TWI252234B

TWI252234B - Novel chromogenic substrates and their use in assaying carboxypeptidase activity

Info

Publication number: TWI252234B
Application number: TW091114987A
Authority: TW
Inventors: Gerard Quentin
Original assignee: Stago Diagnostica
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2006-04-01
Also published as: EP1406920A1; ATE345351T1; FR2826962B1; MXPA03012040A; HUP0400920A2; CN1283657C; CN1524087A; ES2276951T3; DE60216098D1; DE60216098T2; AR034748A1; EP1406920B1; PL367367A1; HK1065321A1; FR2826962A1; KR20040011596A; RU2003137585A; WO2003004516A1; JP2004533489A; CA2450194A1

Description

1252234 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關色原化合物及其用於檢定分析得自羧基胜肽酶N及羧基胜肽酶U組群之酶之用途。特別本發明係關於該化合物用於檢定分析血樣之TAFI(凝血酶可活化纖維蛋白分解抑制劑）之活性及對應檢定分析方法。羧基胜肽酶（CP)構成胜肽外切酶族群的一組酶。此種酶切割多胜肽鏈之最末COOH-端末胺基酸的醯胺键。CP包括絲胺酸叛基胜肽酶、半胱胺酸叛基胜肽酶及金屬瘦基胜肽 S每。已經由細菌、酵母及植物分離多種瘦基胜肽酶且定序。此種酶也大量存在於哺乳類組織。特別已經由胰臟以及由肥大細胞分離羧基胜肽酶。其它於血漿循環的叛基胜肽酶也已經被轉殖、分離及定序。所有此等酶於活體内扮演的角色係依據其所在位置以及物理性質決定。羧基胜肽酶係根據其酶基質之特異性酚類。羧基胜肽酶A組成一大類酶：若最末胺基酸為疏水性 (Phe、Leu、Val、Ala)則CPA偏好水解最末胺基酸之C-端胜肽鍵。其水解二鹼基胺基酸（Asp、Glu)及甘胺酸（Gly)較為緩慢；且不會水解任何鹼性胺基酸如精胺酸（Arg)、離胺酸（Lys)、組胺酸（His)或鳥胺酸（Orn)、離胺酸之低碳同系物，也不會水解二次胺基酸如脯胺酸（Pro)或羥脯胺酸 (Hyp)。羧基胜肽酶B特別水解最末C-端鹼性胺基酸如Arg、 Lys。該類酶再細分為由叛基胜肽酶Η(也稱做腦啡轉化酶或羧基胜肽酶Ε)也包括羧基胜肽酶Μ、Ν及U組成的亞類。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)

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線 1252234 A7 B7 五、發明説明（2 ) 羧基胜肽酶E局限於胰小島、腎上腺及腦垂腺的分泌顆粒以及局限於腦部。羧基胜肽酶Μ為存在於培養中的多種組織及細胞之膜酶。羧基胜肽酶Ν(後文偶爾稱作為CPN)是一種於血漿中循環的酶。CPN可保護有機體對抗釋放於血循環的含鹼性C-端胺基酸（較好為離胺酸）胜肽之血管活性效應及發炎效應。此種酶以活性形式存在於血液。CPN由於其天然酶基質緩激肽、激肽類及過敏性休克毒素類，也定名為激肽 g每。最後，羧基胜肽酶u(不穩定）（後文偶爾稱作為CPU)為也可水解C-端鹼性胺基酸之酶，偏妤作用於精胺酸，但與羧基胜肽酶N相反，CPU於活性形式時高度不穩定。晚近羧基胜肽酶族之概略综論係由BOUMA等人進行 (1)。 TAFI是一種鹼性鋅金屬羧基胜肽酶（1-4)。精確言之， TAFI於3 7°C活性不穩定故屬於羧基胜肽酶U。此種酶、其 cDNA以及對應胺基酸序列已經就人體做敘述例如述於美國專利US-A-5 206 161，TAFI是一種血漿蛋白，TAFI用於調節纖維蛋白分解的角色最初係來自於試管試驗觀察到於活化TAFI存在下血凝塊的分解受抑制。 TAFI可於分解期間割斷暴露於纖維蛋白COOH-端位置的精胺酸及離胺酸殘基。此種水解結果導致纖維蛋白血凝塊表面之胞質素原及tP A固定位置的減少，因而導致藉tP A將胞質素原轉變成為胞質素的減少。 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（3 ) TAFI成功地被識別為前羧基胜肽酶B (pro-PCPB)，呈不穩定前竣基胜肽酶（proCPU :不穩定前複基胜肽酶）及前叛基胜肽酶R (CPR)，原因在於TAFI於精胺酸殘基具有羧基胜肽酶活性。酶原形式是一種於肝臟合成且於血漿循環之單鏈60千道耳呑（kDa)糖蛋白鏈。酶原主要係藉凝血酶於arg 92位置割斷。該蛋白質分解釋放出含有數個糖化位置之92胺基酸N-端肽。凝血酶對 TAFI的催化作用係藉凝血酶調理素於二價離子存在下顯著放大。藉凝血酶催化TAFI活化率由於與凝血酶調理素形成三元複體因而提升超過1〇〇〇倍。活化TAFI (TAFIa)係由酶原催化C-端區組成，包含309胺基酸。由於其於調節纖維蛋白分解機轉上扮演關鍵角色，故測量於不同病變情況下存在於血漿之組成活化TAFI數量以及可活化TAFI數量可快速做自我證明，極為有用。先前技藝已經說明多種使用特定酶基質來檢定分析多種瘦基胜肽酶活性之方法。 WOLFF等人（5)經由測量紫夕卜光吸收差異而比較合成酶基質Hip-Arg、Hip-Lys、Hip-Orn對藉層析術純化之胰臟竣基胜肽酶B之性能表現。 1970年S. SUZUKI等人（6)藉由衍生反應劑TT (2,4,6-三氯-5-三畊）釋放苯〒醯基甘胺酸而改進水解產物的偵測。此種衍生特別係於甘胺酸a CH2S單獨游離酸功能操作。該衍生物轉為亮黃色（最大波長382奈米）。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（4 ) 該種以馬尿醯基殘基而出現黃色變色之方法隨後由許多研究學者廣為使用。 1972年，K. LORENTZ等人（7)使用精胺酸之著色反應，本次使用對苯醌作為反應劑藉羧基胜肽酶B作用於Hip-Arg 酶基質釋放著色精胺酸。藉該方式，有色衍生物之最大波長為480奈米。 1980年Th. H. Plummer等人（8)使用合成酶基質：呋喃基丙烯醯基-Ala-Lys來定量羧基胜肽酶N，於324奈米（近紫外光，非可見光）測量。 1985年G.H. Fischer等人（9)使用經由N-端丹磺醯化預備檢定分析的羧基胜肽酶特定胜肽獲得之螢光酶基質。該檢定分析需要於測量前提取水解產物用於良好分離物質之步驟。 1986年，H. SARUTA等人使用一種比色方法來測定羧基胜肽酶A活性（10)。使用特殊酶：「馬尿酸酶」來水解經由使用CPA水解經-馬尿酿基-Phg酶基質獲得的馬尿酸基衍生物。最後反應由4-胺基安替比林（antipyrine)產生於505奈米有吸收的醌醯亞胺染料證實。 1998年NAM JOO HONG等人使用帶有精胺酸類似物亦即硫代精胺酸之合成酶基質來檢定分析CPB (11)。但前述比色法未曾用於特別檢定分析CPN或CPU特別 TAFI之酶活性，有些缺點為其與藉比色法簡單而有效的檢定分析該類型酶不相容。視情況而定： -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252234 A7 ____B7 __ 五、發明説明（5 ) -結果獲得有色產物之衍生反應於水解過程並非該釋放物種的特異性反應； -或衍生試劑有高毒性，而無法以產業規模使用； -或彩色顯示反應太長太困難而不容易自動化。 1996年W.L. Mock等人說明一種使用合成酶基質檢定分析細菌性來源之胞外新蛋白内切酶之方法，該合成酶基質於酶水解作用下脫色（12)。為達成此項目的，作者合成一種白胺酸殘基其攜帶有N-(4-甲氧苯基偶氮甲醯基）接枝於胺官能及其它中性胺基酸（Leu、Ala、Phe或Gly)。結合芳偶氮甲醯基可產生強烈著色化合物。於熱離胺酸存在下著色劑分子於化學水解反應期間重排，化學水解反應機轉完整述於（12-13)，獲得無色產物（茴香唑（anizole)片段、氮氣、二氧化碳及胺基酸）。如此容易使用介質之脫色速率來追蹤酶反應速率。该作者也基於羧基胜肽酶A (13)及豬騰羧基胜肽酶b (14) ’說明分光光度計量檢定分析之動力學方法。於該種情況下，使用之化合物係由已知可藉攜帶N-芳偶氮甲醯基之羧基胜肽酶A (Phe、Leu)或羧基胜肽酶b (Lys) 割斷的單一胺基酸組成。該等化合物藉酶割裂成為無色產物係藉測量介質著色的減低而予監控。始於前文揭示，本發明作者合成使用比色法檢定分析瘦基胜肽酶N、羧基胜肽酶U及更特別TAFI活性之新穎有色化合物。於第一方面，本發明係有關組成羧基胜肽酶N或lJ之酶 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（6 ) 基質，更特別活化TAFI酶基質之新穎化合物。此等化合物為色原酶基質。本發明化合物之特徵在於其為具有如下通式（I)之芳偶氮甲醯基化合物：

