FR2869908A1 - Substrat peptidique reconnu par la toxine botulique de type a, bont/a et son utilisation pour detecter et/ou doser ladite toxine ou des inhibiteurs de son activite - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un substrat peptidique reconnu sélectivement par la toxine botulique de type A, BoNT/A, caractérisée en ce qu'il comprend dans sa structure peptidique un fragment Nop-(Z)-Pya dans lequel Z représente un enchaînement d'aminoacides, préférentiellement RA, le dit fragment étant clivé par la dite toxine. L'invention concerne également les utilisations de ce substrat, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés pour détecter, identifier et/ou doser la toxine botulique de type A à des concentrations très faibles (de l'ordre de 1 ng/ml), ou des inhibiteurs et/ou activateurs de l'activité métallopeptidasique de ladite toxine, et dans ce dernier cas quantifier leur puissance.
Description
SUBSTRAT PEPTIDIQUE RECONNU PAR LA TOXINE BOTULIQUE DE TYPE A, BONT/A ET
SON UTILISATION POUR DETECTER ET/OU DOSER LADITE TOXINE OU DES INHIBITEURS DE SON ACTIVITE
La présente invention a pour objet un substrat peptidique reconnu sélectivement par la toxine botulique de type A, BoNT/A, et ses utilisations, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés pour détecter, identifier et/ou doser la toxine botulique de type A ou des inhibiteurs et/ou activateurs de l'activité métallopeptidasique de ladite toxine.
La neurotoxine de type A (BoNT/A) fait partie d'une famille de sept protéines apparentées (toxines botuliques A à G) produites par différentes souches du bacille anaérobie clostridium botulinum . Les deux formes les plus fréquemment rencontrées et les plus dangereuses sont les toxines de type A et B avec des doses létales 50 chez la souris de l'ordre de 0,1 à 3 ng/kg par voie intrapéritonéale. Elles agissent au niveau du système nerveux périphérique de l'homme et de diverses espèces animales en induisant le botulisme caractérisé par une paralysie flasque des muscles du squelette pouvant entraîner la mort.
La forme majeure d'intoxication par ces toxines est due à l'ingestion de nourriture ou boissons contaminées. Mais ces toxines peuvent également constituer une arme biologique potentielle dans la mesure où elles sont faciles à produire. D'autre part, depuis plusieurs années, les toxines botuliques, et plus particulièrement la BoNT/A, sont utilisées pour des applications thérapeutiques (dystonies, hyperactivités neuronales telles que strabisme, blépharospasme etc..) ou en cosmétologie. Pour toutes ces applications, il est indispensable de posséder une méthode simple, rapide et sensible, de détection et de quantification de la toxine botulique de type A dans divers milieux, y compris liquides.
Les neurotoxines botuliques sont constituées de deux sous unités protéiques: une chaîne lourde (100 kD) associée à une chaîne légère (50 kD) par l'intermédiaire d'un pont disulfure. La chaîne lourde intervient dans la liaison de la toxine à la terminaison nerveuse, dans l'internalisation puis dans la translocation de la chaîne légère dans le cytosol. La chaîne légère est responsable de la toxicité de la protéine par inhibition de la libération, calcium dépendante, de l'acétylcholine.
La toxicité de la chaîne légère de ces toxines est due à son activité peptidasique. En effet, les toxines botuliques appartiennent à la famille des métallopeptidases à zinc et plus particulièrement à la sous-famille des zincines qui contient la séquence consensus HExxH; (Schiavo et al. (1992) J. Biol. Chem. 267,23479-23483).
Elles clivent de façon très spécifique les protéines neuronales impliquées dans l'exocytose des neurotransmetteurs. Ainsi la syntaxine et la SNAP 25 sont dégradées par les toxines botuliques A, C et E, alors que la synaptobrévine est clivée par la toxine tétanique et par les toxines botuliques B, D, F et G. Le site de clivage est spécifique pour chaque toxine y compris pour un substrat identique.
L'approche la plus efficace pour combattre les effets néfastes de la BoNT/A, soit au cours d'un botulisme déclaré, soit au cours de contreindications thérapeutiques, est le développement d'inhibiteurs sélectifs et de haute affinité pour son activité métallopeptidasique, responsable de sa toxicité. Toutefois, l'identification de tels inhibiteurs, et la détermination de leur efficacité (constantes d'inhibition, Ki), exigent un test simple et robotisable de mesure de l'activité BoNT/A permettant un grand nombre d'essais (HTS).
