ES2297742T3 - Sustratos peptidicos reconocidos por la toxina botulinica de tipo a, bont/a y sus usos. - Google Patents

Sustratos peptidicos reconocidos por la toxina botulinica de tipo a, bont/a y sus usos. Download PDF

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Abstract

Sustrato peptídico reconocido selectivamente por la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A, caracterizado porque comprende en su estructura peptídica un fragmento Nop-(Z)-Pya escindible por dicha toxina, y en el que Z representa una cadena de 2 a 4 aminoácidos.

Description

Sustratos peptídicos reconocidos por la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A y sus usos.
La presente invención tiene por objeto unos sustratos peptídicos reconocidos selectivamente mediante la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A, y sus usos, en particular en el ámbito de la utilización de procedimientos para detectar, identificar y/o dosificar la toxina botulínica de tipo A, o unos inhibidores y/o activadores de la actividad metalopeptidásica de dicha toxina.
La neurotoxina de tipo A (BoNT/A) pertenece a una familia de siete proteínas aparentadas (toxinas botulínicas A a G) producidas mediante diferentes cepas del bacilo anaerobio "clostridium botulinum". Las dos formas encontradas de forma más frecuente y más peligrosas son las toxinas de tipo A y B. Las dosis letales 50 en el ratón por vía intraperitoneal son de 2 pg para la toxina A y de aproximadamente 50 a 100 pg para la toxina B. Éstas actúan a nivel del sistema nervioso periférico del ser humano y de diversas especies animales, induciendo el "botulismo" caracterizado por una parálisis fláccida de los músculos del esqueleto que puede provocar la muerte.
La principal forma de intoxicación mediante estas toxinas se debe a la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas. Pero estas toxinas pueden constituir asimismo un arma biológica potencial en la medida en que son fáciles de producir. Por otra parte, desde algunos años, las toxinas botulínicas, y más particularmente la BoNT/A, se usan para aplicaciones terapéuticas (distonías, hiperactividades neuronales tales como estrabismo, blefaroespasmo, etc.) o estéticas (en particular la reducción de arrugas). Para todas estas aplicaciones, es indispensable poseer un método simple, rápido y sensible, de detección y de cuantificación de la toxina botulínica de tipo A en diversos medios, incluyendo los biológicos.
Las neurotoxinas botulínicas están constituidas por dos subunidades proteicas: una cadena pesada (100 kD) asociada a una cadena ligera (50 kD) mediante un puente disúlfuro. La cadena pesada interviene en la unión de la toxina con la terminación nerviosa, en la internalización y después en la translocación de la cadena ligera en el citosol. La cadena ligera es responsable de la toxicidad de la proteína mediante inhibición de la liberación, dependiente del calcio, de la acetilcolina.
La toxicidad de la cadena ligera de estas toxinas se debe a su actividad peptidásica. En efecto, las toxinas botulínicas pertenecen a la familia de las metalopeptidasas con zinc, y más particularmente a la sub-familia de las "zincins" que contiene la secuencia de consenso HExxH; (Schiavo et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 23479-23483; Roques B.P. (1993) Biochem. Soc. Trans. 21, 678-685).
Estas escinden de manera muy específica las proteínas neuronales implicadas en la exocitosis de los neurotransmisores, tales como la SNAP 25 y la sinaptobrevina. El sitio de escisión es específico para cada toxina incluso para un sustrato idéntico.
La toxina botulínica de tipo A escinde específicamente una de las proteínas del complejo SNARE, el SNAP-25 (secuencia SEC ID nº: 1). Esta proteína de 206 aminoácidos se escinde específicamente a nivel de la unión Q197-R198.
1 
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Anteriores trabajos han demostrado que fragmentos más cortos que esta secuencia SNAP 25 (1-106) podían ser degradados asimismo por la BoNT/A (Schmidt y Bostian, J. Prot. Chem.,1997, 16, 19-26). Es el caso del fragmento mínimo SNAP 25 (187-203): ^{187}S N K T R I D E A N R A T K M L^{203} (secuencia SEC ID nº: 2).
El enfoque más eficaz para combatir los efectos perjudiciales de la BoNT/A, durante un botulismo declarado, o bien durante contra-indicaciones terapéuticas, es el desarrollo de inhibidores selectivos y de alta afinidad para su actividad metalopeptidásica, responsable de su toxicidad. Sin embargo, la identificación de dichos inhibidores, y la determinación de su eficacia (constantes de inhibición, Ki), exigen una prueba sencilla y automatizable de medición de la actividad BoNT/A que permite un número elevado de ensayos (HTS).
Los ensayos actualmente disponibles no son satisfactorios para dichas aplicaciones.
Por otra parte, el método de detección más sensible de las toxinas botulínicas es un ensayo in vivo que se basa en la determinación de la dosis letal 50 en el ratón (DL 50) (Kautter y Salomon (1976) J. Assoc. Anal. Chem., 60, 541-545). Aunque muy sensible, puesto que permite detectar desde 5 hasta 10 pg de BoNT/A, este método adolece de numerosos inconvenientes: el tiempo de respuesta es de varios días y no parece ser el método más preciso para estimar la actividad biológica de una preparación terapéutica de toxina (Pearce et al. (1994) Tox. Applied Pharmacol., 128, 69-77). Además, la estimación de la DL50 varía muy ampliamente con la preparación de la toxina, la cepa de ratón, etc. Por último, se debe señalar que la experimentación sobre animales es cada vez más controvertida.
Se han propuesto ensayos sobre líneas celulares (De Waart et al. (1972) Zentralblatt fur Bacteriology, 222, 96-114), pero su sensibilidad es demasiado baja (1000 DL50 ratón). Se han desarrollado ensayos inmunológicos [radioinmunoensayos (Boroff y Shu-Chen, 1973, Applied Microbiol., 25, 545-549), ensayos ELISA (Hallis et al., 1993 en Botulinum and Tetanus Toxins DasGupta B.R. editores, Nueva York: Plenum Press) con sistemas de amplificación (Stanley et al., 1985, J. Immunol. and Methods, 83, 89-95)], pero ninguno es lo suficientemente sensible. Por otra parte, dan lugar a una proporción significativa de falsos positivos.
