MXPA03012040A - Nuevos substratos cromogenicos y su uso para la dosificacion de la actividad de carboxipeptidasas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos cromogenicos y su utilizacion para la dosificacion de enzimas de la familia de carboxipeptidasas N, y carboxipeptidasas U. Contempla mas especificamente un compuesto de la formula (I) en la cual A = (1) o (2) o (3) o (4) o (5), R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -CI, -CF3, -OCF3,- SCH3, R3 = un radical de aminoacido hidrofobico por una carboxipeptidasa A. R4 = un radical de aminoacido basico.

Description

NUEVOS SUBSTRATOS CROMOGÉNICOS Y SU USO PARA LA DOSIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CARBOXIPEPTIDASAS La presente invención se refiere a los compuestos cromogénicos y su uso para la dosificación de enzimas de la familia de carboxipeptidasas N, y carboxipeptidasas U. Comprende además de manera más específica el uso de dichos compuestos para la dosificación de la actividad de TAFI (Inhibidor de Fibrinolisis Activable por Trombina) en una muestra sanguínea y el método de dosificación correspondiente. Las carboxipeptidasas (CP) constituyen un grupo de enzimas en el seno de la familia de exopeptidasas. Son enzimas que cortan los enlaces de amida de las cadenas polipeptídicas al nivel del último aminoácido de terminal COOH. Comprenden la serina carboxipeptidasas, cisteína carboxipeptidasas y metalocarboxipeptidasas. Numerosas carboxipeptidasas se han aislado y secuenciado, en las bacterias, levaduras y vegetales. Estas enzimas están igualmente presentes en un gran número de tejidos en los mamíferos. Las carboxipeptidasas se han aislado notablemente al nivel del páncreas y en los mastocitos. Otras carboxipeptidasas circulantes en el plasma igualmente se han clonado, aislado y secuenciado. Todas estas enzimas tienen un papel in vivo dependiente a la vez de su localización y de sus propiedades físicas. Así, las carboxipeptidasas se clasifican diferentemente según su especificidad del substrato. Las carboxipeptidasas A tienen un espectro relativamente grande: hidrolizan el enlace péptidico de terminal C del último aminoácido - 2 -preferentemente si es hidrofóbico (Phe, Leu, Val, Ala). Hidrolizan dé manera más lenta los aminoácidos dicarboxílicos (Asp, Glu) así como la glicina (Gly), y no hidrolizan todos los aminoácidos básicos tales como arginina (Arg)„ lisina (Lys), histidina (His) u omitina (Om), un homólogo inferior de la lisina, ni los aminoácidos secundarios tales como prolina (Pro) o hidroxiprolína (Hyp). Carboxipeptidasas B hidrolizan específicamente los últimos aminoácidos básicos de terminales C, tales como Arg, Lys. Esta clase de enzimas se subdivide en subclases constituidas por carboxipeptidasas H (igualmente denominadas encefalina convertasa o carboxipeptidasa E), M. N y E. Carboxipeptidasa E se ha localizado en los gránulos secretorios de islotes pancreáticos, glándulas surrenales y pituitarias, y el cerebro. La carboxipeptidasa M es una enzima de membrana presente en numerosos tejidos y células en cultivo. Carboxipeptidasa N (designada a veces CPN) es una enzima circulante en el plasma. Protege al organismo contra el efecto vasoactivo e inflamatorio de péptidos que contienen un aminoácido básico de terminal C (de preferencia una lisina), liberados en la circulación. Esta enzima existe bajo su forma activa en la sangre. Igualmente se denomina quininasa debido a sus substratos naturales que son bradiquinina, quininas, anafilatoxinas. En fin, carboxipeptidasas U (inestables) (designadas a veces CPU) se enzimas que hidrolizan igualmente los aminoácidos básicos de terminales C, con una preferencia por las argininas, pero que, - 3 -contrariamente a las carboxipeptidasas N, son muy inestables cuando se encuentran bajo su forma activa. Una revisión general reciente sobre las enzimas de la familia de carboxipeptidasas se ha realizado por BOUMA et al., (1 ). TAFI es una metalocarboxipeptidasas de zinc básica (1 -4). Es más precisamente una carboxipeptidasa U, ya qüe su actividad es inestable a 37°C. Esta enzima, de la cual ADNc y la secuencia de aminoácidos corresponde al hombre, por ejemplo, se describen en la patente de E.U. 5,206, 161 , es una proteína plasmática cuyo papel en la regulación de la fibrinolisis se ha contemplado inicialmente a partir de la observación in vitro de un retraso de la lisis de coágulo en presencia de TAFI activo. TAFI activo separa los residuos de arginina y lisina expuestos en posición de terminal COOH sobre la fibrina. Esta hidrólisis conduce a una disminución del número de sitios de fijación de plasminogeno y tPA a la superficie del coágulo de fibrina, y una disminución de la transformación de plasminogeno en plasmina por tPA. TAFI se ha identificado sucesivamente bajo el nombre de procarboxipeptidasa B (pro-PCPB) además de procarboxipeptidasa inestable (proCPU: Procarboxipeptidasa Inestable) y procarboxipeptidasa r (CPR), debido a una actividad carboxipeptidásica sobre los residuos de arginina. La forma zimógena es una glucoproteína de cadena única de 60 KDa sintentizada en el hígado y circulante en el plasma. La separación de zimógeno se realiza principalmente por la trombina al nivel del sitio arg 92. Esta proteolisis libera un péptido de - 4 -terminal N de 92 aminoácidos que contienen varios sitios de glucosilación. La acción catalítica de la trombina en TAFI se aumenta considerablemente por trombomodulina en presencia de iones divalentes. La velocidad de activación de TAFI catalizado por trombina se aumenta así más de 1000 veces debido a la formación de un complejo ternario con la trombomodulina. TAFI inactivo (TAFIa) se constituye por el dominio catalítico de terminal C de zimógeno y comprende 309 aminoácidos. Debido a su papel clave en los mecanismos de regulación del procesos de la fibrinolisis, se prueba rápidamente útil para poder medir la cantidad de TAFI activo constitucional y TAFI activable presenta en el plasma en diferentes estados patológicos. Varios métodos de dosificación de la actividad de diversas carboxipeptidasas que utilizan substratos específicos se han descrito en el estado de la técnica. Asi, WOLFF et al., (5) han comparado los desempeños de substratos sintéticos Hip-Arg, Hip-Lys, Hip-Orn sobre carboxipeptidasas B pancreáticas purificadas por cromatografía al medir las diferencias de absorción en UV. En 1970, S. SUZUKI et al., (6) han mejorado la detección de producto de hidrólisis al derivar la benzoglicina liberada por el reactivo TT (2,4,6 Tricloro-5-Triazin). Esta derivación operará específicamente sobre CH2 de la glicina en a de una función ácida libre únicamente. Este derivado se vuelve amarillo vivo (longitud de onda máxima a 382 nm). Este método de desarrollo de coloración amarilla sobre los - 5 -restos de Hipurilo se ha utilizado grandemente por numerosos autores por la siguiente. En 1972, K. LORENTZ eí al., (7) ha utilizado una reacción de coloración de la arginina liberada esta vez por acción de carboxipeptidasas B sobre un substrato Hip-Arg al utilizar p-benzoquinona como reactivo. De esta manera, el derivado coloreado tiene una longitud de onda máxima de 480 nm. En 1980, Th. H. Plummer eí al., (8) ha utilizado un substrato sintético: Furilacriloil-Ala-Lys para cuantificar las carboxipeptidasas N, la lectura se hace a 324 nm (casi UV pero no visible}. En 1985, G.H. Fischer eí al., (9) ha utilizado un substrato fluorescente por dansilacion de terminal N de un péptido específico de la carboxipeptidasa a dosificar. Esta dosificación necesita una etapa de extracción de productos de hidrólisis para una buena separación de especies que tienen lectura. En 1986, H. SARUTA eí al., han determinado por un método calorimétrico, la actividad de la carboxipeptidasa A (10). Aquellos que utilizan una enzima específica: "Hipuricasa" para hidrolizar el derivado hipuricilo obtenido por hidrólisis de substrato hidroxi-hipuricil-Phg por CPA. Esta reacción se veleta finalmente por 4-aminoantipirina para proporcionar un colorante quinoneimida absorbente a 505 nm. En 1998, NAM