〇 «4

-Ri、R2=H、-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-C卜-CF3、-OCF3、 -SCH3 ; -R3 =可由竣基胜肽酶A水解之胺基酸基團； -R4 =驗性胺基酸基團。特別尺3係選自疏水胺基酸基團例如： -酪胺酸

-丙胺酸R3=-CH3 -纈胺酸R尸-CH-(CH3)2 -白胺酸 r3 二-ch2-ch-(ch3)2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（7 -CH-CH2~CH3 c!h3

-異白胺酸r3= -苯基甘胺酸特《別本發明係選自胺基酸基團例如：

NH -精胺酸 R4=~ (CH2)r- NH- Cf 、NH2 -離胺酸（r4=-(ch2)4-nh2) -烏胺酸 r4=-(ch2)3-nh2 較好R3表示芳香族胺基酸殘基，特別苯基丙胺酸或酪胺酸以及R4表示精胺酸或離胺酸。

Ri較好係選自： -H及-CH3，以及尺2較好係選自； -CH3、-0-CH3及-S-CH3。本發明之較佳一族群化合物可以如下通式表示·

-R!、r2=-h、-ch3、（ch3)2ch-、ch3-0·、Γ1 、-CFi -Rf可藉羧基胜肽酶a水解之胺基酸基團； -11- 本紙張尺度適财Η國家標準(CNS) A4規格(摩297公董） 1252234 A7 B7 五、發明説明（8 ) -尺4=驗性胺基基團。 R3較好表示苯基丙胺酸或酪胺酸；以及 R4較好表示精胺酸或離胺酸。

Ri較好係選自： -H及- CH3，以及 R2較好係選自： -CH3、-0-CH3及-S-CH3。一種特佳本發明化合物為式（I)化合物其中：

該化合物係選自下列化合物組成的組群其中： —CH3 R2:—CH3 1 (2Γ ^ ^ (3Γ R3=— CH2"^—》 NH R4=- (C^^NH-Cf snh2 Ri=—CH3 R〗：—CH3 1 ^ (2Γ ^ (4Γ R3==- _cHrO NH — (CH2)3NH— 、nh2 Ri=—CH3 R225—CH3 Ί 4 (2)· ^ J (5)· R产 -cHz-〇 NH (CH2)3~~NH一(u 、nh2 R^-H r2=-o-ch3 R3=>"· -chK3 NH — (CH2)3~~NH— 、nh2 Ri=-H R2=~0~CH3 r3=- -ch-〇 R4—— (CH2)4—NH2 R1=—Cl —CH3 R3^ -chK3 NH R4=~ (CH2)3—NH- 、nh2 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234

A7 ________B7 _五、發明説明（9 ) F R1=—H R2= -O-i-F Ra_CH /"Λ R4^(CH2)3-NH-^NH F W/ NKJM NH5

Ris-H R2=-SCH3 R3*- Ri=—H R2=—SCH3 R〇= - CH2^^〇h *括弧内數目指示甲基在苯基基團中的位置。特別於前述定義中，本發明係有關由A、R!、R2、R3及 R4基之各種可能的組合獲得之每種式⑴化合物，其定義列舉如前。其餘内文中，前文定義化合物將定名為「式⑴化合物」或「式（I)酶基質」。於第二方面，本發明係有關一種比色檢定分析生物試樣中之羧基胜肽酶N活性或較好CPU活性之方法，該方法中： -該試樣接觸如上定義之式⑴色原化合物，以及得自羧基胜肽酶A族群之酶，而其接觸條件係允許試樣水解；以及 -藉試樣之CPN或CPU水解該式⑴化合物係經由測量由該化合物之吸收光譜選定波長之著色降低（對應於吸收減少）而測定。著色的減少一方面係來自於式⑴化合物藉試樣之羧基胜 r4=—(CH2)3-NH-C^ R4-— NH NH2 (CH2)3-NH-C^

NH -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 x 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（10 ) 肽酶N或U水解，以及它方面係藉羧基胜肽酶A水解。本發明方法較好使用式（I)化合物進行，其中疏水胺基酸為苯基丙胺酸或較好酪胺酸，鹼性胺基酸為精胺酸或離胺酸。本發明方法較好使用式⑴化合物進行，其中Ri係選自-H 及-CH3以及R2係選自-CH3、-0-CH3及S-CH3。較好式（I)化合物之 RAH，R2 為-S-CH3。本發明方法較好使用下式⑴化合物族群進行，其中：

Ri及R2具有前述任一種定義以及尺2較好為-S-CH3。特別式（I)化合物為苯基偶氮甲醯基化合物，其中：

該化合物係選自下列化合物組成的組群，其中： R!=-CH3 R2=一 CH3 or R3^CH2H^~^ R4: NH -(CH2)rNH—cf 、nh2 Rt=-CH3 ° (2Γ 尺2=— CH3 R3-chhQ> ^ NH - (CH2)3r~NH_Ci^ 、nh2 R-[=一CH3 (2Γ R2=一 CH3 (5)· R3=-ch2-^^> R4^ NH -(CH2)r-NH-(f 、nh2 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（q

Ri=—Η Rt=-H R2 R2 = -〇-CH3 -0-CH3 R3 一 NH (CH2)3-NH^(f 、nh2 R4=-(CH2)4~NH2 R1=—Ci r2=—〇H3 R3=—CH2—^ \ NH F?4=~ (CH2)3- NH— 、nh2 R*t=— H R2s — F -0十卩 R3=_CHr_^) NH R4=-(CH2)3-NH〜C^ 、nh2 Ri—H R2= —SCH3 R3=-CH2^} nh2 R4=-(CH2)3-NH-(\ 'NH Rl=—H R2= 一SCH3 NH2 R4=-(CH2)3-NH-C^ *括弧内數目指示甲基在苯基中的位置。使用的羧基胜肽酶A可來自於多種不同來源例如胰細胞或肥大細胞。可為人類來源或動物來源。較好使用豬胰羧基胜肽酶A。本發明方法之基本原理為前述式（I)有色酶基質藉存在於被分析試樣之羧基胜肽酶N或羧基胜肽酶U的作用水解，且關聯添加至介質之羧基胜肽酶A之作用。此種特定水解結果導致起始化合物色彩的消失，可使用分光光度計監測。特別考慮前述N或U或A羧基胜肽酶之水解特異性，以及 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234

前述式（I)化合物之結構特徵，羧基胜肽酶A以及羧基胜肽酶N或活化U接觸此種化合物，將造成化合物之第一與第一胺基酸間之鍵結因羧基胜肽酶N或υ作用割斷，接著為 ♦乎同時偶氮甲醯基與第一胺基酸間之鍵結因A叛基胜肽酶作用而被割斷。兩種反應結果導致起始介質脫色。則容易經由監測著色劑[式（I)化合物]之吸收波長隨著時間之著色的減低而監測’較好係於對應其最大吸收波長（吸收尖峰）監測。此種減低表示水解動力學。最初存在於試樣之活性羧基胜肽酶N或U之量係經由比較測量得之光學密度與校準曲、、泉之光學始、度計算，校準曲線例如可使用某種範圍濃度之活性純化羧基胜肽酶N或U於溶液產生。相反地，若試樣不含羧基胜肽酶N或u，或CPN或CPU為典活性，則式（I)化合物之第一與第二胺基酸間未發生割斷，如此羧基胜肽酶A將無法作用於第一胺基酸的有色基團鍵結。因此理由故，起始物料著色未見減低。特別本發明提供一種檢定分析生物試樣較好為血液試樣例如全血或純血漿或稀釋血漿之cpN或cpiJ活性之方法，較好為檢定分析血樣特別純或稀釋血漿之TAFI活性之方法。本例中’欲試驗血漿首先於緩衝溶液存在下，若有所需帶有欲測量其活性之該羧基胜肽酶活化劑（後文定名為活化劑緩衝液）存在下，讓其培育活化欲研究的羧基胜肽酶需要的時間。培育較好係於周圍溫度進行5至1〇分鐘，較

