CN1969046B - 由A型肉毒杆菌毒素BoNT/A识别的肽底物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由A型肉毒杆菌毒素BoNT/A选择性识别的肽底物,其肽结构中包括Nop-(Z)-Pya片段,其中Z表示氨基酸链,优选RA,所述片段通过所述毒素来切割。所述发明还涉及底物用途,特别是用于进行检测、鉴定和/或定量非常低浓度(约20pg)的A型肉毒杆菌毒素或所述毒素金属肽酶活性的抑制剂和/或激活剂并因此可以定量其能力的方法。
Description
技术领域
本发明涉及由A型肉毒杆菌毒素BoNT/A选择性识别的肽底物及其用途,更具体地是用于进行检测、鉴定和/或定量A型肉毒杆菌毒素或所述毒素的金属肽酶活性的抑制剂和/或激活剂的方法。
背景技术
A型神经毒素(BoNT/A)构成由厌氧杆菌“肉毒杆菌”(Clostridiumbotulinum)的不同菌株产生的七种相关蛋白(肉毒杆菌毒素A至G)家族的一部分。最常遇到的和最危险的两种形式是A和B型毒素。小鼠中通过腹膜内途径的LD50致死量为A型毒素2pg,B型毒素约50至100pg。它们在人和各种动物物种中,通过诱导特征在于可以导致死亡的骨骼肌的松弛性瘫痪的“肉毒中毒”在外周神经系统水平上起作用。
由这些毒素引起中毒的主要形式是由摄入污染的食物或饮料而引起的。但是这些毒素还可以构成潜在的生物武器,由于一定程度上它们易于制造。另一方面,一些年来,肉毒杆菌毒素,尤其是BoNT/A,已经用于治疗(肌张力障碍,神经元活动过度如斜视,眼睑痉挛等)或美容应用(尤其是减少皱纹)。对于所有这些应用,必要的是具有简单、快速而灵敏的方法,用于检测和定量各种介质包括生物介质中的A型肉毒杆菌毒素。
肉毒杆菌神经毒素由两个蛋白亚基构成:重链(100kD)通过二硫桥连接轻链(50kD)。重链参与毒素和神经末段的结合,内在化,然后轻链至胞液的转移。轻链通过乙酰胆碱钙依赖性释放的抑制负责蛋白质的毒性。
这些毒素的轻链的毒性是由其肽酶活性而引起的。事实上,肉毒杆菌毒素属于锌金属肽酶家族,更具体地属于锌蛋白(zincin)亚家族,其包含共有序列HexxH;(Schiavo等,(1992),J.Biol.Chem.267,23479-23483;Roques B.P.(1993)Biochem.Soc.Trans.21,678-685)。
它们非常特异性地切割参与神经递质胞吐的神经元蛋白,如SNAP25和突触短杆素。对每种毒素,包括对相同的底物切割位点是特异性的。
A型肉毒杆菌毒素特异性地切割SNARE复合蛋白中的一种,SNAP-25(序列SEQ ID NO:1)。206个氨基酸的该蛋白在Q197-R198键的水平上被特异性地切割。
SEQ ID NO:1:1M A E D A D M R N E L E E M Q R R A D Q L AD E S L E S T R R M L Q L V E E S K D A G I R T L V M L D E QG E Q L E R I E E G M D Q I N K D M K E A E K N L T D L G K FC G L C V C P C N K L K S S D A Y K K A W G N N Q D G V V A SQ P A R V V D E R E Q M A I S G G F I R R V T N D A R E N E MD E N L E Q V S G I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R QI D R I M E K A D S N K T R I D E A N Q197__198R A T K M L G SG206
之前的工作已经表明短于该SNAP 25序列(1-206)的片段也可以通过BoNT/A来降解(Schmidt和Bostian,J.Prot.Chem.,1997,16,19-26)。最小SNAP-25(187-203)片段:187S N K T R I D E A N R AT K M L203(序列SEQ ID NO:2)的情况就是如此。
不管是在已宣布肉毒中毒情况的过程中,还是在治疗相反适应症的过程中,对抗BoNT/A有害作用的最有效方法是抑制剂的研发,该抑制剂是选择性的并对其引起毒性的金属肽酶活性具有高度亲和性。然而,这样抑制剂的鉴定,及其有效性(抑制常数,Ki)的测定,需要简单的BoNT/A活性测量测试,其可以是自动化的,允许大量测试(HTS)。
目前可利用的测试对于这样的应用是不令人满意的。
另一方面,用于检测肉毒杆菌毒素最灵敏的方法是体内测试,其基于测定小鼠的半数致死量(LD50)(Kautter和Salomon(1976)J.Assoc.Anal.Chem.,60,541-545)。尽管非常灵敏,因为其可以检测5至10pg的BoNT/A,但该方法具有很多缺陷:响应时间是几天,且似乎不是评估治疗性毒素制剂生物活性的最精确的方法(Pearce等(1994)Tox.Applied Pharmacol.,128,69-77)。此外,LD50的估计随着毒素制剂,小鼠品系等的改变非常大。最后,应当注意的是动物实验变得越来越有争议。
已经提出基于细胞系的测试(De Waart等(1992)Zentralblatt für Bacteriologie,222,94-114),但是它们的灵敏度不足(1000只小鼠LD50)。已经发展了免疫测试[放射性免疫测定法(Boroff和Shu-Chen,1973,Applied Microbiol.,25,545-549),使用扩增系统(Stanley等,1985,J.Immunol.and Methods,83,89-95)的ELISA测试(Hallis等,1993,在Botulinum and Tetanus Toxins(肉毒杆菌毒素和破伤风毒素)中DasGupta B.R.编辑,纽约:Plenum Press)],但是没有一种方法是足够灵敏的。此外,它们产生相当大比例的假阳性。