JOO HONG eí al., ha utilizado un substrato sintético con un análogo de la arginina, tiaarginina para dosificar CPB (1 1 ). Sin embargo, los métodos calorimétricos descritos anteriormente ya no se utilizan más para dosificar específicamente la actividad enzimática - 6 -de CPN o CPU , notablemente TAFI , ya que presentan ciertos inconvenientes incompatibles con una prueba de dosificación simple y eficaz de este tipo de enzima por calorimetría. En efecto, según los casos considerados: - ya sea la reacción de derivación que resulta en un producto coloreado no es específico de especies liberadas cuando la hidrólisis, - ya sea los reactivos de derivación son muy tóxicos y no pueden utilizarse a la escala industrial, - ya sea el método de revelación coloreada es muy grande y apremiante y no puede ser automático fácilmente. En 1996, W.L Mock ef al., han descrito un método de dosificación de una endoproteasa de zinc extracelular de origen bacteriano, termolisina, con la ayuda de substratos sintéticos que se decoloran bajo la acción de hidrólisis enzimática (12). Para hacer esto, los autores han sintetizado los compuestos dipeptídicos constituidos de un residuo de leucina que lleva un grupo N-(4-metoxifenilazoformil) transplantado al nivel de la función de amina, y por otro lado un aminoácido neutro (Leu, Ala, Phe o Gly). La incorporación del grupo arazoformilo da lugar a un compuesto fuertemente coloreado. En presencia de la termolisina, la molécula de colorante se reordena durante la reacción química de hidrólisis según un mecanismo bien descrito en (12-13), que proporciona nacimiento a los productos no coloreados (fragmento anizola, N2, C02 y aminoácido). Por lo tanto es fácil seguir la velocidad de la enzima por la - 7 -velocidad de decoloración del medio. Los mismos autores han descrito igualmente un método cinético de dosificación par espectrometría base sobre el mismo principio que el precedente para la carboxipeptidasa A (13) y carboxipeptidasa B porcina pancreática (14). En este caso, los compuestos utilizados se constituyen de un solo aminoácido conocido por separarse por carboxipeptidasa A (Phe, Leu) o carboxipeptidasa B (Lys), que lleva un grupo N-arazoformilo. La separación enzimática de estos compuestos en productos no coloreados, se sigue por la medición de decrecimiento de coloración del medio. Partiendo de estas enseñanzas, los autores de la presente invención han sintetizado nuevos compuestos coloreados para dosificar, por el método calorimético, la actividad de carboxipeptidasa N, o carboxipeptidasa U, y más particularmente, la actividad de TAFI. Según un primer aspecto, la presente invención tiene por objeto nuevos compuestos, que constituyen substratos de carboxipeptidasa N o U, y más particularmente substratos de TAFI activo. Estos compuestos son substratos cromogénicos. Los compuestos de la invención se caracterizan porque tratan de compuestos de arazoformilo de fórmula general (I) siguiente: en la cual: - 8 - - R1 , R2 = ?, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3l -SCH3 - R3 = un radical de aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A.

- R4 = un radical de aminoácido básico. De manera más particular, R3 se elige entre los radicales aminoácidos hidrofóbicos tales como: - la tirosina: la fenilalanina la alanina: CH3 la valina: -CH-(CH3)2 la leucina: -CH2-CH-(CH3) - la isoleucina: - la fenilglicina: R4 se elige de manera más precisa entre los radicales de aminoácidos tales como: - la arginina - la lisina (R4 = -(CH2)4-NH2) - la ornitina -(CH2)3-NH2 De preferencia, R3 representa un resto aminoácido aromático y en particular la fenilalanina o la tirosina, y R4 la arginina o la lisina. Ri se elige de preferencia entre: -H y -CH3, y R2, se elige de preferencia entre: Una familia preferida de compuestos según la invención se representa por la fórmula general: en la cual: - - Ri, R2 = -H, -CH3, (CH3)2 CH-, CH3-O-, Cl-, -CF3. - R3 = un radical de aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A.

- R4 = un radical de aminoácido básico. R3 representa preferentemente la fenilalanina, o la tirosina y, presenta preferentemente la arginina o la lisina - 10 - -H y -CH3> y R2, se elige de preferencia entre: Un compuesto particularmente preferido de la familia de la presente invención es un compuesto de la fórmula (I) en la cual: dicho compuesto eligiéndose en el seno del grupo constituido por los siguientes compuestos eri los cuales: NH R1=— Cl R2=-CH3 R __ CH2- % R4=- (CH2>5-NH-C \ — / NH2 - 1 1 - * las cifras entre paréntesis determina la posición de los grupos metilo en el radical fenilo. La invención se refiere en particular, en el cuadro de definiciones proporcionadas anteriormente, cada compuesto que corresponde a la fórmula (I) y que resulta de las combinaciones posibles de los grupos A, R1 , R2, R3 y R4 de los cuales se ha proporcionado una definición preferida anteriormente. Por lo tanto, los compuestos así definidos se denominará indiferentemente "compuestos de fórmula (I)" o "substratos de fórmula (I)". Según un segundo aspecto, la presente invención tiene por objeto un método de dosificación colorimétrica de la actividad de una carboxipeptidasa N, o de preferencia de la actividad de CPU, en una muestra biológica en la cual: - se pone en contacto dicha muestra - con un compuesto cromogénico de la fórmula (I) tal como se define anteriormente, y una enzima de la familia de carboxipeptidasas A, en las condiciones que permiten la hidrólisis de la muestra y, - 12 - - se determina la hidrólisis de dicho compuesto de la fórmula (I) por CPN o CPU de la muestra por la medición del decrecimiento de su coloración (que corresponde a una disminución de la absorción) a una longitud de onda seleccionada a partir del espectro de absorción de dicho compuesto. La disminución de la coloración resulta de la doble hidrólisis de substrato de la fórmula (I) por las carboxipeptidasas N o U de la muestra por una parte, por carboxipeptidasa A por otra parte. El método según la presente invención se realiza de preferencia con la ayuda de un compuesto de la fórmula (i) en la cual el aminoácido hidrofóbico es fenilalanina o de preferencia tirosina, y el aminoácido básico es arginina o lisina. El método de la invención se realiza preferentemente con la ayuda de un compuesto de la fórmula (I) en la cual R1 se elige entre -H y -CH3, y R2 entre -CH3, -0-CH3 y -S-CH3. Ventajosamente, cuando el compuesto de la fórmula (I), es H , R2 es S-CH3. El método de la presente invención se realiza ventajosamente con la familia de compuestos de la fórmula (I) en la cual: R1 y R2 teniendo cualquiera de los significados proporcionados anteriormente y R2 siendo de preferencia -S-CH3. De manera más particular el compuesto de la fórmula (I) - 13 -utilizado es un compuesto fenilazoformilo en el cual dicho compuesto eligiéndose en el seno de un grupo constituido por lo siguientes compuestos, en los cuales: Ri=— H R2=-SCH3 -F-CHa^^ ^-(CHzfc- H-t^ - 14 - Las cifras entre paréntesis determina la posición de grupos metilo en el radical fenilo. Carboxipetidasa A utilizada puede provenir de diferentes fuentes, tales como, por ejemplo, páncreas o células mastocitarias. Puede ser de origen humano o animal. Se utiliza preferentemente en el cuadro de la invención de la carboxipeptidasa A pancreática de origen bovino. El principio del método de la invención se basa en una hidrólisis de un substrato coloreado de fórmula (I) tal como se describe anteriormente, por la acción de la carboxipeptidasa N o de la carboxipeptidasa U eventualmente presente en la muestra analizada, asociada con aquella de carboxipeptidasa A agregada en el medio. Esta hidrólisis específica conduce a una extinción de la coloración de compuesto de partida, que puede seguir con la ayuda de un espectrofotómetro. De manera más precisa, tomado en cuenta las especificaciones de hidrólisis de carboxipeptidasas N o U y A expuestas precedentemente, y las características estructurales de compuestos de la fórmula (I) descritos anteriormente, el contacto de una carboxipeptidasa A y una