的大环内酯类化合物接触，进行转化反应。转化反应的温度可在考虑转化体的最佳温度后适当确定。另外，反应时间也在考虑向16位羟化的大环内酯类化合物的转化率(反应的进行程度)等后可适当确定。如20～31℃，1～5天合适。而且，反应模式可以分批式实施，也可以连续式实施，任一形式均可。
所产生的16位羟化的大环内酯类化合物的分离及纯化可利用通常用于将微生物代谢产物自其培养液分离所采用的分离、纯化方法。如可使用甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯、醋酸丁酯、氯仿、甲苯等有机溶剂提取；使用Diaion HP-20等疏水性吸附树脂的吸附洗脱处理；使用Sephadex LH-20等的凝胶过滤层析；使用活性炭、硅胶等的吸附层析；或通过薄层层析的吸附洗脱处理；或使用反相柱等的高效液相层析等所有公知的方法。而且，不特别限定为此处所示的方法。通过单独使用这些方法或以任意顺序组合使用这些方法，且反复使用，可分离纯化作为目的的16位羟化的大环内酯类化合物。
此外，在本发明中，DNA变体是指对组成碱基通过删除、替代、添加、插入等获得的修饰体或其衍生物，均为表达与最初的DNA显示同样效果的DNA。
另外，本说明书中所用的“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
本说明书中所用的“C1-22烷基”是指碳数为1至22个的直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等，优选地碳数为1至6个的直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
本说明书中所用的“不饱和C2-22烷基”是指碳数2至22个的直链或支链链烯基、或者是指碳数2至22个的直链或支链炔基，如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、1，3-己二烯基、1，5-己二烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-乙炔基-2-丙炔基、2-甲基-2-丙炔基、1-戊炔基、1-己炔基、1，3-己二炔基、1，5-己二炔基等，优选地为碳数2至10个的直链或支链链烯基、或者为碳数2至10个的直链或支链炔基，如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等。
本说明书中所用的“C6-14芳基”是指由6至14个碳原子构成的芳族烃环式基团，如包含单环式基团、二环式基团、三环式基团等的稠环。可例举如苯基、茚基、1-萘基、2-萘基、薁基、庚搭烯基、indacenyl、苊基、芴基、phenalenyl、菲基、蒽基等，优选地为苯基、1-萘基、2-萘基等。
本说明书中的“5元环至14元环的杂芳基”是指含有1个或1个以上选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子的单环式、二环式或三环式5至14元芳族杂环式基等。列举合适的例子，作为含氮的芳族杂环式基，如吡咯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、四唑基、苯并三唑基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、中氮茚基、嘌呤基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹嗪基、2，3-二氮杂萘基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、肉啉基、蝶啶基、咪唑并三嗪基、吡嗪并哒嗪基、吖啶基、菲啶基、咔唑基、carbazolinyl、啶基、菲咯啉基、吩嗪基、咪唑并吡啶基、咪唑并嘧啶基、吡唑并吡啶基、吡唑并吡啶基等；作为含硫的芳族杂环式基，如噻吩基、苯并噻吩基等；作为含氧的芳族杂环式基，如呋喃基、吡喃基、环戊吡喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基等；作为含有2个或2个以上的不同种杂原子的芳族杂环式基，如噻唑基、异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、吩噻嗪基、异唑基、呋咱基、吩嗪基、唑基、isoxazoyl、苯并唑基、二唑基、吡唑并唑基、咪唑并噻唑基、噻吩并呋喃基、呋喃并吡咯基、吡啶并嗪基等，优选地为噻吩基、呋喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。
本说明书中所用的“3元环至14元环的含氮非芳族杂环基”是指含有1个或1个以上氮原子的单环式、二环式或三环式的3至14元环非芳族杂环基。列举合适的例子，可列举如azilidinyl、azetizyl、吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、高哌啶基、高哌嗪基、咪唑基、吡唑烷基、咪唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、咪唑啉基、唑啉基、奎宁环基等。此外，在所述含氮的非芳族杂环基中，也包含由吡啶酮环衍生的基团、非芳族性稠环(如由苯邻二甲酰亚胺环、琥珀酰亚胺环等衍生的基团)。
本说明书中所用的“C2-22烷酰基”是指在上述定义的“C1-22烷基”的末端是羰基，可例举如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基等，优选地为碳数2至6个的烷酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等。
本说明书中所用的“C7-15芳酰基”是指上述定义的“C6-14芳基”、“5元环至14元环杂芳基”的末端结合有羰基的基团，可例举如苯甲酰基、1-萘酰基、2-萘酰基、吡啶甲酰基、烟酰基、异烟酰基、呋喃甲酰基等。
本说明书中所用的“C3-23不饱和烷酰基”是指上述定义的“不饱和C2-22烷基”的末端结合有羰基的基团，可例举如丙烯酰基、丙炔酰基、巴豆酰基、异巴豆酰基、油酰基、亚麻酰基等，优选地为碳数2至6个的不饱和烷酰基，如丙烯酰基等。
本说明书中所用的“C7-22芳烷基”是指在上述定义的“C1-22烷基”中在可取代的部分使用上述定义的“C6-14芳基”取代的由7至22个碳原子组成的基团，具体地可例举如苄基、苯乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基、1-萘甲基、2-萘甲基等，优选地为碳数7至10个的芳烷基，如苄基、苯乙基等。
本说明书中所用的“C1-22烷氧基”是指在上述定义的“C1-22烷基”的末端结合有氧原子的基团，合适的基团可例举如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、仲戊氧基、正己氧基、异己氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、2-乙基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、己氧基等。
本说明书中所用的“不饱和C2-22烷氧基”是指上述定义的“不饱和C2-22烷基”的末端结合有氧原子的基团，作为合适的基团可例举如乙烯氧基、烯丙氧基、1-丙烯氧基、异丙烯氧基、2-甲基-1-丙烯氧基、2-甲基-2-丙烯氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、3-丁烯氧基、1-戊烯氧基、1-己烯氧基、1，3-己二烯氧基、1，5-己二烯氧基、炔丙氧基、2-丁炔氧基等。
本说明书中所用的“C6-14芳氧基”是指在上述定义的“C6-14芳基”的末端结合有氧原子的基团，具体地可例举如苯氧基、茚氧基、1-萘氧基、2-萘氧基、薁氧基、庚搭烯氧基、indacenyl氧基、苊基氧基、芴基氧基、phenalenyl氧基、菲基氧基、蒽基氧基等。
本说明书中所用的“5元环至14元环的杂芳氧基”是指在上述定义的“5元环至14元环的杂芳基”末端结合有氧原子的基团，具体地可例举如吡咯基氧基、吡啶基氧基、哒嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基、三唑基氧基、四唑基氧基、苯并三唑基氧基、吡唑基氧基、咪唑基氧基、苯并咪唑基氧基、吲哚基氧基、异吲哚基氧基、中氮茚基氧基、嘌呤基氧基、吲唑基氧基、喹啉基氧基、异喹啉基氧基、喹嗪基氧基、2，3-二氮杂萘基氧基、萘啶氧基、喹喔啉基氧基、喹唑啉基氧基、肉啉基氧基、蝶啶基氧基、咪唑并三嗪基氧基、吡嗪并哒嗪基氧基、吖啶基氧基、菲啶基氧基、咔唑基氧基、carbazolinyl氧基、啶基氧基、菲咯啉基氧基、吩嗪基氧基、咪唑并吡啶基氧基、咪唑并嘧啶基氧基、吡唑并吡啶基氧基、吡唑并吡啶基氧基、噻吩基氧基、苯并噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡喃基氧基、环戊吡喃基氧基、苯并呋喃基氧基、异苯并呋喃基氧基、噻唑基氧基、异噻唑基氧基、苯并噻唑基氧基、苯并噻二唑基氧基、吩噻嗪基氧基、异唑基氧基、呋咱基氧基、吩嗪基氧基、唑基氧基、isoxazoyl氧基、苯并唑基氧基、二唑基氧基、吡唑并唑基氧基、咪唑并噻唑基氧基、噻吩并呋喃基氧基、呋喃并吡咯基氧基、吡啶并嗪基氧基等，优选地为噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡啶基氧基、哒嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基。
本说明书中所用的“5元环至14元环的杂芳氧基烷基”是指在上述的C1-6烷基中取代有上述的“5元环至14元环杂芳氧基”的基团。
本说明书中所用的“C1-22烷基磺酰基”是指结合有上述定义的“C1-22烷基”的磺酰基，具体地可例举如甲磺酰基、乙磺酰基、正丙磺酰基、异丙磺酰基等。
本说明书中所用的“C6-14芳基磺酰基”是指结合有上述定义的“C6-14芳基”的磺酰基，具体地可例举如苯磺酰基、1-萘磺酰基、2-萘磺酰基等。
本说明书中所用的“C1-22烷基磺酰氧基”是指上述定义的“C1-22烷基磺酰基”的末端结合有氧原子的基团，可例举如甲磺酰氧基、乙磺酰氧基、正丙磺酰氧基、异丙磺酰氧基等。
本说明书中所用的“有取代基也可”中的取代基是指如选自以下的基团：
(1)卤素原子、
(2)羟基、
(3)硫醇基、
(4)硝基、
(5)亚硝基、
(6)氰基、
(7)羧基、
(8)磺酰氧基、
(9)氨基、
(10)C1-22烷基
(如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等)、
(11)不饱和C2-22烷基
(如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等)、
(12)C6-14芳基
(如苯基、1-萘基、2-萘基等)、
(13)5元环至14元环杂芳基
(如噻吩基、呋喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等)、
(14)3元环至14元环含氮非芳族杂环
(如azilidinyl、azetizyl、吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、咪唑基、吡唑烷基、咪唑烷基、吗啉基、咪唑啉基、唑啉基、奎宁环基等)、
(15)C1-22烷氧基
(如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、伸丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等)、
(16)C6-14芳氧基
(如苯氧基、1-萘氧基、2-萘氧基等)、
(17)C7-22芳烷基氧基
(如苄氧基、苯乙氧基、3-苯基丙基氧基、4-苯基丁基氧基、1-萘甲基氧基、2-萘甲基氧基等)
(18)5元环至14元环杂芳氧基
(如噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡啶基氧基、哒嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基等)、
(19)C2-23烷酰基
(如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基等)、
(20)C7-15芳酰基
(如苯甲酰基、1-萘酰基、2-萘酰基等)、
(21)C3-23不饱和烷酰基
(如丙烯酰基、丙炔酰基、巴豆酰基、异巴豆酰基、油酰基、亚麻酰基等)、
(22)C2-23烷酰氧基
(如乙酰氧基、丙酰氧基、丙烯酰氧基等)、
(23)C2-22烷氧基羰基
(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基等)
(24)不饱和C3-22烷氧基羰基
(乙烯氧基羰基、烯丙氧基羰基、1-丙烯氧基羰基、异丙烯氧基羰基、炔丙氧基羰基、2-丁炔氧基羰基)、
(25)C1-22烷基磺酰基
(如甲磺酰基、乙磺酰基、正丙磺酰基、异丙磺酰基等)、
(26)C6-14芳基磺酰基
(如苯磺酰基、1-萘磺酰基、2-萘磺酰基等)和
(27)C1-22烷基磺酰氧基
(如甲磺酰基氧基、乙磺酰基氧基、正丙磺酰基氧基、异丙磺酰基氧基等)。
实施例
参考例1(作为原料的大环内酯类化合物11107B的制备)
自链霉菌(Streptomyces sp.)Mer-11107株(FERM BP-7812)的斜面培养(ISP-2培养基)取1铂环量接种至已加入了50ml种子培养基[葡萄糖2％、Esusan-meat(味の素(株)生产)1％、酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)0.5％、氯化钠0.25％、碳酸钙0.32％，灭菌前pH6.8]的500ml容量三角瓶，于28℃培养2天获得第一阶段种子培养液。将该培养液0.1ml接种至已加入了同样的种子培养基100ml的500ml容量三角瓶，于28℃培养1天获得第二阶段种子培养液。将由此获得的第二阶段种子培养液800ml接种至已加入了生产培养基[可溶性淀粉5％、Pharmamedia 0.8％、谷蛋白粉0.8％、酵母提取物0.5％、碳酸钙0.1％，灭菌前pH6.8]100 L的200L罐中，在培养温度28℃和搅拌数90转/分钟、通气量1.0vvm、内压20kPa的条件下通气搅拌培养5天，获得培养液。
将如此获得的培养液的一部分(10L)使用10L 1-丁醇提取后，减压干燥丁醇层，获得100g粗活性级分。将该粗活性级分添加至SephadexLH-20(Pharmacia Co.Ltd.生产，1500ml)，用四氢呋喃-甲醇(1∶1)的溶剂洗脱。将540ml至660ml的洗脱级分减压下浓缩至干，获得残渣(660mg)。接下来，将该残渣溶解于乙酸乙酯和甲醇(9∶1；v/v)的混合液中，进行硅胶柱层析(WAKO GEL C-200、50g)。将该柱用正己烷和乙酸乙酯(1∶9；v/v)的混合液(2L)洗脱，收集468ml至1260ml的洗脱级分，减压下浓缩，获得粗活性级分25mg。
将获得的粗活性级分在下述HPLC制备条件(A)进行制备型高效液相层析(HPLC)，收集保留时间34分钟处所洗脱的级分，去除乙腈后，在下述HPLC制备条件(B)下将该级分通过HPLC进行脱盐而获得大环内酯类化合物11107B(保留时间：37分钟)6mg。
HPLC制备条件(A)
柱：YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC Co.生产)
温度：室温
流速：10ml/分钟
检测：240nm
洗脱液：乙腈/0.15％磷酸二氢钾(pH3.5)(2∶8～8∶2，v/v，0～50分钟，线性梯度)
HPLC制备条件(B)
柱：YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC Co.生产)
温度：室温
流速：10ml/分钟
检测：240nm
洗脱液：甲醇/水(2∶8～10∶0，v/v，0～40分钟，线性梯度)。
实施例1：确定链霉菌A-1544株(FERM BP-8446)来源的基因的碱基序列
(1)制备链霉菌A-1544株的染色体DNA
向包含葡萄糖1％、麦芽汁0.4％、酵母提取物1％的培养基接种A-1544株，于28℃培养3天。将获得的培养液3000转/分钟离心10分钟收集菌体。使用Blood & Cell Culture kit(QIAGEN公司)自该菌体制备染色体DNA。
(2)克隆编码具有大环内酯类化合物11107的16位羟化活性的蛋白质的DNA的部分序列
参考推定的天蓝色链霉菌(Streptmyces coelicolor)A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列，设计并制备混合引物(5Dm-3F(序列编号4)和5Dm-3R(序列编号5))。
由于考虑密码子的变动可提高反应性，使用了混合碱基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下来，使用这2种引物(5Dm-3F和5Dm-3R)并以上述(1)获得的A-1544株染色体DNA为模板进行PCR反应。PCR反应使用Takara LA Taq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、50℃退火2分钟、68℃延伸30秒的3阶段反应重复进行35次。结果扩增到约500bp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-A1)。该DNA片段-A1具有很高可能性为编码具有羟化活性的蛋白质的DNA的一部分。PCR反应所扩增的DNA片段-A1通过SUPREC PCR(宝酒造社)自反应液回收。