Se han desarrollado algunos ensayos, basados sobre la actividad peptidásica de la BoNT/A. Por una parte, el estudio de la escisión del SNAP 25 o de su fragmento SNAP 25(137-206) (Hallis et al. (1996) J. Clinic.Microbiol., 34, 1934-1938) inmovilizado sobre resina, seguido de la detección del metabolito fijado sobre la resina mediante un anticuerpo, y después de un sistema de amplificación, llevó a la manifestación de aproximadamente 1000 DL50 ratón/ml. Sin embargo, este método es largo y costoso.
La caracterización por Schmidt y Bostian (J. Prot. Chem. (1997), 16, 19-26) del fragmento más pequeño de SNAP 25, reconocido por la BoNT/A, (187-203) SNAP 25, llevó a la realización del primer sustrato fluorogénico de BoNT/A mediante introducción de un grupo dnp (dinitrofenilo) y DACLA (dimetil-amino-cumarinilo) en las cadenas laterales de una lisina en la posición 197 y de una cisteína en la posición 200, respectivamente (Schmidt y Stafford, Applied Environ. Microbiol. (2003), 69, 297-303). Este método permite detectar rápidamente cantidades mayores o iguales a 100 ng/ml.
Sin embargo, todos estos métodos no poseen la sensibilidad, la reproducibilidad, la fiabilidad y la facilidad de uso requeridos para detectar y cuantificar las dosis de BoNT/A nativa menores o iguales a 1 ng/ml, siendo la concentración correspondiente a la dosis letal para un ser humano de 70 kg del orden de 1 \mug. Esto implica detectar dosis inferiores a 5 ng en un pequeño volumen de medio infectado mediante la BoNT/A, en caso de ingestión.
La presente invención tiene precisamente por objetivo proponer un nuevo ensayo de detección y de cuantificación de la BoNT/A que permite responder a estos imperativos.
El método elegido para la dosificación de la BoNT/A en el ámbito de la presente invención se basa en el fenómeno de extinción de fluorescencia por colisión entre un fluoróforo (L.pirenil-alanina, Pya) y un elemento muy polar (L.p-nitro-fenilalanina, NOP) (sustrato con fluorescencia reprimida según un mecanismo de represión por colisión; patente FR 0004507). Al contrario que la FRET (fluorescencia por transferencia de energía), no existe ningún recubrimiento del espectro de emisión de fluorescencia del resto L-Pya y del espectro de absorción de L-NOP. La pirenilalanina Pya presenta una fluorescencia muy importante que se apaga casi totalmente cuando se dispone Pya en una cadena peptídico en la proximidad del resto Nop. En consecuencia, la fluorescencia de Pya puede manifestarse sólo a partir del momento en el que se escinde la secuencia peptídico situada entre Pya y Nop.
La extinción de fluorescencia de Pya en presencia de NOP se debe al establecimiento durante la excitación por irradiación de un nuevo estado excitado diferente del de Pya en ausencia de NOP. El nuevo estado se desactiva muy fácil y rápidamente mediante conversión interna de la energía, y eso sin emisión ninguna (proceso no radioactivo).
Por lo tanto, el método elegido en el marco de la presente invención se distingue muy claramente del usado en el FRET. En este último caso, tal como se indica anteriormente, el recubrimiento de los espectros de absorción del aceptor (quencher) y de emisión del donante (fluoróforo) crea un nuevo estado de excitación diferente de aquel creado en ausencia del receptor. Este estado se desactiva muy fácilmente mediante conversión interna de la energía, y eso sin emisión (proceso no radioactivo). El aspecto teórico de estos métodos se relatan en: Yaron et al., Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979) y Lakowicz J.R., Principles of fluorescence spectroscopy, 2ª ed., Ed. KA.PP.
En los dos métodos, la extinción de fluorescencia depende de la distancia entre los dos fluoróforos. La eficacia de los dos procedimientos se puede estudiar experimentalmente en ejemplos precisos en los que las configuraciones (distancias entre las dos parejas) son óptimas. Es el caso de las siguientes moléculas en las que las entidades implicadas se han introducido una al lado de la otra.
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FRET
2
La hidrólisis enzimática de la unión CONH dispersa teóricamente al infinito las dos parejas DABCYL y EDANS. El aumento de fluorescencia observado de EDANS en este caso es del orden de 200 UA (unidad arbitraria) [G.T. Wang et al., Tet. Lett. 31, (1990)].
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Complejo de colisión
3
El aumento de fluorescencia de Pya durante la escisión enzimática de la unión peptídica CONH lleva a una exaltación de fluorescencia de 800 UA. [N. Luciani et al., Biochem. J. 356 (2001); Patente Fr 00.04507, PCT/FR01/01058].
Esta mejor exaltación de fluorescencia observada con el uso del complejo de colisión Pya/Nop, está en el origen de la elección por parte de los inventores de los pares Pya-Nop o Nop-Pya, y no de FRET.
Los inventores han descrito anteriormente un sustrato muy específico de la toxina botulínica de tipo B en el que se han introducido restos Pya y Nop en las posiciones 74 y 77 respectivamente del fragmento 60-94 de la sinaptobrevina, sustrato natural mínimo de la BoNT/B (Patente FR 0007113; C. Anne et al. Analytical Biochem. (2001), 291, Z53-261).
En el caso de la BoNT/A, el sustrato natural es SNAP 25, y la secuencia mínima de SNAP 25 escindida por la BoNT/A es el fragmento (187-203) SNAP 25 (Schmidt y Bostian, supra) que corresponde a la fórmula (187-203)SNAP 25 = ^{187}S-N-K-C-R-I-D-E-A-N-Q^{197}R-A-T-K-M-L^{203} (SEC ID nº : 2) indicada anteriormente.
La escisión de este péptido, o del péptido sustrato natural SNAP 25, por la BoNT/A, se realiza a nivel de la unión Q^{197}-R^{198}.
De la misma manera que se efectuó en el caso de la determinación de la BoNT/B con un fragmento de sinaptobrevina, los inventores han introducido a ambos lados del sitio de escisión del SNAP 25 por la toxina botulínica de tipo A, un resto Pya en posición 195, 196 ó 197, y un resto Nop en posición 199, 200 ó 201 de estos diferentes fragmentos de SNAP 25.
De manera inesperada, estas modificaciones llevaron a la formación de péptidos que no son, o que son poco, sustratos de la BoNT/A. Así, sólo el péptido Pya^{197}Nop^{200}(187-203)SNAP 25 está débilmente escindido por la toxina BoNT/A a una concentración elevada (200 ng/ml), con sólo una duplicación de la fluorescencia de base en aproximadamente 1 h (Fig. 1).