已经发展了几种基于BoNT/A肽酶活性的测试。另一方面,固定于树脂上的SNAP 25或其SNAP 25(137-206)片段的切割(Hallis等(1996)J.Clinic.Microbiol.,34,1934-1938),接着通过抗体,然后扩增系统检测固定于树脂上的代谢物的研究,证明了约1000只小鼠LD50/ml。尽管如此,该方法是费时而昂贵的。
Schmidt和Bostian(J.Prot.Chem.(1977),16,19-26)对由BoNT/A识别的SNAP 25最小片段,(187-203)SNAP 25的表征,证明了通过分别在位置197的赖氨酸和位置200的半胱氨酸侧链上引入dnp(二硝基苯基)和DACIA(二甲基-氨基-香豆素基)的BoNT/A的第一荧光生成底物(Schmidt和Stafford,Applied Environ,Microbiol.(2003),69,297-303)。该方法可以快速检测大于或等于100ng/ml的量。
尽管如此,不是所有这些方法都具有灵敏性、重现性,可靠性和容易使用,所述特性是检测和定量低于或等于1ng/ml的天然BoNT/A的量,浓度对应于70kg体重人的约为1μg的致死量所需要的。这涉及检测BoNT/A感染的小体积介质中低于5ng的量,假设摄食了。
发明内容
本发明的确切主题是提出一种响应这些需要的新测试,用于检测和定量BoNT/A。
在本发明的框架内对于BoNT/测定所选择的方法是基于通过荧光团(L.芘基-丙氨酸,Pya)和非常极性的元素(L.对-硝基-苯丙氨酸,NOP)(具有根据通过碰撞抑制机理抑制的荧光的底物;专利FR0004507)之间的碰撞而引起荧光消光的现象。和FRET(荧光共振能量转移)不同,不存在L-Pya残基荧光发射光谱和L-NOP吸收光谱的恢复。芘基丙氨酸Pya具有非常显著的荧光,将Pya置于接近Nop残基的肽链中时,荧光实际上完全消失。因此,当位于Pya和Nop之间的肽序列被切割时,Pya的荧光只能维持一瞬间。
NOP存在下Pya荧光的消光是由于不同于NOP不存在下Pya的状态的新激发态在照射激发过程中的建立。新的状态通过能量的内部转换非常容易并快速地失去活力,而没有发射(非放射性方法)。
因此本发明框架内选择的方法非常明显地不同于FRET中所用的方法。后一种情况中,如之前所述的,受体(猝灭剂)吸收光谱和供体(荧光团)发射光谱的恢复形成不同于受体不存在下所形成的状态的新的激发态。这种状态通过内部能量转换非常容易灭活,而没有发射(非放射性方法)。这些方法的理论方面报道于:Yaron等,Anal.Biochem.95,228-235(1979)和Lakowicz.J.R.,Principles of fluorescencespectroscopy(荧光光谱法原理),第2版,编辑KA.PP。
这两种方法中,荧光消光取决于两个荧光团之间的距离。可以针对其中构型(两个伴侣之间的距离)最佳的精确实例来实验研究这两种方法的有效性。以下分子就是这种情况,其中并排引入了所涉及的实体。
FRET
---D A B C Y L-CO-↑-NH-EDANS-
DABCYL=4-[4(二甲氨基苯基-偶氮)苯甲酸]
EDANS=亚乙基-二氨基-萘-磺酸盐(Ethylene-DiAmino-Naphthalene-Sulphonate)
CONH键的酶水切割理论上无限分散两个伴侣DABCYL和EDANS。这种情况中所观察到的EDANS的荧光增强为约200UA(任意单位)[G.T.Wang等,Tet.Lett.31,(1990)]。
碰撞复合物
---Pya-CO-↑-NH-Nop---
肽键CONH的酶切割过程中Pya荧光增强导致800UA荧光的增强。[N.Luciani等,Biochem.J.356(2001);专利Fr00.04507,PCT/FR01/01058]。
这种使用Pya/Nop碰撞复合物观察到的更多的荧光增强,是发明人选择Pya-Nop或Nop-Pya对,而非FRET的起因。
本发明人之前描述了对B型肉毒杆菌毒素非常特异性的底物,其中已经在突触短杆素60-94片段的位置74和77分别引入了Pya和Nop残基,这是BoNT/B的最小天然底物(专利FR0007113;C.Anne等,Analytical Biochem.(2001),291,253-261)。
在BoNT/A的情况中,天然底物是SNAP 25,而通过BoNT/A切割的SNAP 25的最小序列是SNAP 25(187-203)片段(Schmidt和Bostian,上述),对应于上述通式SNAP25(187-203)=187S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Q197R-A-T-K-M-L203(SEQ ID NO:2)。
这种肽或天然肽底物SNAP25通过BoNT/A的切割在Q197-R198键的水平上进行。
在使用突触短杆素片段的BoNT/B测定情况中以相同的方式进行,本发明人在A型肉毒杆菌毒素的SNAP 25切割位点两侧引入残基,在这些不同SNAP25片段的位置195,196或197引入Pya残基,而在位置199,200或201引入Nop残基。
出人意料地,这些修饰导致形成不是BoNT/A底物的肽,或只在少数情况中是BoNT/A底物的肽。因此,只有肽Pya197Nop200(187-203)SNAP25受到高浓度(200ng/ml)毒素BoNT/A的微弱切割,只在约1小时内基础荧光加倍(图1)。
因此,该结果表明两种肉毒杆菌毒素A和B活性位点的结构及其作用模式的显著差异。
另一方面,令人惊讶地,Pya-(Z)-Nop序列由反向序列Nop-(Z)-Pya的替代,使得可以获得卓越的BoNT/A底物,其灵敏度达高于由BoNT/A切割的并含有Pya-(Z)-Nop序列的底物的灵敏度100倍,Z表示以这样的方式选择使得该反向序列可以通过BoNT/A来切割的氨基酸链。