Les tests actuellement disponibles ne sont pas satisfaisants pour de telles applications.
La méthode de détection la plus sensible des toxines botuliques est un essai in vivo qui repose sur la détermination de la dose létale 50 chez la souris (DL 50) (Kautter et Salomon (1976) J. Assoc. Anal. Chem., 60, 541-545). Bien que très sensible, puisqu'elle permet de détecter de 5 à 10 pg de BoNT/A, cette méthode présente de nombreux inconvénients: le temps de réponse est de plusieurs jours et elle ne paraît pas être la méthode la plus précise pour estimer l'activité biologique d'une préparation thérapeutique de toxine (Pearce et al. (1994) Tox.Applied Pharmacol., 128, 69-77). De plus, l'estimation de la DL50 varie très largement avec la préparation de toxine, la souche de souris, etc. Enfin notons que l'expérimentation sur animal est de plus en plus controversée.
Des tests sur lignées cellulaires ont été proposés (De Waart et al. (1972) 30 Zentralblatt fur Bacteriology, 222, 96-114), mais leur sensibilité est trop faible (1000 DL50 souris). Des tests immunologiques ont été développés [radioimmunoessais (Boroff et Shu-Chen, 1973, Applied Microbiol., 25, 545-549), tests ELISA (Hallis et al., 1993 in Botulinum and Tetanus Toxins DasGupta B.R. editeur, New York: Plenum Press) avec des systèmes d'amplification (Stanley et al. ,1985,J. Immunol. and Methods, 83, 89-95)], mais aucun n'est suffisamment sensible.
Quelques essais, basés sur l'activité peptidasique de la BoNT/A ont été développés. D'une part, l'étude du clivage du SNAP 25 ou de son fragment SNAP 25(137-206) (Hallis et al. (1996) J. Clinic.Microbiol., 34, 19341938) immobilisé sur résine, suivie de la détection du métabolite fixé sur la résine par un anticorps, puis d'un système d'amplification, a conduit à la mise en évidence d'environ 1000 DL50 souris/ml. Néanmoins cette méthode est longue et coûteuse.
La caractérisation par Schmidt et Bostian (J. Prot. Chem. (1997), 16, 1926) du plus petit fragment de SNAP 25, reconnu par la BoNT/A, (187-203) SNAP 25, a conduit à la mise au point du premier substrat fluorigénique de BoNT/A par introduction d'un groupe dnp (dinitrophenyl) et DACIA (diméthyl-amino-coumarinyl) sur les chaînes latérales d'une lysine en position 197 et d'une cystéine en position 200, respectivement (Schmidt et Stafford, Applied Environ. Microbiol. (2003), 69, 297-303). Cette méthode permet de détecter rapidement des quantités supérieures ou égales à 100ng/mL.
Toutes ces méthodes ne possèdent pas la sensibilité, la reproductibilité, la fiabilité et la facilité d'utilisation requises pour détecter et quantifier les doses de BoNT/A native 20 inférieures ou égales à 1 ng/ml. Une telle concentration correspond à la dose létale pour un homme de 70 kg.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un nouveau test de détection permettant de répondre à ces impératifs.
Les inventeurs ont précédemment démontré que l'utilisation de la Lpyrénylalanine (Pya) associée à l'aminoacide modifié L-(paranitro) phénylalanine (Nop) dans un enchaînement Pya-(Z)-Nop avec Z constitué de un ou plusieurs aminoacides, représente un couple particulièrement intéressant pour définir un substrat à fluorescence réprimée (brevet FR 0004507). La pyrénylalanine Pya présente une fluorescence très importante qui est quasi totalement éteinte lorsque Pya est placé dans un enchaînement peptidique à proximité du reste Nop. En conséquence, la fluorescence de Pya ne peut se manifester qu'à partir du moment où la séquence peptidique située entre Pya et Nop est clivée.