carboxipeptidasa N o U activada con tal compuesto generará un corte al nivel del enlace entre el primer y el segundo aminoácido de dicho compuesto debido a la acción de la carboxipeptidasa N o U, siguiendo casi - 15 -simultáneamente un corte al nivel del enlace entre el grupo azoformilo y el primer aminoácido, debido a la acción de la carboxipolipeptidasa A. El resultado de estas dos reacciones será una decoloración del medio de partida. Será entonces fácil seguir en función del tiempo este decrecimiento de coloración al colocarse en una longitud de onda de absorción de colorante [compuesto de la fórmula (I)], de preferencia en la longitud de onda que corresponde a su máximo (pico) de absorción. Este decrecimiento es representativo de la cinética de hidrólisis. La cantidad de carboxipeptidasa N o U activa presente inicialmente en la muestra se calcula al comparar la densidad óptica medida a aquella de una curva de contraste que puede, por ejemplo, establecerse a partir de una gama de concentraciones de carboxipeptidasa N o U purificada activa en solución. Inversamente, si la muestra no contiene carboxipeptidasa N o U o si es inactiva, no habrá corte entre el primer y segundo aminoácido de compuesto de la fórmula (I); y entonces, la carboxipeptidasa A no podrá tratar un nivel del enlace de grupo coloreado sobre el primer aminoácido. De hecho, no se observará disminución de la coloración de la solución de partida. La invención contempla más particularmente un método de dosificación de la actividad de un CPN o CPU en una muestra biológica, notablemente una muestra sanguínea tal como sangre total o de plasma o diluida, y, preferentemente, un método de dosificación de la actividad de TAFI en una muestra sanguínea, notablemente de plasma puro o diluido. En este caso, la muestra a probarse se emplea en presencia - 16 -de una solución de tampón con, si es necesario, un activador de la carboxipeptidasa de la cual se desea medir la actividad (solución nombrada tampón activador a continuación), y dejada en incubación, el tiempo necesario para obtener la activación de la carboxipeptidasa estuidada. La incubación es de preferencia realizada a temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos, ventajosamente 8 a 12 minutos, de preferencia 10 minutos. Según un modo de realización preferido de la invención, el activador de carboxipeptidasa puede ser un activador, notablemente un factor de la coagulación, que se deja agitar a manera de activar la carboxipeptidasa U, en particular TAFl. En este caso, se agrega enseguida en la mezcla un inhibidor de serina proteasas para acabar en un bloqueo del proceso de coagulación. El inhibidor de serina proteasas es, por ejemplo, PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-clorometilacetona-Bachem - Ref. No. 1065) utilizado en una gama de concentración final de 1 a 50 µ?, de preferencia 30 µ?, que corresponden a las concentraciones iniciales de 10 a 250 µ? y de preferencia 150 µ?. Otros compuestos, tales como Pefabloque [4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluorurodehipocloruro - Pentafam - Ref. 399.01 ] utilizado preferentemente a una concentración de 0.1 m convienen igualmente. Simultáneamente o inmediatamente después de la adición del inhibidor, se agrega uno de los compuestos de la fórmula (I) según la invención en solución acuosa. Este compuesto se utiliza en general en una gama de concentraciones finales comprendida entre 0.25 y 10 mM, de - 17 -preferencia entre 0.25 y 2.5 mM, ventajosamente entre 0.25 y 1 mM. Se utiliza de preferencia a 0.4 mM. Después de una nueva fase de incubación, de preferencia a temperatura ambiente durante la cual el substrato de la fórmula (1 ) se habrá cortado al nivel de su segundo aminoácido por CPN o CPU de la muestra de la cual se busca la actividad, la hidrólisis puede detenerse por adición de HCI, seguida inmediatamente por la adición de una base para reajustar pH a un valor comprendido entre 7 y 8. La densidad óptica de mezcla así obtenida se mide entonces una primer vez sin adición de CPA en el medio. CPA se agrega enseguida en el medio, y DO es una nueva medición. Su decrecimiento puede seguir al espectrofotómetro. Traduce la hidrólisis de substrato de la fórmula (I) por la acción conjunta de CPU o N de la muestra y CPA. Los delta DO (? DO ) medidos se comparan con los valores llevados en una curva de contraste que puede, por ejemplo, obtenerse a partir de una muestra deficiente en CPN o CPU estudiada, sobrecargada con esta enzima purificada. El procedimiento descrito anteriormente constituye un modo de realización preferido de la invención. Sin embargo, varias variantes de este se contemplan, como que concierne a las secuencias de adición de diferentes compuestos utilizados, como naturaleza de estos compuestos. Entran igualmente en la definición de la presente invención. Así, es por ejemplo posible incorporar el substrato de la fórmula (I) desde el principio del método, al mismo tiempo que el tampón activador de la coagulación. - 1 8 - Del mismo modo, se puede realizar la dosificación a partir de dos alícuotas del mismo medio reaccional, del cual una sola se trata con CPA. Se mide entonces ADO entre estas dos alícuotas. En el caso en donde el tampón activador activa la coagulación, la activación puede realizarse según diferentes vías conocidas por el experto en la material, y utilizadas en rutina en las pruebas de coagulación. Estas vías de activación son notablemente: - la vía de activación por el complejo trombina/trombomodulina. Esta primer posibilidad constituye un modo de realización preferido de la presente invención. - la vía de activación por el factor XI activo, que en este caso reemplaza la trombina en el tampón activador. Para acelerar la reacción, puede ser ventajoso agregar igualmente la trombomodulina en el medio. - la vía de activación por venenos, notablemente veneno de serpiente, con igualmente la adición eventual de protrombina y/o trombomodulina en el medio. Los venenos preferentemente utilizados son los venenos de la familia de "trombina" tal como el veneno de Arkistrodon rhodostoma o Bathrops atroz, así como los venenos de activadores de protrombina, tales como aquel de Notechis scutatus o Echis carinatus (1 5-1 8). - la vía de activación por el factor relativo al tejido, en - 19 - presencia de fosfolípidos y de calcio (activación de ia vía exógena según el principio de un tiempo Quick). - la vía de activación de la fase de contacto. - la vía de activación por plasmina. Ventajosamente, el método según la invención permite medir para una misma muestra, por una parte la actividad de CPN y/o CPU "constitucional" presente en esta, es decir, CPN y/o CPU presente bajo una forma activa "naturalmente" (es decir, sin inducción de la activación por un tampón activador), y por otro lado, la actividad de CPN y/o CPU activable, es decir, CPN y/o CPU presente en la muestra bajo una forma inactiva, cuya actividad se inducirá o generará durante el proceso de activación unido al efecto del tampón activador. Para esto, se compara la actividad de hidrólisis en un substrato de la fórmula (I) de una muestra según el método descrito anteriormente, al poner la muestra en presencia de un tampón activador (detección de la actividad total de CPN o CPU en la muestra), ya sea en presencia de un tampón fisiológico sin activador (detección de la actividad de CPN y/o CPU constitucional). La diferencia de delta de DO entre dos mediciones permite obtener la actividad de CPN o CPU activable presente en la muestra. Según una variante preferida, la presente invención tiene por objeto un método de dosificación de TAFI activo en una muestra biológica, notablemente una muestra sanguínea, dicho método utilizando uno de los compuestos o substratos de la fórmula (I) descritos precedentemente. La actividad de TAFI constitucional y/o activable se mide al - 20 -tratar la muestra tal como aquella que se describió, en presencia y en ausencia de un inhibidor específico de TAFI. El inhibidor que se utiliza de preferencia es CPI ("Carboxipeptidasa Inhibidora