接下来，为了获得对产生的DNA片段-A1进行碱基序列分析的足量DNA片段-A1，使用DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)将DNA片段-A1连接入质粒载体pT7Blue T(Novagen公司)，转化大肠杆菌JM109株。然后，使用含有氨苄青霉素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉汤琼脂培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)选择所转化的大肠杆菌。将由此分离的转化大肠杆菌的菌落用含有氨苄青霉素(50μg/mL)的L-肉汤液体培养基(1％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培养。使用质粒纯化试剂盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的转化大肠杆菌菌体分离纯化质粒DNA，获得一定量的DNA片段-A1。
(3)经克隆的DNA片段-A1的碱基序列分析
将前项(2)所获得的DNA片段-A1的碱基序列使用分析装置(PEBiosystems 377XL)通过染料终止子循环测序法分析DNA碱基序列。虽然通过电泳测定的PCR反应所扩增DNA片段-A1为约500bp，但碱基序列分析的结果表明确切地为528bp(参见序列编号1的碱基1775～碱基2302)。由于在所克隆的上述528bp DNA序列的两端发现有与进行上述PCR反应时使用的2种引物对应的DNA序列，因此明确了上述PCR反应中DNA片段-A1是由这2种引物(5Dm-3F和5Dm-3R)特异性扩增的。
(4)DNA片段-A1的邻近区域的分析
如上所述，由于确定了编码来自A-1544株的、具有羟化活性的蛋白质的部分DNA序列，通过反向PCR法(细胞工学14卷，p.591-593，1995年)对延伸至克隆片段的上游、下游域的邻近区域的碱基序列进行扩增、克隆、序列分析。即，将A-1544株染色体DNA(参见(1))于H缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM-二硫苏糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶PstI和SalI分别消化。将获得的各限制酶切断的DNA片段使用DNALigation Kit ver.2(宝酒造社)进行自身环化。
另一方面，自DNA片段-A1的碱基序列设计并制备引物(6PIN-2F(序列编号6)和6PIN-2R(序列编号7))。
接下来，使用这2种引物(6PIN-2F和6PIN-2R)和作为模板的上述经自身环化的A-1544株染色体DNA进行PCR反应。PCR反应使用了Takara LATaq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸5分钟的2阶段反应重复35次。
结果扩增了约3.5kbp大小的DNA片段(DNA片段-B1)和约2.8kbp大小的DNA片段(DNA片段-C1)，它们极有可能为编码具有羟化活性的蛋白质的DNA以及具有包含其上游和下游区域的DNA序列的DNA。
通过SUPREC PCR(宝酒造社)自该PCR扩增反应液回收DNA片段-B1和DNA片段-C1。接下来，为了获得足量用于碱基序列分析的各DNA片段：DNA片段-B1和DNA片段-C1，与上述(2)同样，使用质粒载体pT7BlueT(Novagen公司)、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)、大肠杆菌JM109株和质粒纯化试剂盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)，获得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B1(约3.5kbp大小)和DNA片段-C1(约2.8kbp大小)的碱基序列分析
将前项(4)所得的DNA片段-B1和DNA片段-C1的碱基序列使用DNA碱基序列分析装置(PE Biosystems 377XL)，通过染料终止子循环测序法分析。进行这样的碱基序列分析了解到自DNA片段-B1和DNA片段-C1的序列得到序列编号1所示的3793bp的碱基序列这一情报。
对该3793bp中的可读框(ORF)进行检索，确定了有2种蛋白质得到编码。将这些蛋白质的氨基酸序列通过BLAST search检索的结果为：序列编号1的碱基1322～碱基2548中存在编码包含与细胞色素P450具有高同源性的409个氨基酸的蛋白质的ORF(以下称为psmA)。PsmA与推定为天蓝色链霉菌A3(2)的细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列和推定为浅青紫链霉菌(Streptmyces lividans)的细胞色素P450(CYP105D4)的氨基酸序列具有最高的同源性(同源性72.6％)，与灰色链霉菌(Streptmyces griseus)的细胞色素P450soy(SoyC)也具有比较高的同源性(同源性69.4％)。由此认为psmA为编码细胞色素P450类的羟化酶的基因的可能性高。
另外，在紧挨psmA的下游(序列编号1的碱基2564～碱基2761)存在编码与3Fe-4S类的铁氧还蛋白具有高同源性的蛋白质的ORF(以下称为psmB)。psmB编码的蛋白质包含66个氨基酸，与紧挨推定为天蓝色链霉菌A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列下游的推定为铁氧还蛋白的氨基酸序列具有最高的同源性(83.3％)，而且与灰色链霉菌的铁氧还蛋白soy(soyB)也具有比较高的同源性(同源性57.6％)。因此认为psmB用于电子转移，编码与psmA一同进行羟化的铁氧还蛋白。
实施例2：制备具有psmA和psmB的转化体
(1)制备含有A-1544株来源的psmA和psmB这两者的DNA片段
参考实施例1中分析的序列编号1的碱基序列，设计并制备了在5’末端添加有NdeI位点的引物DM-NdeF(序列编号8)和5’末端添加有SpeI位点的引物DM-SpeR(序列编号9)。接下来，利用这2种引物(DM-NdeF和DM-SpeR)并以实施例1(1)所获得的A-1544株染色体DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应使用Takara LA Taq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸2分钟的2阶段反应重复进行30次。
结果扩增到包含psmA和psmB的约1.5kbp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-D1)。自该PCR扩增反应液通过SUPREC PCR(宝酒造社)回收DNA片段-D1。
(2)质粒pTC-DM的构建
将pT7NS-CamAB(参见WO03/087381)在H缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM-二硫苏糖醇，100mM NaCl)中通过限制酶NdeI和SpeI消化得到质粒消化物。同样地，将前项(1)所得的DNA片段-D1使用限制酶NdeI和SpeI消化，将所得的DNA片段-D1的消化物与质粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)连接。由此，构建了内部含有psmA和psmB两者的DNA片段-D1和质粒pT7NS-CamAB连接在一起的约9.5kbp大小的质粒(称为质粒pTC-DM)。
(3)大肠杆菌转化株BL21(DE3)/pTC-DM的制备
使用前项(2)制备的质粒pTC-DM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Novagen公司)。由此获得了经质粒pTC-DM转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-DM株。
实施例3：通过具有psmA和psmB的大肠杆菌转化体进行下式所示的ME-265向ME-282的转化
Figure A20048003505400461
(1)转化体反应液的制备
实施例2(3)得到的经转化大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-DM株和BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的冻结种子接种于15mL容量试管中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的3mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振荡培养20小时。将该种母培养液500μL接种于250mL容量的三角瓶中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的50mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振荡培养3小时后，依次添加100mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙酰丙酸50μL，32℃振荡培养6小时。离心分离(5000转/分钟、10分钟)得到的培养液，收集菌体。将菌体悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、8mg/mL ME-26550μL。这样得到的转化反应液于28℃反应24小时。用乙腈1mL提取反应液200μL，通过HPLC测定ME-265和ME-282的量。测定结果如表3所示。
另外，HPLC的详细条件如下所示。
分析装置：Shimadzu HPLC 10Avp
柱：CAPCELL PAK C18SG120(φ4.6mm×250mm)
流动相：45％乙腈(0～15分钟)
        60％乙腈(15～30分钟)
        45％乙腈(30～45分钟)
流速：1ml/分钟
检测：UV240nm
注射体积：10μL
柱温度：40℃
分析时间：45分钟
保留时间：ME-265    24.8分钟
          ME-282    12.7分钟
表3
  mg/L   BL21(DE3)/pT7NS-CamAB   BL21(DE3)/pTC-DM
  ME-265   143   0
  ME-282   0   130
(2)自转化体反应液获得ME-282
向反应了24小时的反应液1.8mL中加入水4mL，使用乙酸乙酯8mL提取1次，4mL提取2次。合并乙酸乙酯层，使用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂。将获得的残渣经薄层层析(MERCK Silicagel 60 F2540.25mm展开液；己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)纯化，得到ME-282 0.2mg。
1H-NMR谱(CD3OD，500MHz)：δppm(积分，多重度，结合常数J(Hz))：0.87(3H，d，J＝7.0Hz)，0.90(3H，d，J＝7.0Hz)，0.94(3H，t，J＝7.3Hz)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz)，1.21-1.26(1H，m)，1.29-1.37(3H，m)，1.34(3H，s)，1.44-1.52(2H，m)，1.60-1.64(1H，m)，1.65(1H，dd，J＝6.2，13.9Hz)，1.77(3H，d，J＝1.1Hz)，1.86(1H，dd，J＝5.4，13.9Hz)，1.89-1.94(1H，m)，2.00(3H，s)，2.43(1H，dd，J＝5.5，13.9Hz)，2.50-2.60(1H，m)，2.56(1H，dd，J＝3.3，13.9Hz)，2.66(1H，dd，J＝2.2，7.7Hz)，2.89(1H，dt，J＝2.2，6.2Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.8，8.4Hz)，3.75-3.80(1H，m)，4.90(1H，overlapped with D2O)，5.01(1H，d，J＝10.6Hz)，5.42(1H，dd，J＝9.2，15.0Hz)，6.13(1H，d，J＝10.6Hz)，6.52(1H，dd，J＝11.0，15.0Hz)。
结果，作为对照的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株没有获得认为是ME-282的峰，而含有psmA和psmB的BL21(DE3)/pTC-DM株几乎消耗掉ME-265而获得了认为是ME-282的峰。这暗示psmA和psmB参与自ME-265向ME-282的转化。
实施例4：通过携带psmA和psmB的大肠杆菌转化体将大环内酯类化合物11107B转化为大环内酯类化合物11107D
(1)转化体反应液的制备
与实施例3同样，以大环内酯类化合物11107B为底物进行试验。实施例2(3)得到的转化大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-DM株以及BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的冻结种子接种于15mL容量试管中含氨苄青霉素50μg/mL的3mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，30℃振荡培养20小时。将该种母培养液500μL接种于250mL容量的三角瓶中含氨苄青霉素50μg/mL的50m L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，28℃振荡培养5小时后，依次添加100mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙酰丙酸50μL，25℃振荡培养20小时。离心分离(5000转/分钟、10分钟)获得的培养液，收集菌体。将菌体悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH6.1)1.75mL中，向其添加80％甘油250μL、40mg/mL 11107B 50μL。由此得到的转化反应液28℃反应24小时。用乙腈1mL提取反应液200μL，通过HPLC测定大环内酯类化合物11107B和11107D的量。该测定结果如表4所示。另外，HPLC的详细条件如下所示。
分析装置：Shimadzu HPLC 10Avp
柱：CAPCELL PAK C18 SG120(φ4.6mm×250mm)
流动相：35％乙腈(0～10分钟)
        35％～65％乙腈(10～12分钟)
        65％乙腈(12～15分钟)
        35％乙腈(15～20分钟)
流速：1ml/分钟
检测：UV240hm
注射体积：10μL
柱温度：40℃
分析时间：20分钟
保留时间：11107B    14.3分钟
          11107D    7.9分钟
表4
  mg/L   BL21(DE3)/pT7NS-CamAB   BL21(DE3)/pTC-DM
  11107B   636   619
  11107D   0   71
(2)自转化体反应液获得大环内酯类化合物11107D
向反应了24小时的反应液1.8mL中加入水4mL，使用乙酸乙酯8mL提取1次，4mL提取2次。合并乙酸乙酯层，使用无水硫酸钠干燥后，除去溶剂。将获得的残渣经薄层层析(MERCK Silicagel 60 F254 0.25mm展开液；乙酸乙酯)纯化，得到11107D 0.1mg。
1H-NMR谱(CD3OD，500MHz)：δppm(积分，多重度，结合常数J(Hz))：0.87(3H，d，J＝7.0Hz)，0.88(3H，d，J＝7.0Hz)，0.93(3H，t，J＝7.0Hz)，1.18(3H，s)，1.18-1.69(8H，m)，1.33(3H，s)，1.77(3H，d，J＝1.1Hz)，1.82-1.90(1H，m)，2.05(3H，s)，2.49-2.60(3H，m)，2.66(1H，dd，J＝2.2，8.2Hz)，2.89(1H，dt，J＝2.4，5.7Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.8，8.3Hz)，3.73-3.82(1H，m)，5.04(1H，d，J＝9.8Hz)，5.05(1H，d，J＝10.6Hz)，5.56(1H，dd，J＝9.8，15.2Hz)，5.70(1H，dd，J＝9.8，15.2Hz)，5.86(1H，d，J＝15.2Hz)，6.3(1H，d，J＝10.8Hz)，6.52(1H，dd，J＝10.8，15.2Hz)。