Ainsi un substrat très spécifique de la toxine botulique de type B a été décrit par introduction des résidus Pya et Nop en positions 74 et 77 respectivement du fragment 60-94 de la synaptobrévine, substrat naturel minimal de la BoNT/B (brevet FR 0007113; C. Anne et al. Analytical Biochem. (2001), 291, 253-261).
Dans le cas de la BoNT/A, le substrat naturel est le SNAP 25, et la séquence minimale du SNAP 25 clivée par la BoNT/A est le fragment (187203)SNAP 25 (Schmidt et Bostian, supra) correspondant à la formule (187203)SNAP25 = t87S-N-KT-R-I-D-E-A-N-Q187R-A-T-K-M-L203 (SEQ ID NO: 1).
Le clivage de ce peptide, ou du peptide substrat naturel SNAP25, par la BoNT/A, 10 s'effectue au niveau de la liaison Q197-R198.
Toutefois, à la différence du substrat de BoNT/B, l'introduction de Pya en positions 195, 196 ou 197, et celle de Nop en positions 199, 200, 201 ou 202, du fragment (187-203) SNAP 25 n'a pas conduit à l'obtention d'une molécule clivée par la BoNT/A. Ce résultat suggère donc des différences importantes dans la structure du site actif des deux toxines botuliques A et B ainsi que dans leur mode d'action.
Cependant de façon complètement inattendue, le remplacement de la séquence Pya-(Z)-Nop par la séquence inverse Nop-(Z)-Pya, avec Z représentant un enchaînement d'aminoacides choisi de manière à ce que cette séquence inverse puisse être clivée par la BoNT/A, a permis d'obtenir de très bons substrats de BoNT/A.
La présente invention repose donc sur le fait qu'il est possible de détecter une fluorescence intense provoquée par la séparation des résidus Nop et Pya intégrés dans un substrat de la BoNT/A lors du clivage enzymatique par cette neurotoxine d'une des liaisons situées entre ces résidus, à condition que le résidu Nop se retrouve dans le métabolite Nterminal et que le résidu Pya se retrouve dans le métabolite C-terminal issus de ce clivage. La figure 1 illustre ce phénomène.
Ainsi, la présente invention a principalement pour but de fournir un substrat peptidique reconnu par BoNT/A, utilisable dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés pour détecter, identifier et/ou doser la toxine botulique de type A à des concentrations très faibles (de l'ordre de 1 ng/ml), ou des inhibiteurs et/ou activateurs de l'activité métallopeptidasique de ladite toxine, et dans ce dernier cas pour quantifier leur puissance.
Un premier aspect de l'invention concerne donc un substrat peptidique, reconnu sélectivement par la toxine BoNT/A, caractérisé en ce qu'il comprend dans sa structure peptidique un fragment Nop-(Z)-Pya dans lequel Z représente un enchaînement d'aminoacides, ledit fragment étant clivé par la dite toxine.
Avantageusement Z représente de 2 à 4 aminoacides choisis de telle manière que le fragment Nop-(Z)-Pya susmentionné puisse être clivé par la BoNT/A.
De préférence Z représente 2 aminoacides.
Avantageusement, afin de préserver la spécificité et l'efficacité de la BoNT/A, les aminoacides constituant Z sont choisis parmi ceux de la séquence naturelle du SNAP25 10 au niveau du site de clivage par la toxine, à savoir au niveau de la liaison Q19'-R'98.
Avantageusement encore, Z contient les résidus arginine R en position 198 et A en position 199 de SNAP25.
De préférence, le fragment Nop-(Z)-Pya des substrats de l'invention est choisi parmi les suivants: 1) Nop-R-A-Pya (SEQ ID NO: 2) 2) Nop-R-A-T-Pya (SEQ ID NO: 3) 3) Nop-R-A-T-K-Pya (SEQ ID NO: 4} Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le reste (Z) comprend 2 aminoacides et la séquence Nop-(Z)- Pya répond à la définition: Nop-R-A-Pya (SEQ ID 20 NO: 2).
Comme cela a été précisé ci-dessus, le fragment minimal de SNAP25 reconnu par la BoNT/A est le fragment (187-203)SNAP 25, à savoir le fragment 187SN-K-T-R-I-DE-A-N-Q197 198R-A-T-K-M-L203 (SEQ ID NO: 1), qui est clivé au niveau de la liaison Q197-R198.