Este resultado sugiere por lo tanto diferencias importantes en la estructura del sitio activo de las dos toxinas botulínicas A y B, así como en su modo de acción.
Por el contrario, de manera sorprendente, la sustitución de la secuencia Pya-(Z)-Nop por la secuencia inversa Nop-(Z)-Pya, representando Z una cadena de aminoácidos elegido de manera que esta secuencia pudiese ser escindida por la BoNT/A, ha permitido obtener excelentes sustratos de BoNT/A, cuya sensibilidad es hasta 100 veces superior a la de los sustratos escindidos por la BoNT/A y que contiene la secuencia Pya-(Z)-Nop.
La presente invención se basa por lo tanto en el hecho de que es posible detectar una fluorescencia intensa provocada por la separación de los restos Nop y Pya integrados en un sustrato de la BoNT/A durante la escisión enzimática por esta neurotoxina de una de las uniones situadas entre estos restos, con la condición de que el resto Nop se encuentre en el metabolito N-terminal y que el resto Pya se encuentre en el metabolito C-terminal. La figura 2a ilustra este fenómeno.
Así, la presente invención tiene principalmente como objetivo suministrar un sustrato peptídico reconocido por BoNT/A, usable en el ámbito de la realización de procedimientos para detectar, identificar y/o dosificar la toxina botulínica de tipo A a concentraciones muy débiles (del orden de 20 pg), o inhibidores y/o activadores de la actividad metalopeptidásica de dicha toxina y, en este último caso, para cuantificar su potencia.
Un primer aspecto de la invención se refiere por lo tanto a un sustrato peptídico, reconocido selectivamente por la toxina BoNT/A, caracterizado porque comprende en su estructura peptídica un fragmento Nop-(Z)-Pya en el que Z representa una cadena de aminoácidos, siendo dicho fragmento escindido por dicha toxina.
Ventajosamente, Z representa de 2 a 4 aminoácidos elegidos de tal forma que el fragmento Nop-(Z)-Pya mencionado anteriormente esté escindido por la BoNT/A.
Ventajosamente, con el fin de preservar la especificidad y la eficacia de la BoNT/A, los aminoácidos de los sustratos de la invención se eligen entre los de la secuencia natural del SNAP 25.
Todavía más ventajosamente, Z contiene los restos arginina R en la posición 198 y A en la posición 100 de SNAP 25 (Fig. 2a).
Preferentemente, el fragmento Nop-(Z)-Pya de los sustratos de la invención se selecciona de entre los siguientes:
4
Según un modo de realización preferido de la invención, el resto (Z) comprende 2 aminoácidos. Preferentemente, la secuencia Nop-(Z)-Pya corresponde a la definición: Nop-R-A-Pya (SEC ID nº: 3).
Para eso, la invención tiene más particularmente por objeto un sustrato peptídico, reconocido por la toxina BoNT/A, caracterizado porque comprende, o está constituido por la siguiente secuencia:
5
en la que
-
X representa un aminoácido, o una cadena de 2 a 52 aminoácidos,
-
M, n y p, representan independientemente uno del otro 0 ó 1,
-
Xaa representa E o Q,
es decir cualquier sustrato tal como se han definido anteriormente que comprende, o que está constituido por la secuencia (187-206)SNAP 25 en la que:
-
el resto Q en la posición 197 se sustituye por un resto Nop, y el resto T en la posición 200 se sustituye por un resto Pya; la escisión por la BoNT/A de una unión peptídica situada entre estos dos aminoácidos Nop y Pya conduce a la exaltación de fluorescencia en la que se basa la invención,
-
el resto M en la posición 202 se sustituye por un resto isóstero tal como Nle, y
-
cuando sea apropiado:
\bullet el resto E en la posición 194 se sustituye por un resto Q, y/o
\bullet se suprime el resto L en la posición 203 se suprime, y/o
\bullet se suprimen los restos GSG en las posiciones 204 y 206.
Ventajosamente, se protegen los restos N-terminal y C-terminal de los sustratos descritos anteriormente y a continuación de la invención en particular mediante acetilación y amidificación respectivamente, con el fin de evitar cualquier degradación no específica mediante aminopeptidasas y/o carboxipeptidasas (por ejemplo durante el uso de toxinas purificadas de forma incompleta).
La invención tiene más particularmente por objeto un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque cuando m representa 1, X representa:
-
un resto arginina o un resto cisteína cuya función tiol es, cuando sea apropiado, inmovilizado sobre un soporte sólido, o
-
una cadena de 2 a 52 aminoácidos, que corresponde a un fragmento peptídico de la proteína SNAP 25 (SEC ID nº: 1) cuyo aminoácido C-terminal corresponde al aminoácido situado en la posición 186 de la secuencia de la proteína SNAP 25, y el aminoácido N-terminal que corresponde a uno de los aminoácidos situados en la posición 135 a 185 de la secuencia de la proteína SNAP 25, siendo uno o varios de los aminoácidos mencionados anteriormente, cuando sea apropiado, sustituidos por un aminoácido seleccionado de entre: A, S, E, F, L, Nle.
La invención se refiere más particularmente a un sustrato peptídico, reconocido por la toxina BoNT/A, caracterizado por la siguiente secuencia:
6
en la que
-
n = 0 ó 1,
-
m = 0 ó 1,
-
X = D o C,
-
Xaal representa E o Q,
-
Y, cuando m = 1 y X = C, cuando sea apropiado, la función tiol del resto cisterna se inmoviliza sobre un soporte sólido, por ejemplo con la ayuda de un resto maleimida.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene más particularmente por objeto los sustratos tales como los definidos anteriormente que comprende la secuencia (187-203)SNAP 25 mencionada anteriormente, en la que:
-
el resto Q en la posición 197 se sustituye por un resto Nop, y el resto T en la posición 200 se sustituye por un resto Pya,
-
el resto M en la posición 202 se sustituye por un resto Nle,
-
el resto N-terminal S en la posición 187 se acetila, o se protege mediante un resto acetilcisteína, y
-
se amidifica el resto C-terminal en la posición 203,
es decir, las secuencias S1 y S2 siguientes:
7
La invención tiene más particularmente por objeto sustratos tales como se han definido anteriormente, que corresponden a una variante de las secuencias S1 y S2, en la que el resto E194 se sustituye por un resto glutamina Q, es decir las secuencias S3 y S4 siguientes:
8
La invención tiene más particularmente por objeto unos sustratos tales como se han definido anteriormente, que corresponden a una variante de las secuencias S3 y S4, en la que se suprime la leucina N-terminal en la posición 203, es decir, las secuencias S5 y S6 siguientes:
9
La invención tiene asimismo por objeto un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia SEA ID nº: 6 mencionada anteriormente, en la que Xaa, n y p son tales como se han definido anteriromente, m = 1, y X representa una cadena de aminoácidos que corresponde a la secuencia KAD de SNAP 25 (184-186), o su secuencia derivada KSD.