结果，作为对照的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株没有获得认为是大环内酯类化合物11107D的峰，而含有psmA和psmB的BL21(DE3)/pTC-DM株，获得了认为是大环内酯类化合物11107D的峰。这暗示psmA和psmB参与自大环内酯类化合物11107B向11107D转化。
实施例5：A-1544自身克隆株的转化试验
(1)制备A-1544株来源的含有psmA和psmB这两者的DNA片段(自身克隆用)
参考实施例1中分析的序列编号1的碱基序列，设计合成5’末端添加有BglII位点的引物DM-BglF(序列编号10)和5’末端添加有BglII位点的引物DM-BglR(序列编号11)。
然后，使用这2种引物(DM-BglF和DM-BglR)并以实施例1(1)所获得的A-1544株染色体DNA作为模板进行PCR反应。PCR反应使用了Takara LATaq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、63℃退火30秒、68℃延伸4分钟的3阶段反应重复进行30次。
结果，扩增到含有psmA和psmB的约3.5kbp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-E1)。将该PCR扩增反应液通过琼脂糖凝胶电泳分开。自琼脂糖凝胶切下上述的约3.5kbp大小的DNA片段-E1，通过SUPREC 01(宝酒造社)回收。
(2)质粒pIJDMG的构建
将pIJ702于H缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶BglII消化，获得质粒消化物。同样地将前项(1)所获得的DNA片段-E1经限制酶BglII消化，所获得的DNA片段-E1消化物与质粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)连接。由此构建了内部含有psmA和psmB这两者的DNA片段-E1与质粒pIJ702连接的约8.5kbp大小的质粒(称为质粒pIJDMG)。
(3)自身克隆株A-1544/pIJDMG株的制备
使用前项(2)所制备的质粒pIJDMG，按照Genetic Manipulation ofStreptomyces：A Laboratory Manual.John Innes Foundation，Norwich，1985所述的方法转化A-1544株。由此获得了经质粒pIJDMG转化的A-1544/pIJDMG株。
实施例6：通过自身克隆株自11107B向11107D转化
实施例5(3)所获得的转化体A-1544/pIJDMG株、A-1544/pIJ702株以及原始的A-1544株的冻结种子接种于250mL容量的三角瓶中含有硫链丝菌肽25μg/mL的50mL SMN培养基(stabilose 2％、葡萄糖2％、Esusan-meat 2％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.25％、CaCO3 0.32％ pH7.4)中，28℃振荡培养48小时(种母培养，但对A-1544株不添加硫链丝菌肽)。将得到的种母培养液0.5mL接种于250mL容量的三角瓶中含有硫链丝菌肽25μg/mL的SMN培养基50mL中，28℃振荡培养72小时(但对A-1544株不添加硫链丝菌肽)。将所得到的培养液分成2mL，向其添加1M磷酸缓冲液(pH6.5)100μL、40mg/mL 11107B 50μL。将由此获得的转化培养液于28℃反应12小时。用乙腈1mL提取反应液200μL，通过HPLC测定11107B和11107D的量。测定结果如表5所示。另外，HPLC的详细条件如下所示。
分析装置：Shimadzu HPLC 10Avp
柱：CAPCELL PAK C18 SG120(φ4.6mm×250mm)
流动相：35％乙腈(0～10分)
        35％～65％乙腈(10～12分钟)
        65％乙腈(12～15分钟)
        35％乙腈(15～20分钟)
流速：1ml/分钟
检测：UV240nm
注射体积：10μL
柱温度：40℃
分析时间：20分钟
保留时间：11107B    14.3分钟
          11107D    7.9分钟
表5
  mg/L   A-1544株   A-1544/pIJ702株   A-1544/pIJDMG株
  11107B   496   651   14
  11107D   196   0   535
结果表明经含有psmA和psmB的质粒转化的A-1544/pIJDMG株与原始的A-1544株相比较，经12小时反应转化活性为约2.7倍。这暗示psmA和psmB的自身克隆可在自大环内酯类化合物11107B向11107D转化中发挥作用。
实施例7：确定链霉菌Mer-11107株(FERM BP-7812)来源的基因的碱基序列
(1)链霉菌Mer-11107株染色体DNA的制备
向包含葡萄糖1％、麦芽汁0.4％、酵母提取物1％的培养基中接种Mer-11107株，于28℃培养3天。将获得的培养液3000转/分钟离心10分钟，收集菌体。使用Blood & Cell Culture kit(QIAGEN公司)自该菌体制备染色体DNA。
(2)克隆编码具有大环内酯类化合物11107的16位羟化活性的蛋白质的DNA的部分序列
参考推定为天蓝色链霉菌A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列，设计并制备混合引物(5Dm-3F(序列编号4)和5D-1R(序列编号12))。
为了提高反应性，考虑了密码子的变动，使用混合碱基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下来，使用这2种引物(5Dm-3F和5D-1R)并以前项(1)所得到的Mer-11107株染色体DNA为模板进行PCR反应。PCR反应使用Takara LATaq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、50℃退火2分钟、68℃延伸30秒的3阶段反应重复进行35次。结果扩增到约300bp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-A2)。该DNA片段-A2很可能是编码具有羟化活性的蛋白质的DNA的一部分。PCR反应扩增的DNA片段-A2通过SUPREC PCR(宝酒造社)自反应液回收。
接下来，为了获得用于分析DNA片段-A2的碱基序列的足量DNA片段-A2，使用DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)连接质粒载体pT7BlueT(Novagen公司)和DNA片段-A2，转化大肠杆菌JM109株。然后，使用含有氨苄青霉素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉汤琼脂培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)选择经转化的大肠杆菌。由此分离的转化大肠杆菌菌落使用含有氨苄青霉素(50μg/mL)的L-肉汤液体培养基(1％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培养。使用质粒纯化试剂盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的转化大肠杆菌菌体分离纯化质粒DNA，获得一定量的DNA片段-A2。
(3)分析克隆的DNA片段-A2的碱基序列
将前项(2)所获得的DNA片段-A2的碱基序列使用分析装置(PEBiosystems 377XL)通过染料终止子循环测序法分析DNA碱基序列。虽然通过电泳测定的PCR反应所扩增DNA片段-A2为约300bp，但碱基序列分析的结果表明确切地为325bp(参见序列编号2的碱基837～碱基1161)。由于在所克隆的上述325bp DNA序列的两端发现有与进行上述PCR反应时使用的2种引物对应的DNA序列，因此明确了上述PCR反应中DNA片段-A2是由这2种引物(5Dm-3F和5D-1R)特异性扩增的。
(4)DNA片段-A2邻近区域的分析
如上所述，确定了Mer-11107株来源的编码具有羟化活性的蛋白质的部分DNA序列，通过反向PCR法(细胞工学14卷，p.591-593，1995年)扩增位于克隆片段上游、下游区域的邻近区域碱基序列，并克隆、序列分析。即，将Mer-11107株染色体DNA(参见(1))于K缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM KCl)中使用限制酶BamHI、于H缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶SalI分别消化。获得的各限制酶切断的DNA片段使用DNALigation Kit ver.2(宝酒造社)使自身环化。
另外，通过DNA片段-A2的碱基序列，设计并制备引物(7PIN-2F(序列编号13)和6PIN-2R(序列编号7))。
接下来，使用这2种引物(7PIN-2F和6PIN-2R)，以上述自身环化的Mer-11107株染色体DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应使用Takara LATaq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸5分钟的2阶段反应重复35次。
结果扩增到约1.3kbp大小的DNA片段(DNA片段-B2)和约1.4kbp大小的DNA片段(DNA片段-C2)，它们很可能是具有这样DNA序列的DNA，所述DNA序列包含编码具有羟化活性的蛋白质的DNA以及其上游和下游区域。
通过SUPREC PCR(宝酒造社)自该PCR扩增反应液回收DNA片段-B2和DNA片段-C2。接下来，对所获得的DNA片段-B2和DNA片段-C2，为了获得足量的用于碱基序列分析的各DNA片段，与上述(2)同样地使用质粒载体pT7Blue T(Novagen公司)、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)、大肠杆菌JM109株和质粒纯化试剂盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)，获得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B2(约1.3kbp大小)和DNA片段-C2(约1.4kbp大小)的碱基序列分析
将前项(4)所获得的DNA片段-B2和DNA片段-C2的碱基序列使用DNA碱基序列分析装置(PE Biosystems 377XL)通过染料终止子循环测序法分析。通过如此进行碱基序列的分析，自DNA片段-B2和DNA片段-C2序列获得了序列编号2所示的2329bp碱基序列的情报。
对该2329bp中的可读框(ORF)进行检索，确定了有2种蛋白质得到编码。将这些蛋白质的氨基酸序列通过BLAST search检索的结果为：序列编号2的碱基420～碱基1604中存在编码包含与细胞色素P450具有高同源性的395个氨基酸的蛋白质的ORF(以下称为bpmA)。由此，bpmA与自A-1544株分离的psmA的氨基酸序列具有最高的同源性(同源性67.4％)，与灰色链霉菌的细胞色素P450soy(SoyC)具有比较高的同源性(同源性64.8％)。由此认为bpmA为编码细胞色素P450类羟化酶的可能性高。
另外，在紧挨bpmA的下游(序列编号2的碱基1643～碱基1834)存在编码与3Fe-4S类的铁氧还蛋白具有高同源性的蛋白质的ORF(以下称为bpmB)。bpmB编码的蛋白质包含64个氨基酸，与自A-1544株分离的psmB氨基酸序列具有最高的同源性(同源性81.0％)，而且与推定为天蓝色链霉菌A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列的紧下游推定为铁氧还蛋白的氨基酸序列具有比较高的同源性(76.2％)。因此认为bpmB用于电子转移，与bpmA一起实施羟化。
实施例8：制备具有bpmA和bpmB的转化体
(1)制备含有Mer-11107株来源的bpmA和bpmB这两者的DNA片段
参考实施例7中分析的序列编号2的碱基序列，设计并制备5’末端添加有NdeI位点的引物07-NdeF(序列编号14)和5’末端添加有SpeI位点的引物07-SpeR(序列编号15)。接下来，使用这2种引物(07-NdeF和07-SpeR)，以实施例7(1)获得的Mer-11107株染色体DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应使用Takara LA Taq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸2分钟的2阶段反应重复进行30次。
结果扩增了含bpmA和bpmB的约1.5kbp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-D2)。通过SUPREC PCR(宝酒造社)自该PCR扩增反应液回收DNA片段-D2。
(2)质粒pTC-D07的构建
将pT7NS-CamAB(参见WO03/087381)于H缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶NdeI和SpeI消化，获得质粒消化物。同样地，将前项(1)所获得的DNA片段-D2使用限制酶NdeI和SpeI消化，并使用DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)连接所获得的DNA片段-D2的消化物和质粒消化物。由此，构建了内部含有bpmA和bpmB两者的DNA片段-D2和质粒pT7NS-CamAB连接在一起的约9.5kbp大小的质粒(称为质粒pTC-D07)。
(3)大肠杆菌转化株BL21(DE3)/pTC-D07的制备
使用前项(2)制备的质粒pTC-D07转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Novagen公司)。由此获得了经质粒pTC-D07转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-D07株。
实施例9：通过具有bpmA和bpmB的大肠杆菌转化体自大环内酯类化合物11107B向11107D转化
实施例8(3)得到的经转化大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-D07株和BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的冻结种子接种于15mL容量试管中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的3mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振荡培养20小时。将该种母培养液500μL接种于250mL容量的三角瓶中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的50mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振荡培养4小时后，依次添加100mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙酰丙酸50μL，32℃振荡培养5小时。离心分离(5000转/分钟、10分钟)得到的培养液，收集菌体。将菌体悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、40mg/mL大环内酯类化合物11107B 12.5μL。这样得到的转化反应液于28℃反应24小时。用甲醇600μL提取反应液400μL，通过HPLC测定大环内酯类化合物11107B和11107D的量。测定结果示于表6。另外，HPLC的详细条件如下所示。
分析装置：Shimadzu HPLC 10Avp
柱：Develosil ODS UG-3(φ4.6mm×250mm 3μm)
流动相：45％～55％ 甲醇(0～5分钟)
        55％甲醇(5～13分钟)
        55％～70％甲醇(13～17分钟)
        70％甲醇(17～21分钟)
        45％甲醇(21～25分钟)
流速：1.2ml/分钟
检测：UV240nm
注射体积：5μL
柱温度：40℃
分析时间：25分钟
保留时间：11107B    12.2分钟
          11107D    4.2分钟
表6
  mg/L   BL21(DE3)/pT7NS-CamAB   BL21(DE3)/pTC-D07
  11107B   162   156
  11107D   0.00   0.78
结果，作为对照的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株没有获得大环内酯类化合物11107D的峰，而含有bpmA和bpmB的BL21(DE3)/pTC-D07株获得了大环内酯类化合物11107D的峰。这暗示bpmA和bpmB参与自大环内酯类化合物11107B向11107D转化。