1252234 A7 B7 五、發明説明（13 ) 好8至12分鐘，更好10分鐘時間。本發明之較佳具體實施例中，羧基胜肽酶活化劑可為凝血活化劑特別為凝血因子，允許以活化複基胜肽酶U，特別TAFI之方式作用。本例中，隨後添加絲胺酸蛋白酶抑制劑至混合物來遮斷凝血過程。絲胺酸蛋白酶抑制劑例如為PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-氯甲基甲酮-貝肯（Bachem)-參考編號1065)，使用之終濃度係於1至50/zM之範圍較好30gM，對應於初濃度 10至250 // Μ且較好150 /z Μ。其它化合物例如皮法克 (Pefabloc) [ 4-(2-胺乙基）-苯磺醯氟次氯酸鹽-潘薩芳 (PenthaphaΓm)-參考編號 399.01]，較佳使用濃度0.1mM。添加抑制劑之同時或恰在添加後，本發明式（I)化合物之一係呈水溶液添加。此種化合物通常係使用0.25至10 mM，較好0.25至2.5 mM及更好0.25至1 mM之終濃度。較佳使用濃度為0.4 mM。又經另一段時間之培育期較好以周圍溫度培育後，於該期間式⑴基質於第二胺基酸藉試樣之CPN或CPU(欲測量其活性）割斷，藉加入鹽酸停止水解，即刻接著添加鹼重新調整pH至7至8範圍之值。然後首次測量所得混合物之光密度（0D)，而未添加CPA 至介質。然後添加CPA至介質，再度測量0D。使用分光光度計監測其下降。表示經由試樣之CPU或CPN與CPA之聯合作用而水解式（I)酶基質。測量得的0D差值（△ 0D)比較校準曲線之值，校準曲線 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（14 ) 例如由缺乏欲研究之CPN或CPU之試樣使用過量經純化之酶獲得。前述試驗方案構成本發明之較佳具體實施例。但就添加不同化合物順序以及化合物性質可有多項變化。亦屬本發明之定義。舉例言之，一旦開始本發明方法，與凝血活化劑緩衝液同時，可摻混式（I)酶基質。以相同方式劑量可始於兩整份相同反應介質，其中一者只使用CPA處理。然後測量兩份間的Δ DO。當活化劑缓衝液活化凝固時，活化可藉熟諳技藝人士已知且例行用於凝血試驗之不同方法進行。特別活化方法包括： -透過凝血酶/凝血酶調理素複體活化。第一項可能組成本發明之較佳具體實施例。 -以活化因子XI活化，活化因子XI於此種情況下可替代活化劑緩衝液之凝血酶。為了加速反應，較好也添加凝血酶調理素至介質。 -使用毒液特別蛇毒活化，可能添加前凝血酶及/或凝血酶調理素至介質。較佳蛇毒係得自「仿凝血酶」族群例如得自 Arkistrodon rhodostoma或 Bathrops之蛇毒，以及得自Notechis scutatus或Echis carinatus之前凝血酶活化劑蛇毒（15-18)。 -藉組織因子於磷脂質及鈣存在下活化（使用快克（Quick) 試驗原理之外生性活化作用）， -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）

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1252234 A7 B7 五、發明説明（15 ) -接觸相之活化， -藉胞質素活化。較好本發明方法可對同一試樣測量其中存在的「組成性」CPN及/或CPU活性，亦即CPN及/或CPU係以「天然」活性形式存在（換言之，無需使用活化劑緩衝液謗生活化）；以及第二，可活化CPN及/或CPU活性，亦即以失活化形式存在於試樣之CPN及/或CPU其活性將於活化過程關聯活化劑缓衝液之效果而被謗發或產生。為了達成此項目的，試樣之式⑴基質水解活性使用前述方法比較，將試樣置於活化劑緩衝液存在下（偵測試樣中 CPN或CPU總活性）、或置於不含活化劑之生理緩衝液存在下（偵測組成性CPN及/或CPU活性）。兩次測量間之A 0D差異獲得存在於試樣之可活化CPN 或CPU活性。於較佳變化例，本發明係有關一種檢定分析生物試樣特別血樣之活化TAFI之方法，該方法係使用前述式（I)化合物或酶基質之一。組成性TAFI及/或可活化ΤΑΠ活性係經由於有以及無特定TAFI抑制劑存在下處理前述試樣測量。較佳抑制劑為CPI(得自馬鈐薯塊莖的羧基胜肽酶抑制劑），其用於試管試驗以及活體試驗研究對TAFI之功能廣泛述於參考文獻（參考文獻1)。熟諳技藝人士了解CPI可為變更其它血漿CP活性而特異性抑制TAFI。於本發明方法之範圍，CPI用量濃度為0.10至0.50 mM(初濃度）或以終濃 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（16 ) 度表示為2至10//1^，較好7//?4(終濃度）或0.38 111^4(初濃度）。根據較佳變化例原理，試樣係藉TAFI活化劑緩衝液活化，例如使用凝血酶/凝血酶調理素複體活化血液凝固之緩衝液，根據前述方法於有或無TAFI抑制劑存在下處理。含以及不含TAFI抑制劑之介質著色差異可測定試樣中活化TAFI (TAFIa)之酶活性。更精確言之，本發明方法可使用下述方案進行：若有所需欲試驗試樣可分成兩份或兩份以上，係依據是否欲測定試樣所含全部TAFI活性、或是否欲對組成性TAFI以及可活化ΤΑΠ活性做區別而定。 -含TAFI抑制劑之第一份可根據前述方法活化及處理。如此由於藉試樣中存在的其它羧基胜肽酶將因式（I)酶基質及殘餘水解導致介質只有略微變色。 -第二份係以前述相同方式但無TAFI抑制劑存在下處理。如此獲得介質之強烈變色，該強烈變色係與式（I) 酶基質藉試樣之活化TAFI作用水解有關。 -測量第一份與第二份之著色差異（△ 0D)。如此表示試樣中活化TAFI之比活性。若欲對可活化TAFI以及組成TAFI之比活性間做區別，使用第三份相同試樣，也測量對式（I)酶基質之水解活性，但其中未添加活化劑緩衝液至介質而未觸發活化。不同整份間的A 0D可產生試樣之總TAFI活性或單獨組成TAFI之活性，如此可推定可活化TAFI活性。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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1252234 A7 B7 五、發明説明（17 ) 於第三方面，本發明係有關一種檢定分析CPN或CPU之診斷套件組，該診斷套件組包含一種如前文定義之式⑴酶基質。較好本發明之診斷套件組為可測量血樣中TAFI活性之套件組。特別該診斷套件組包含： -TAFI活化劑，特別TAFI活化劑緩衝液； -羧基胜肽酶A ; -式（I)酶基質； -TAFI抑制劑； -套件組視需要地進一步包含 -絲胺酸蛋白酶抑制劑。各組成分較好係呈粉末形式或凍乾形式。下列實例及附圖舉例說明本發明。塁丄：不同式（I)合成化合物之吸收光譜，使用紫外光-可見光分光光度計測量。圖2 ：藉酸水解進行AAFFR分析。圖3 :由TAFI缺乏血漿以過量經純化TAFI獲得0至26微克 /毫升濃度範圍產生的校準曲線。圖4 ：以匯集血漿產生的某種濃度範圍之校準曲線。校準係以凝血酶產生方法進行。比色劑量係以色原酶基質4-MTPAFYP進行。實例1 : 一組根據本發明之偶氮甲醯基化合物之合成 -21- 木紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（18 ) 下表1顯示8種較佳本發明式（I)化合物之化學式。以紫外光-可見光分光光度計（優維康重（UVIKON-KONTRON))測量之吸收光譜顯示於圖1。五種化合物4 (MxPAFFR)之一之合成之詳細說明列舉如後。下述此種化合物之各步騾彼此相同，但化合物5 (MxPAFFK)例外，其需要額外離胺酸脫保護步騾（參考下述反應圖及說明）。表1 :