因此,本发明基于以下事实:可以检测由通过这种神经毒素酶切割位于这些残基之间的一个键的过程中整合至BoNT/A底物中的Nop和Pya残基的分离引起的强烈荧光,只要Nop残基位于N-端代谢物中而Pya残基位于C-端代谢物中。图2a说明了这种现象。
因此,本发明的主要目的是提供由BoNT/A识别的肽底物,其可以在实施检测、鉴定和/或测定非常低浓度(约20pg)A型肉毒杆菌毒素或所述毒素金属肽酶活性的抑制剂和/或激活剂的方法的框架内使用,且在后一种情况中,可用于量化它们的能力。
因此,本发明的第一方面涉及由BoNT/A毒素选择性识别的肽底物,其特征在于在其肽结构中含有Nop-(Z)-Pya片段,其中Z表示氨基酸链,所述片段通过所述毒素来切割。
有利地,Z表示2至4个如下选定的氨基酸,使得上述Nop-(Z)-Pya片段可通过BoNT/A来切割。
有利地,为了保持BoNT/A的特异性和有效性,本发明底物的氨基酸从天然SNAP25序列的氨基酸中选择。
还有利地,Z在SNAP25的位置198含有精氨酸残基R和在位置199含有残基A(图2a)。
优选,本发明底物的Nop-(Z)-Pya片段选自以下:
1)Nop-R-A-Pya (SEQ ID NO:3)
2)Nop-R-A-T-Pya (SEQ ID NO:4)
3)Nop-R-A-T-K-Pya (SEQ ID NO:5)
根据本发明的优选实施方案,残基(Z)含有2个氨基酸。优选,Nop-(Z)-Pya序列对应于定义:Nop-R-A-Pya(SEQ ID NO:3)。
因此本发明更具体的主题是由BoNT/A毒素识别的肽底物,其特征在于其包括以下的序列或由以下的序列构成:
(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p(SEQ ID NO:6),其中:
-X表示氨基酸,或2至52个氨基酸的链,
-m,n和p,各自独立地表示0或1,
-Xaa表示E或Q,
即,如上定义的任何底物包括SNAP 25(187-206)序列或由SNAP25(187-206)序列构成,其中:
-位置197的Q残基由Nop残基替代,而位置200的T残基由Pya残基替代;位于这两个氨基酸Nop和Pya之间的肽键受到BoNT/A的切割导致荧光增强,本发明就基于此。
-位置202的M残基由同型空间配位残基如Nle替代,
-并且,如果合适:
.位置194的E残基由Q残基替代,
.和/或位置203的L残基受到抑制,
.和/或位置204至206的GSG残基受到抑制。
有利地,以上和此后所述的本发明底物的N-端和C-端残基得到保护,特别地各自通过乙酰化和酰胺化,以避免氨基肽酶和/或羧基肽酶(例如,在使用未完全纯化的毒素的过程中)的任何非特异性降解。
本发明更具体的主题是上述底物,其特征在于当m表示1时,X表示:
-精氨酸残基或半胱氨酸残基,如果合适,将其巯基官能团固定于固体支持物上,
-或2至52个氨基酸的链,对应于蛋白质SNAP 25(SEQ ID NO:1)的片段肽,其C-端氨基酸对应于位于蛋白质SNAP 25序列位置186的氨基酸,而其N-端氨基酸对应于位于蛋白质SNAP 25序列135至185位置的氨基酸之一,如果合适,上述一个或多个氨基酸由选自A、S、E、F、L、Nle的氨基酸替代。
更具体地,本发明涉及由BoNT/A毒素识别的肽底物,其特征在于以下序列:
Ac-(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa1-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n-NH2(SEQ ID NO:7),其中:
-n=0或1
-m=0或1
-X=D或C
-Xaa1表示E或Q,
-且当m=1和X=C时,如果合适,将半胱氨酸残基的巯基功能固定于固体支持物上,例如使用马来酰亚胺残基。
本发明更具体的主题是如上所述的底物,包含上述SNAP25(187-203)序列,其中:
-位置197的Q残基由Nop残基替代,且位置200的T残基由Pya残基替代,
-位置202的M残基由Nle残基替代,
-位置187的N-端S残基是乙酰基,或通过乙酰半胱氨酸残基来保护,
-且位置203的C-端L残基是酰胺化的,
即,以下的序列S1和S2:
S1:Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ IDNO:8)
S2:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ IDNO:9)
本发明更具体的主题是如上所述的底物,对应于序列S1和S2的变体,其中E194残基由谷氨酰胺Q残基替代,即以下的序列S3和S4:
S3:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ IDNO:10)
S4:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQID NO:11)
本发明更具体的主题是如上所述的底物,对应于序列S3和S4的变体,其中在位置203的N-末端亮氨酸受到抑制,即以下的序列S5和S6:
S5:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ IDNO:12)
S6:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ IDNO:13)
本发明的主题还有上述的底物,其特征在于其包括上述序列SEQID NO:6或由上述序列SEQ ID NO:6构成,其中Xaa,n,和p如上所定义,m=1,且X表示对应于SNAP 25(184-186)的KAD序列或其衍生KSD序列的氨基酸链。
因此,本发明更具体的主题是如上所述的底物,其特征在于其包括以下序列S7(SEQ ID NO:14)或由以下序列S7构成:
S7:Ac K S D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L G SG NH2(SEQ ID NO:14)