Para eso, la invención tiene más particularmente por objeto un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia S7 (SEC ID nº: 14) siguiente:
10
La velocidad de la reacción enzimática de la BoNT/A en estos sustratos depende extremadamente de la longitud del sustrato (V. V. Vaidyanathan et al. J. Neuro. Chem.,1999, 72, 327-337) probablemente debido a la estructura de la subunidad enzimática de la BoNT/A (Segelke et al. Proc. Natl Acad. Sci USA, 101, 6888-6893, 2004) y a un mecanismo de tipo alostérico (Breidenbach et al. Nature, 432, 925-929, 2004), con existencia de exositios, similar al demostrado por los inventores para la toxina tetánica (Cornille et al. J. Biol. Chem., 272, 3459-3464, 1997).
Estos resultados demuestran que la parte indispensable de SNAP 25 está constituida por el fragmento C-terminal SNAP 25 (187-203), pero que la afinidad máxima para la toxina se da por la secuencia que precede al resto 187 del SNAP 25 siempre que contenga las secuencias que se fijan a los exositios, en particular las secuencias 156-186 ó 146-186.
Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto sustratos preferidos de toxina butolínica de tipo A capaces de ser hidrolizados muy rápidamente, permitiendo eso detectar esta toxina a concentraciones iguales o inferiores a la dosis letal en el ser humano (del orden de 1 \mug/70 kg). En efecto, las aplicaciones de la invención se deben particularmente a la detección y eventualmente a la cuantificación de la BoNT/A en el agua, los diferentes productos alimentarios y el aire que estarían infectados, en particular en caso de bioterrorismo. La segunda aplicación importante es la determinación muy precisa de las concentraciones de BoNT/A en productos farmacéuticos usados para diferentes aplicaciones médicas y estéticas (Schantz y Johnson Microbiol. Rev., 1992, 56, 80-99). En este último caso, la técnica reivindicada permite efectivamente determinar cuantitativamente una concentración del orden de 10 DL 50 ratón, es decir aproximadamente 20 pg. Concentraciones tan bajas se deben determinar obligatoriamente en las especialidades farmacéuticas de manera que se sustituyan todos los métodos in vitro e in vivo que existen hoy en día.
Para eso, la invención tiene más particularmente por objeto un sustrato peptídico reconocido selectivamente por la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A, caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia SEC ID nº: 6 mencionada anteriormente, en la que Xaa, n y p son tales como se han definido anteriormente, m = 1, y X representa una cadena de al menos 30 aminoácidos.
La invención se refiere más particularmente a un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque X representa una cadena de al menos 30 aminoácidos, que corresponde a un fragmento peptídico de la proteína SNAP 25, cuyo aminoácido C-terminal corresponde al aminoácido situado en la posición 186 de la secuencia de la proteína SNAP 25, y el aminoácido N-terminal corresponde a uno de los aminoácidos situados en la posición 135 a 156 de la secuencia de la proteína SNAP 25 (SEC ID nº: 1), siendo uno o varios de los aminoácidos mencionados anteriormente, cuando sea apropiado, sustituidos con un aminoácido seleccionado de entre: A, S, E, F, L, Nle.
La invención tiene más particularmente por objeto un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque X representa una cadena de aminoácidos que corresponde:
-
a la secuencia SNAP 25 (135-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
100
-
a la secuencia SNAP 25 (141-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
101
-
a la secuencia SNAP 25 (146-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
102
-
a la secuencia SNAP 25 (156-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
103
en las que Xaa1, Xaa2, Xaa3 y Xaa4, representan, independientemente unas de otras, M o Nle.
La invención se refiere más particularmente a un sustrato tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque comprende, o está constituido por una de las siguientes secuencias:
-
S8: SEC ID nº: 19:
104
-
S9: SEC ID nº: 20:
105
-
S10: SEC ID nº: 21:
106
Un sustrato tal como se ha definido anteriormente particularmente preferido según la invención es el caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia S9: SEC ID nº: 20 siguiente:
107
Los parámetros (Km, Kcat, Vmax) de la hidrólisis de S9 (véase la figura 9) demuestran ser mejores que los indicados para SNAP 25 en sí, y otros sustratos indicados hasta la fecha.
La invención se refiere asimismo a los fragmentos, o metabolitos, no fluorescentes y fluorescentes que proceden de la escisión (figura 1a) de los sustratos peptídicos de la invención mediante BoNT/A, estando los metabolitos no fluorescentes caracterizados porque comprenden el resto Nop, y estando los metabolitos fluorescentes caracterizados porque comprenden el resto Pya.
La invención tiene más particularmente por objeto los metabolitos fluorescentes mencionados anteriormente que proceden de la escisión de los sustratos peptídicos de la invención mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R, es decir, los metabolitos de fórmula:
11
en la que n y p son tal como se han definido anteriormente,
y más particularmente:
-
el metabolito M1 fluorescente siguiente, que procede en particular de la escisión de los sustratos S1, S2, S3, S4, S8, S9 y S10 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
12
-
el metabolito M2 fluorescente siguiente, que procede en particular de la escisión de los sustratos S5 y S6 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
13
-
el metabolito M3 fluorescente siguiente, que procede en particular de la escisión del sustrato S7 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
14
Los sustratos según la presente invención son interesantes por varias razones:
-
permiten detectar rápidamente en el seno de un líquido o de una sustancia la presencia eventual de la toxina botulínica de tipo A, a concentraciones inferiores a la dosis letal en el ser humano,
-
presentan una selectividad muy alta frente a otras toxinas botulínicas, y otras peptidasas,
-
hacen posible la detección sistemática de alto caudal de inhibidores potenciales de la toxina botulínica de tipo A,
-
dan lugar solamente a dos metabolitos debido al corte selectivo de la unión Nop-R mediante BoNT/A.