-22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（

裝訂

k -23-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（20 )

A/4-甲氧苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物4) 之合成 : 引言:後述各步驟對各種著色劑皆完全相同。各步驟後接著進行高效液相層析術，以及進行苯基丙胺酸與精胺酸 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 _____ B7 五、發明説明（21 ) 偶合之胺基酸分析。 :格利^試劑反應圖

2UL· ··準備1當量4-溴茴香醚以及1當量鎂。將鎂及20% 重量比4-溴茴香醚引進三頸瓶，攝取於無水四氫呋喃（2毫升/毫莫耳），將總成置於氮氣下。藉將三頸瓶之一點使用炊具加熱而引發反應，反應介質轉成褐色。反應開始時 (鎂表面發泡），於90°C回流加熱，然後緩慢加入其餘攝取於無水THF (2毫升/毫莫耳）之4-溴茴香醚。1小時後停止回流。4-甲氧苯基溴化鎂係「就此」用於隨後步驟（褐色）。 1 :玻璃器皿及鎂於120°C烘箱預先乾燥，其它產物係於乾燥器内乾燥。駐留時間：因格利亞試劑為高度不安定之化合物，對水敏感，因此HPLC分析期間形成的分級產物獲得三個特徵駐留時間：駐留時間1 : 2.68分鐘駐留時間2 : 3.32分鐘駐留時間3 : 5.38分鐘篇2步驟··與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合反應圖 -25-

1252234 A7 B7 五、發明説明（22 )

格利亞試劑 · 偶氮二羧酸二第三丁酯

方法:將1當量偶氮二羧酸二第三丁酯及1當量4-甲氧苯基溴化鎂（格利亞試劑）攝取於無水THF (2毫升/毫莫耳）。各自冷卻至0-5 °C。添加格利亞試劑至偶氮二羧酸二第三丁酯。攪拌10分鐘，加入1.02當量乙酸，緩慢回復至周圍溫度。進行水/醚萃取。乾燥醚化相，蒸發至乾。獲得黃色油。駐留時間：7.85分鐘第3步騾：脫保護反應圖

-26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（23 )

方法:將1當量N，N’-貳-(第三丁氧羰基）-4-(甲氧）苯基肼攝取於異丙醇（10.2毫升/毫莫耳）然後添加4.8 Μ鹽酸於二哼烷（2毫升/毫莫耳）。回流加熱（80°C)。15分鐘後冷卻，添加醚（5毫升/毫莫耳）。將4-(甲氧）苯基肼鹽酸鹽沈澱出。經過濾及乾燥。粉末攝取於水及調整至pH=7。進行水/二氯甲烷萃取，將二氯甲烷蒸發至乾。獲得4-甲氧苯基肼（黃色粉末），經乾燥。駐留時間：2.20分鐘第4步驟：與碳酸二苯酯偶合反應圖

削h2 ♦ Λ_f \—/己烷/苯結晶 4·(甲氧)苯基肼 __ 碳酸二苯酯

方法：將1.4當量碳酸二苯酯攝取於苯（0.25毫升/毫莫 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（24 ) 耳），於120°C回流加熱。緩慢添加1當量4-甲氧苯基肼於苯 (0.7毫升/毫莫耳）。6小時後停止回流。濃縮介質，然後由己烷/苯（4/1)進行結晶。於乾燥器内過濾及乾燥白色晶體。駐留時間：6.74分鐘第5步騾：與笨基丙胺酸偶合反應圖

方法：1.2當量苯基丙胺酸三乙基銨鹽攝取於二甲基甲醯胺（3.33毫升/毫莫耳）回流（95°C)加熱。緩慢添加1當量4-甲氧苯基肼甲酸鹽攝取於二甲基甲醯胺（2毫升/毫莫耳）。1 小時30分鐘後停止回流，讓其回復室溫，濃縮。酸化 (pH=2)。藉層析純化（白色晶體）。駐留時間：6. 12分鐘 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（25 ) 第6步驟：氧化；由「肼基i轉成「偶氮！形式反應圖

方法：將1當量N_(4-甲氧苯基肼基甲醯基）-L-苯基丙胺酸攝取於含1當量氫氧化鈉及1當量乙酸銨之超純水（20.8毫升/毫莫耳）。添加1當量偏過碘酸鈉於超純水（4.2毫升/毫莫耳）。20分鐘後反應介質經酸化（pH=2)，然後藉層析術純化（橙色晶體）。駐留時間：6.8 6分鐘第7步驟：與精胺酸偶合反應圖 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（26 )

方法:將1當量精胺酸甲酯鹽酸鹽攝取於二甲基甲醯胺 (3毫升/毫莫耳）。加入1.1當量DIAE(二異丙基乙基胺），1當量N-(4-甲氧苯基偶氮甲醯基）-L-苯基丙胺酸，然後加入1.1 當量TBTU (0-(苯并三唑-1-基）-Ν,Ν,Ν’,Ν’-四甲基四氟硼酸脲鑌）。添加需要量之DIAE而獲得pH=7-8。5分鐘後蒸發至乾及藉層析術純化（燈色晶體）。駐留時間：6.06分鐘第8步驟：皂化 -30- 本紙張又度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（27 ) 反應圖

方法：1當量N-(4-甲氧苯基偶氮甲醯基）-L-苯基丙胺酸精胺酸甲酯攝取於水/甲醇混合物（比例：1/2 ; 3毫升/毫莫耳）。添加3當量1 N氫氧化鈉。1小時後酸化反應介質，濃縮然後進行水/二氯甲烷萃取。二氯甲烷相經蒸發然後乾燥。獲得N-(4-甲氧苯基偶氮甲醯基）-L-苯基丙胺醯基精胺酸呈燈色粉末。駐留時間：5.5分鐘酸水解後進行終產物之胺基酸分析監測序列之均一程 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（28 ) 度。此項分析結果顯示於圖2之層析圖。分析條件· >HPLC AAA系歹ij ;前管柱使用PITC(異氰酸苯酯）衍生； >C18管柱；100埃；5微米；250x4.6毫米 >於254奈米偵測；流速=1毫升/分鐘 >洗提劑： A :乙酸鹽緩衝劑，pH 5.74 B : 70%乙腈，30%乙酸鈉緩衝液；32 mM ; pH=6.10 C :乙腈其它化合物之合成方案係基於前文說明之相同步騾。摘述於如下反應圖。對此等化合物各合成步騾所得停駐時間示於下表II : 表II :於各步騾對其它合成著色劑進行HPLC所得停駐時間步驟 2,3DMPAFFR 2,4DMPAFFR 2,5DMPAFFR MxAPFFR MxPAFFK CITAFFR TFMxPAFFR 1 / / / / / / / 2 9.12分鐘 9.18分鐘 9.15分鐘 7.85分鐘 7.85分鐘 9.25分鐘 9.26分鐘 3 3.59分鐘 3.81分鐘 3.73分鐘 2.20分鐘 2.20分鐘 3.93分鐘 3.94分鐘 4 7.87分鐘 7.96分鐘 7.82分鐘 6.74分鐘 6.74分鐘 8.06分鐘 7.92分鐘 5 7.04分鐘 7.13分鐘 7.11分鐘 6.12分鐘 6.12分鐘 7.51分鐘 7.45分鐘 6 7.82分鐘 7.88分鐘 7.90分鐘 6.86分鐘 6.86分鐘 7.85分鐘 7.79分鐘 7 7.10分鐘 7.02分鐘 7.10分鐘 6.06分鐘 9.84分鐘 7.13分鐘 7.08分鐘 8 6.55分鐘 6.54分鐘 6.62分鐘 5.50分鐘 9.23分鐘 6.71分鐘 6.65分鐘分析條件: ΜΓ18管柱；5微米；100x4.6毫米 -32· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（29 )

，於2 5 4奈米偵測；流速=1毫升/分鐘 >梯度：〇，—1〇%Β 10f->90%B >使用 A ··水含0.1%三氟乙酸； B :乙腈含0.1%三氟乙酸； B/2,3-二甲基苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物 1)之合成：第1步騾：格利亞試劑

第2步驟：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合

第3步驟：脫保護 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1252234 A7B7 五、發明説明（30 )