BoNT/A对其底物的酶反应速度极大程度上取决于底物的长度(V.V.Vaidyanathan等,J.Neuro.Chem.,1999,72,327-337),可能是由于BoNT/A酶亚基的结构(Segelke等,Proc.Natl Acad.Sci USA,101,6888-6893,2004)和变构类型机制(Breidenbach等,Nature,432,925-929,2004),其中存在外部位点,与发明人对于破伤风毒素所证明的相似(Cornille等,J.Biol.Chem.,272,3459-3464,1997)。
这些结果证明SNAP 25不可缺少的部分由C-端SNAP 25(187-203)片段构成,但是对于毒素的最大亲和力是由SNAP25 187残基之前的序列产生的,只要其含有结合至外部位点的序列,尤其是156-186或146-186序列。
因此本发明的主题是提出能够得到非常快速水解的A型肉毒杆菌毒素的优选底物,使得可以检测等于或低于人致死量浓度(约1μg/70kg)的这种毒素。实际上,本发明的应用特别打算用于检测和任选地定量可能会被污染的水、不同的食品和空气中,尤其是生物恐怖活动情况中的BoNT/A。第二个重要应用是非常精确地测定用于不同医学和美容应用中的药品中的BoNT/A浓度(Schantz和Johnson,Microbiol.Rev.,1992,56,80-99)。后一种情况中,所要求的技术可以有效地定量测定约10只小鼠LD50的浓度,即约20pg。这样低的浓度在药物特性方面必定必须测定,以便替代现有的所有体外和体内方法。
本发明更具体的主题是由A型肉毒杆菌毒素,BoNT/A,选择性识别的肽底物,其特征在于其包括上述序列SEQ ID NO:6或由上述序列SEQ ID NO:6构成,其中Xaa,n和p如上所定义,m=1,且X表示至少30个氨基酸的链。
本发明更具体地涉及如上所述的底物,其特征在于X表示至少30个氨基酸的链,对应于蛋白质SNAP25的肽片段,其C-端氨基酸对应于位于蛋白质SNAP25序列位置186的氨基酸,N-端氨基酸对应于位于蛋白质SNAP 25序列位置135至156的氨基酸之一,如果合适,上述一个或多个氨基酸由选自A、S、E、F、L、Nle的氨基酸替代。
本发明更具体的主题是如上所述的底物,其特征在于X表示对应于以下的氨基酸链:
-SNAP 25(135-186)序列,或其以下的衍生序列:
135R R V T N D A R E N E Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L RH Xaa2 A L D Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQID NO:15),
-SNAP 25(141-186)序列,或其以下的衍生序列:
141A R E N E Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L R H Xaa2 A LD Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQ ID NO:16),
-SNAP 25(146-186)序列,或其以下的衍生序列:
146Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L R H Xaa2 A L D Xaa3 G NE I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQ ID NO:17)
-SNAP 25(156-186)序列,或其以下的衍生序列:
156I I G N L R H Xaa2 A L D Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D RI Xaa4 E K A D186(SEQ ID NO:18)
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3和Xaa4各自独立地表示M或Nle。
本发明更具体地涉及如上所述的底物,其特征在于其包括以下的序列之一,或由以下的序列之一构成:
-S8:SEQ ID NO:19:
Ac R R V T N D A R E N E M D E N L E Q V S G I I G N L RH M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I M E K A D S N K T R ID E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
-S9:SEQ ID NO:20:
Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I ME K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
-S10:SEQ ID NO:21:
Ac I I G N L R H Nle A L D Nle G N E I D T Q N R Q I D RI Nle E K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
根据本发明如上定义的特别优选的底物特征在于其包括以下的序列S9:SEQ ID NO:20或由以下的序列S9:SEQ ID NO:20构成:
SEQ ID NO:20:
Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I ME K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
证明S9的水解参数(Km,kcat,Vmax)(参见图9)比对于SNAP 25自身所报道的和迄今为止所报道其他底物的更好。