En consecuencia, la presente invención se refiere al uso de un sustrato tal como se ha definido anteriormente, para la realización de procedimientos de detección, de identificación y/o de dosificación de la BoNT/A o de un compuesto capaz de inhibir o de activar la BoNT/A, y para la realización de métodos de diagnóstico in vitro de la presencia de la BoNT/A en una muestra que procede de diversos medios tales como agua, aire, leche, bebidas, alimentos, y medios biológicos tales como sangre, orina, y el líquido cefalorraquídeo, así como para la determinación precisa de las concentraciones de la BoNT/A durante la preparación, la purificación, y el acondicionamiento de composiciones farmacéuticas para fines de uso terapéutico en el ser humano o en el animal (en particular en el ámbito de patologías neurológicas), o de composiciones cosméticas.
Según una variante preferida de la invención, los sustratos se usan para buscar inhibidores de la BoNT/A, y cuantificar su poder de inhibición.
La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento para detectar, identificar y/o dosificar un compuesto capaz de inhibir la BoNT/A, caracterizado porque comprende:
-
poner en presencia una disolución de un sustrato según la invención con dicha BoNT/A o su cadena ligera (tales como se describen en particular en Cai y Singh, Biochemistry (2001) 40, 4693-4702), y al menos un compuesto susceptible de inhibir la BoNT/A;
-
medir la fluorescencia, emitida por los metabolitos fluorescentes mencionados anteriormente formados durante la etapa anterior de hidrólisis del sustrato, en presencia y/o en ausencia de dicho compuesto, indicando entonces una disminución de fluorescencia entre la medición efectuada en presencia de este compuesto y la medición efectuada en ausencia de este compuesto, que el compuesto ensayado es inhibidor de BoNT/A.
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La adición de dosis crecientes de un compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática de la BoNT/A frente a un sustrato según la presente invención, se traduce en una disminución de la intensidad de la fluorescencia debido a la disminución de la cantidad de metabolito formado por la BoNT/A. La medición de esta intensidad reflejada en una curva patrón establecida mediante mezclado del sustrato y del metabolito fluorescente formado, permite, por lo tanto, evaluar el poder de inhibición en porcentaje de inhibición a una concentración dada fija del compuesto inhibidor, o bien determinar precisamente su IC50, y después su Ki con la ayuda del Km del sustrato y de varias concentraciones del producto de inhibición.
Un compuesto al que se aplica el ensayo definido anteriormente para determinar su actividad inhibidora frente a la BoNT/A puede ser de diversas naturaleza, sin limitación, y puede presentarse en forma aislada, ser conocido o desconocido y/o estar presente en un banco de compuestos, un extracto biológico.
La extrema sensibilidad de la dosificación permite operar en volúmenes muy débiles (50 ó 100 \mul) a concentraciones del orden de 5 a 50 \muM del sustrato elegido (en particular S5, S8 y S9). El ensayo, por lo tanto, se puede utilizar en placas de 96 pocillos o más, permitiendo su robotización con determinación automática de los Ki cuando el fluorímetro de lectura está conectado a un ordenador que posee un programa comercial apropiado.
La presente invención propone por lo tanto un ensayo de identificación de inhibidores de la BoNT/A, así como la determinación de sus poderes de inhibición mediante un ensayo fluorimétrico muy rápido, reproducible y que permite realizar ensayos robotizables y muy numerosos que pueden adaptarse a una selección de alto caudal de moléculas inhibidoras.
La presente invención propone asimismo la producción de nuevos productos industriales, que se pueden usar eventualmente en forma de kits, que comprenden en particular placas de 96, 192 y 384 pocillos listo para usar, y que contienen un sustrato tal como se define anteriormente según la invención, y los agentes reactivos necesarios para la determinación de los poderes de inhibición o activadores de la BoNT/A. Además, la presente invención propone kits que comprenden comprimidos que contienen juntos uno de los sustratos de la invención (en particular S9), y los agentes reactivos necesarios para el desarrollo de la reacción enzimática, y, por lo tanto, para la aparición de una fluorescencia intensa en caso de adición de agua o de una sustancia que contiene la BoNT/A. En este caso, ventajosamente los kits de la invención comprenden asimismo un fluorímetro, cuya longitud de onda está preferentemente comprendida entre 360 y 420 nm, y la longitud de onda de excitación está comprendida entre 320 y 350 nm, así como los agentes reactivos EDTA y/o gangliósidos separados o asociados, y cualquier sustancia capaz de inhibir las enzimas diferentes de la BoNT/A sin afectar a la actividad de esta última.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de la presencia de la BoNT/A en una muestra tal como se ha definido anteriormente, o de medición de las concentraciones de la BoNT/A durante las etapas de fabricación, purificación y acondicionamiento de las composiciones farmacéuticas o cosméticas en una muestra extraída durante estas etapas.
La invención se refiere asimismo a un método de diagnóstico in vitro de la presencia de la BoNT/A en el organismo humano o animal, que usa un sustrato según la invención.
\newpage
Dichos métodos de diagnóstico o de medición comprenden:
-
una etapa de puesta en presencia en disolución de un sustrato según la invención con una muestra tal como se ha definido anteriormente (por ejemplo extracciones efectuadas sobre alimentos, líquidos, o extracciones sanguíneas humanas, eventualmente contaminadas mediante la BoNT/A);
-
la medición de la fluorescencia emitida por los eventuales metabolitos fluorescentes mencionados anteriormente formados durante la etapa anterior, demostrando la presencia de BoNT/A en dicha muestra, que se puede cuantificar con la ayuda de curvas patrón apropiadas (véanse las figura anexas),
-
cuando sea apropiado y con el objetivo de apartar respuestas falsamente positivas, la eliminación de la fluorescencia emitida durante la etapa mencionada anteriormente, mediante adición de un quelante de zinc, como por ejemplo, y de manera no limitativa, el tetracetato de etilendiamina EDTA que inhibe la actividad metaloproteásica de la BoNT/A (figura 3), o mediante adición de gangliósidos, que bloquean está última mediante formación de un complejo inactivo.
Las figuras y los ejemplos adjuntos se representan a título ilustrativo y no limitativo de la presente invención.