第4步騾：與碳酸二笨酯偶合

苯於120°C回流己烷/苯結晶 2,3~(二曱基)苯基研. 碳酸二苯酯

第5步驟：與笨基丙胺酸偶合 -34-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（31

第6步騾：氧化；「肼基i轉成「偶氮i形式

-35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（32 ) 第7步驟：與精胺酸偶合

第8步騾：皂化

-36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（33 ) C/2,4-二甲基苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物 2)之合成：第1步.驟：格利亞試劑

第2步騾：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合

第3步驟：脫保護

第4步驟：與碳酸二苯酯偶合 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（34 CHa

NH— 2,4-(二甲基)苯基胼

笨於120°C回流己烷/苯結晶碳酸二苯酯

第5步驟：與苯基丙胺酸偶合

裝訂

-38-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（35 )

裝第7步騾：與精胺酸偶合

訂

-39-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（36 ) 第8步騾：皂化

N-(2,4-二甲基苯基偶氮甲釀基)-L·苯基丙胺醯基猜胺酸 D/2,5-二甲基苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物 3)之合成：第1步驟：格利亞試劑

第2步騾：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（37 ) 第3步驟：脫保護

Ν，Ν·-貳-(第三丁氧羰基)-2,3-(二甲基)苯基耕____2,5-(二甲基)苯基胼第4步驟：與碳酸二苯酯偶合

第5步驟：與苯基丙胺酸偶合

木紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（38 ) 第6步驟：氧化；「胼基！轉成「偶氮|形式

第7步驟：與精胺酸偶合

-42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（39 ) 第8步驟：皂化

Ν-(2,4·二甲基苯基偶氮甲醢基)-L-苯基丙胺醢基精胺酸 E/4-甲氧苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基離胺酸之合成：第1步驟 ♦格利亞試劑

第2步驟··與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

1252234 A7 B7 五、發明説明（4〇

第3步驟：脫保護

NH2 4·(甲氧)苯基肼鹽酸鹽第4步驟：與碳酸二苯酯偶合 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） Ϊ252234

A7 B7 41 ) 五、發明説明（

Ο

4-(甲氧)苯基肼基甲酸酯星騾：與苯基丙胺酸偶合

1·!堂騾：氧化；「胼盖i棘成「偶氮i形式

_____ -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（42 ) 第7步驟：與離胺酸偶合

第8步驟：皂化

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（43 )

第9步騾：脫保護本特定化合物需要額外將離胺酸的支鏈脫保護之步騾 (ε-Boc : Ν-ε -第三丁氧談基）。

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（44 ) 方法:放置1當量N-(4-甲氧苯基偶氮甲醯基）-L-苯基丙胺酸-L-離胺酸（ε -Boc)於二氯甲烷（3毫升/毫莫耳）於燒瓶。開始攪拌。接上含三氟乙酸（3毫升/毫莫耳）之滴液漏斗。緩慢添加（逐滴）。15分鐘後濃縮反應介質，以高效液相層析術純化。獲得燈色粉末。 F/3-氣-對-甲苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物 6)之合成：第1步騾：格利亞試劑反應圖

第2步騾：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合反應圖

第3步驟：脫保護反應圖

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（45 ) 第4步驟：與碳酸二苯酯偶合反應圖

第5步騾：與苯基丙胺酸偶合反應圖 3-氯-對-甲笨基胼基甲酸酯 ·苯基丙胺酸，三乙基銨鹽

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第6步驟：氧化；「肼基！轉成「偶氮i形式 -49- 木紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 五、發明説明（46 ) 第7步騾：與精胺酸偶合反應圖第8步驟：皂化反應圖 A7 B7

-50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（47

HN 爭、NHz 1) 皂化甲醇/水(2/3 ; 1/3)

2) 中和HC11N

G/4-(三氟甲氣）笨基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物7)之合成：第1步騾：格利亞試劑反應圖

第2步驟：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合反應圖 -51- ϋ張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）

1252234 A7 B7 五、發明説明（48 )

第3步騾：脫保護反應圖

反應圖

-52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（49 ) 第5步驟：與苯基丙胺酸偶合反應圖

反應圖

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（50 ) 第7步騾：與精胺酸偶合反應圖

Ν-(4·(三氟甲氧)苯基偶氮甲醢基)心苯基丙胺醢基精胺酸甲酯

裝訂第8步騾：皂化反應圖

-54-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（51 )

H/4-甲硫基苯基偶氮甲醯基苯基丙胺醯基精胺酸（化合物8) 之合成 : 第1步驟：格利亞試劑 +Mg(切屑）> 4·甲硫基苯基漠_Μ_格利亞試劑第2步驟：與偶氮二羧酸二第三丁酯偶合

裝訂 l3cs^，义九又欠格利亞試劑偶氮二羧酸二第三丁酯

第3步驟：脫保護

N，N'·武-(第三丁氧羰基)-4-(甲硫基)苯基肼 4·( T硫基)苯基肼 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（52 ) 第4步驟：與碳酸二苯酯偶合 y~NH~NH2 —\苯於120t回流己烷/苯結晶 4·(甲硫基)苯基胼碳酸二苯酯 4·(甲硫基)苯基肼基甲酸酯第5步騾：與苯基丙胺酸偶合

第6步驟：氣化；「肼基！轉成「偶氮i形式

第7步騾：與精胺酸偶合

-56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（53 ) 第8步騾：皂化

nh-ch-c^ 0

1)皂化甲碎/水(2/3 ; 1/3) » 2)中和 HC11N

Η〆、NH2 Η〆、㈣ ΝΚ4-甲硫基苯基偶氮甲醯基)-L-苯基丙胺醯基精胺酸甲酯 N_(4·甲硫基苯基偶氮甲醢基)-L-苯基丙胺醯基精胺酸 (橙色） (橙色） 1/4-甲硫基苯基偈一氮甲醯基酪胺醯某胺酸（化合物9)之合成：第1步騾：格利亞試劑

Mg(切屑） 4·甲硫基苯基溴鎂無水THF "qxTnT" 格利亞試劑第2步驟：與偶氮二羧酸二第三丁酯

氧羰基)冰(f硫基)苯基肼 1) HC1於二呤烷(4.8M);異丙醇 2) Na〇H1N(pH*7)

HaCS—^ NH—NH2 4-(甲硫基)苯基肼第i步| :與碳酸二笨酯偶合 -57- 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

1252234 A7 B7 五、發明説明（54 ) 苯於120°C回流己坡/苯結晶 UNH-cUo-^^ 4-(曱破基)苯基肼基甲酸酯 -—〇 -nh-nh2 ♦ ^ 4-(甲硫基)苯基肼碳酸二苯酿第5步驟：輿酪胺逡性金

第6步騾：ϋ.化；「胼基i轉成「偶氮I形式

第7步驟：與精胺酸偶合

第8步驟：皂化 .58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（55 )

實例2 ： A)劑量原理以及主要使用之試劑 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（56 )