A ce titre, l'invention,a plus particulièrement pour objet un substrat peptidique, reconnu par la toxine BoNT/A, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence suivante: S-N-K-T-R-I-D-Xaal-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle- (L) (SEQ ID NO: 5) avec n = 0 ou 1, et Xaal représente E ou Q, à savoir la séquence (187-203)SNAP 25 dans laquelle: - le résidu Q en position 197 est remplacé par un résidu Nop, et le résidu T en position 200 est remplacé par un résidu Pya, - le résidu M en position 202 est remplacé par un résidu isostère tel que Nle, et, le cas échéant: le résidu E en position 194 est remplacé par un résidu Q, et/ou le résidu L en position 203 est supprimé.
Selon une autre réalisation préférée de l'invention les résidus Nterminal et C- terminal du substrat susmentionné sont protégés afin d'éviter toute dégradation non spécifique (par exemple lors de l'utilisation de toxines incomplètement purifiées), notamment par acétylation et amidification respectivement.
A ce titre l'invention concerne plus particulièrement un substrat peptidique, reconnu par la toxine BoNT/A, caractérisé par la séquence suivante: Ac-(C)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaal-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L)n NH2 (SEQ ID NO: 6) dans laquelle: -n=0ou1, -m=0ou1, - Xaal représente E ou Q, - le résidu C-terminal est protégé par amidification, - lorsque m = 0, le résidu -S- N-terminal est protégé par acétylation, - et lorsque m = 1, le résidu -S- N-terminal est bloqué par un reste Acétylcystéine dont la fonction thiol est immobilisée sur un support solide, par exemple à l'aide d'un reste malcimide.
L'invention a plus particulièrement pour objet les substrats tels que définis ci-dessus comprenant la séquence (187-203)SNAP 25 susmentionnée dans laquelle: - le résidu Q en position 197 est remplacé par un résidu Nop, et le résidu T en position 200 est remplacé par un résidu Pya, - le résidu M en position 202 est remplacé par un résidu Nle, - le résidu N-terminal S, en position 187 est acétylé, ou protégé par un reste acétylcystéine (vide supra), - et le résidu C-terminal L en position 203 est amidifié, à savoir les séquences S1 et S2 suivantes: S 1: Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N- Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 7) S2: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R- A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 8) L'invention a plus particulièrement pour objet des substrats tels que définis ci- dessus, correspondant à une variante des séquences S1 et S2 dans laquelle le résidu E194 est remplacé par un résidu glutamine Q, à savoir les séquences S3 et S4 suivantes: S3: Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K- Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 9) S4: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L- NH2 (SEQ ID NO: 10) L'invention a plus particulièrement pour objet des substrats tels que définis ci- dessus, correspondant à une variante des séquences S3 et S4 dans laquelle la leucine N- terminale en position 203 est supprimée, à savoir les séquences S5 et S6 suivantes: S5: Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 11) S6: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 12) L'invention concerne également les fragments, ou métabolites, non fluorescents et fluorescents issus du clivage (figure 1) des substrats peptidiques de l'invention par la BoNT/A, les métabolites non fluorescents étant caractérisés en ce qu'ils comprennent le résidu Nop, et les métabolites fluorescents étant caractérisés en ce qu'ils comprennent le 15 résidu Pya.
L'invention a plus particulièrement pour objet les métabolites fluorescents susmentionnés issus du clivage des substrats peptidiques de l'invention par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop197-198R, à savoir les métabolites de formule: R-A-Pya-K-Nle-(L) -NH2 (SEQ ID NO: 13) dans laquelle n est tel que défini ci-dessus, et plus particulièrement: - le métabolite Ml fluorescent suivant, issu du clivage des substrats S1, S2, S3, et S4 par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop197-198R, M1: R-APya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 14) - le métabolite M2 fluorescent suivant, issu du clivage des substrats S5, et S6 par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop197-198R, M2: R-A-Pya-K- Nle-NH2 (SEQ ID NO: 15).