实施例10：确定自A-1560株(FERM BP-10102)来源的基因的碱基序列
(1)制备A-1560株的染色体DNA
向包含葡萄糖1％、麦芽汁0.4％、酵母提取物1％的培养基接种A-1560株，于28℃培养3天。将获得的培养液3000转/分钟离心10分钟收集菌体。使用Blood & Cell Culture kit(QIAGEN公司)自该菌体制备染色体DNA。
(2)克隆编码具有大环内酯类化合物11107的16位羟化活性的蛋白质的DNA的部分序列
参考推定的天蓝色链霉菌A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列，设计并制备混合引物(5Dm-3F(序列编号4)和5Dm-2R(序列编号16)。
由于考虑密码子的变动可提高反应性，使用了混合碱基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下来，使用这2种引物(5Dm-3F和5Dm-2R)并以上述(1)获得的A-1560株染色体DNA为模板进行PCR反应。PCR反应使用Takara LA Taq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、50℃退火2分钟、68℃延伸30秒的3阶段反应重复进行35次。结果扩增到约750bp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-A3)。该DNA片段-A3具有很高可能性为编码具有羟化活性的蛋白质的DNA的一部分。PCR反应所扩增的DNA片段-A3通过SUPREC PCR(宝酒造社)自反应液回收。
接下来，为了获得对产生的DNA片段-A3进行碱基序列分析的足量DNA片段-A3，使用DNA Ligation kit ver.2(宝酒造社)将DNA片段-A3连接入质粒载体pT7Blue T(Novagen公司)，转化大肠杆菌JM109株。然后，使用含有氨苄青霉素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉汤琼脂培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)选择所转化的大肠杆菌。将由此分离的转化大肠杆菌的菌落用含有氨苄青霉素(50μg/mL)的L-肉汤液体培养基(1％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培养。使用质粒纯化试剂盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的转化大肠杆菌菌体分离纯化质粒DNA，获得一定量的DNA片段-A3。
(3)经克隆的DNA片段-A3的碱基序列分析
将前项(2)所获得的DNA片段-A3的碱基序列使用分析装置(PEBiosystems 377XL)通过染料终止子循环测序法分析DNA碱基序列。虽然通过电泳测定的PCR反应所扩增DNA片段-A3为约750bp，但碱基序列分析的结果表明确切地为741bp(参见序列编号3的碱基616～碱基1356)。由于在所克隆的上述741bp DNA序列的两端发现有与进行上述PCR反应时使用的2种引物对应的DNA序列，因此明确了上述PCR反应中DNA片段-A3是由这2种引物(5Dm-3F和5Dm-2R)特异性扩增的。
(4)DNA片段-A3的邻近区域的分析
如上所述，由于确定了编码来自A-1560株的、具有羟化活性的蛋白质的部分DNA序列，通过反向PCR法(细胞工学14卷，p.591-593，1995年)对延伸至克隆片段的上游、下游域的邻近区域的碱基序列进行扩增、克隆、序列分析。即，将A-1560株染色体DNA(参见(1))于K缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM KCl)中使用限制酶BamHI、于L缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇)中使用限制酶KpnI、于H缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶SalI分别消化。将获得的各限制酶切断的DNA片段使用DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造社)进行自身环化。
另一方面，自DNA片段-A3的碱基序列设计并制备引物(5PIN-2F(序列编号17)和6PIN-2R(序列编号7))。
接下来，使用这2种引物(5PIN-2F和6PIN-2R)并以上述经自身环化的A-1560株染色体DNA作为模板进行PCR反应。PCR反应使用了Takara LATaq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸5分钟的2阶段反应重复35次。
结果扩增了约4.5kbp大小的DNA片段(DNA片段-B3)、约3.0kbp大小的DNA片段(DNA片段-C3)和约1.7kbp大小的DNA片段(DNA片段-D3)，它们极有可能为编码具有羟化活性的蛋白质的DNA以及具有包含其上游和下游区域的DNA序列的DNA。
通过SUPREC PCR(宝酒造社)自该PCR扩增反应液回收DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3。接下来，为了获得足量用于碱基序列分析的各DNA片段：DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3，与上述(2)同样，使用质粒载体pT7Blue T(Novagen公司)、DNA Ligation kitver.2(宝酒造社)、大肠杆菌JM109株和质粒纯化试剂盒(QIAfilter PlasmidMidi Kit，QIAGEN公司)，获得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B3(约4.5kbp大小)、DNA片段-C3(约3.0kbp大小)和DNA片段-D3(约1.7kbp大小)的碱基序列分析
将前项(4)所得的DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3的碱基序列使用DNA碱基序列分析装置(PE Biosystems 377XL)，通过染料终止子循环测序法分析。进行这样的碱基序列分析了解到自DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3的序列中得到序列编号3所示的1860bp的碱基序列这一情报。
对该1860bp中的可读框(ORF)进行检索，确定了有2种蛋白质得到编码。将这些蛋白质的氨基酸序列通过BLAST search检索的结果为：序列编号3的碱基172～碱基1383中存在编码包含与细胞色素P450具有高同源性的404个氨基酸的蛋白质的ORF(以下称为tpmA)。TpmA与推定为天蓝色链霉菌A3(2)的细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列具有最高的同源性(同源性77.4％)、与自A-1544株分离的psmA的氨基酸序列也具有高的同源性(同源性76.6％)。由此认为tpmA为编码细胞色素P450类的羟化酶的基因的可能性高。
另外，在紧挨tpmA的下游(序列编号3的碱基1399～碱基1593)存在编码与3Fe-4S类的铁氧还蛋白具有高同源性的蛋白质的ORF(以下称为tpmB)。tpmB编码的蛋白质包含65个氨基酸，与自A-1544株分离的psmB的氨基酸序列具有最高的同源性(同源性81.0％)，与紧挨推定为天蓝色链霉菌A3(2)细胞色素P450(CYP105D5)的氨基酸序列下游的推定为铁氧还蛋白的氨基酸序列也具有高同源性(82.5％)。因此认为tpmB用于电子转移，编码与tpmA一同进行羟化的铁氧还蛋白。
实施例11：制备具有tpmA和tpmB的转化体
(1)制备含有A-1560株来源的tpmA和tpmB这两者的DNA片段
参考实施例10中分析的序列编号3的碱基序列，设计并制备了在5’末端添加有NdeI位点的引物tpm-NdeF(序列编号18)和5’末端添加有SpeI位点的引物tpm-SpeR(序列编号19)。接下来，利用这2种引物(tpm-NdeF和tpm-SpeR)并以实施例10(1)所获得的A-1560株染色体DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应使用Takara LA Taq(宝酒造社)和PCR扩增装置(Biometra社T Gradient)，将98℃变性20秒、68℃退火和延伸2分钟的2阶段反应重复进行30次。
结果扩增到包含tpmA和tpmB的约1.5kbp大小的DNA片段(以下称为DNA片段-E3)。自该PCR扩增反应液通过SUPREC PCR(宝酒造社)回收DNA片段-E3。
(2)质粒pTC-tpmAB的构建
将pT7NS-CamAB(参见WO03/087381)在H缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl)中通过限制酶NdeI和SpeI消化得到质粒消化物。同样地，将前项(1)所得的DNA片段-E3的消化物和质粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(宝酒造)连接。由此，构建了内部含有tpmA和tpmB这两者的DNA片段-E3和质粒pT7NS-CamAB连接的约9.5kbp大小的质粒(称为质粒pTC-tpmAB)。
(3)大肠杆菌转化株BL21(DE3)/pTC-tpmAB的制备
使用实施例11(2)制备的质粒pTC-tpmAB转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Novagen公司)。由此获得了经质粒pTC-tpmAB转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-tpmAB株。
实施例12：通过具有tpmA和tpmB的大肠杆菌转化体进行11107B向11107D的转化
前项(3)得到的经转化大肠杆菌BL21(DE3)/pTC-tpmAB株、以及BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的冻结种子接种于15mL容量试管中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的3mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振荡培养20小时。将该种母培养液500μL接种于250mL容量的三角瓶中装有的含氨苄青霉素50μg/mL的50mL L-肉汤培养基(1.0％细菌用胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振荡培养4小时后，依次添加100mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙酰丙酸50μL，32℃振荡培养5小时。离心分离(5000转/分钟、10分钟)得到的培养液，收集菌体。将菌体悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、40mg/mL 11107B12.5μL。这样得到的转化反应液于28℃反应24小时。用甲醇600μL提取反应液400μL，通过HPLC测定11107B和11107D的量。测定结果如表7所示。另外，HPLC的详细条件如下所示。
分析装置：Shimadzu HPLC 10Avp
柱：Develosil ODS UG-3(φ4.6mm×250mm 3μm)
流动相：45％～55％甲醇(0～5分钟)
        55％甲醇(5～13分钟)
        55％～70％甲醇(13～17分钟)
        70％甲醇(17～21分钟)
        45％甲醇(21～25分钟)
流速：1.2ml/分钟
检测：UV240nm
注射体积：5μL
柱温度：40℃
分析时间：25分钟
保留时间：11107B    12.2分钟
          11107D    4.2分钟
表7
  mg/L   BL21(DE3)/pT7NS-CamAB   BL21(DE3)/pTC-tpmAB
  11107B   141   128
  11107D   0   18
结果表明，作为对照的大肠杆菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株未获得11107D的峰，与之相反，含有tpmA和tpmB的BL21(DE3)/pTC-tpmAB株可获得11107D的峰。这暗示tpmA和tpmB参与自11107B向11107D的转化。
实施例13：通过自身克隆株进行下式表示的自11107H向11107CB的转化
Figure A20048003505400631
(1)转化体反应液的制备
制备包含stabilose 2.0％、葡萄糖2.0％、大豆粉(Honen Soypro)2.0％、酵母提取物0.5％、CaCO3 0.32％的pH 7.4的培养基，向250mL三角瓶中加入25mL培养基，121℃20分钟加热灭菌。向该培养基添加硫链丝菌肽，使其终浓度为25mg/L后，按1％接种A-1544/pIJDMG株冻结种子，28℃、220转/分钟进行种母培养3天。将该种母培养液以1％添加至同样组成的培养基，28℃、220转/分钟进行2天培养。该培养结束后，自培养液通过离心分离菌体而集菌，并悬浮于pH 6.5的磷酸缓冲液20mL中。向该菌体悬浮液添加底物11107H(100g/L DMSO溶液)至终浓度2000mg/L，于28℃、220转/分钟进行16小时的转化反应。
(2)自转化体反应液获得大环内酯类化合物11107CB
自实施同样操作的转化反应液(6个烧瓶)离心分离菌体，使用等量的乙酸乙酯提取离心上清2次。浓缩提取液后，通过薄层层析(MERCKSilicagel 60 F254’0.5mm展开液；甲苯∶丙酮＝1∶1)纯化，得到11107CB119.5mg。
ESI-MS m/z 573(M+Na)+
1H-NMR谱(CD3OD，500MHz)：δppm(积分，多重度，结合常数J(Hz))：0.81(3H，d，J＝6.7Hz)，0.89(3H，d，J＝7.0)，0.94(3H，t，J＝7.4Hz)，1.25(3H，s)，1.30-1.20(1H，m)，1.33(3H，s)，1.55-1.40(2H，m)，1.65(1H，dd，J＝6.3，14.0Hz)，1.75(3H，s)，1.88(1H，dd，J＝5.4，14.0Hz)，2.07(3H，s)，2.68-2.40(4H，m)，2.89(1H，m)，3.51(1H，m)，4.51(1H，m)，4.97(1H，d，J＝8.6Hz)，4.99(1H，d，J＝9.3Hz)，5.30(1H，dd，J＝9.7，15.2Hz)，5.52(1H，dd，J＝9.4，15.2Hz)，5.58(1H，dd，J＝1.9，15.5Hz)，5.78(1H，dd，J＝2.8，15.5Hz)，5.85(1H，d，J＝15.3Hz)，6.07(1H，d，J＝11.0Hz)，6.51(1H，dd，J＝11.0，15.3Hz)
实施例14：通过自身克隆株进行下式表示的自11107L向11107CG的转化
Figure A20048003505400641
(1)转化体反应液の制备
制备包含stabilose 2.0％、葡萄糖2.0％、大豆粉(Honen Soypro).0％、酵母提取物0.5％、CaCO3 0.32％的pH 7.4的培养基，向250mL三角瓶中加入25mL培养基，121℃ 20分钟加热灭菌。向该培养基添加硫链丝菌肽，使其终浓度为25mg/L后，按1％接种A-1544/pIJDMG株冻结种子，28℃、220转/分钟进行种母培养3天。将该种母培养液以1％添加至同样组成的培养基，28℃、220转/分钟进行2天培养。该培养结束后，自培养液通过离心分离菌体而集菌，并悬浮于pH 6.5的磷酸缓冲液20mL中。向该菌体悬浮液添加底物11107L(100g/L DMSO溶液)至终浓度1600mg/L，于28℃、220转/分钟进行16小时的转化反应。
(2)自转化体反应液获得大环内酯类化合物11107CG
自该转化反应液离心分离菌体，使用等量的乙酸乙酯提取离心上清2次。浓缩提取液后，通过薄层层析(MERCK Silicagel 60 F254’0.25mm展开液；甲苯∶丙酮＝1∶1)纯化，得到11107CG 25mg。
ESI-MS m/z 633(M+Na)+
1H-NMR谱(CD3OD，500MHz)：δppm(积分，多重度，结合常数J(Hz))：0.88(3H，d，J＝6.7Hz)，0.90(3H，d，J＝7.0Hz)，0.94(3H，d，J＝7.4Hz)，1.18(3H，s)，1.30-1.20(1H，m)，1.34，(3H，s)，1.56-1.40(2H，m)，1.66(1H，dd，J＝6.2，14.0Hz)，1.79-.169(2H，m)，1.81(3H，d，J＝1.0Hz)，1.86(1H，dd，J＝5.4，14.0Hz)，2.05(3H，s)，2.08(3H，s)，2.52(1H，dd，J＝4.2，15.2Hz)，2.64-2.55(1H，m)，2.67(1H，dd，J＝2.2，7.9Hz)，2.78(1H，dd，J＝3.0，15.2Hz)，2.90(1H，dt，J＝2.2，5.6Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.4，8.8Hz)，3.75(1H，m)，4.98(1H，dd，J＝2.8，11.3Hz)，5.08(1H，d，J＝9.7Hz)，5.13(1H，d，J＝9.6Hz)，5.61(1H，dd，J＝9.9，15.2Hz)，5.75(1H，dd，J＝9.7，15.2Hz)，5.88(1H，d，J＝15.3Hz)，6.13(1H，d，J＝11.0Hz)，6.54(1H，dd，J＝11.0，15.3Hz)