本发明还涉及源自本发明的肽底物受BoNT/A切割的非荧光和荧光片段,或代谢物(图1a),非荧光代谢物的特征在于它们包括Nop残基,荧光代谢物的特征在于它们包括Pya残基。
本发明更具体的主题是源自本发明的肽底物在Nop197_198R键的水平上受BoNT/A切割的上述荧光代谢物,即代谢物通式为:
R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:22)
其中n和p如上所定义,
且更具体地是:
-以下的荧光代谢物M1,特别源自底物S1、S2、S3、S4、S8、S9和S10在Nop197_198R键的水平上受BoNT/A的切割,
M1:R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:23)
-以下的荧光代谢物M2,特别源自底物S5和S6在Nop197_198R键的水平上受BoNT/A的切割,
M2:R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ ID NO:24)
-以下的荧光代谢物M3,特别源自底物S7在Nop197_198R键的水平上受BoNT/A的切割,
M3:R-A-Pya-K-Nle-L-G-S-G-NH2(SEQ ID NO:25)。
根据本发明的底物在以下几种方式中是有用的:
-它们可以快速检测液体或物质内低于人致死量浓度的A型肉毒杆菌毒素可能的存在,
-与其他肉毒杆菌毒素和其他肽酶相比,它们具有非常高的灵敏度,
-它们可以高通量筛选A型肉毒杆菌毒素的潜在抑制剂,
-由于BoNT/A选择性切割Nop-R键,它们只产生两种代谢物。
因此,本发明涉及之前所定义底物的用途,用于实施检测、鉴定和/或试定BoNT/A或能够抑制或激活BoNT/A的化合物的方法,和用于实施诊断从各种介质如水、空气、奶、饮料、食物和生物介质如血液、尿液和脑脊髓液中获得的样品中BoNT/A存在的体外方法,以及用于精确测定用于人或动物治疗目的(特别是在神经病学病变框架内)的药物组合物或化妆品组合物的生产、纯化和检验过程中的BoNT/A浓度。
根据本发明的优选变体,将底物用于探寻BoNT/A抑制剂并量化它们的抑制能力。
本发明的主题还有用于检测、鉴定和/或试定能够抑制BoNT/A的化合物的方法,其特征在于包括:
-将溶液中根据本发明的底物和所述的BoNT/A或其轻链(如特别是Cai和Singh,Biochemistry(2001)40,4693-4702中所述的),以及至少一种能够抑制BoNT/A的化合物混合;
-在所述化合物存在和/或不存在下,测量由上一步骤过程中底物水解形成的上述荧光代谢物发射的荧光,该化合物存在和该化合物不存在下所进行测量之间的荧光减少,结果表明所测试的化合物是BoNT/A的抑制剂。
与根据本发明的底物相比,加入递增量的能够抑制BoNT/A酶活性的化合物,由于通过BoNT/A所形成代谢物量的减少,得到荧光强度减少的表达。因此相对于通过底物和所形成的荧光代谢物混合物所建立的标准曲线来测量该强度,可以评价以给定固定浓度的抑制化合物的抑制百分比表示的抑制能力,或精确地测定其IC50,然后其Ki,使用底物的Km和几种浓度的抑制产物。
为了测定其与BoNT/A相比的抑制活性,以上定义的测试中所使用的化合物性质上可以不同,且没有限制并可以以分离形式呈现,为已知或未知的和/或存在于化合物库中,即生物提取物。
测定法的最大灵敏度使得可以在非常小的体积(50或100μl)中操作,使用浓度为约5至50μM的选定底物(尤其是S5、S8和S9)。因此测试可以用于96孔或更多孔的平板中,当阅读荧光计与合适的商业计算机处理软件连接时,可以使用Ki的自动化测定使其自动化。
因此,本发明提出通过非常快速的荧光测试来鉴定BoNT/A的抑制剂以及测定它们的抑制能力的测试,其是可重复的,使测试自动化并以非常大的数量来进行,并能够使其适于抑制分子的高通量选择。
本发明还提出新工业产品的生产,该产品可以任选以试剂盒的形式来使用,特别地所述试剂盒含有即可使用的96,192和384孔平板,并含有根据本发明如上定义的底物和测定BoNT/A抑制或激活能力必需的试剂。此外,本发明提出包括片剂的试剂盒,该试剂盒含有本发明的一种底物(尤其是S9)和产生酶反应并因此在加入水或含有BoNT/A的底物的情况中显现强的荧光所需的试剂。这种情况下,本发明的试剂盒还有利地包括荧光计,其发射波长优选在360至420nm之间,且激发波长优选在320至350nm之间,以及试剂EDTA和/或分开或结合的神经节苷脂和能够抑制BoNT/A以外的酶而不影响后者活性的任何物质。
本发明的另一方面涉及用于诊断如上定义的样品中BoNT/A存在,或在药物或美容组合物的生产、纯化和检验阶段的过程中测量这些阶段过程中取出的样品中BoNT/A浓度的体外方法。
本发明还涉及使用根据本发明的底物诊断人或动物体中BoNT/A存在的体外方法。
这样的诊断或测量方法包括:
-将溶液中根据本发明的底物和如上所定义的样品(例如,从食物、液体或人血样品,任选地受到BoNT/A的污染,取出的样品)混合的步骤;
-测量上一步骤过程中形成的任何上述荧光代谢物发射的荧光,获得所述样品中BoNT/A存在的证据,可以使用合适的标准曲线(参见附图)来定量,
-如果合适且为了除去假阳性响答的目的,消除上述阶段过程中所发射的荧光,通过加入抑制BoNT/A金属蛋白酶活性的锌螯合剂,例如但非限制性地,乙二胺四乙酸EDTA(图3),或通过加入神经节苷脂,其通过无活性复合物的形成来阻断后者。
以说明而非限制本发明的方式呈现了附图和实施例。
附图说明
-图1:以下底物受到BoNT/A切割过程中荧光增强的差异:
底物1(肽1),Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-AN-Pya-R-A-Nop-K-Nle-L-NH2(■,下曲线)和底物2(肽2),Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(□,上曲线)。沿着x-轴表示以分钟计的时间,沿着y-轴为荧光(U.A.)