Figuras
- Figura 1: Diferencia de exaltación de fluorescencia durante la escisión mediante BoNT/A del sustrato 1 (péptido 1), Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-AN- Pya -R-A- Nop -K-Nle-L-NH_{2} (\sqbullet, gráfica inferior) y 2 (péptido 2), Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N- Nop -R-A- Pya -K-Nle-L-NH_{2} (\blacklozenge, curva superior). En abscisas se representa el tiempo en minutos, y en ordenadas la fluorescencia (U.A.).
- Figura 2:
a)
Esquema de la escisión de los sustratos según la invención mediante BoNT/A.
b)
Comparación de la emisión de fluorescencia del sustrato S1 (10^{-5}M) y su metabolito M1 (a 5 10^{-7}M que corresponde a 5% de degradación). Excitación a 343 nm. En abscisas se indica la longitud de onda en nm, y en ordenadas la intensidad emitida.
- Figura 3: Curva de calibrado de la fluorescencia para la determinación de los % de sustrato degradado durante una dosificación.
- Figura 4: Fluorescencia emitida por la degradación del sustrato S1 (50 \muM) en 1 h mediante la BoNT/A, e inhibición de la fluorescencia (por lo tanto de la actividad enzimática por el EDTA).
- Figura 5: Ensayo fluorimétrico de cuantificación de la BoNT/A con el sustrato S9. Las concentraciones se expresan en LD 50 ratones, es decir 1 DL 50 = 2 pg. En abscisas se indica el tiempo en minutos, y en ordenadas la fluorescencia (U.A.).
- Figura 6: Relación lineal entre la exaltación de fluorescencia (en ordenadas, U.A.) y la concentración de BoNT/A (en abscisas, en DL50) con un tiempo determinado con el sustrato S9.
- Figura 7: Emisión de fluorescencia del sustrato S9 y su metabolito M1 que corresponde a 2,5% de degradación; excitación a 343 nm. En abscisas se indica la longitud de onda en nm, en ordenadas la fluorescencia en U.A.
- Figura 8: Parámetros analíticos de S9.
- Figura 9: Parámetros cinéticos de la degradación de S9 mediante la BoNT/A. El Km y las constantes catalíticas se revelan más favorables que para el SNAP 25. En abscisas se indica la concentración PL50 en \muM, y en ordenadas la velocidad de escisión (en pmol/min/\mug). Inserción: relación velocidad/concentración del sustrato en pml/min/\mug de enzima/\muM de sustrato en abscisas, y velocidad en pmol/min/\mug en ordenadas.
Ejemplos 1) Síntesis de los péptidos
Los compuestos reivindicados se pueden obtener mediante los métodos habituales de la síntesis en fase sólida según el método de Merrifield sobre un sintetizador automático como, por ejemplo, el aparato 431A de Applied Biosystems. La química usada corresponde a la tecnología Fmoc. La desprotección de las cadenas laterales y la escisión de la peptidilresina se efectúan mediante el ácido trifluoroacético, tal como se describe por E. Atherton y R.C. Sheppard (1989) en "Solid phase peptides synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford". Las uniones se efectúan según las técnicas convencionales con la ayuda de agentes de unión como HATU, Bop, PyBrop y usando preferentemente la diciclohexilcarbodiimida (DCC) en presencia de hidroxibenzotriazol (HOBT). Se pueden encontrar detalles sobre las técnicas usadas en las publicaciones que relatan la síntesis de péptidos muy grandes efectuadas por los inventores (Cornille F. et al., J. Pept. Res., 1999, 54, 427-435; Cornille F. et al., Nucleic Ac. Res., 1998, 26, 2143-2149; Cornille F. et al.,
Int. J. Pept. Rot. Res., 1990, 36, 551-558; de Rocquigny H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 6472-6476).
La L-pirenilalanina se obtiene según un procedimiento de síntesis asimétrica descrita en la publicación de Soleilhac et al. (Anal. Biochem., 1996, 241, 120-127).
Los péptidos se purifican mediante HPLC semi-preparativa. La pureza de los péptidos se estima superior a 95% mediante HPLC en fase inversa, y su identificación se obtiene mediante espectrometría de masas.
108
2) Características físico-químicas del sustrato S9 Análisis de los aminoácidos
109
pNO_{2}-Phe se detectó pero no se cuantificó. Nle coeluyó con Leu. Existe una hidrólisis incompleta entre Ile-Ile. Met está parcialmente destruido durante la hidrólisis (véase asimismo HPLC de S9, figura 8).
3) Ensayo fluorimétrico de detección de la BoNT/A
Se incuban 50 \muM de sustrato (por ejemplo S1) durante 1h con una cantidad desconocida de BoNT/A de doble cadena a 37ºC en 100 ml de tampón Hepes 20 mM, pH 7,4, que contiene BSA (1 mg/ml), ZnSO4 (0,3 mM) y DTT (5 mM). Se detiene la hidrólisis enzimática dispondiendo la muestra a 4ºC, o añadiendo 5 \mul de HCl 2N, y se lee directamente la fluorescencia emitida con el fluorímetro (\lambdaex 343 nm, \lambdaem 377 nm).
La intensidad de fluorescencia medida se reporta a una curva patrón para establecer la cantidad de BoNT/A presente en la muestra. Los experimentos efectuados con varias cantidades de BoNT/A muestran que la precisión alcanza \pm10% de la cantidad de neurotoxina en el intervalo comprendido entre 0,2 ng/ml y 15 ng/ml (véase la figura 5).
4) Ensayo fluorimétrico de detección de la BoNT/A con el sustrato S9 (figura 5)
Se incuban 10 \muM de sustrato S9 en función del tiempo con diferentes concentraciones de BoNT/A de doble cadena (1 DL50 = 2 pg) a 37ºC en 100 \mul de tampón de Hepes 20 mM, pH 7,4, que contiene BSA (1 mg/ml), ZnSO_{4} (0,3 mM) y DTT (5 mM). Se lee directamente la fluorescencia emitida con un aparato citofluor (\lambdaex 340 nm, \lambdaem 400 nm). Su aumento con relación al control está directamente relacionado con la concentración de BoNT/A en cada tiempo. Esto permite por lo tanto determinar en una muestra de concentración en BoNT/a desconocida la cantidad de toxina (véase la figura 6). Con S9 se puede cuantificar una concentración de BoNT/A de 0,2 ng/ml.
Estos experimentos se pueden realizar con diferentes tipos de fluorímeto y volúmenes de muestras variables, por ejemplo de 50 \mul a 2 ml.