de Tubérculos de Papa) cuya utilización en los estudios in vitro y in vivo en la función de TAFI se ha descrito grandemente en la literatura (ref. 1 ). A la fecha es bien conocido por el experto en la materia que CPI inhibe específicamente TAFI sin alterar la actividad de otros CP plasmáticos. En el cuadro del método de la invención, CPI puede utilizarse en una gama de concentraciones que tienen de 0.10 a 0.50 mM (concentraciones iniciales), o de 2 a 10 µ? expresados en 0.38 mM (concentración inicial). Según el principio activo de esta variante preferida, la muestra se activa por el tampón de activación de TAFI, por ejemplo, un tampón de activación de la coagulación por el complejo trombina/trombomodulina, se trata según el método descrito precedentemente ya sea en presencia o ya sea en ausencia del inhibidor de TAFI. La diferencia de coloración del medio con y sin inhibidor de TAFI permite así determinar la actividad enzimática apropiada de TAFI activo (TAFIa) en la muestra. De manera más precisa, el método de la invención puede realizarse según el siguiente procedimiento." la muestra a probarse se divide en 2 alícuotas o más si es necesario, según se desee determinar la actividad de todo el TAFI contenido en la muestra o se desee hacer la distinción entre la actividad de TAFI constitucional y aquella de TAFI activable. - 21 - - Una primer alícuota que contiene el inhibidor de TAFI se activa y trata según el método descrito precedentemente. Aquel que no va a generar más que una débil decoloración del medio, resultante de una hidrólisis residual del substrato de la fórmula (I) por otras carboxipeptidasas presentes en la muestra. - Una segunda alícuota se trata de manera idéntica a la anterior, pero en la ausencia del inhibidor de TAFI. Va a resultar en una fuerte decoloración del medio, unido a hidrólisis del substrato de la fórmula (I) por TAFI activado en la muestra. - Se mide la diferencia de coloración (? DO) entre la primer y segunda alícuota. Lo que se así representativo de la actividad específica de TAFI activo en la muestra. Si se desea hacer la distinción entre la actividad específica de TAFI activable y aquella de TAFI constitucional, se utiliza una tercer alícuota de la misma muestra de la cual se mide igualmente la actividad de hidrólisis en el substrato de la fórmula (I), pero en la cual no se soltará la activación, sin agregar el tampón activador en el medio. ? DO entre estas diferentes alícuotas permiten obtener ya sea la actividad de TAFI total de la muestra, ya sea solo TAFI constitucional, y se deduce aquella de TAFI activable. Según un tercer aspecto, la invención tiene por objeto un equipo de diagnóstico para la dosificación de CPN o CPU, dicho equipo de - 22 -diagnóstico comprendiendo un substrato de la fórmula (I) tal como se define precedentemente. Preferentemente, el equipo dé diagnóstico según la presente invención es un equipo para medir la actividad de TAFI en una muestra sanguínea. Tal equipo de diagnóstico comprende notablemente: - un activador de TAFI, notablemente un tampón activador de TAFI, - carboxipeptidasa A, - substrato de la fórmula (I), inhibidor de TAFI. El equipo comprende igualmente de manera opcional un inhibidor de serina proteasas. Cada uno de estos compuestos se presenta preferentemente en polvo o bajo forma lifolizada. Los siguientes ejemplos y figuras ilustran la presente invención. Figura 1 : Espectro de absorción de diferentes compuestos de la fórmula (I) sintetizados, medido con un espectrómetro UV-visible. Figura 2: Análisis de AAFFR efectuado por hidrólisis ácida. Figura 3: Curva de contraste establecida a partir de un plasma deficiente de TAFI, sobrecargado con TAFI purificado para obtener uná gamma de concentración que tiene de 0 a 26 µg ml. Figura 4: Curva de contraste para una gamma de concentración, obtenida a partir de un plasma pool. La calibración se 23 realiza en método de generación de trombina. La dosificación colorimétrica se hace con el substrato cromogénico 4-MTPAFYR. Ejemplo N°1 : Síntesis de un grupo de compuestos de azolformilo según la invención. La tabla I a continuación indica las fórmulas químicas de 8 de los compuestos preferidos entre los compuestos de la fórmula (I) según la invención. Sus espectros de absorción medidos con un espectrómetro UV-visible (UVIKON- ONTRON) se reportan en la figura 1 . Se describe a continuación en detalle la síntesis de uno de ellos, el compuesto n°4 (MxPAFFR). Las etapas descritas abajo para este compuestos son idénticas para los otros, excepto para el compuesto n°5 (MxPAFFK) para el cual una etapa complementaria de desprotección de la Usina es necesaria (ver siguiente esquema reaccional y explicación). Tabla 1 : FORMULAS Compuesto 1 : 2.3DMPAFFR 2,3-dimetilfenilazoformilfenilalanilargi - 24 - - 25 - - 26 - A/ Síntesis de 4-metoxifenilazoformilfenilalanilarginina (Compuesto Introducción: Todas las etapas descritas a continuación son idénticas para cada colorante. Cada etapa se sigue pro cromatografía líquida de alto desempeño y por análisis de aminoácidos para los acoplamientos con fenilalanina y arginina. 1 er etapa: Reactivo de Griqnard Esquema reaccional Modo operativo: Preparar 1 eq. de 4-bromoanisola y 1 eq. de magnesio. Introducir el magnesio y 20% en masa de 4-bromoanisola en un tricol, volver a tomar en tetrahidrofurano anhidro (2 mL/mmol) y colocar el montaje bajo nitrógeno. Iniciar la reacción al calentar el tricol a un punto con un decapador térmico, el medio reaccional volviéndose marrón. Cuando empieza la reacción (efervescencia a la superficie de magnesio), colocar a reflujo a 90°C después agregar lentamente el resto de 4- bromoanisola tomado en THF anhidro (2 mL/mmol). Detener el reflujo después de 1 h. El bromuro de 4-metoxifenilmagnesio se utiliza como tal para la siguiente etapa (color marrón). Observar: La cristalería y el magnesio se secan previamente en la estufa a 120°C y los otros productos en el disecador. Tiempos de retención: El reactivo de Grignard siendo un compuesto muy inestable y sensible al agua, se obtiene en tres tiempos de retención - 27 -característicos de los productos de degradación formados cuando el análisis HPLC: Tiempo de retención 1 : 2.68 min Tiempo de retención 2: 3.32 min Tiempo de retención 3: 5.38 min 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato Esquema reaccional Reactivo de Grígnard di-t-butil azodicarboxilato N,N'-bis-(t-butoxicarboni -4-(metox¡ enllh¡draz¡na Modo operativo: Retomar en parte 1 eq. de di-t-butilazodicarboxilato y 1 eq. de 4-metoxifenilmagnesiobromuro (reactivo de Grignard) en THF anhidro (2 mL/mmol). Enfriar cada uno entre 0-5°C. Agregar el reactivo de Grignard en di-t-butilazodicarboxilato. Agitar 10 min, agregar 1 .02 eq. de ácido acético después dejar revenir a temperatura ambiente. Efectuar una extracción de agua/éter. Secar la fase eterificada, evaporar en seco. Se obtiene un aceite amarillo. Tiempo de retención: 7.85 min. 3ra etapa: Desprotección Esquema reaccional - 28 - Modo operativo: Retomar 1 eq. de N,N'-bis-(t-butoxicarbonil)-4 (metoxi)fenilhidrazina en el isopropanol (10.2 mL/mmol) después d< agregar HCI en el dioxano a 4.8 M (2 mL/mmol). Llevar a reflujo (80°C) Después de 15 min, enfriar, agregar éter (5 mL/mmol). 