TAFI 步驟1) TAFIa之製造酶基質 ▼ TAFIa

AAI 步驟2) TAFIa活性試驗 aJ\2

COOH

AA2 COOH 步驟3) 測量

羧基胜肽酶A

γ 酶基質I AA1I COOH DCh之測量

V 脫色酶基質 do2之測量 ▼ D02 - D01: 反應TAFIa活性 -60-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（57 ) 四種主要化學劑構成劑量的主幹，須將欲決定劑量的血漿試樣以及特定TAHa (CPI)抑制劑加至其中。凝血酶-凝血酶調理素凝血酶之製造活化缓衝液凝血酶凝血酶調理素氯化鈣接觸路徑活化劑凝血酶調理素氯化#5 活化抑制劑 PPACK PPACK 酶基質偶氮甲醯基衍生物偶氮甲醯基衍生物 TAFIa活性之測量羧基胜肽酶A(CPa) 羧基胜肽酶A (CPa) 設計生物試驗時已經合成且使用若干酶基質。今日最佳之酶基質為4-甲硫基苯基偶氮甲醯基酪胺醯基精胺酸：4-MTPAFYR。 l.TAFIa之製備已經試驗兩種TAFI活化路徑，說明於操作模式如後： *凝血酶-凝血酶調理素方法··欲決定劑量之血漿試樣於凝血酶/凝血酶調理素複體存在下培育。凝血酶調理素透過凝血酶放大TAFI之蛋白質分解速率。如此試樣中存在的全部TAFI直接被轉成TAFIa。 *凝血酶之獲得：欲決定劑量之血漿試樣與特有凝血路徑活化劑共同培育。所得凝血酶偶合凝血酶調理素，謗發形成TAFIa。本例中，TAFIa之獲得係依據試樣提引出凝血酶之能力決定。前述兩種操作模式中，TAFIa之獲得係藉凝血酶抑制劑，PPACK : D-Phe-Pro-Arg-CH2Cl(絲胺酸蛋白酶抑制劑） -61- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（58 ) 中止。 2. TAFIa活性試驗一組根據本發明之酶基質藉TAFIa之羧基胜肽酶活性水解，該酶基質係由二胜肽於其N端提供式（I)偶氮甲醯基族群之色彩組成。 TAFIa割斷C-端胺基酸殘基。回收的殘餘酶基質仍然維持有色。 3. TAFIa活性之測量 TAFIa活性係經由羧基胜肽酶A(CPA)對殘餘有色酶基質之作用測量。CPA特異性割斷第二胺基酸，酶基質喪失其著色。此種脫色作用係與試樣中之TAFIa活性成正比。 4. 非特異性評估為了防止酶基質水解之非特異活性（特別由於血漿中之組成活性羧基胜肽酶N水解），各試樣係於有以及無CPI(得自馬鈐薯塊莖之羧基胜肽酶抑制劑，此等TAFI特異性抑制劑）存在下進行。 B)使用本發明方法檢定分析ΤΑΠ活性之方案例 a)第一操作模式：凝血酶-凝血酶調理素方法試驗血漿樣本被分成兩份，一份補充CPI(克百肯-參考編號2173 5 9)，另一份補充海派斯（hepes)緩衝液。然後兩份使用酵素方法以相同方式處理： TAFI活化 150微升血漿使用海派斯緩衝液（或含13微克/毫升海派斯緩衝液之經純化TAFI)稀釋至1/20 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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1252234 A7 B7 五、發明説明（59 ) 10微升PC1或水於周圍溫度經歷5分鐘 1 5 0微升凝血活化劑緩衝液於周圍溫度10分鐘 100 微升 PPACK 試驗TAFI活性 + 100微升 MxPAFFR(酶基質）(5 mM) 於周圍溫度30分鐘 100微升鹽酸1 M+100微升氫氧化鈉1 Μ 測量使用海派斯緩衝液稀釋至1/3 測量於382奈米之光密度 25微升羧基胜肽酶A 於3 82奈米測量光密度經歷1分鐘時間第一操作模式可能之變化： -檢定分析可於37°C溫度進行 -酶基質與活化劑緩衝液同時由一開始即摻混於其中 -HPLC用於測量較佳不同產物終濃度： -PPACK: H-D-Phe-Pro-Arg-氯甲基甲酮MW=451，30 (貝肯-參考編號1065)。 -皮法克：可用來替代PPACK ·· 0.1 mM(潘薩芳-參考編號 399.01) °

-S每基質 MxPAFFR ·· 1 mM -63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

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1252234 A7 B7 五、發明説明（60 ) -羧基胜肽酶A ··得自牛胰臟（希格瑪公司-參考編號 C0386)。 5. 1毫升燒瓶，5000單位，21毫克蛋白質/毫升，47單位/ 毫克蛋白質 CPA已經使用前置過濾器、5微米過濾器、及0.45微米過遽器藉加入數毫升水過濾、