-图2:a)根据本发明的底物受到BoNT/A切割的图。
b)底物S1(10-5M)及其代谢物M1(5x10-7M,对应于5%的降解)的荧光发射比较。在343nm处激发。沿着x-轴表示以nm计的波长,沿着y-轴为所发射的强度。
-图3:用于测定试验过程中所降解底物%的荧光标准曲线。
-图4:通过BoNT/A在1小时内降解底物S1(50μM)所发射的荧光和(因此EDTA对酶活性的)荧光的抑制。
-图5:使用底物S9的BoNT/A荧光定量测试。浓度以小鼠LD50来表示,即1 LD50=2pg。沿着x-轴表示以分钟计的时间,沿着y-轴为荧光(U.A.)。
-图6:用底物S9测定时荧光增强(沿着y-轴,U.A.)和BoNT/A浓度(沿着x-轴,以LD50计)之间的线性关系。
-图7:底物S9及其对应于2.5%降解的代谢物M1的荧光发射;在343nm处激发。沿着x-轴表示以nm计的波长,沿着y-轴为以U.A.计的荧光。
-图8:S9的分析参数。
-图9:S9通过BoNT/A降解的动力学参数。证明Km和催化常数比对于SNAP25的更有利。沿着x-轴表示以μM计的PL50浓度,沿着y-轴为切割速度(以pmol/min/μg计)。插图:沿着x-轴是以pmol/min/μg酶/μM底物计的速度/底物浓度之比,沿着y-轴为以pmol/min/μg计的速度。
实施例
1)肽的合成
根据Merrifield的方法在自动化合成仪例如Applied Biosystem的设备431A上通过常用的固相合成方法可以获得所要求的化合物。所用的化学方法对应于Fmoc技术。通过三氯醋酸进行肽基树脂的侧链去保护和切割,如E.Atherton和R.C.Sheppard(1989)在“Solid phasepeptides synthesis:a practical approach(固相肽合成:一种实用的方法),IRL Press,Oxford)中所述的。根据常规技术来进行偶联,使用偶联剂如HATU、Bop、PyBrop,且优选在羟基苯并三唑(HOBT)的存在下使用二环己基碳化二亚胺(DCC)。所使用技术的详细内容可以在报道本发明人进行的特大肽合成的出版物中找到(Cornille F.等,J.Pept.Res.,1999,54,427-435;CornilleF.等,Nucleic Ac.Res.,1998,26,2143-2149;Cornille F.等,Int.J.Pept.Rot.Res.,1990,36,551-558;de Rocquigny H等,Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,6472-6476)。
根据Soleihac等在出版物中所述的不对称合成方法来获得L-芘基丙氨酸(Anal.Biochem.,1996,241,120-127)。
通过半制备性HPLC来纯化肽。通过反相HPLC估算肽的纯度高于95%并通过质谱获得它们的鉴定。
底物S1:Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:8):M(理论值)2233.53;MH+(实验值)2234.20
底物S2:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:9)M(理论值)2236.67;MH+(实验值)2337.98
底物S3:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:10)M(理论值)2232.55;MH+(实验值)2233.78
底物S4:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:11)M(理论值)2335.69;MH+(实验值)2336.48
底物S5:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQID NO:12)M(理论值)2119.39;MH+(实验值)2120.54
底物S6:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ ID NO:13)M(理论值)2222.53;MH+(实验值)2223.80
代谢物M1:R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:23)
M(理论值)867.12;MH+(实验值)868.24
代谢物M2:R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ ID NO:24)
M(理论值)759.96;MH+(实验值)758.02
底物S7:Ac K S D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle LG S G NH2(SEQ ID NO:14):M(理论值)2764.81;M(实验值)2764.0
底物S9:Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R Q ID R I M E K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle-L NH2(SEQID NO:22):M(理论值)5827.7;M(实验值)5826.9
底物S10:Ac I I G N L R H Nle A L D Nle G N E I D T Q N RQ I D R I Nle E K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle LNH2(SEQ ID NO:23):M(理论值)5773.58;M(实验值)5773.2
2)底物S9的物理化学特性
氨基酸分析:
Asx:9.76/10 Thr:1.91/2 Cys:X
Glx:5.03/5 Ala:4.17/4 Ile:5.14/6
Ser:1.00/1 Pro:X Leu:4.20/3
Gly:1.97/2 Tyr:X Phe:X
His:0.96/1 Val:X Trp:X
Ar:5.07/5 Met:2.58/3 Lys:3.14/3
检测到pNO2-Phe,但没有定量。Nle和Leu共洗脱。Ile-Ile之间存在不完全水解。在水解过程中部分破坏了Met(请参见S9的HPLC,图8)。
3)BoNT/A荧光检测试验
在100ml含有BSA(1mg/ml),ZnSO4(0.3mM)和DTT(5mM)的20mMHepes缓冲液(pH7.4)中用未知量的双链BoNT/A在37℃温育50μM底物(例如S1)1小时。通过将样品放置于4℃或加入5μL的2N HCl来停止酶水解,用荧光计直接阅读所发射的荧光(λ激发343nm,λ发射377nm)。
为了确定样品中存在的BoNT/A量,使所测量的荧光强度与标准曲线相关联。使用几个BoNT/A量所进行的实验表明精确度达到0.2ng/ml至15ng/ml范围内神经毒素量的±10%(参见图5)。
4)使用底物S9的BoNT/A荧光检测试验(图5)