产业上的可利用性
通过使用携带本发明DNA的质粒转化的转化体，可以高效产生具有极好抗肿瘤活性的、在水溶液中稳定性也极好的16位带羟基的12元环大环内酯化合物。
                       序列表
<110>美露香株式会社
<110>卫材株式会社
<120>参与大环内酯类化合物的羟化作用的DNA
<130>04063PCT
<150>JP 2003-396828
<151>2003-11-27
<160>19
<210>1
<211>3793
<212>DNA
<213>链霉菌属(Streptomyces sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1322)..(2548)
<220>
<221>CDS
<222>(2564)..(2761)
<400>1
ctgcagctcg acgtgcgggt cggacttcac gttgaagtac cagaccggat gcttgggcgc     60
accgcccagc gaggcgaccg ccgcgtaact cccctcgtgc tcgacccgca tcagcggcgt    120
cttgcggatc tttccgctgc gcgcgccccg ggtggtgagc acgatgaccg gcagcccggt    180
gtcccgcagc gtggtgccct tggtgccccc ggaactctcg tacagctcga cctgctcgcg    240
cacccactgc gtcgggctgg gctcgtactc gccctcaagt ggcaagggat ccgtctcctt    300
cgtcggtccg gcggatggtg ctccggacgg tcccaactcc cgcggccgcc cggatcatcc    360
gtaccgcatg ccccttcgcc cgagcgggtg atcaccgttc cggccatccg gtcgtccgca    420
ccgcgagcac caggatcacg gcgctggaga gcagggccgt gaccagccgc ccccggtggc    480
ccgtcagggc gcgacccagc agcgcgcccc cgcccgccag cagtagctgc cagctcgcgg    540
acgcggcgaa ggccgccgcg gcgaacaccg cccgtttcag cggccgtgcc gcaccggcgg    600
cgccgctgcc gagcaccagc gccacgaagt agaccaccgt catgggattg agcagggtga    660
tcccgagaag gccgagataa gcccctgccg cgcctggaac cggccgttcc gggcgggtgg    720
tgagccgatg ggcgcggtac tgccgcaggg cgagcagcgc cgcccgcagc gcgagcaccg    780
cgaggaccag cgccgaggcc cagcgcagcg ggtccagcac cggccgcagc tgtgccgcga    840
gggcggcgcc gcccacggtc gcgagcagcg cgtacagccc gtcggccgtg gcgacgccga    900
gcgccgccga ggcgccggtg cgcagcgagg tgcgggcggt gagggagacc agataggtcc    960
cgaccgcgcc gacgggcacc gcgatgccgt acccggcgag caggcccgcg agcagcgcgc   1020
ccgtcacggg cgtgcgggac tggttcctcc ggggacggcg gggctgctgt cggcccggca   1080
ccgcgggggc ggtggcagcg ggcgtcggca ggagggaggc tgtaggaggc atgggccgat    1140
cctggggccg ccgcgcccgc accggcaaat gaattacggc gcgttccagc ccccggccgg    1200
ctcgctcttc ggccacttca ccgcgtacgg cgatctggcc gaacttgctg tcgccccata    1260
ggtgcctcgg gcatctaatg aagatcggca cgacgcacct cttcgtctgc gaggtctttc    1320
c atg acg gaa ctg acg gac atc acc ggc ccg ggg acc ccg gcc gaa        1366
  Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Gly Thr Pro Ala Glu
    1               5                  10                  15
ccc gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac ccc ccc acc      1414
Pro Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr
                 20                  25                  30
gga tac ggc ccg ctg cgc gac ggg cgc agc ctg tcc cgc gtc acc ctc      1462
Gly Tyr Gly Pro Leu Arg Asp Gly Arg Ser Leu Ser Arg Val Thr Leu
             35                  40                  45
ttc gac ggc cgc gag gtc tgg atg gtc acg ggc cac gcc acc gcc cgc      1510
Phe Asp Gly Arg Glu Val Trp Met Val Thr Gly His Ala Thr Ala Arg
         50                  55                  60
gcg ctg ctc gcg gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc acc ctc ccg ggc      1558
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr Leu Pro Gly
     65                  70                  75
ttc ccc gtg ccc acg gcc cgc ttc gcg gcc gtc cgc gac cgg cgg gtg      1606
Phe Pro Val Pro Thr Ala Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Arg Arg Val
 80                  85                  90                  95
gcg ctg ctc ggc gtg gac gac ccg gtc cac cag acc cag cgg cgg atg      1654
Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Val His Gln Thr Gln Arg Arg Met
                100                 105                 110
atg atc ccg tcg ttc acc ctc aag cgc gcg gcc ggg ctg cgg ccc acc      1702
Met Ile Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Ala Gly Leu Arg Pro Thr
            115                 120                 125
atc cag cgg acc gtc gac ggg ctg ctg gac gcg atg atc gag aag ggg      1750
Ile Gln Arg Thr Val Asp Gly Leu Leu Asp Ala Met Ile Glu Lys Gly
        130                 135                 140
ccg ccg gcc gag ctg gtc tcc gcc ttc gcc ctg ccc gtg ccc tcg gtg      1798
Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Val
    145                 150                 155
gtc atc tgc ggc ctg ctc ggc gtg ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc      1846
Val Ile Cys Gly Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe
160                 165                 170                 175
gag gaa cag tcc cgc acg ctg ctg cgc ggt ccc acg gcc gcc gac tcg      1894
Glu Glu Gln Ser Arg Thr Leu Leu Arg Gly Pro Thr Ala Ala Asp Ser
                180                 185                 190
caa ggg gcg cgc gag cgg ctc gag gag tac ctc ggc ggg ctg atc gac      1942
Gln Gly Ala Arg Glu Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Leu Ile Asp
            195                 200                 205
gac aag gag cgg cag gcc gaa ccc ggc gac ggc gtc ctg gac gac ctc      1990
Asp Lys Glu Arg Gln Ala Glu Pro Gly Asp Gly Val Leu Asp Asp Leu
        210                 215                 220
gtc cac cag cgg ctg cgc acc ggc gag ctg gac cgg cgc gac gtg gtg      2038
Val His Gln Arg Leu Arg Thr Gly Glu Leu Asp Arg Arg Asp Val Val
    225                 230                 235
gcg ctg gcc gtc atc ctg ctc gtg gcc ggg cac gag acg acc gcc aac      2086
Ala Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn
240                 245                 250                 255
atg atc tcc ctc ggc acc tac acg ctg ctg cgg cac ccc ggc cgg ctg      2134
Met Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Arg His Pro Gly Arg Leu
                260                 265                 270
gcc gag ctg cgc gcc gac ccg gcg ctg ctg ccc gcc gcc gtg gag gag      2182
Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu
            275                 280                 285
ctg atg cgg atg ctc tcg atc gcg gac ggg ctg ctg cgc ctg gcc ctg      2230
Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Leu Ala Leu
        290                 295                 300
gag gac atc gag atc gcc ggc gcc acg atc cgg gcc ggc gag ggc gtc      2278
Glu Asp Ile Glu Ile Ala Gly Ala Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val
    305                 310                 315
ctg ttc tcc acc tcg ctg atc aac cgc gac gag tcc gtg ttc gac gac      2326
Leu Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Phe Asp Asp
320                 325                 330                 335
ccc gac acc ctg gac ttc cac cgc tcc acc cgc cac cac gtg gcc ttc      2374
Pro Asp Thr Leu Asp Phe His Arg Ser Thr Arg His His Val Ala Phe
                340                 345                 350
ggt ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcc cgc gcc gag      2422
Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu
            355                 360                 365
ctg gag atc gcc ctg ggc acg ctc ctg gag cgg ctc ccc ggc ctc cgg      2470
Leu Glu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg
        370                 375                 380
ctg gcc gcg ccc gcc gag gag atc ccg ttc aaa ccc ggc gac acg atc      2518
Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile
    385                 390                 395
cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa gaggctctgg tc atg cac    2569
Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp                   Met His
400                 405                                   410
atc gac atc gac aag gac cgc tgc atc ggc gcc ggc cag tgc gcg ctg      2617