-CPI :使用 7//M 根據製造商的指示（克百肯公司），1毫克CPI可抑制約8 毫克稀釋至50%之TAFI (50單位/毫克）。 3 0//M PPACK濃度對應於終濃度150//M。終濃度1 mM酶基質係對應於初濃度5 mM。終濃度7 //M CPI係對應於初濃度 0.3 8 mM 〇發明人觀察到指示濃度可修改俾使用PPACK終濃度降至 6 μ Μ以及酶基質終濃度降至0.4 mM。活化劑缓衝液： • 本發明之較佳凝血活化路徑係使用凝血酶/凝血酶調理素複體活化。本例中使用之活化劑緩衝液包含下列組成分· 37微升0至80 nM較好10 nM凝血酶調理素（兔肺凝血酶調理素-美國診斷公司-參考編號237)。 6微升0.2至10 NIH/毫升凝血酶較好0.8 NIH/亳升（戴諾帝構（Diagnostica Stago)研究產品）。 750微升0至80 nM氯化鈣，較好40 nM 705微升9.4mM海派斯緩衝液；pH=7.6 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（61 ) 該濃度係對活化劑緩衝液終容積1498微升列舉。註：海派斯緩衝液含有海派斯20 mM、氯化钾4 mM及牛血清白蛋白1%。其它試驗係使用海派斯20 mM及氯化鈉150 mM進行。 • 如說明指示，其它活化路徑亦屬可能，特別使用因子 XIa活化。該種情；兄下，活化劑緩衝液例如含有下列組成分： 5微升3 0單位/毫升凝血酶調理素 3 0微升純因子XIa(克百肯公司-參考編號233483)。 88微升海派斯緩衝液pH= 7.4(海派斯20 mM及氯化鈉150 mM) 〇濃度係舉例說明，可由熟諳技藝人士調整。 b)第二操作模式另一種活化凝血之方式涉及凝血酶，要求使用接觸路徑活化劑。 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（62 凝血酶的製造 1) TAFI活化 100微升試樣土 10微升CPI 100微升活化緩衝液 -3 0微升凝血酶調理素30單位/毫升 -165微升接觸相活化劑 -800微升20 mM氯化鈣周圍溫度培育10分鐘 100微升 PPACK 2)試驗TAFI活性 100微升酶基質周圍溫度培育30分鐘 100微升鹽酸1 N 100微升氫氧化鈉1 N 測量使用500微升緩衝液+ 50微升硫酸稀釋250微升反應介質讀取DOi 或使用250微升緩衝液+ 250微升CPa稀釋250微升反應介質於周圍溫度培育5分鐘 50微升硫酸讀取D02 405奈米實例3 : 凝血酶/凝血酶調理素方法之校準曲線的產生如下圖3顯示由TAFI空乏血漿獲得之校準曲線，該血漿含過量經純化之TAFI而獲得TAFI濃度由0至26微克/毫升之範圍。使用之式⑴化合物為MxPAAFR，濃度5 mM。使用本發明方法測量之△ ODs示於下表III : 表 III : TAFIa(微克/毫升） 0 1.63 3.25 6.5 13 26 A OD測量值 0.168 0.217 0.273 0.399 0.624 0.995 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（63 ) 如圖3可知，校準曲線對於所研究之濃度範圍呈直線，該範圍超過涵蓋式量濃度區段，TAFI係以5至15微克/毫升存在於有機體。如此本發明方法可測定TAFI缺乏以及異常高濃度TAFI。實例4 : 對不同型血漿所得結果本發明方法使用實例2所述方案應用於不同型血漿。新鮮血漿，冷凍血漿：可檢定分析新鮮血漿及冷)東血漿但光密度減低。係由於冷凍期間TAFI略微分解所造成（蛋白質分解）。新鮮血聚冷凍血漿 9.4微克/毫升 6.0微克/毫升 11.2微克/毫升 6.5微克/毫升 10.7微克/毫升 5.6微克/毫升冷〉東血聚，康乾血漿： TAFI檢定分析可用於凍乾血漿，同等適用於冷凍血漿。冷康血漿：凍乾血漿 AOD ： 0.302 0.354 各種來源之冷凍血漿：血栓溶解 2.9微克/毫升 CIVD 2.8微克/毫升肝硬化 1.4微克/毫升懷孕 7.1微克/毫升血中纖維蛋白原過高 4.6微克/毫升 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（64 ) HNF 6.1微克/毫升（未經分選之肝素） AVK 5.8-8.2-6.5-7.1微克/毫升（抗維生素K)。實例5 使用不同之本發明酶基質進行檢定分析本發明方法適用於含經純化之TAFI且帶有若干實例1所述化合物之溶液。試驗係對6.5微克/毫升純TAFI於海派斯緩衝液之溶液進行。結果示於下表IV。表IV ：化合物測量初OD 終OD △〇D 2.3DMPAFFR 5mM 350奈米 0.318 0.089 0.229 2.4DMPAFFR 5mM 330奈米 1.004 0.087 0.917 2.5DMPAFFR 5mM 320奈米 0.973 0.131 0.842 AAFFK 5mM 320奈米 0.973 0.131 0.842 實例6 ·· TAFIa對本發明式（I)化合物之特異性本實例驗證相較於其它鹼性羧基胜肽酶，需要使用本發明方法及式（I)化合物特別檢定分析CPN或CPU特別TAFI活性。 1.本例中，檢定分析係使用Mock於（14)所述化合物族群之酶基質進行。該酶基質係由攜帶發色基團茴香基偶氮甲醯基基團（CH3OC6H4-N=N-CO-部分）之單一胺基酸組成。選用之胺基酸為精胺酸，精胺酸為通常被叛基胜肽酶B水解之鹼性胺基酸（1)。 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A7 B7 五、發明説明（65 ) 此種酶基質於後文稱做AAFR(茴香基偶氮甲醯基精胺酸）或MxAFR(4-甲氧苯基偶氮甲醯基精胺酸）。該酶基質（0.25 mM)係與血漿TAFI試樣並存 '或豬膜#复基胜肽酶B溶液（希格瑪公司-參考編號C9584)，5.2莫耳/升並存。兩種試樣個別著色之喪失係使用分光光度計監測。各試樣係使用如下方案處理： a) 起始試樣： •血漿TAFI(存在於正常血漿匯集物-稀釋至1/20)或 • 5.2莫耳/升豬胰羧基胜肽酶B(於海派斯缓衝液） b) 使用血漿TAFI試樣之凝血酶-凝血酶調理素-氯化鈣複體（參考實例2)活化。 c) 添加 5 mM AAFR。 d) 於382奈米測量OD。結果：於382奈米初OD 終OD Δ OD 豬CPB 1.054 0.445 0.608 血漿TAFIa 1.730 1.681 0.049 結論 · 與胰CPB相反，活化TAFI無法水解AAFR。 2.然後將本發明方法應用至經純化之TAFI溶液，使用式（I) 化合物酶基質（MxPAFFK)或使用MxAFR來查驗TAFIa仍然水解式（I)化合物。凝血活化作用係利用凝血酶-凝血酶調理素-氯化鈣複體引發（參考實例2方案）。 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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1252234 A7 B7 五、發明説明（66 ) 兩種試樣個別著色的減少係使用分光光度計追蹤。 a) 開始試樣：經純化後TAFI溶液，18微克/毫升（於海派斯緩衝液稀釋）。 b) 活化凝血。 c) 添加 27 mM MxAFR或 MxPAFFK(對照），濃縮 MxAFFK。 d) 添加CPA至含MxPAFFK試樣。 e) 測量於382奈米之〇D。結果：初OD 終OD Δ OD TAFIa+MxAFR 1.356 1.300 0.056 TAFIa+MxPAFFK 1.397 0.849 0.548 結論 · 活化TAFI無法水解MxAFR，但於MxPAFFK具有活性。實例7 :凝血酶之製備方法如實例2之揭示於操作模式b)經由稀釋血漿匯集物而獲得某種範圍（圖4)。血漿 A OD 濃度微克/毫升對照系統N 0.848 7.69 對照系統P P 0.670 4.90 正常jk蒙 0.928 9.39 此種方法可根據其形成凝血酶之量來區別血漿。若較佳，則反映出病人之凝血能力較高。 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252234 A7 B7 五、發明説明（67 ) 參考文獻: 1. BOUMA. B.N. et al·:叮hrombin-Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI· Plasma Procarboxypeptidase B， Procarboxypeptidase R, Procarboxypeptidase U)M. Thromb. Research, 101:329-354,2001. 2. BAJZAR L.: ^Purification and Characterization of TAFI, a Thrombin-activable Rbrinofysis Inhibitor"•丄 of Biol. Chem·, 270,24:14477-14484,1995. 3. JUHAN-VAGUE l.f ALESSI M,-C. : TAFI : lien molecufaire entre les processus de coagulation et de fibrinolysew [TAFI: molecular link between coagulation and fibrinolysis processes]. Sang Thrombose Veineuse, 5, 10:314-6, 1998. 4. SCHATTEMAN K. et al. : MCarboxypeptidase U at the interface between coagulation and fibrinolysis". Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 7(2):93-101,2001. 5. WOLF M. et al·:叮he kinetics of carboxypeptidase B activity1•.丄 of Biol· Chem., 237, n° 10, Octobre 1962. 6· SUZUKI S. et al. : "Spectrophotometric determination of glycine with 2,4,6-Trichloro-s-Triazine". Analytical Chemistry, Vol. 42, NQ1, January 1970. 7· LORENTZ K· et al· : "Determination of carboxypeptidase B in duodenal contents". Clinica Chimica Acta, 37:515-517,1972. 8· PLUMMER Th. H. et al.: wAn improved spectrophotometric assay for human plasma carboxypeptidase Nw. Analytical Biochemistry, 108:348-353,1980. 9. FISCHER G.H· et al· : "Synthetic inhibitors of carboxypeptidase N”. Adv.. Experimental Med. Biol. J98, Part A, 405-410,1986. 10. SARUTA H. et ai. : "Colorimetric determination of carboxypeptidase A activity in serumH. Clin. Chem. 32:5, 748-751,1986. 11· NAM-JOO HONG et at. : "Development of substrate for carboxypeptidase B by employing Thiaarginine peptides". Bull Korean Chem. Soc., VoL 19, N° 2, 189-93, 1998. 12. MOCK W. L. et al. : "Arazoformyl Dipeptide Substrates for Thermolysin. Confirmation of a Reverse Protonation Catalytic Mechanism11. Biochemistry, 35: 7369-7377, 1996. -71- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱)

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k 1252234 A7 B7 五、發明説明（68 ) 13. MOCK W. L. et al.: HAraz〇formy| Peptide Surrogates as Spectrophotometric Kinetic Assay Substrates for Carboxypeptidase Aw. Analytical Biochemistry, 239:218-222, 1996. 14. MOCK W. L. et al. : ^Catalytic activity of carboxypeptidase B and of carboxypeptidase Y with anisyiazoformyl substrates*·. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 9:187-192, 1999. 15. HATTON M.W. : "Studies on the coagulant enzyme from Agkistrodon rhodostoma venom. Isolation and some properties of the enzyme". Biochem. JM 131(4):799^807,1973. 16. STOCKER K. et al· : "The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (batroxobin)". Methods EnzymoL 45:214-223,1976. 17. DENSON K.W.E· : "Clot-inducing substances present in such venoms with particular reference to Echis carinatus venom”. Thromb. Res:, 8:351-360, 1976. 18. ROSING J. et al. : "Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators^. Toxicon, 30(12):1515-1527,1992. -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

Claims

I25^Ml 14987號專利申請案中文申請專利範圍替換本(94年11月） A8 B8 C8 D8 科年il別六、申請專利範圍 1. 一種如下式（I)化合物，

ΟΗ 其中：

-Ri、R2 = H、-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-C1、-CF3、 -OCF3、-SCH3 ; -R3 =可由羧基胜肽酶A水解之胺基酸基團； -R4 =驗性胺基酸基團。 2.如申請專利範圍第1項之化合物，其具有如下式（I):