Les substrats conformes à la présente invention sont intéressants à plusieurs titres: - ils permettent de détecter rapidement au sein d'un liquide ou d'une substance la présence éventuelle de la toxine botulique de type A, à des concentrations inférieures à la dose létale chez l'homme, - ils présentent une très haute sélectivité vis à vis des autres toxines botuliques, - ils rendent possible le criblage à haut débit d'inhibiteurs potentiels de la toxine botulique de type A. En conséquence, la présente invention concerne l'utilisation d'un substrat tel que défini précédemment pour la mise en oeuvre de procédés de détection, d'identification et/ou de dosage de la BoNT/A ou d'un composé capable d'inhiber ou d'activer la BoNT/A, et pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de la présence de la BoNT/A dans un échantillon biologique déterminé.
Selon une variante préférée de l'invention, le composé à doser est un composé 10 capable d'inhiber la BoNT/A.
La présente invention a également pour objet un procédé pour détecter, identifier et/ou doser un composé capable d'inhiber la BoNT/A caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en présence en solution d'un substrat conforme à l'invention avec ladite BoNT/A ou sa chaîne légère (telles que décrites notamment dans Cai and Singh, Biochemistry (2001) 40, 4693-4702), et au moins un composé susceptible d'inhiber la BoNT/A; - la mesure de la fluorescence, émise par les métabolites fluorescents susmentionnés formés lors de l'étape précédente d'hydrolyse du substrat, en présence et/ou en l'absence dudit composé, une diminution de fluorescence entre la mesure effectuée en présence de ce composé et celle effectuée en l'absence de ce composé, indiquant alors que le composé testé est inhibiteur de BoNT/A.
Un composé auquel on applique le test défini ci-dessus pour déterminer son activité inhibitrice vis à vis de la BoNT/A peut être de nature' diverse, sans limitation et peut se présenter sous une forme isolée, être connu ou inconnu et/ou être présent dans une banque de composés, un extrait biologique.
L'addition de doses croissantes d'un composé capable d'inhiber l'activité enzymatique de la BoNT/A vis-à-vis d'un substrat conforme à la présente invention, se traduira par une diminution de l'intensité de la fluorescence due à la diminution de la quantité de métabolite formé par la BoNT/A. La mesure de cette intensité rapportée à une courbe étalon établie par mélange du substrat et du métabolite fluorescent formé, permet donc soit d'évaluer le pouvoir inhibiteur en pourcentage d'inhibition à une concentration donnée fixe du composé inhibiteur, soit de déterminer précisément son IC50 puis son Ki à l'aide du Km du substrat et de plusieurs concentrations du produit inhibiteur.
L'extrême sensibilité du dosage permet d'opérer dans des volumes très faibles (50 ou 100 l) avec des concentrations de l'ordre de 50 M du substrat choisi (Si à S6). Le test est donc utilisable en plaques à 96 puits ou plus, permettant sa robotisation avec détermination automatique des Ki lorsque le fluorimètre de lecture est relié à un ordinateur possédant un logiciel commercial approprié.
La présente invention propose donc un test d'identification d'inhibiteurs de la BoNT/A ainsi que la détermination de leur pouvoirs inhibiteurs par un essai fluorimétrique très rapide, reproductible et permettant des tests robotisables et très nombreux pouvant s'adapter à une sélection à haut débit de molécules inhibitrices.
La présente invention propose également la production de produits industriels nouveaux, éventuellement utilisables sous forme de kits, notamment comprenant des plaques de 96, 192 et 384 puits prêts à l'emploi, et contenant un substrat tel que défini ci-dessus selon l'invention, et le cas échéant de la BoNT/A éventuellement colyophilisée avec ledit substrat, auxquels on ajoute les réactifs nécessaires à la détermination des pouvoirs inhibiteurs ou activateurs des molécules testées, ou de la présence de la BoNT/A dans un échantillon déterminé.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de diagnostic de la présence de la BoNT/A, en particulier dans l'eau ou les aliments éventuellement contaminés, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un substrat conforme à l'invention.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de la présence de la BoNT/A dans l'organisme humain ou animal, mettant en oeuvre un substrat conforme à l'invention.