在100μL含有BSA(1mg/ml),ZnSO4(0.3mM)和DTT(5mM)的20mMHepes缓冲液(pH7.4)中用不同浓度的双链BoNT/A(1只小鼠LD50=2pg)在37℃随时间的变化温育10μM的底物S9。用cytofluor设备直接阅读所发射的荧光(λ激发340nm,λ发射400nm)。
将其相对于对照的增加与每个时间的BoNT/A浓度直接相联系。因此,这可以测定未知BoNT/A浓度的样品中的毒素含量(参见图6)。使用S9可以定量0.2ng/ml的BoNT/A浓度。
可以用不同类型的荧光计和可变的样品体积例如50μl至2ml来进行这些实验。
5)测定BoNT/A(50ng/100μl)对S9(10μM)的切割位点
通过LC-MC(Kromasil C18 CH3CN/H20(0.5%TFA),60分钟内10%CH3CN至90%的梯度);LCD上的电喷雾质谱(Avantage ThermoFinnigan)和HPLC(Kromasil C18 CH3CN/H20(0.5%TFA),30分钟内10%CH3CN至90%的梯度)来平行进行分析。
对应于M+H检测荧光代谢物M1具有m/z=870.1。
代谢物M1:R A Pya K Nle-L NH2
对应于(M+H)检测非荧光代谢物M3具有m/z=4975.0。
代谢物M4:Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R QI D R I M E K A D S N K T R I D E A N Nop(SEQ ID NO:26)
还通过HPLC(共同注入合成的代谢物)证实了只形成了两种代谢物。
6)通过A型肉毒杆菌毒素对以下受抑制的荧光底物的作用所诱导
的荧光比较(图
1)
肽1:Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Pya-R-A-Nop-K-Nle-L-NH2(SEQID NO:27)
肽2:Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQID NO:8)
实验(参见图1)表明了相对于Pya-Z-Nop,Nop-Z-Pya的排列具有非常明显的优势。Pya-Z-Nop产生了小得多的荧光改变,以便满足本专利的需要(药物制剂中BoNT/A的精确测定,检测各种制剂尤其是水中能够在人体中产生毒性作用的非常小剂量的BoNT/A)。
Claims (15)
1.由A型肉毒杆菌毒素BoNT/A选择性识别的肽底物,其特征在于在其肽结构中含有对应于Nop-R-A-Pya序列(SEQ ID NO:3)的Nop-(Z)-Pya片段,所述片段通过所述毒素来切割。
2.根据权利要求1的由A型肉毒杆菌毒素BoNT/A特异性识别的肽底物,其特征在于其包括以下序列或由以下序列构成:
Ac-(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:6),其中:
-X表示氨基酸,或2至52个氨基酸的链,
-m,n和p,各自独立地表示0或1,
-Xaa表示E或Q。
3.根据权利要求1的底物,包括以下序列或由以下序列构成:
Ac-(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:6),其中:
-X表示氨基酸,或2至52个氨基酸的链,
-m,n和p,各自独立地表示0或1,
-Xaa表示E或Q,
其特征在于在m表示1时,X表示:
-精氨酸残基或半胱氨酸残基,如果合适,将其巯基官能固定于固体支持物上,
-或2至52个氨基酸的链,对应于蛋白质SNAP25的肽片段,其C端的氨基酸对应于位于蛋白质SNAP25序列位置186的氨基酸,其N端的氨基酸对应于位于蛋白质SNAP25序列位置135至185的氨基酸之一,如果合适,上述的一个或多个氨基酸由选自A、S、E、F、L、Nle的氨基酸来替代。
4.根据权利要求1的底物,其特征在于其包括以下的S1至S6的序列或由以下的S1至S6的序列构成:
S1:Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ IDNO:8)
S2:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQID NO:9)
S3:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ IDNO:10)
S4:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQID NO:11)
S5:Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ IDNO:12)
S6:Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ IDNO:13)。
5.根据权利要求1的底物,其特征在于其包括以下序列或由以下序列构成:
Ac-(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:6),其中:
-X表示对应于SNAP 25(184-186)的KAD序列或其衍生的KSD序列的氨基酸链,
-m,n和p,各自独立地表示0或1,
-Xaa表示E或Q。
6.根据权利要求5的底物,其特征在于其包括以下的序列S7(SEQID NO:14)或由以下的序列S7(SEQ ID NO:14)构成:
S7:Ac K S D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L G SG NH2(SEQ ID NO:14)。
7.根据权利要求1的底物,其特征在于其包括以下序列或由以下序列构成:
Ac-(X)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaa-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:6),其中:
-X表示至少30个氨基酸的氨基酸链,
-m,n和p,各自独立地表示0或1,
-Xaa表示E或Q。
8.根据权利要求7的底物,其特征在于X表示对应于以下序列的氨基酸链:
-SNAP25(135-186)序列,或其以下的衍生序列:
135R R V T N D A R E N E Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L RH Xaa2 A L D Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQID NO:15)
-SNAP25(141-186)序列,或其以下的衍生序列:
141A R E N E Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L R H Xaa2 A LD Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQ ID NO:16)
-SNAP25(146-186)序列,或其以下的衍生序列:
146Xaa1 D E N L E Q V S G I I G N L R H Xaa2 A L D Xaa3 G NE I D T Q N R Q I D R I Xaa4 E K A D186(SEQ ID NO:17)