5) Determinación del sitio de escisión de S9 (10 \muM) mediante BoNT/A (50 ng/100 \mul)
El análisis se efectuó en paralelo mediante LC-MS (Kromasil C18 CH_{3}CN/H_{20} (0,5% TFA) gradiente 10% CH_{3}CN a 90% durante 60 min; electropulverizador de masas en LCD Avantage Thermo Finnigan) y HPLC (Kromasil C18 CH_{3}CN/H_{20} (0,5% TFA) gradiente 10% CH_{3}CN a 90% durante 30 min.
Se detecta el metabolito fluorescente M1 con un m/z = 870,1 que corresponde a M+H.
110
Se detectó el metabolito no fluorescente M3 con m/z = 4975,0 que corresponde a (M+H)
111
Se verificó asimismo mediante HPLC (coinfección con los metabolitos sintetizados) que sólo existen dos metabolitos formados.
6) Comparación de la fluorescencia inducida por acción de la toxina botulínica de tipo A sobre los sustratos con fluorescencia reprimida siguientes (Figura 1)
112
El experimento (véase la figura 1) muestra la clara superioridad de la disposición Nop-Z-Pya con relación a Pya-Z-Nop. Este último da una variación de fluorescencia demasiado débil para responder a las exigencias de la presente patente (dosificación precisa de BoNT/A en las preparaciones farmacéuticas, detección de dosis muy bajas de BoNT/A susceptibles de generar efectos tóxicos en el ser humano en diversas preparaciones, en particular el agua.
<110> PHARMALEADS
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<120> SUSTRATO PEPTÍDICO RECONOCIDO POR LA TOXINA BOTULÍNICA DE TIPO A, BONT/A Y SU USO PARA DETECTAR Y/O DOSIFICAR DICHA TOXINA O INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD
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<130> BOTA
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<160> 27
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 206
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
15 
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<210> 2
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Péptido derivado de SNAP 25
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<400> 2
16 
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<210> 3
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido derivado de SNAP 25
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (4)..(4)
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<223> L-prenilalanina (Pya)
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<400> 3
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\sa{Xaa Arg Ala Xaa}
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<210> 4
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido derivado de SNAP 25
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (5)..(5)
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<223> L-prenilalanina (Pya)
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<400> 4
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\sa{Xaa Arg Ala Thr Xaa}
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<210> 5
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido derivado de SNAP 25
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (6)..(6)
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<223> L-prenilalanina (Pya)
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<400> 5
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\sa{Xaa Arg Ala Thr Lys Xaa}
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<210> 6
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido derivado de SNAP 25
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(1)
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<223> Un aminoácido acetilado o una cadena de 2 a 52 aminoácidos acetilados en el lado N-terminal, o ningún aminoácido
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (2)..(2)
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<223> Ser o Ser acetilado, si no hay ningún aminoácido en el lado N-terminal
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (9)..(9)
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<223> Glu o Gln
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (12)..(12)
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<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (15)..(15)
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<223> L-prenilalanina (Pya)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle o Nle amidificado si no hay ningún aminoácido en la siguiente posición
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina o L-leucina amidificada si no hay ningún aminoácido en la posición siguiente, o si no hay ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly-Ser-Gly amidificado o ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia derivada de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-aspartato acetilado o L-cisteína acetilada, o ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina o L-serina acetilada si no hay ningún aminoácido en la posición anterior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glu o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle o Nle amidificado sino hay ningún aminoácido en la posición 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada o ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina protegida por un resto Acetilcisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
115 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
116 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina protegida por un resto acetilcisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina (Nle) amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina protegida por un resto acetilcisteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenialanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-lisina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-glicina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP2S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Met o Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-arginina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (69)..(69)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-isoleucina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-isoleucina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle o Nle amidificada si no hay ningún aminoácido en la siguiente posición
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Leu amidificada si no hay ningún aminoácido en la siguiente posición o si no hay ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly-Ser-Gly amidificada o ningún aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Xaa Lys Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina (Nle) amidificada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Xaa Lys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glicina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Xaa Lys Xaa Leu Gly Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-isoleucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido derivado de SNAP 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-serina acetilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-prenilalanina (Pya)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-(paranitro)fenilalanina (Nop)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Nle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-leucina amidificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
27

Claims (19)

1. Sustrato peptídico reconocido selectivamente por la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A, caracterizado porque comprende en su estructura peptídica un fragmento Nop-(Z)-Pya escindible por dicha toxina, y en el que Z representa una cadena de 2 a 4 aminoácidos.
2. Sustrato según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento Nop-(Z)-Pya se elige entre los siguientes:
28
3. Sustrato según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el fragmento Nop-(Z)-Pya corresponde a la secuencia Nop-R-A-Pya (SEC ID nº: 3).
4. Sustrato peptídico según una de las reivindicaciones 1 a 3, reconocido selectivamente por la toxina botulínica de tipo A, BoNT/A, caracterizado porque comprende, o está constituido por la siguiente secuencia:
29
en la que:
-
X representa un aminoácido o una cadena de 2 a 52 aminoácidos,
-
M, n y p representan, independientemente unos de otros, 0 ó 1,
-
Xaa representa E o Q.
5. Sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque cuando m representa 1, X representa:
-
un resto arginina o un resto cisteína cuya función tiol es, cuando sea apropiado, inmovilizado sobre un soporte sólido,
-
o una cadena de 2 a 52 aminoácidos, que corresponde a un fragmento peptídico de la proteína SNAP 25 cuyo aminoácido C-terminal corresponde al aminoácido situado en la posición 186 de la secuencia de la proteína SNAP 25, y el aminoácido N-terminal que corresponde a uno de los aminoácidos en la posición 135 a 185 de la secuencia de la proteína SNAP 25, siendo uno o varios de los aminoácidos mencionados anteriormente, cuando sea apropiado, sustituido por un aminoácido seleccionado de entre: A, S, E, F, L, Nle.
6. Sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende, o está constituido por las secuencias S1 a S6 siguientes:
30
7. Sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque X representa una cadena de aminoácidos que corresponde a la secuencia KAD de SNAP 25 (184-186), o su secuencia derivada KSD.
8. Sustrato según la reivindicación 5, caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia S7 (SEC ID nº: 14):
\vskip1.000000\baselineskip
S7: A c K S D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L G S G NH_{2} 
\hskip3cm
(SEC ID nº: 14).