De telles méthodes de diagnostic comprennent: - une étape de mise en présence en solution d'un substrat conforme à l'invention avec un échantillon biologique déterminé (par exemple des prélèvements effectués sur des aliments, des liquides, ou des prélèvements sanguins humains, éventuellement contaminés par la BoNT/A); - la mesure de la fluorescence émise par les éventuels métabolites fluorescents susmentionnés formés lors de l'étape précédente, témoignant de la présence de BoNT/A dans ledit échantillon, qui peut être quantifiée à l'aide de courbes étalons appropriées, et le contrôle par rapport à un témoin positif et/ou un témoin négatif, - le cas échéant, l'élimination de la fluorescence émise lors de l'étape susmentionnée par addition d'un chélatant du zinc, comme par exemple, et de manière non limitative, l'éthylène diamine tétracétate EDTA qui inhibe l'activité métalloprotéasique de la BoNT/A (figure 3).
Les figures et exemples ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
Figures: - Figure 1: Comparaison de l'émission de fluorescence du substrat S1 (10"5M) et son métabolite Ml (à 5 10"7M correspond à 5% de dégradation). Excitation à 343 nm.
- Figure 2: Courbe d'étalonnage de la fluorescence pour la détermination des % de substrat dégradé au cours d'un dosage.
- Figure 3: Fluorescence émise par la dégradation du substrat S1 (50 mM) en 1 h par la BoNT/A et inhibition de la fluorescence (donc de l'activité enzymatique par l' EDTA).
Exemples
Exemple 1: Synthèse des peptides Les composés revendiqués peuvent être obtenus par les méthodes usuelles de la synthèse en phase solide selon la méthode de Merrifield sur un synthétiseur automatique comme par exemple l'appareil 431A de Applied Biosyst'ems. La chimie utilisée correspond à la technologie Fmoc et la protection des chaînes latérales permettant leur clivage par l'acide trifluoroacétique tel que décrit par E. Atherton et R.C. Sheppard(1989) dans Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach,ERL Press, Oxford.
Les couplages sont effectués selon des techniques conventionnelles à l'aide d'agents de couplage comme HATU, Bop, PyBrop et de préférence en utilisant le 30 dicyclohexylcarbodiimide en présence d'hydroxybenzotriazole.
La 1-pyrenylalanine est obtenue selon un procédé de synthèse asymétrique décrit dans la publication Soleilhac et al. (Anal. Biochem. (1996), 241, 120-127); La pureté des peptides est estimée supérieure à 99% par HPLC en phase inverse et leur identification est obtenue par spectrométrie de masse. Substrat S 1: Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 7): M (théo) 2233,53; MH+ (exp) 2234,20 Substrat S2: Ac-C-S-N-K-TR-I-D-E-A-N-Nop-R-A-Pya-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 8) : M (théo) 2336,67; MH+ (exp) 2337,98 Substrat S3: Ac-S-NK-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 9) : M (théo) 2232,55; MH+ (exp) 2233,78 Substrat S4: Ac-C-S-N-K-T-R-I-DQ-A-N-Nop-R-A-Pya-K-NIe-L-NH2 (SEQ ID NO: 10) : M (théo) 2335,69; MH+ (exp) 2336,48 Substrat S5: Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 11) : M (théo) 2119,39; MH+ (exp) 2120,54 Substrat S6: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D- Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 12) : M (théo) 2222,53; MH+ (exp) 2223,80 Métabolite M1: R-A-Pya-K-Nle-L- NH2 (SEQ ID NO:14) M (théo) 867,12; MH+ (exp) 868,24 Métabolite M2: R-A- Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 15).
M(théo) 756,96; MH+ (exp) 758,02
Exemple 2
Essai fluorimétrique de détection de la BoNT/A On incube le substrat (Si par exemple) 50 M pendant 1h avec une quantité inconnue de BoNT/A double chaîne à 37 C dans 100mL de tampon Hépes 20mM, pH 7,4, contenant de la BSA (lznglmL), du ZnSO4 (0,3mM) et du DTT (5mM). On arrête l'hydrolyse enzymatique en plaçant l'échantillon à 4 C, ou en ajutant 5 L d'HCl 2N, et on lit directement la fluorescence émise au fluorimètre (2 ex 343 nm, Xem 377 nm).
L'intensité de fluorescence mesurée est rapportée à une courbe étalon pour établir la quantité de BoNT/A présente dans l'échantillon. Les expériences effectuées avec plusieurs quantités de BoNT/A montrent que la précision atteint + 10% de la quantité de neurotoxine dans la gamme 1 ng/ml à 5 g/ml.