-SNAP25(156-186)序列,或其以下的衍生序列:
156I I G N L R H Xaa2 A L D Xaa3 G N E I D T Q N R Q I D RI Xaa4 E K A D186(SEQ I D NO:18)
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3和Xaa4各自独立地表示M或Nle。
9.根据权利要求7的底物,其特征在于其包括以下的序列S8至S10之一或由以下的序列S8至S10之一构成:
-S8:SEQ ID NO:19:
Ac R R V T N D A R E N E M D E N L E Q V S G I I G N L RH M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I M E K A D S N K T R ID E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
-S9:SEQ ID NO:20:
Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I ME K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2
-S10:SEQ ID NO:21:
Ac I I G N L R H Nle A L D Nle G N E I D T Q N R Q I D RI Nle E K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2。
10.根据权利要求7的底物,其特征在于其包括以下序列S9(SEQID NO:20)或由以下序列S9(SEQ ID NO:20)构成:
Ac I I G N L R H M A L D M G N E I D T Q N R Q I D R I ME K A D S N K T R I D E A N Nop R A Pya K Nle L NH2。
11.源自权利要求1中所定义的肽底物由BoNT/A切割的非荧光和荧光代谢物,非荧光代谢物的特征在于它们包含Nop残基,而荧光代谢物的特征在于它们包含Pya残基。
12.根据权利要求11的荧光代谢物,源自根据权利要求1的肽底物通过BoNT/A在Nop197_198R键水平上的切割,即,代谢物的通式为:
R-A-Pya-K-Nle-(L)n(GSG)p-NH2(SEQ ID NO:22)
其中n和p如权利要求2中所定义。
13.根据权利要求11的以下荧光代谢物:
-以下的荧光代谢物M1,源自底物S1、S2、S3、S4、和S8至S10通过BoNT/A在Nop197_198R键水平上的切割,
M1:R-A-Pya-K-Nle-L-NH2(SEQ ID NO:23)
-以下的荧光代谢物M2,源自底物S5和S6通过BoNT/A在Nop197_198R键水平上的切割,
M2:R-A-Pya-K-Nle-NH2(SEQ ID NO:24)
-以下的荧光代谢物M3,源自底物S7通过BoNT/A在Nop197_198R键水平上的切割,
M3:R-A-Pya-K-Nle-L-G-S-G-NH2(SEQ ID NO:25)。
14.根据权利要求1的底物用于制备组合物的用途,所述组合物用于进行在源自各种介质如水、空气、奶、饮料、食物和生物介质如血液、尿液和脑脊髓液样品中检测、鉴定和/或测试BoNT/A或能够抑制或激活BoNT/A的化合物的方法,以及用于精确测定用于人或动物治疗目的药物组合物或化妆品组合物的生产、纯化和检验过程中的BoNT/A浓度。
15.一种试剂盒,含有根据权利要求1的底物,且如果合适,BoNT/A,以及测定所测试分子的抑制或激活能力必需的试剂,或测定样品中BoNT/A存在必需的试剂,且如果合适,荧光计,以及试剂EDTA和/或分开的或结合的神经节苷脂和能够抑制BoNT/A以外的酶而不影响后者活性的任何物质。
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2004
- 2004-05-05 FR FR0404817A patent/FR2869908B1/fr not_active Expired - Fee Related
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2005
- 2005-05-04 CN CN2005800200721A patent/CN1969046B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
Title |
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ANNE C ET AL.HIGH-THROUGHPUT FLUOROGENCI ASSAY FORDETERMINATION OF BOTULINUM TYPE B NUROTOXINPROTEASE ACTIVITY.ANALYTICAL BIOCHEMISTRY291 2.2001,291(2),253-261. |
ANNE C ET AL.HIGH-THROUGHPUT FLUOROGENCI ASSAY FORDETERMINATION OF BOTULINUM TYPE B NUROTOXINPROTEASE ACTIVITY.ANALYTICAL BIOCHEMISTRY291 2.2001,291(2),253-261. * |
LUCIANI N ET AL.HIGHLY SENSITIVE AND SELECTIVE FLUORESCENCEASSAYS FOR RAPID SCREENING OFENDOTEHELIN-CONVERTING ENZYME INHIBITORS.BIOCHEMICAL JOURNAL356 3.2001,356(3),813-819. |
LUCIANI N ET AL.HIGHLY SENSITIVE AND SELECTIVE FLUORESCENCEASSAYS FOR RAPID SCREENING OFENDOTEHELIN-CONVERTING ENZYME INHIBITORS.BIOCHEMICAL JOURNAL356 3.2001,356(3),813-819. * |
SOLEILHAC ET AL.A SENSITIVE AND RAPID FLUORESCENCE-BASEDASSAY FOR DETERMINATION OF TETANUS TOXINPEPTIDASE ACTIVITY.ANALYTICAL BIOCHEMISTRY241.1996,241120-127. * |
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CN1969046A (zh) | 2007-05-23 |
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