4- metoxifenilhidrazinahidrocloruro se precipita. Filtrar y secar. Retomar el polvo en el agua después de ocasionar un pH 7. Efectuar la extracción de agua/diclorometano y evaporar la fase de diclorometano en seco. Se obtiene 4-metoxifenilhidrazina (polvo amarillo) que se seca. Tiempo de retención: 2.20 min 4ta etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Esquema reaccional - 29 - Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 4-(metox¡)fenilhidrazina difenilcarbonato 4-(metoxi)fen¡lhidrazoformato Modo operativo: Retomar 1 .4 eq. de dífenilcarbonato en benceno (0.25 mL/mmol) y llevar a reflujo a 120°C. Agregar lentamente 1 eq. de 4- metoxifenilhidrazina retomada en benceno (0.7 mL/mmol). Detener el reflujo después de 6 h. Concentrar el medio reaccional después efectuar una cristalización hexano/benceno (4/1 ). Filtrar y secar los cristales blanquecinos en el disecador. Tiempo de retención: 6.74 min 5ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina Esquema reaccio al - 30 - Modo operativo: Llevar a reflujo (95°C) 1 .2 eq. de sal de trietilamonio de la fenilalanina retomada en dimetilformamida (3.33 mL/mmol). Agregar lentamente 1 eq. de 4-metoxifenilhidrazoformato retomado en dimetilformamida (2 mL/mmol). Detener el reflujo después de 1 h30, dejar revenir a temperatura ambiente, concentrar. Acidificar (pH=2). Purificar por cromatografía (cristales blanquecinos). Tiempo de retención: 6.12 min 6ta etapa: Oxidación: Paso de la forma "h id razo" a la forma "azo" Esquema reaccional Modo operativo: Retomar 1 eq. de N-(4-metodifenilhidrazoformil)-L- Fenilalanina en agua ultra pura (20.8 mL/mmol) que contiene 1 eq. de hidróxido de sodio y 1 eq. de acetato de amonio. Agregar 1 eq. de metaperiodato de sodio retomado en agua ultra pura (4.2 mL/mmol). Después de 20 min el medio reaccional se acidifica (pH=2) después se 31 purifica por cromatografía (cristales nara Tiempo de retención: 6.86 mín 7ma etapa: Acoplamiento con arginina Esquema reaccional Modo operativo: Retomar 1 eq. de Argininametiléster, hidrocloruro en dimetilformamida (3 mL/mmol). Agregar 1.1 eq. de DIAE (Diisopropiletilamina), 1 eq. de N-(4-metoxifenilazoformil)-L-Fenilalanina después de 1 .1 eq. de TBTU (0-(Benzotriazol-1 -il)-N,N,N\N'- tetrametiluronio tetrafluoroborato). Agregar la cantidad necesaria de DIAE para tener un pH a 7-8. Después de 5 min, evaporar en seco y purificar por cromatografía (cristales naranja). Tiempo de retención: 6.06 min - 32 - 8ava etapa: Saponificación Esquema reaccional N-(4-MetoxiFenilAzoFormil)-L-Fen¡IAIaninaArginlnaMetiléster N-(4-MetoxiFen¡¡AzoFormil)-L-FenllAlan¡naArg¡n¡na Anisil AzoFormilFenilalanina Arginina: AAFFR Modo operativo: retomar 1 eq. de N-(4-metodifenilazoformil)-L-FenilalaniaArgininametiléser en una mezcla de agua/metanol (Proporción: 1 /2; 3 mL/mmol). Agregar 3 eq. de hidróxido de sodio 1 N. Después de 1 h, acidificar MR, concentrar después de efectuar una extracción de agua/diclorometano. La fase de diclorometano se evapora después de secarse. Se obtiene N-(4-metoxifenilazoformil)-L-FenilalanilArginina que es un polvo naranja. Tiempo de retención: 5.5 min. Un análisis de aminoácido de producto final se efectúa después de hidrolizar el ácido para controlar la homogeneidad de la secuencia. Los - 33 -resultados de este análisis se reportan en el cromatograma de la figura 2. Condiciones analíticas: > Cadena HPLC AAA; Derivación precolumna en PITC (fenilisocianato) > Columna C18; 100A; 5µ; 250 x 4.6 mm Detección a 254 nm; Residuo = 1 mL/min > Eluyentes: A: Tampón de acetato pH 5.74 B: Tampón 70% CH3CN, 30% AcONa; 32 mM; pH = 6.10 C: CH3CN Los procedimientos de síntesis para los otros compuestos se basan en las mismas etapas que aquellas que se describen anteriormente. Se resumen en los esquemas reaccionales siguientes. Los tiempos de retención obtenidos en cada etapa de síntesis de estos compuestos se reportan en la tabla II a continuación: Tabla II: Tiempos de retención obtenidos sobre HPLC para cada etapa para los otros colorantes sintetizados Condiciones analíticas: - 34 - > Columna C18; 5µ; 100x4.6mm > Detección a 254 nm; Residuo = 1 mL/min > Gradiente: 0' ? 10%B 10' ? 90%B > Con A: Agua a 0.1 % de ácido trifluoroacético B: Acenotriló a 0.1 % de ácido trifluoroacético B/ Síntesis de 2, 3-dimetilfenilazoformilfen Halan ilarg ¡nina (Compuesto 1 ): 1er etapa: Reactivo de Grignard 2, 3-dimetilfenilbromuro Magnesio Reactivo de Grignard 2 etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato Reactivo de Grignard di-t-butil azodicarboxilato AJ, N'-bis-(t-butoxicarbonil)-2, 3-(dimet¡l)fenilh¡drazina 3ra etapa: Desprotección - 35 - nol N,N'-bis-(t-butoxic,arbonil)-2,3-(dirnetil)fenilhidrazina 2,3-(dimetU)fenHh¡drazina etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 2,3-(dimet¡0fentthidrazina difenilcarbonato 2,3-(dimetil)fenilhidrazoformato ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina - 36 - etapa: Oxidación: Paso de la forma "hidrazo" a la forma "azo" 1) Agua; NalHao 10% 2) CHsCOONao. 10% 3) etaperiodato de sodio N-(2,3^imet¡IFenilH¡drazoFormil)-L-FenilAlanina (cristales blanquecinos) N-(2,3-dimetilFenilazoFormil)-L-FenilAlanina ¦ (cristales naranja) ma etapa: Acoplamiento con arginina N-(2,3^i etilFenilAzoFormii L-FenilAlanüArgmmaMetiléster (color naranja) - 37 - 8ava etapa: Saponificación Cl Síntesis de 2,4-dimetilfemlazoformilfenilalanilarginina (Compuesto 2): 1 er etapa: Reactivo de Grignard 2, 3-dÍmetiffenübromuro Magnesio Reactivo de Grignard 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato - 38 - Reactivo de Grignard di-t-butil azodicarboxilato N,N'-bis-(t-butox¡carbonil)-2,4—(dimetil)fenilh¡drazina ra etapa: Desprotección nol N,N'-bis-(t-butoxicarbonil)-2,4-(dimetil)fen¡lh¡drazina 2,4-(dimetil)fenilhidrazina ta etapa: Acopiamiento con difenilcárbonato Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 2,4-(dimetil)feniIhidrazina difenilcárbonato 2, 4-(dimetil)fenilhidrazoformato - 39 - ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina etapa: Oxidación; Paso de la forma "hidrazo" a la forma "azo' ma etapa: Acoplamiento con arqinina - 40 - ava etapa: Saponificación N-(2,4^imetílFenilAzoFormil)-L-FenilAlanilArgininaMetiléster (color naranja) N-(2 -di etilFenilAzoFormil)-L-Feni¡AlaninaArginina - 41 - DI Síntesis de 2,5-dimetilfenilazoformilfenilalanilarqinina (Compuesto 3): 1er etapa: Reactivo de Grignard THF anhidro + g (giró) 0eC ;N2 2, 5-dirnetiffen¡lbromuro Magnesio Reactivo de Grignard 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato Reactivo de Grignard di-t-butil azodicarboxilato ?? N'-bis-(t-butoxicarbonil)-2, 5-(dimetiI)fenilhidraz¡na 3ra etapa: Desprotección nol /V, N-bis-(t-butoxicarbonii)-2, 5-(dimetil)†enilhidrazina 2,5-(dimetil)fenilhidrazina - 42 - etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 2,5-(dimet¡l)fenilhidrazina difenilcarbonato 2,5-(dimetil)fenilhidrazoformato ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina ta etapa: Oxidación: Paso de la forma "hidrazo" a la forma "azo' - 43 - 1) Agua; NalHac 10% 2) CHaCOONac. 10% 3) etaperiodato de sodio ?/-(2, 5-dimetilFenilazoForm¡l)-L-FenilAlanina ¦ (cristales naranja) ma etapa: Acoplamiento con arqinina N-(2,5^imetilFenilAzoFormll)-L-FenilAlanilArgininaMetiléster (color naranja) ava etapa: Saponificación - 44 - E/ Síntesis de 4-metoxifenilazoformilfenilalanillisina 1er etapa: Reactivo de Grignard 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato THF anhidro Reactivo de Grignard di-t-butil azodicarboxilato N,N'-bis-(t-butoxicarbonil)-4-(metoxi)fen¡lhidrazina - 45 - ra etapa: Desprotección etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 4~(metoxi)fenilhidrazina difenilcarbonato 4-( etoxi)fen¡ihídrazoformato ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina - 46 - etapa: Oxidación : Paso de la forma "hidrazo" a la forma "azo' ma etapa: Acoplamiento con lisina N-(4-MetoxlFenilAzoFormU)-L-FenilAlan¡na Argininametilesterhidrocloruro (color naranja) N-(4~Metox¡FenilAzoFormil)-L-FenilAlan¡IArgininaMetiléster (color naranja) - 47 - 8ava etapa: Saponificación N-(4-MetoxiFenilAzoFor il)-L-FenilAlaniIUs¡na(Boc)Met¡Jéster (color naranja) Anisil AzoFormilFenilalanina Arginina: AAFFR 9na etapa: Desprotección Este compuesto particular necesita una etapa complementaria para desproteger la cadena lateral de la Usina (e-Boc: ?-e-tertiobutoxicarbonil). - 48 - TFA/CHjQz N-(4-Metox¡FenilHidrazoFormil)-L-FenilAIanilLislna(Boc) N-(4-Metox¡FenilAzoFormil)-L-Fen¡IAIaninaLisina Modo operativo: Retomar 1 eq. de N-(4-MetoxiFenilAzoformil)-L-FeniIalaniI-L-Lisina(s-Boc) en diclorometano (3mL/mmoL) en un balón. Colocar bajo agitación. Conectar una ampolleta a bromo que contiene ácido trifluoroacético (3mL/mmoL). Agregar lentamente (gota a gota). Después de 15 min, concentrar el medio reaccional y purificarlo por cromatografía líquida de alto desempeño. Se obtiene al final un polvo naranja.