Ile Asp Ile Asp Lys Asp Arg Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu
            415                 420                 425
gcc gcc ccg ggc gtg ttc acc cag gac gac gac ggc tac agc acc ctg      2665
Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Tyr Ser Thr Leu
        430                 435                 440
ctc ccc ggc cgc gag gac ggc ggg ggc gac ccg atg gtc cgg gag gcg      2713
Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala
    445                 450                 455
gcc cgc gcc tgc ccg gtg agc gcc atc cgg gtg acc gaa ccg gcc ggc      2761
Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Arg Val Thr Glu Pro Ala Gly
460                 465                 470                 475
tga ggcggggccc ggcggccgcg gcccgctgcc gggaccgccg ttcccagttc agtagg    2820
gtcgtgcgat gacctcacag gccgggaagc ccttcctcta cgtcgtcgtc tgcgcggccg    2880
ggaccgccgc cggagtcacc acgctgatcg gcgccgccca ggcgcggggc tgggaggtgg    2940
gggtcctggc cacgccggtg gcgatgggcg ggttcttcga cacggctgcg gtcgaggaga    3000
tgacgggccg gcccatccgc tcggcctggc gctcgccggc cgatccgcgc ccgttcccgc    3060
cgccgggcgc cgtggtggtg gcgcccgcca ccttcaacac cgtcaacaag tgggcggccg    3120
gtctcgccga cacgctcgcc gtcggcacgc tctgcgaggc ggcgggcctc ggcgtgccga    3180
tcgccgtcct gccctgcgtg gcggacgcgc tggccgccca ccccgcgtac cgggagggcc    3240
ttctccggct gcgtgggatg ggcgtccgct tcggcgagcc gtacgccggc ccgccggggg    3300
aggacggcga ggcggacggc gcacggcccg ggttcgcctg ggagaacgcc ctggacctgc    3360
tggagcgggc ctgaacccgc tccccgaccc gtagggcctg tctgacactg tcagacaggc    3420
cctaacggca ggtcagcgcc ggcccggcca gcatgccgcc ggtgtagagg tcctggcccc    3480
gcggcagcca gtagcccagc ctggagacca ccgtggagca gtcaggcccg acggtgacgc    3540
ggaccttcac cgtctcggga cggccgggct gcagcgcggt cagcgcgcag tccagggagt    3600
acgcgagccg ggtcttcgag gtaccggccg accagcgggt tgacgcagcg ggcgtcgtcc    3660
gtggcgatcc gcaccccggt gcccgccccg ccgatgagtc cgagccgggc gctgccgtcg    3720
ccctcgtcgc tgtcccggcg gaccgtgtag gtcagcgtgg tggtggcgtc gcgccgcagg    3780
gtgtccggtc gac                                                       3793
<210>2
<211>2329
<212>DNA
<213>链霉菌属
<220>
<221>CDS
<222>(420)..(1604)
<220>
<221>CDS
<222>(1643)..(1834)
<400>2
ggatccacgg gtggccgccg cgctcgcccg ggtgaccgac cggcgtatcg gctatgtcgc     60
cgcgctcttc gcggcgctgg gcttccccga gggcgaggcg cgggaccgcg gcctgctggc    120
gtacaccgcc tacctcggcc acacccagct cggacatgcc gtccgacaga gcctgccggc    180
cgaggcggca cacgaccgct atctggatgg cgtgatcgac accctcgtac ggccgcggga    240
cggaggcgat gaagccgaac atgtcacaat ctgaacgagg ttggcggaac tgcgcgcaga    300
acatgcccgg tatccgcggc atgaggtgag atcggcgcgg cgaaacacgg tgcgccacag    360
cgttgccatc tcacacacga gcaactcgag ccacttgaga ctcgtacggg aggaaattc     419
gtg acc gaa gcc atc ccc tac ttt cag aac cgc acc tgt ccc tac cac      467
Val Thr Glu Ala Ile Pro Tyr Phe Gln Asn Arg Thr Cys Pro Tyr His
  1               5                  10                  15
ccg ccc gcc gcc tat cag cca ctg cgc ggg gcc ggc ccg ctg agc cat      515
Pro Pro Ala Ala Tyr Gln Pro Leu Arg Gly Ala Gly Pro Leu Ser His
             20                  25                  30
gtc acg ttc tac gac ggc cgg aag gtg tgg gcg gtc acc ggc cac ccc      563
Val Thr Phe Tyr Asp Gly Arg Lys Val Trp A1a Val Thr Gly His Pro
         35                  40                  45
gag gca cgg gcg ctg ctg acc gac cag cga ctc tcc gcc gac cgg cag      611
Glu Ala Arg Ala Leu Leu Thr Asp Gln Arg Leu Ser Ala Asp Arg Gln
     50                  55                  60
aac ccg gcc ttc ccg gtc ccc ttc gaa cgc ttc gcg gcc atc cgc cgg      659
Asn Pro Ala Phe Pro Val Pro Phe Glu Arg Phe Ala Ala Ile Arg Arg
 65                  70                  75                  80
gtc cgg acg ccg ctg atc ggg gtc gac gac ccg gag cac aac acc cag      707
Val Arg Thr Pro Leu Ile Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln
                 85                  90                  95
cgc cgg atg ctg atc ccc agc ttc agc ctc aag cgg acc gcc gca ctg      755
Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Leu Lys Arg Thr Ala Ala Leu
            100                 105                 110
cgg ccg gag atc cag cgg atc gtc gac ggg ctg ctc gac cgg atg ctg      803
Arg Pro Glu Ile Gln Arg Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Arg Met Leu
        115                 120                 125
gat cag ggc ccg ccc acc gag ctg gtc tcc gcg ttc gcc ctg ccg gtc      851
Asp Gln Gly Pro Pro Thr Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val
    130                 135                 140
ccg tcg atg gtg atc tgc gca ctg ctc gga gtc tca tac gcc gac cat      899
Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Ser Tyr Ala Asp His
145                 150                 155                 160
gag ttc ttc gag gag gag tcc cgc cgc atc ctg cgc ggc cgg tcg gcc      947
Glu Phe Phe Glu Glu Glu Ser Arg Arg Ile Leu Arg Gly Arg Ser Ala
                165                 170                 175
gag gag gcg gag gac gcc cgg ctg aag ctg gag gag tac ttc acc ggg      995
Glu Glu Ala Glu Asp Ala Arg Leu Lys Leu Glu Glu Tyr Phe Thr Gly
            180                 185                 190
ctg atc gcc gcc aag gag aag aac ccg ggc gac ggg ctg ctg gac gag     1043
Leu Ile Ala Ala Lys Glu Lys Asn Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu
        195                 200                 205
ctg atc gag gac cgg ctg cgg acc ggc gcg ctc acc cgc gac gag ctg     1091
Leu Ile Glu Asp Arg Leu Arg Thr Gly Ala Leu Thr Arg Asp Glu Leu
    210                 215                 220
gtc cgg ctc gcc atg atc ctg ctg gtg gcc ggc cat gag acc acc gcc     1139
Val Arg Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala
225                 230                 235                 240
aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg gac cac ccc gag cag     1187
Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Asp His Pro Glu Gln
                245                 250                 255
ctg gcg cag ctc aag gcc gac gag ggc ctg atg ccg gcc gcc atc gag      1235
Leu Ala Gln Leu Lys Ala Asp Glu Gly Leu Met Pro Ala Ala Ile Glu
            260                 265                 270
gag ctg ctg cga ttc ctg tcc atc gcg gac ggc ctg ctg cgg gtg gcg      1283
Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala
        275                 280             285
acg gag gac atc gag atc ggc ggt cag gtg atc cgg gcc gac gac gcg      1331
Thr Glu Asp Ile Glu Ile Gly Gly Gln Val Ile Arg Ala Asp Asp Ala
    290                 295                 300
gtc ctg ttc ccc gcc tca ctg atc aac cgg gac gag gcc gcc tat ccg      1379
Val Leu Phe Pro Ala Ser Leu Ile Asn Arg Asp Glu Ala Ala Tyr Pro
305                 310                 315                 320
gca ccc gac gag ctg gac ctc ggc cgt tcg gcc cgc cat cac gtg gcg      1427
Ala Pro Asp Glu Leu Asp Leu Gly Arg Ser Ala Arg His His Val Ala
                325                 330                 335
tcc ggc ttc ggg atc cac cag tgc ctg ggg cag aac ctc gcc cgc gcg      1475
Ser Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala
            340                 345                 350
gag atg gag atc gcg ctg cgc tca ctg ttc acc agg atc ccg cag ctg      1523
Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Thr Arg Ile Pro Gln Leu
        355                 360                 365
cgg ctc gcc gtg ccg gcc gcc gag att ccg ttc aag gac gga gac acc      1571
Arg Leu Ala Val Pro Ala Ala Glu Ile Pro Phe Lys Asp Gly Asp Thr
    370                 375                 380
ctg caa ggc atg atc gaa ctg ccg ctg gcc tgg tag cagccaggac ggcaga    1623
Leu Gln Gly Met Ile Glu Leu Pro Leu Ala Trp
385                 390                 395
ccaaagaaag gggtccgga atg cgg atc gcg atc gac acc gac cgc tgt atc     1675