\vskip1.000000\baselineskip
9. Sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque X represente una cadena de aminoácidos de la menos 30 aminoácidos.
10. Sustrato según la reivindicación 9, caracterizado porque X representa una cadena de aminoácidos que corresponde:
-
a la secuencia SNAP 25 (135-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
120 
\vskip1.000000\baselineskip
-
a la secuencia SNAP 25 (141-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
121 
\vskip1.000000\baselineskip
-
a la secuencia SNAP 25 (146-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
122 
\vskip1.000000\baselineskip
-
o a la secuencia SNAP 25 (156-186), o sus secuencias derivadas siguientes:
123
124
en las que Xaa1, Xaa2, Xaa3 y Xaa4, representan, independientemente unas de otras, M o Nle.
11. Sustrato según las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque comprende, o está constituido por una de las secuencias S8 a S10 siguientes:
-
S8: SEC ID nº: 19:
125
-
S9: SEC ID nº: 20:
126
-
S10: SEC ID nº: 21:
127
12. Sustrato según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque comprende, o está constituido por la secuencia S9 (SEC ID nº: 20) siguiente:
128
13. Metabolitos no fluorescentes y fluorescentes que proceden de la escisión de los sustratos peptídicos definidos en una de las reivindicaciones 1 a 12, mediante la BoNT/A, estando los metabolitos no fluorescentes caracterizados porque comprenden el resto Nop, y estando los metabolitos fluorescentes caracterizados porque comprenden el resto Pya.
14. Metabolitos fluorescentes según la reivindicación 13, que proceden de la escisión de los sustratos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, mediante la BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R, es decir los metabolitos de fórmula:
31
en la que n y p son tal como se han definido en la reivindicación 5.
15. Metabolitos fluorescentes según la reivindicación 13 ó 14, siguientes:
-
el metabolito M1 fluorescente siguiente, que procede de la escisión de los sustratos S1, S2, S3, S4 y S8 a S10 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
32 
\vskip1.000000\baselineskip
-
el metabolito M2 fluorescente siguiente, que procede de la escisión de los sustratos S5 y S6 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
33 
\vskip1.000000\baselineskip
-
el metabolito M3 fluorescente siguiente, que procede de la escisión del sustrato S7 mediante BoNT/A a nivel de la unión Nop^{197-198}R,
34
16. Uso de un sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 12, para la realización de procedimientos de detección, de identificación y/o de dosificación de la BoNT/A, o de un compuesto capaz de inhibir o activar la BoNT/A, y para la realización de métodos de diagnóstico in vitro de la presencia de la BoNT/A en una muestra que procede de diversos medios tales como el agua, el aire, la leche, las bebidas, los alimentos, y los medios biológicos tales como sangre, orina, y el líquido cefalorraquídeo, así como para la determinación precisa de las concentraciones de la BoNT/A durante la preparación, la purificación y el acondicionamiento de composiciones farmacéuticas para fines de uso terapéutico en el ser humano o en el animal, o de composiciones cosméticas.
17. Procedimiento para detectar, identificar y/o dosificar un compuesto capaz de inhibir la BoNT/A, caracterizado porque comprende:
-
poner en presencia en disolución de un sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 13, con la BoNT/A, y al menos un compuesto susceptible de inhibir la BoNT/A;
-
medir la fluorescencia, emitida por los metabolitos fluorescentes según una de las reivindicaciones 13 a 15, formados durante la etapa anterior, en presencia y/o en ausencia de dicho compuesto, indicando entonces una disminución de fluorescencia entre la medición efectuada en presencia de este compuesto y la medición efectuada en ausencia de este compuesto, que el compuesto ensayado es inhibidor de BoNT/A.
18. Método de diagnóstico in vitro de la presencia de la BoNT/A en una muestra tal como se define en la reivindicación 16, o de medición de las concentraciones de la BoNT/A durante las etapas de preparación, purificación y acondicionamiento de composiciones farmacéuticas o cosméticas en una muestra extraída durante estas etapas, que comprende:
-
una etapa de puesta en presencia en disolución de un sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 12, con dicha muestra;
-
la medición de la fluorescencia emitida por los eventuales metabolitos fluorescentes según una de las reivindicaciones 13 a 15, formados durante la etapa anterior, demostrando la presencia de BoNT/A en dicha muestra, que se puede cuantificar con la ayuda de curvas patrón apropiadas,
-
cuando sea apropiado y con el objetivo de apartar respuestas falsamente positivas, la eliminación de la fluorescencia emitida durante la etapa mencionada anteriormente, mediante adición de un quelante de zinc, como por ejemplo, y de manera no limitativa, el tetracetato de etilendiamina EDTA que inhibe la actividad metaloproteásica de la BoNT/A (figura 3), o mediante adición de gangliósidos, que bloquean está última mediante formación de un complejo inactivo.
19. Kits que comprenden un sustrato según una de las reivindicaciones 1 a 12, y, cuando sea apropiado, BoNT/A, así como los agentes reactivos necesarios para la determinación de los poderes de inhibición o activación de las moléculas ensayadas, o de la presencia de la BoNT/A en una muestra determinada y, cuando sea apropiado, un fluorímetro, así como los agentes reactivos EDTA y/o gangliosidos separados o asociados, y cualquier sustancia capaz de inhibir las enzimas diferentes de la BoNT/A sin afectar a la actividad de esta última.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8022172B2 (en) * 2001-08-28 2011-09-20 Allergan, Inc. Luminescence resonance energy transfer (LRET) assays for clostridial toxin activity
US7374896B2 (en) * 2001-08-28 2008-05-20 Allergan, Inc. GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity
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US8753831B2 (en) * 2007-06-05 2014-06-17 City Of Hope Methods for detection of botulinum neurotoxin
FR2931151A1 (fr) * 2008-05-13 2009-11-20 Pharmaleads Soc Par Actions Si Nouveaux derives d'amino-acides, leur procede de preparation et leur utilisation therapeutique
FR2963022B1 (fr) * 2010-07-21 2012-08-31 Pharmaleads Nouveaux substrats a fluorescence reprimee, leur preparation et leur utilisation pour l'identification, la detection et le dosage de legionella pneumophila
FR2997081B1 (fr) 2012-10-23 2015-11-27 Pharmaleads Inhibiteurs mixtes de l'aminopeptidase n et de la neprilysine
US10408837B2 (en) * 2013-12-09 2019-09-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Peptide substrates recognizable by type E botulinum neurotoxin
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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