F/ Síntesis de 3-cloro-p-tolilazoformilfenilalanilarqinina (Compuesto (BU 1er etapa: Reactivo de Grignard Esquema reaccional - 49 - Reactivo de Grignard 3- oro-4-bromotolueno Magnesio 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato Esquema reaccional N,N'-bis-(t-butoxicarbon¡I)-3-(cloro-p-tolil)hidrazina 3ra etapa: Desprotección Esquema reaccional 4ta etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Esquema reaccional - 50 - Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 3-c!oro-p-tolilh¡drazina difenilcarbonato 3-c¡oro-p-tolilhidrazoformato 5 etapa: Acoplamiento con fenilalanina Esquema reaccional 6 etapa: Oxidación: Paso de ia forma "hidrazo" a la forma "azo* Esquema reaccional - 51 - 1) Agua; NalHac. 10% 2) CH3COONac. 10% 3) Metaperiodato de sodio N-(3-cioro-P-tofílHidrazoFormií)-L-FenífAlanma N-(3-cloro-P-tolilAzoFormi¡)-L-Fen¡IAIanina 7ma etapa: Acoplamiento con arqinina Esquema reaccional 8ava etapa: Saponificación Esquema reaccional - 52 - Gl Síntesis de 3-cloro-p-tolilazoformilfenilalanilarginina (Compuesto 1 er etapa: Reactivo de Griqnard Esquema reaccional 2da etapa: Acoplamiento con dí-t-butilazodicarboxilato Esquema reacciona! - 53 - Esquema reaccional nol N,N'-bís-(t-butox¡carbon¡l)^-(trWuorometoxi)fenilhidraz¡na 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazina 4ta etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Esquema reaccional - 54 - Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 4-(trifluorometoxi)†enilhidrazina difenilcarbonato 4-(trifluorometeoxi)fenilhidrazoformato 5ta etapa: Acoplamiento con fenilalanina Esquema reaccional 6 etapa: Oxidación: Paso de a forma "hidrazo" a la forma "azo' Esquema reaccional - 55 - 7ma etapa: Acoplamiento con arqinina Esquema reaccional N-(4-(trifíuorometox¡)fenilAzoFormil)-L-FenilAlanina Argininametilesterhidrocloruro N-(4-(trMuorometoxi)fen¡IAzoFormil)-L-FenilAlanilArgininaM - 56 - 8ava etapa: Saponificación Esquema reaccional 1) Saponificación aCMAgua (2/3; 1/3) 2) Neutralización HCl 1N N-(4-(trffluorometoxi)fenilAzoFormil)-L-FenilAlanilArg ^ (color naranja) N-(4-(Muoro etox¡)fenilAzoFormil)-L-FeniIAIan¡IArginina (color naranja) H/ Síntesis de 4-metoxifeniiazoformilfenilalanilarginina (Compuesto 8): 1 er etapa: Reactivo de Grignard 2da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato - 57 - Reactivo de Grígnard di-t-butil azodicarboxilato N,N'-bis-(t-butoxicarbonil)-4-(metilt¡o)fenilhidrazina ra etapa: Desprotección nol N -bis^t-butoxicarbonil)-4-(metiltb)fenilhidrazina 4-(metiltio)fenilhidrazina ta etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 4-(metiltio)fenilhidrazina difenilcarbonato 4-(metiltio)fenilhidrazoformato ta etapa: Acopiamiento con feniialanina - 58 - 6ta etapa: Oxidación: Paso de la forma "hídrazo" a la forma "azo 7ma etapa: Acoplamiento con arginina N-(4-mefílt¡oFen¡lazoFormil)-L-FenilAlanina Argininametilesterhidrocloruro - 59 - 8a a etapa: Saponificación 1) Saponificación M MaaOOHH//AAaguuaa ( (22//33; 1/3) 2) Neutralización HCI 1N N-(4-metiItíoFenilAzoFormll)-L-FenilAlanilArgininaMetiléster (color naranja) N-(4-metiltioFenilAzoFormil)-L-FenilAlaninaArginina Color naranja I/ Síntesis de 4- etiltiofenilazoformilfeniltirosilarginina (Compuesto 1 er etapa: Reactivo de Grignard - 60 - THF anhidro + Mg (giro) 0°C ;f½ 4-metiItiofenilbromuro Magnesio Reactivo de Grignard da etapa: Acoplamiento con di-t-butilazodicarboxilato ra etapa: Desprotección nol N, 4-(metiltio)fenilhídraz¡na ta etapa: Acoplamiento con difenilcarbonato - 61 - o H3CS — y-NH-NHz ^ D-&-0 ^ ^ Reflujo de benceno a 120°C Cristalización de hexano/benceno 4-(metiltio)fenilhídrazina difenilcarbonato 4-(metilt¡o)fenilhidrazoformato ta etapa: Acoplamiento con tirosina ta etapa: Oxidación: Paso de la forma "h id razo" a la forma "azo' - 62 - 1) Agua; NalHao. 10% 2) CHsCOONac. 10% 3) Metaperiodato de sodio N-(4-metiltioFenilHidrazoFormi¡)-L-Tirosina N-(4- etílt¡oFenilazoForinil)-L-Tirosina ma etapa: Acoplamiento con arginina H-(4-metMoFen¡lazoForm\f)-L-Ttrosma Arginínametilesterhidrocloruro N-(4-metiltioFenilAzoFormil)-L-nosilArg¡ninaMetiféster ava etapa: Saponificación - 63 - N-(4-metiltioFenilAzoFormil)-L- os¡IArgin¡naMetiléster (color naranja) N-(4-metíítioFenilAzoFormil)-L- rosilArgin¡na Color naranja Ejemplo N°2: 1. Principio de dosificación y principios reactivos empleados - 64 - Principio de dosificación de actividad enzimática TAFIs extracción de coloración 25 - 65 - 2. Ejemplo del procedimiento de dosificación de la actividad de TAFI según el método de la invención a) 1 er modo operativo: método trombina-trombomodulina La muestra de plasma probada se divide en dos alícuotas, una adicionada de PIC (Calbiochem - Ref. 21 7359), y la otra de tampón hepes- Las dos alícuotas se tratan enseguida de manera idéntica según el principio siguiente: Activación de TAFI 150 µ? de plasma diluido en 1 /20 de tampón hepes (o TAFI purificado a 1 3 µg/ml en tampón hepes) 0 µ? PIC o H20 5 minutos a temperatura ambiente 1 50 µ? de tampón activador de la coagulación 1 0 minutos a temperatura ambiente 00 µ? PPACK + 1 00 µ? xPAFFR (substrato) (5 mM) Prueba de Actividad de TAFI 30 minutos a temperatura ambiente 1 00 µ? HCI 1 + 1 00 µ? NaOH 1 M Revelación Dilución a 1 /3 en tampón hepes Lectura de DO a 382 nm 25 µ? Carboxipeptidasa A Lectura de DO a 382 nm en 1 minuto Variantes posibles del primer modo operativo: - se puede efectuar la dosificación a una temperatura de - 66 - 37°C - el substrato puede incorporarse en el inicio, al mismo tiempo que el tampón activador - la lectura puede hacerse por HPLC Concentraciones finales preferidas de diferentes productos: - PPACK: H-D-Phe-Pro-Arg-clorometilacetona PM = 451 30 µ? (Bachem - No. Ref 1065) - Pefabloc: puede utilizarse en lugar de PPACK: 0.1 mM (Pentaharm - Ref 399.01 ) - Substrato (MxPAFFR): 1 mM - Carboxipeptidasa A : origen del páncreas bovino (Sigma - Ref. C 0386). Frasco de 5.1 mi a 5000 unidades, 21 mg prot/ml, 47 unidades/mg proteína CPA sé filtra con prefiltro, filtra 5 µ?? y filtra 0.45 µ?, por lo que se agregan mi de H20 - PIC: utilizado a 7 µ? 1 mg de PCI puede inhibir aproximadamente 8 mg de TAFI (50 U/mg) a 50% según las indicaciones del proveedor (Calbiochem). La concentración de 30 µ? de PPACK corresponderá a una concentración inicial de 150 µ?. La concentración final de 1 mM de substrato corresponderá a una concentración inicial de 5 mM. La concentración final de 7 µ? de CPI corresponderá a una concentración inicial de 0.38 mM. Los inventores han observado que las concentraciones - 67 -indicadas anteriormente pueden modificarse para utilizar una concentración final en PPACK disminuida hasta 4 µ? y una concentración final en substrato disminuida. Tampón activador: · La vía de activación preferida de la coagulación en el cuadro de la presente invención es la vía de activación por el complejo trombina/trombomodulina. En este caso, el tampón activador utilizado comprende los siguientes constituyentes. 37 µ? trombomodulina de 0 a 80 mM y preferentemente a 10 nM (trombomodulina de pulmón de ratón - American Diagnostica - Ref. 237). 6 µ? trombina de 0.2 a 10 NIH/ml y preferentemente a 0.8 NIH/ml (Diagnostica Síago - Producto de búsqueda). 750 µ! cloruro de calcio de 0 a 80 nm y preferentemente a 40 nM 705 µ? de tampón hepes 9.4 mM pH = 7.6 Las concentraciones se proporcionan para un volumen final de 1498 µ? de tampón activador. N .B: tampón hepes contiene: Hepes 20 mM, KCI 4 mM y BSA 1 % de otros análisis se han realizado con Hepes 20 mM y NaCI 1 50 mM.