                     Met Arg Ile Ala Ile Asp Thr Asp Arg Cys Ile
                                     400                 405
ggc gcc ggc cag tgt gcc ctg acc gcg ccc ggg ggt ttc acc cag gat      1723
Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Gly Phe Thr Gln Asp
            410                 415                 420
gac gac ggt ttc agt gca ctg ctg ccc ggc cgg gag gac ggc gcc ggc      1771
Asp Asp Gly Phe Ser Ala Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala Gly
        425                 430                 435
gac ccg ctg gtg cgg gaa gcc gcc cgc gcc tgc ccc gtg cag gcc att      1819
Asp Pro Leu Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gln Ala Ile
    440                 445                 450
gcg gtc acc gac gat tag cagcaccccc gcggacgacc cggcagacgc gcgcggcc    1875
Ala Val Thr Asp Asp
455
ccggctgaca cccggcgccc gaggcgcgcc cgagccgtcc gcccctccac ttgtccctac    1935
ggcatccacc ccatccgcta ccgcaacacc ccttgggtga cgggcagttt cgaggacccc    1995
ggtgtgcccg gggcgtactg gtgaccgtca ccggcttcac gccgcgattg cccacatagg    2055
cgtcgtcgct cgcggcgatc acgaagcgcg gtcggtgccc cggctcgtaa cggtgcacga    2115
tgcccggcag ttccacggtg aaccgccggg ccacatcggg cacccgggcc ggggccacca    2175
acaggtgcac cagcgtcttc ctgccgttcg gcgcgacatc gtagagcttg gcgaacagca    2235
ccagcttgtc cgccgcatcc gcggaccgct gcgcccgccc ggcctgcggc gaggcaacct    2295
tcagcgtcac cctcggcgcg cccaccacgt cgac                                2329
<210>3
<211>1860
<212>DNA
<213>未知
<220>
<221>CDS
<222>(172)..(1383)
<223>A-1560株
<220>
<221>CDS
<222>(1399)..(1593)
<400>3
cggggatcgt acgccgtacc gtttcggggc aaccgaatta cgatgcggaa tggatggttc     60
ccagccagat cccgcaggta gccgatctgg ccgaacttga tgtcgtgcac tggatgcctc    120
gggcatctaa tgaagatcgg cacgacgcat ccttcgtctg cgaggtctcc c atg aca     177
                                                         Met Thr
                                                           1
gac acg aca gac ctg acc gag ctg tca gat ccc gtc tcc ttc ccc cag      225
Asp Thr Thr Asp Leu Thr Glu Leu Ser Asp Pro Val Ser Phe Pro Gln
          5                  10                  15
gac cgg agc tgc ccc tac cac ccg ccc acc ggg tac gac ccg ctg cgc      273
Asp Arg Ser Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Asp Pro Leu Arg
     20                  25                  30
acc gaa cgg ccg ccc gcc cgc atc cgg ctc tac gac ggc cgc ccc gcc      321
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Arg Leu Tyr Asp Gly Arg Pro Ala
 35                  40                  45                  50
tgg ctc gtc acc ggc cac gcc gtc gcc cgt gac ctg ctg gtc gac ccc      369
Trp Leu Val Thr Gly His Ala Val Ala Arg Asp Leu Leu Val Asp Pro
                 55                  60                  65
cgc ctg tcc acg gac cgc acc cgc tcg ggc ttc ccg gcc aca act ccc      417
Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr Arg Ser Gly Phe Pro Ala Thr Thr Pro
             70                  75                  80
cgc ttc gcc gcg gtc cgc gac cgc aag ccg gcg ctc ctc ggc gtc gac      465
Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Arg Lys Pro Ala Leu Leu Gly Val Asp
         85                  90                  95
gac ccc aag cac cgc acc cag cgg tgg atg atg atc ccg agc ttc acc      513
Asp Pro Lys His Arg Thr Gln Arg Trp Met Met Ile Pro Ser Phe Thr
    100                 105                 110
ctc agg cgc gcc acc gag ctc agg ccg cgc atc cag gag atc gtc gac      561
Leu Arg Arg Ala Thr Glu Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Ile Val Asp
115                 120                 125                 130
gaa ctg ctg gac gtg atg atc gcc cag gga ccc ccg gcc gac ctg gtg      609
Glu Leu Leu Asp Val Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val
                135                 140                     145
cgt tcc ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcc atg gtg atc tgc gcc ctg ctc      657
Arg Ser Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu
            150                 155                 160
ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag gac cag tcc agg cgg      705
Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Asp Gln Ser Arg Arg
        165                 170                 175
ctg ctg cgc gga ccg gcg gcc gag gac acg cag gac gcc cgg gac cgg      753
Leu Leu Arg Gly Pro Ala Ala Glu Asp Thr Gln Asp Ala Arg Asp Arg
    180                 185                 190
ctc gcc gcg tac ctg gag gac ctg atc gac gag aag cgg cgc cgg ccc      801
Leu Ala Ala Tyr Leu Glu Asp Leu Ile Asp Glu Lys Arg Arg Arg Pro
195                 200                 205                 210
ggt gac ggc ctg ctg gac gaa ctc gtc cag cag cgt ctg aac gaa ggc      849
Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu Leu Val Gln Gln Arg Leu Asn Glu Gly
                215                 220                 225
gag ctc gac cgg gag gaa ctg acc gcg ctg gcg atg atc ctg ctg gtc      897
Glu Leu Asp Arg Glu Glu Leu Thr Ala Leu Ala Met Ile Leu Leu Val
            230                 235                 240
gcg ggc cac gag acc acc gcc aac atg atc tcc ctg ggc acc tac acg      945
Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr
        245                 250                 255
ctc ctg ctg cac ccc gaa cgg ctg acc gag ctg cgc gcc gac ccc gcg      993
Leu Leu Leu His Pro Glu Arg Leu Thr Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala
    260                 265                 270
ctg ctg ccg gcc gcc gtc gag gaa ctg atg cgg atg ctg tcc atc gcg      1041
Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala
275                 280                 285                 290
gac gga ctg ctg cgg cag gcc acc gag gac atc gag atc gcc ggg acc      1089
Asp Gly Leu Leu Arg Gln Ala Thr Glu Asp Ile Glu Ile Ala Gly Thr
                295                 300                 305
acc atc agg gcc ggg gac ggc gtg gtc ttc tcc acc tct gtc atc aac      1137
Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn
            310                 315                 320
cgc gac gag gac gtc tac ccg gcc ccc gac acc ctc gac ttc cac cgc      1185
Arg Asp Glu Asp Val Tyr Pro Ala Pro Asp Thr Leu Asp Phe His Arg
        325                 330                 335
tcg acc cgc cac cac gtc gcc ttc ggt ttc gga atc cac cag tgc ctc      1233
Ser Thr Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu
    340                 345                 350
ggc cag aac ctc gcc cgc acc gaa ctg gag atc gcc ctg cgc acg ctc      1281
Gly Gln Ash Leu Ala Arg Thr Glu Leu Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu
355                 360                 365                 370
ctc gaa cgg ctg ccc acg ctc cgg ctc gcc gcc cca ccg gag gaa atc      1329
Leu Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Glu Glu Ile
                375                 380                 385
ccc ttc aaa ccc ggc gac acc atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtc      1377
Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val
            390                 395                 400
agc tgg taa gaggctgccg tc atg cat atc gag atc gac aag gac cgc tgc    1428
Ser Trp                   Met His Ile Glu Ile Asp Lys Asp Arg Cys
                          405                 410
atc ggc gcc gga cag tgc gcc ctg acc gcc ccg ggt gtg ttc acc cag      1476
Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln
                420                 425                 430
gac gac gac ggc ttc agt gac ctg ttg ccc ggc cgg gag gac ggc gcc      1524
Asp Asp Asp Gly Phe Ser Asp Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala
415             435                 440                 445