-R!、R2 = H、-CH3、-CH(CH3)2、-OCH3、-CM、-CF3、 -OCF3、-SCH3 ; -R3 =疏水胺基酸基圑； 79256-941121.doc 本紙張·尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 χ 297公釐) 1252234 as B8 C8 _______D8 六、申請專利範圍 -Rf精胺酸或離胺酸基團。 3·如申請專利範圍第1或2項之化合物，其特徵在於η以及 R2=-SCH3。 4·如申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於R3係選自下列胺基酸基團： -酪胺酸， -苯基丙胺酸， -丙胺酸， -纈胺酸， -白胺酸， -異白胺酸， -笨基甘胺酸。 5_如申請專利範圍第1項之化合物5其特徵在於Rs表示苯基丙胺酸。 6.如申請專利範圍第3項之化合物，其特徵在於r3表示苯基丙胺酸。 7·如申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於r3表示苯基丙胺酸或路胺酸以及r4表示精胺酸或離胺酸。 8·如申請專利範圍第3項之化合物，其特徵在於r3表示苯基丙胺酸或酪胺酸以及R4表示精胺酸或離胺酸。 9. 如申請專利範圍第1項之化合物5其特徵在於r3為酪胺酸。 10. 如申請專利範圍第3項之化合物，其特徵在於r3為酪胺酸。 79256-941121.doc -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1252234 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 1L如申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於I係選自 -H及-CH3，以及 R2係選自 CH3、0-CH3、及-S-CH3。 12。如申請專利範圍第1項之化合物，其具有式（I)，該化合物係選自下列化合物組成的組群，其中： Ri=~~CH3 R2:—CH3 ^ 3 (3Γ R3s- CHt—^ ^ m R4=~ (CH2)x^ NH—C/ 、nh2 CH3 J <2Γ R2-—CH3 4 (4广 R3=- 》 NH R43— (CH2)3 —NH一、nh2 Rj=~·CH3 尺2=一 CH3 ^ (5Γ R3=— > /NH R^3— (CH2)3—NH—u snh2 Ri=—Η R2 =~0^CH3 R3=_ CH2—^ > NH (CH2)3 — NH- 、nh2 R】=—Η R2 =^"0—CH3 R3=— > ~ (CH2)4 — NH2 R1=—CI R2=一CH3 R3=— ^ NH FV>-(CH2)3 — NH—Cf 、nh2 R1=-H r2= R3_CH 户 \=y 、nh2 79256-941121.doc -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D nh2 R4=-(CH2)3-NH-C 1252234 Γ、申請專利範圍 Ri:-H R2=-SCH3 «3=-CH2^^ Ri=-H R2= - SCH3 R3=-CH2^^-OH *括弧中數目指示甲基在苯基基團中之位置。 13. 如申請專利範圍第1項之化合物，其特徵在於其為4-MTPAFYR (4㈣曱硫基苯基偶氮曱醯基酪胺醯基精胺酸）^ 14. 一種檢定分析於一生物試樣之羧基胜肽酶N或羧基胜肽酶U之活性之方法，其中： -該試樣係與如申請專利範圍第1至13項中任一項之式 (I)化合物以及與羧基胜肽酶A於可讓試樣水解之條件下接觸；以及 -測量含式（I)酶基質之試樣與羧基胜肽酶A之著色減少，該著色係由於式（I)酶基質藉試樣之CPN或CPU以及藉CPA雙重水解所致。 15. 如申請專利範圍第14項之方法，其特徵在於Rf Η及R2 = -S-CH3 〇 16. 如申請專利範圍第14或15項之方法，該酶基質為精胺酸或離胺酸基團。 17. 如申請專利範圍第14或15項之方法，其特徵在於該酶基質為一種式（I)化合物其中R3係選自下列胺基酸基團： -酪胺酸， -苯基丙胺酸， 79256-941121.doc -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) m nh2 R4= - (CH2)3-Nhhc( λΝΗ 1252234 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 -丙胺酸， -綠胺酸， -白胺酸， •異白胺酸， -苯基甘胺酸。 18·如申請專利範圍第14或15項之方法，其特徵在於該〜為酪胺酸。 ⑽申請專利範圍第14或15項之方法，其特徵在於該酶基質為其中R3表示苯基丙胺酸之式⑴化合物。申請專利範圍第14或15項之方法，其特徵在於該酶基質為其中R3表示笨基丙胺酸以及R4表示精胺酸或離胺酸之式⑴化合物。 2L如申請專利範圍第14或15項之方法，其特徵在於該酶基貝為一種式（I)化合物其中Ri係選自七及以及心係選自 CH3、〇-CH3及-S-CH3。 22.如申請專利範圍第14項之方法，其特徵在於該酶基質為一種式（I)化合物： R3—CHZ-/ A 只4=— (CH2)x^NH — NH 该化合物係選自下列化合物組成的組群，其中： fV-CH3 ⑶· ‘nh2 Ri= 一CH3 郎 R2=-CH3 (4). (CH2)3 —NH— NH 2 NH -5- 79256-941121.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252234 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 R1=—CH3 (2r R2=-CH3 {5)m R3=^—CHz-/—\ R4^- (CH2)3-NH~cf Km2 Ri=—H R2 =—O—CH3 R3=—CH R43"·" (CH。)〗一 NH — NH kNH2 R1=—H R2 CH3 r3s—CH2—/~\ R4— (CH2)4-NH2 R1=—Cl R2=~CH3 r3=—CH (CH2)3~~~NH— NH Km2 Ri=-H R2= —0—ό—F R3=-CH；

(CH2)rNH — Cf NH NH 2 R1:—H R2= 一 SCH3 R3s—CH2^^ R4=—(〇Η2)3-ΝΗ-( nh2 iH Ri=_H R2= - SCH3 巧=- CH2^^~OH *括弧中數目指示曱基在苯基基團中之位置。 23, 如申請專利範圍第14、15或22項中任一項之方法，其中該式（I)化合物為4-MTPAFYR(4-曱硫基苯基偶氮甲醯基酪胺醯基精胺酸）。 24. 如申請專利範圍第14、15或22項中任一項之方法，其特 FU= 一 (〇Η2)3-ΝΚΗ νη2 ‘NH 79256-941121.doc -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1252234 六、申請專利範圍效在於該混合物之光密度係於未添加CPA之下測量，然後於添加CPA後測量。 25·如申請專利範圍第14、15或22項中任一項之方法，其特徵在於該測量得之著色減少係與校準曲線數值比對f 26·如申請專利範圍第14、15或22項中任_項之方法，其特徵在於該試樣為血樣。〃 27·如申請專利範圍第26項之方法，其特徵在於該試樣漿。 28.如申請專利範圍第14、15或22項中任一項之方法，其特徵在於該CPA為胰CPA。 29·如申請專利範圍第14、15或22項中任一項之方法，其特徵在=該欲試驗之試樣係與活化劑緩衝液並存一段獲得欲測1活性之羧基胜肽酶U活化所需時間，然後與絲胺酸蛋白酶抑制劑接觸。 3〇·如申請專利範圍第29項之方法，其特徵在於式⑴酶基質如與活化劑綾衝液同時添加，或與絲胺酸蛋白酶抑制劑同時或緊接於其後添加。 3!•如申請專利範圍第29項之方法，其特徵在於該活化係使用凝血酶/凝血酶調理素複體方法進行。 32.如申請專利範圍第1 4、1 5或22項中任一項之方法，其中該缓基胜肽酶為一種C p u。 33 —種檢定分析—試樣之組成性cpN4Cpu以及該試樣之可活化CPN或CPU活性之方法，其特徵在於比較試樣對式⑴酶基質之水解活性，將試樣與活化劑緩衝液並存一 79256-941121.doc 本纸银尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X297公袭) 六、申請專利範圍段獲得欲測量活性後與絲胺酸蛋白酶抑二:胜二太蛛…活化所需時間後’隨申請專利範圍第14項之2 察所得水解活性與如對式蠢其= 緩㈣存在下’ ^樣對式（I)每基質之水解活性做比較。 34·2請專利範圍第32項之方法，纟特徵在於該CPU為於二:二利犯圍第29或30項中任-項之方法，其特徵在 :糸於有以及無特定TAFI抑制劑存在下處理。如申請專利範圍第29或30項中任一項於該特定侧抑制劑為cpi、:^ M之方法，其特徵在種榀疋刀析血樣之經活化凝血酶可活化二:劑（Thr-in Activatable 。二 1ί〇Γ，TAFI)之方法’該方法包含下列步驟： a)將第-份試樣與特定侧抑㈣並存，以及请專利範圍第29項之方法處理之，甲抑請專利範圍第29項之方法但於無特定TAFI 抑制劑存在下處理第二份試樣， C)測量第一份與第二份間之ΤΑΠ活性。表不试樣中經活化见如申請專利範圍第37項之方法，該方法係用於區別同一試樣之組成性tAFI活性與可活化ΤΑΠ活性，立特定位第三份試樣之水解活性係於無活化劑緩 (I)酶基質測量。于仕下對式 39. -種如申請專利範圍第U13項中任一項之式⑴化合物 -8. 79256-941i21.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A视格(21GX2^Jy 1252234 申請專利範園用t /、係用於檢定分析試樣之羧基胜肽酶n或σ之催化活性。 40。如申請專利範圍第3 9項種 CPU 〇 4L如申請專利範圍第40項酉學為TAFI。仫:種檢定分析一試樣之CPN或cpu活性之套件組，包含種色原酶基質，該酶基質係由如申請專利範圍第^至 13項中任一項之化合物組成。 43。如申請專利範圍第4 2項之套件組，其中該羧基胜肽酶為一種 C P U。 44. 一種檢定分析一生物試樣之TAFI活性之套件組，包含 -一種TAFI活化劑緩衝液； -羧基胜肽酶A ; -一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之式⑴酶基質；土 -一種TAFI抑制劑。之用途’其中該羧基胜肽酶為之用途，其特徵在於該羧基胜肽 79256-941121.doc -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)