• Como lo indicado en la descripción, otras vías de activación son posibles notablemente la vía de activación por el factor Xla. En este caso un ejemplo de tampón activador contiene los siguientes constituyentes: 5 µ? trombomodulina a 30 U/ml 30 µ? Factor Xla puro (Calbiochem - Ref. 233483). 88 µ? tampón hepes pH = 7.4 (Hepes 20 mM y NaCI 150 mM). - 68 - Las concentraciones se proporcionan a manera de ejemplo y edén reajustarse por el experto en la materia. 2do modo operativo: método de generación de trombina Otra vía de activación de la coagulación hace intervenir la trombina y requiere el empleo de un activador de la fase contacto.

Ejemplo n°3: Establecimiento de una qama de contraste en método de trombina/trombomodulina - 69 - La figura 3 a continuación representa una curva de contraste establecida a partir de un plasma deficiente en TAFl sobrecargado con TAFl purificado para obtener una gama de concentración en TAFl que tiene de 0 a 26 g/ml. El compuesto de la fórmula 1 utilizado es MxPAAFR a una concentración de 5 mM. ? DO medidos según el método de la invención se reportan en la siguiente tabia III: Tabla III: Como aparecerá en la figura 3, la curva de contraste es lineal para las gamas de concentraciones estudiadas. Cubre grandemente la zona de normalidad, TAFl estando presente en el organismo a las concentraciones que tienen de 5 a 15 µg/ml. El método de la invención permite entonces disminuir tanto los beneficios de TAFl como las tasas normalmente elevadas. Ejemplo N°4: Resultados obtenidos sobre diferentes tipos de plasmas El método de la invención se ha aplicado sobre diferentes tipos de plasmas según el procedimiento descrito en el ejemplo n°2. Plasma fríos, plasmas congeladosi Se puede efectuar la dosificación en plasmas fríos o plasmas congelados pero se observa una disminución de DO entre los dos. Lo que resulta en una ligera degradación de TAFl cuando la descongelación (la - 70 - proteína se degrada). Plasmas fríos Plasmas congelados 9.4 µg/ml 6.0 µ?/ml 1 1 .2 µg¡m 6.5 µ9/??? Plasma congelado, plasma liofilizado: En plasma liofilizado, la dosificación de TAFI es posible y similar a un plasma congelado. Plasma congelado Plasma liofilizado ? DO: 0.302 0.354 Plasma de origen diverso congelado: Trombolítico 2.9 µ lm CIVD 2.8 µQlm\ Cirhhosa 1 .4 µg/m) Maternidad 7.1 µQlm\ Hiperfibrinogenemia 4.6 µ?/??! HNF 6.1 µg/ml (heparinas no fraccionadas) AVK 5.8 - 8.2 - 6.5 - 7.21 µg/ml (anti-vitamina K). Ejemplo N°5: Dosificación realizada con diferentes substratos de la invención El método de la invención se ha aplicado en una solución que contiene TAFI purificado, con diferentes compuestos descritos en el Ejemplo n° 1 . La prueba se realiza en una solución a 6.5 µg/ml de TAFI purificado en un tampón hepes. Los resultados se reportan en la tabla IV a continuación Tabla IV: Ejemplo N°6 Especificidad de TAFIa para los compuestos de la fórmula (!) de la invención: El ejemplo siguiente va a demostrar la necesidad de utilizar el método y los compuestos de la fórmula (I) de la invención para dosificar específicamente la actividad de CPN o U, en particular TAFI, con respecto a otras carboxipeptidasas básicas. 1 . La dosificación se realiza, en este caso, con un substrato de la familia de compuestos descritos por Mock en (14). Este substrato se constituye de un solo aminoácido portador de radical de cromofor de anizilazoformilo (porción CH3OC6H4-N = N-CO-). El aminoácido elegido es arginina, un aminoácido básico normalmente hidrolizado por carboxipeptidasas B (1 ). Este substrato se denomina más adelante AAFR (AnizilAzoFormilArginina) o MxAFR (4-MetoxifenilAzoformilarginina). Este substrato (0.25 mM) se pone en presencia ya sea de una muestra de TAFI plásmico, ya sea de una solución de carboxipeptidasa B pancreática porcina (Sigma - Ref. C9584) a 5.2 mol/l. La disminución de coloración de cada una de las muestras se sigue por un espectrofotómetro. Cada una de las muestras se trata según - 72 -el siguiente procedimiento: a) muestra de partida: • TAFI plasmático (presente en un pool normal de plasmas - diluido en 1 /20) o • Carboxipeptidasa B pancreática porcina 5.2 mol/l (en tampón hepes). b) activación con complejo trombina/trombomodulina-CaCI2 (ver ejemplo 2) para la muestra de TAFI plasmático. c) adición de AAFR a 5 mM d) lectura de DO a 382 nm Resultados: Conclusión: TAFI activa no hidroliza AAFR contrariamente a CPB pancreático. 2. El método de la invención se aplica enseguida en una solución de TAFI purificado, ya sea con un substrato de la fórmula (I) (MxPAFFK), ya sea con MxAFR para verificar que TAFIa hidroliza sin embargo un compuesto de la fórmula (I). La activación de la coagulación se libera por el complejo de trombina-trombomodulina-CaCI2 (ver procedimiento del ejemplo 2). La disminución de coloración de cada una de las dos muestras se sigue por un espectrofotómetro. a) muestras de partida: solución de TAFI purificado a 18 µ§?p\? (diluido en tampón hepes). - 73 - b) activación de la coagulación. c) adición de MxAFR 27 mM o MxPAFFK (test concentración de MxAAFK. d) adición de CPA en la muestra que contiene MxPAFFK. e) lectura DO a 382 nm Resultados: Conclusión : TAFI activo no hidroliza MxAFR cuando está activo en MxPAFFK,} Ejemplo n° 7 METODOLOGÍA DE GENERACIÓN DE TROMBINA Una gama se realiza como se describe en el ejemplo 2 el modo operativo b) por dilución de un plasma pool (figura 4).

Esta metodología permite discriminar los plasmas en función de su capacidad para generar trombina. Es un mejor reflejo del estado de hipercoagulabilidad del paciente. - 74 - BIBLIOGRAFÍA BOU A, B.N. et al: "Thrombin-Activable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI, Plasma Procarboxypeptidase B, Procarboxypeptidase R, Procarboxypeptidase U)". Thromb. Research, 101 :329-354, 2001 . BAJZAR L: "Purification and Characterization of TAFI, a Throrrtbin-activable Fibrinolysis Inhibitor". J. of Biol. Chem., 270, 24: 14477-14484, 1995. JUHAN-VAGUE I., ALESSI M.-C: "TAFI : lien moiéculaire entre les processus de coagulation et de fibrinolyse". Sang Thrombose Veineuse, 5, 10:314-6, 1998. SCHATTE AN K. et al. : "Carboxypeptidase U at the interfase between coagulation and fibrinolysis". Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 7(2):93-101 , 2001 . WOLF M. et al.: "The kinetics of carboxypeptidase B activity". J. of Biol. Chem. , 237, n°10, Octobre 1962. SUZUKI, S. et al. : "Spectrophotometric determination of glycine with 2,4,6-Trichloro-s-Triazine". Analytical Chemistry, Vol. 42, N° 1 , January 1970. LORENTZ K. et al. : "Determination of carboxypeptidase B in duodenal contents". Clínica Chimica Acta, 37:515-517, 1972. PLUMMER Th. H et al.; "An improved spectrophotometric assay for human plasma carboxypeptidase N". Analytical Biochemistry, 108:348-353, 1980. FISCHER G. H. et al.: "Synthetic inhibitors of carboxypeptidase Ñ". Adv. Experimental Med. Biol., 198, Part A, 405-410, 1986. - 75 - 10. SARUTA H. et al.: "Colorimetric determinaron of carboxypeptidase A activity in serum". Clin. Chem. 32:5, 748-751 , 1986. 1 1 . NAM-JOO HONG et al. : "Development of substrate for carboxypeptidase B by employing Thiaarginina peptides". Bull Korean Chem. Soc, Vol. 19, N°2, 189-93, 1998. 12. MOCK W. L. et al. : "Arazoformyl Dipeptide Substrates for Thermolysin. Confirmation of a Reverse Protonation Catalytic Mechanism". Biochemistry, 35: 7369-7377, 1996. 13. MOCK W. L. et al.: "Arazoformyl Peptide Surrogates as Spectrophotometric Kinetic Assay Substrates for Carboxypeptidase A". Analytical Biochemistry, 239:21 8-222, 1996. 14. MOCK W. L. et al.: "Catalytic activity of carboxypeptidase B and of carboxypeptidase Y with anisylazoformyl substrates". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9: 187-192, 1999. 15. HATTON M.W.: "Studies on trie coagulant enzyme from Agkistrodon rhodostoma venom. Isolation and some properties of the enzyme". Biochem. J. , 131 (4):799-807, 1973. 16. STOCKER K. et al. :- "The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (batroxobin)". Methodos Enzymol. 45:214-223, 1 976. 17. DENSON K.W. E.: "Clot-inducing substances prevent in such venoms with particular reference to Echis carinatus venom". Thromb. Res., 8:351 -360, 1976. 18. ROSING J. et al. : "Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators". Toxicon, 30(12): 1515-1527, 1992.