ggc gac ccg atg gtc cgg gag gcc gcc agg gcc tgc ccc gtg agt gcc      1572
Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala
            450                 455                 460
atc acg ctg tcc gag gac ggg tag ggggccgagc cgcgccgccc gccggtccgc     1626
Ile Thr Leu Ser Glu Asp Gly
        465
tgccgcggcg ccgtgccgac gcggcggccg gccggcccgt ccggtgcccg tcgcgtcgcc    1686
ccgtggcccc ggcggcggct gattgactag ggttcccggg tgagcgaaca ggcccagaag    1746
ccctccgggg cgccgcccgc gaaagacacc gggacggcgc ccgggaaacc ccttcctcta    1806
cgtcgtcgtc tgcgccgccg gcatcgccga aggcgtcagc aagctgatca ccgc          1860
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：5Dm-3F引物
<400>4
ttcgcsctsc csgtcccstc satggtsat                                        29
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：5Dm-3R引物
<400>5
gttgatsays gasgtsgaga a                                                21
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：6PIN-2F引物
<400>6
gctgcgcctg gccctggagg acatcgagat                                       30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：6PIN-2R引物
<400>7
ctgttcctcg aagaactcgt ggtcggcgta                                       30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：DM-NdeF引物
<400>8
gcccccatat gacggaactg acggacatca                                       30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：DM-SpeR引物
<400>9
gggccactag tcagccggcc ggttcggtca                                       30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：DM-BglF引物
<400>10
cgcatagatc ttcacccgag cgggtgatca                                       30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：DM-BglR引物
<400>11
tcccgagatc ttgaaggtcc gcgtcaccgt                                       30
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：5D-1R引物
<400>12
aggtgcccag cgagatcatg tt                                               22
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：7PIN-2F引物
<400>13
ccatgatcct gctggtggcc ggccatgaga                                       30
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：07-NdeF引物
<400>14
gccccatatg accgaagcca tcccctactt                                       30
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：07-SpeR引物
<400>15
gccactagtg ctaatcgtcg gtgaccgcaa                                       30
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：5Dm-2R引物
<400>16
ctggatsgtg tcsccsggyt t                                                21
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：5PIN-2F引物
<400>17
cggaatccac cagtgcctcg gccagaacct                                       30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：tpm-NdeF引物
<400>18
ggccccatat gacagacacg acagacctga                                       30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>链形式：单链
<220>
<223>拓扑结构：线性
<220>
<223>人工序列的描述：tpm-SpeR引物
<400>19
gcgcgactag tccccctacc cgtcctcgga                                       30

Claims (16)

1.经分离的纯DNA，其为参与将式(I)
所示的大环内酯类化合物(以下称为大环内酯类化合物11107B)生物学转化为式(II)
Figure A2004800350540002C2
所示的16位羟化大环内酯类化合物的DNA，包含编码部分或全长的具有16位羟化酶活性的蛋白质或铁氧还蛋白的DNA或其变体。
2.下述(a)、(b)或(c)所示的权利要求1所述的DNA：
(a)编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质的DNA，所述DNA选自由序列编号1的碱基1322位至碱基2548位的连续碱基序列、序列编号2的碱基420位至碱基1604位的连续碱基序列和序列编号3的碱基172位至碱基1383位的连续碱基序列组成的组，
(b)上述(a)所示DNA的变体，为这样的DNA：
(i)与上述(a)所示的DNA在严格的条件下杂交，且
(ii)编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质，
(c)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(a)所示的DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(a)或(b)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
3.自权利要求2所述的DNA编码的蛋白质。
4.携带权利要求2所述的DNA的自我复制型或整合复制型重组质粒。
5.经权利要求4所述的重组质粒转化的转化体。
6.编码具有大环内酯类化合物11107B的16位羟化酶活性的蛋白质的DNA的分离方法，其特征在于以包含权利要求2所述的DNA或其部分的DNA作为探针或引物使用。
7.下述(d)、(e)或(f)所示的权利要求1所述DNA：
(d)编码铁氧还蛋白的DNA，所述DNA选自由序列编号1的碱基2564位至碱基2761位的连续碱基序列、序列编号2的碱基1643位至碱基1834位的连续碱基序列和序列编号3的碱基1399位至碱基1593位的连续碱基序列组成的组，
(e)上述(d)所示DNA的变体，为这样的DNA：
(i)与上述(d)所示的DNA在严格的条件下杂交，且
(ii)编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质，
(f)这样的DNA，由于基因密码子的简并性，与上述(d)所示的DNA在严格的条件下不杂交，但所编码的蛋白质与自上述(d)或(e)所示的DNA编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。
8.自权利要求7所述的DNA编码的蛋白质。
9.携带权利要求7所述的DNA的自我复制型或整合复制型重组质粒。
10.经权利要求9所述的重组质粒转化的转化体。
11.编码具有铁氧还蛋白功能的蛋白质的DNA的分离方法，其特征在于以包含权利要求7所述的DNA或其部分的DNA作为探针或引物使用。
12.16位羟化的大环内酯类化合物的产生方法，其特征在于：使用培养基培养权利要求5或权利要求10所述的转化体，在培养中或培养后，将经增殖的转化体与式(III)
〔式中，
Figure A2004800350540004C2
R12、R16b、R17a、R17b、R18、R20a、R20b、R21a和R21b相同或不同，表示
(1)氢原子，
(2)可具有取代基的C1-22烷基，
(3)-OR(式中R表示
1)氢原子，
可以有取代基的
2)C1-22烷基，
3)C7-22芳烷基，
4)5元环至14元环的杂芳氧基烷基，
5)C2-22烷酰基，
6)C7-15芳酰基，
7)C3-23不饱和烷酰基，
8)-CORco(式中Rco可以有取代基，表示
8-1)5元环至14元环的杂芳基，
8-2)C1-22烷氧基，
8-3)不饱和C2-22烷氧基，
8-4)C6-14芳氧基，
8-5)5元环至14元环的杂芳氧基，
或
8-6)3元环至14元环的含氮非芳族杂环)，
9)C1-22烷基磺酰基，
10)C6-14芳基磺酰基，
或
11)-SiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3相同或不同，表示C1-6烷基或C6-14芳基))，
(4)卤素原子
或
(5)-RM-NRN1RN2
{式中RM表示单键或-O-CO-；
RN1和RN2
1)相同或不同，表示
1-1)氢原子或
1-2)可以有取代基的
(i)C1-22烷基，
(ii)不饱和C2-22烷基，
(iii)C2-22烷酰基，
(iv)C7-15芳酰基，
(v)不饱和C3-23烷酰基，
(vi)C6-14芳基，
(vii)5元环至14元环的杂芳基，
(viii)C7-22芳烷基，
(ix)C1-22烷基磺酰基或
(x)C6-14芳基磺酰基；
或
2)RN1和RN2与结合的氮原子一起形成可具有取代基的3元环至1
4元环含氮非芳族杂环}；
但是，
R21a和R21b一起可形成(i)酮结构(＝O)或(ii)肟结构{＝NORox(式中Rox表示可具有取代基的C1-22烷基、不饱和C2-22烷基、C6-14芳基、5元环至14元环的杂芳基或C7-22芳烷基)}；
R16a表示氢原子；
R21c表示
(1)氢原子或
(2)
Figure A2004800350540006C1
(式中R22a、R22b和R22c相同或不同，表示
1)氢原子，
2)C1-6烷基，
3)-OR(式中R具有上述的含义)，
4)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含义)或
5)卤素原子；
或
R21a和R21b中的任一方与R22a和R22b中的任一方一起可形成部分结构
Gm表示
(1)式(GM-I)所示的基团
{式中
R2和R10相同或不同，表示氢原子或C1-22烷基；
R3a、R3b、R5a、R5b、R6a和R6b相同或不同，表示
1)氢原子，
2)羟基，
3)可具有取代基的
3-1)C1-22烷基，
3-2)C1-22烷氧基，
3-3)C6-14芳氧基，
3-4)5元环至14元环的杂芳氧基，
3-5)C2-22烷酰氧基，
3-6)C7-15芳酰氧基，
3-7)C3-23不饱和烷酰氧基，
3-8)-OCORco(式中Rco具有上述的含义)，
3-9)C1-22烷基磺酰氧基，
3-10)C6-14芳基磺酰氧基，
或
3-11)-OSiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3具有上述的含义)，
4)卤素原子，
或
5)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN和RN2具有上述的含义)；
或者
R5a和R5b可一起形成酮结构(＝O)；
或者
R6a和R6b可一起形成螺环氧乙烷基或环外亚甲基；或者，
R7a和R7b相同或不同，表示氢原子或-ORH(式中RH表示氢原子、C1-22烷基或C2-22烷酰基)}、
(2)式(GM-II)所示的基团
(式中R2、R3a、R3b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)，
(3)式(GM-III)所示的基团
(式中R2、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)，
(4)式(GM-IV)所示的基团
(式中R2、R6a、R7a、R7b和R10与式(GM-I)的定义相同)；
或
(5)式(GM-V)所示的基团
(式中R2、R3a、R6a、R6b和R10与式(GM-I)的定义相同)〕所示的大环内酯类化合物接触，转化为式(IV)
Figure A2004800350540009C3
(式中W、R12、R16b、R17a、R17b、R20a、R20b、R21a、R21b、R21c和Gm表示与式(III)的定义相同)
所示的16位羟化的大环内酯类化合物，收集如此转化的16位羟化的大环内酯类化合物。
13.权利要求12所述的产生方法，其中转化体为权利要求5所述的转化体，且为具有编码铁氧还蛋白的DNA的转化体。
14.权利要求12所述的产生方法，其特征在于：将式(III-a)
Figure A2004800350540010C1
(式中
54表示双键或单键、W’表示双键或
Figure A2004800350540010C2
R5’表示氢原子或乙酰氧基，R6’表示氢原子或羟基，R7’表示氢原子或乙酰基)所示的化合物转化为式(IV-a)
Figure A2004800350540010C3
(式中
54、
W’、R5’、R6’和R7’与式(III-a)的定义相同)所示的化合物。
15.权利要求14所述的产生方法，向式(IV-a)的化合物转化中的式(III-a)的化合物选自由以下化合物组成的组中：
(1)
54是单键、W’是
R5’、R6’和R7’是氢原子的化合物，
(2)
54是单键、W’是
Figure A2004800350540010C5
R5’和R6’是氢原子，R7’是乙酰基的化合物，
(3)
54是单键、W’是
R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(4)
54是单键、W’是
R5’是氢原子，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物，
(5)
54是单键、
W’是双键，R5’、R6’和R7’是氢原子的化合物，
(6)
54是单键、
W’是双键，R5’和R6’是氢原子，R7’是乙酰基的化合物，
(7)
54是单键、
W’是双键，R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(8)
54是单键、
W’是双键、R5’是氢原子、R6’是羟基、R7’是乙酰基的化合物、
(9)
54是双键、W’是
Figure A2004800350540011C3
R5’和R7’是氢原子，R6’是羟基的化合物，
(10)
54是双键、W’是
R5’是氢原子，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物，
(11)
54是单键、W’是
R5’是乙酰氧基，R6’是羟基，R7’是氢原子的化合物，和
(12)
54是单键、W’是
Figure A2004800350540012C3
R5’是乙酰氧基，R6’是羟基，R7’是乙酰基的化合物。
16.权利要求5或权利要求10所述的转化体的用途，用于产生16位羟化的大环内酯类化合物。
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