Claims (1)

1. 76 - REIVINDICACIONES 1 . Compuesto de la siguiente fórmula (I): en la cual: - R1 , R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3 - R3 = un radical de aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A. - R4 = un radical de aminoácido básico. 2. Compuesto según la reivindicación 1 de la siguiente fórmula (I): en la cual: - R1 , R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3 - R3 = un radical de aminoácido hidrofóbico. - R4 = un radical de arginina o Usina. 3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque R1 =H y R2=-S-CH3. 4. Compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque R3 se elige entre los radicales de los siguientes aminoácidos: - la tirosina, - la fenilalanina, - la alanina, - la valina, - la leucina, - la isoleucina, - la fenilglicina, 5. Compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, caracterizado porque R3 representa la fenilalanina. 6. Compuesto según la reivindicación 1 o ia reivindicación 3, caracterizado porque R3 representa la fenilalanina o la tirosina y R4 la arginina o la lisina. - 78 - 7. Compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 3 , caracterizado porque R3 representa la tirosina. 8. Compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque Ri se -elige , entre : - y -CH , -y R2 se elige entre Chb, O-CI-b y -S-CH3. 9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque A es 1 0. Compuesto según la reivindicación 1 de la fórmu la (I) , en la cual dicho compuesto eligiéndose en el seno del grupo constituido por los siguientes compuestos en los cuales: - 79 - F Ri=-H R2= — O-C-F R^_CHs_ ^ {^ (CHzJa- H-c F / NH2 * las cifras entre paréntesis determinan la posición de los grupos metilo en el radical fenilo. 1 1 . Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque se trata de 4-MTPAFYR (4-metiltiofenilazoformiltirosina arginina). 1 2. Método de dosificación de la actividad de una carboxipeptidasa N o una carboxipeptidasa U en una muestra biológica en la cual: - se pone en contacto dicha muestra con un compuesto de la fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , y una carboxipeptidasa A, en las condiciones que permiten hidrolizar la muestra y, - se mide la disminución de coloración de la muestra que contiene el substrato de fórmula (I) y carboxipeptidasa A, que resulta de doble hidrólisis de substrato de la fórmula (I) - 80 - por CPN o CPU de la muestra y por CPA. 13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque R1 = H y R2 = -S-CH3. 14. Método según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque R4 es un radical arginina o lisina. 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en la cual R3 se elige entre los siguientes radicales de aminoácidos: - la tirosina, - la fenilaianina, - la alanina, - la valina, - la leucina, - la isoieucina, - la fenilglicina, 16. Método según una de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque R3 es tirosina. 17. Método según la reivindicación 12 a 1 5, caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en la cual R3 representa la fenilaianina. 18. Método según las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en la cual R3 representa fenilaianina y R4 arginina o ¡isina. 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 18, caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en - 81 -la cual se elige entre -H y -CH3) y R2 se elige entre CH3, 0-CH3 y -S-CH3. 20. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en la cual: en la cual - R1 , R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2 , -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3 - R3 = un radical de aminoácido hidrolizable por una carboxipeptidasa A. - R4 = un radical de aminoácido básico. 21 . Método según la reivindicación 21 , caracterizado porque el substrato es un compuesto de la fórmula (I) en la cual: dicho compuesto eligiéndose en el seno del grupo constituido por los siguientes compuestos, en los cuales: - 82 - * las cifras entre paréntesis determinan la posición de los grupos metilo en el radical fenilo. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13, 15, 20 ó 21 , en el cual el compuesto de la fórmula (I) es 4-MTPAFYR (4-metiltiofenilazoformiltirosinarginina). 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, caracterizado porque la densidad óptica de la mezcla se mide sin adición de CPA, después de la adición de CPA. 24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23, caracterizado porque la disminución de coloración medida se compara con los valores llevados en una curva de contraste. 25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a - 83 - 22, caracterizado porque la muestra es una muestra sanguínea. 26. Método según la reivindicación 25, caracterizado porque la muestra es de plasma. 27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 26, caracterizado porque CPA es CPA pancreática. 28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 27, caracterizado porque la muestra a probarse se pone en presencia de un tampón activador el tiempo necesario para obtener la activación de carboxipeptidasa U de la cual se mide la actividad, después en presencia de un inhibidor de serina proteasas. 29. Método según la reivindicación 28, caracterizado porque el substrato de la fórmula (I) se agrega al mismo tiempo que el tampón activador, o simultáneamente o inmediatamente después del inhibidor de serina proteasas. 30. Método según la reivindicación 28, caracterizado porque la activación se realiza por la vía de complejo trombina/trombomodulina. 31 . Método para dosificar la actividad de CPN o CPU constitucional de una muestra y aquella de CPN o CPU activable de la misma muestra, caracterizado porque se compara la actividad de hidrólisis de la muestra en un substrato de la fórmula (I) después de poner en presencia la muestra con un tampón activador, si llega el caso el tiempo necesario para obtener la activación de carboxipeptidasa U de la cual se va a medir la actividad, después en presencia de un inhibidor de serina proteasas, la actividad de hidrólisis observada comparándose con la actividad de hidrólisis de muestra en un substrato de la fórmula (I) en la - 84 -ausencia de tampón activador según la reivindicación 21 . 32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, caracterizado porque la carboxipeptidasá es CPU. 33. Método según la reivindicación 32, caracterizado porque CPU es TAFI. 34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizado porque la muestra se trata en presencia y en ausencia de un inhibidor específico de TAFI. 35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, caracterizado porque el inhibidor específico de TAFI es CPI. 36. Método de dosificación de TAFI activo en una muestra sanguínea, que comprende las siguientes etapas: a) poner en presencia de una alícuota n° 1 de la muestra con un inhibidor específico de TAFI, y tratamiento de esté según el método de la reivindicación 28, b) tratamiento de una alícuota n°2 de la muestra según el método de la reivindicación 28, en la ausencia de inhibidor específico de TAFI, c) medición de ? DO ente alícuota n° 1 y alícuota n° 2, representativo de la actividad de TAFI activo en la muestra. 37. Método según la reivindicación 36, para diferenciar la actividad de TAFI constitucional y aquella de TAFI activable de la misma muestra, caracterizado porque se mide la actividad de hidrolizar una tercer alícuota de la muestra en un substrato de la fórmula (I) en la ausencia de - 85 -tampón activador. 38. Utilización de un compuesto de la fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 para dosificar la actividad enzimática de una carboxipeptidasas N o U en una muestra. 39. Utilización según la reivindicación 38, caracterizada porque la carboxipeptidasa es TAFI. 40. Equipo para dosificar la actividad de CPN o CPU en una muestra que comprende un substrato cromogénico constituido por un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 . 41. Equipo para dosificar la actividad de TAFI en una muestra biológica que comprende - un tampón activador de TAFI, - de la carboxipeptidasa A, - un substrato de la fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , - un inhibidor de TAFI.