Claims (13)
1. Substrat peptidique reconnu sélectivement par la toxine botulique de type A, BoNT/A, caractérisée en ce qu'il comprend dans sa structure peptidique un fragment 5 Nop-(Z)-Pya dans lequel Z représente un enchaînement d'aminoacides, le dit fragment étant clivé par la dite toxine.
2. Substrat selon la revendication 1, caractérisé en ce que Z comprend de 2 à 4 aminoacides et de préférence 2 aminoacides.
3. Substrat selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment Nop-(Z)-Pya est choisi parmi les suivants: 1) Nop-R-A-Pya (SEQ ID NO: 2) 2) Nop-R-A-T-Pya (SEQ ID NO: 3) 3) Nop-R-A-T-K-Pya (SEQ ID NO: 4)
4. Substrat selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le fragment Nop-(Z)-Pya correspond à la séquence Nop-R-A-Pya (SEQ ID NO:2).
5. Substrat selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par la séquence suivante: Ac-(C)m-S-N-K-T-R-I-D-Xaal-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-(L) NH2 (SEQ ID NO: 6) dans laquelle: -n=0ou1, -m=0ou1, - Xaal représente E ou Q, - le résidu C-terminal est protégé par amidification, - lorsque m = 0, le résidu -S- N-terminal est protégé par acétylation, - et lorsque m = 1, le résidu -S- N-terminal est bloqué par un reste Acétylcystéine dont 30 la fonction thiol est immobilisée sur un support solide.
6. Substrat selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences S1 à S6 suivantes: S 1: Ac-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-NopR-A-Pya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO:
7) S2: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-E-A-N-Nop-R-APya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 8) S3: Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-KNle-L-NHZ (SEQ ID NO: 9) S4: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-LNH2 (SEQ ID NO: 10) S5: Ac-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 11) S6: Ac-C-S-N-K-T-R-I-D-Q-A-N-Nop-R-A-Pya-K-Nle-NH2 (SEQ ID NO: 12) 7. Métabolites non fluorescents et fluorescents issus du clivage des substrats peptidiques définis dans l'une des revendications 1 à 6, par la BoNT/A, les métabolites non fluorescents étant caractérisés en ce qu'ils comprennent le résidu Nop, et les métabolites fluorescents étant caractérisés en ce qu'ils comprennent le résidu Pya.
8. Métabolites fluorescents selon la revendication 7, issus du clivage des substrats peptidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop'97-198R, à savoir les métabolites de formule: R-A-Pya-K-Nle-(L) -NH2 (SEQ ID NO: 13) dans laquelle n est tel que défini dans la revendication 5.
9. Métabolites fluorescents selon la revendication 7 ou 8, suivants: - le métabolite M1 fluorescent suivant, issu du clivage des substrats S1, S2, S3, et S4 par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop197-198R, M1: R-APya-K-Nle-L-NH2 (SEQ ID NO: 14) - le métabolite M2 fluorescent suivant, issu du clivage des substrats S5, et S6 par la BoNT/A au niveau de la liaison Nop197-'98R, M2: R-A-Pya-K- Nle-NH2 (SEQ ID NO: 15).
10. Utilisation d'un substrat selon l'une des revendications 1 à 6, pour la mise 30 en oeuvre de procédés de détection, d'identification et/ou de dosage de la BoNT/A ou d'un composé capable d'inhiber ou d'activer la BoNT/A, et pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de la présence de la BoNT/A dans un échantillon biologique déterminé.
11. Procédé pour détecter, identifier et/ou doser un composé capable d'inhiber 5 la BoNT/A, caractérisé en ce qu'il comprend: - la mise en présence en solution d'un substrat selon l'une des revendications 1 à 6 avec la BoNT/A et au moins un composé susceptible d'inhiber la BoNT/A - la mesure de la fluorescence, émise par les métabolites fluorescents selon l'une des revendications 7, 8 ou 9 formés lors de l'étape précédente, en présence et/ou en l'absence dudit composé, une diminution de fluorescence entre la mesure effectuée en présence de ce composé et celle effectuée en l'absence de ce composé, indiquant alors que le composé testé est inhibiteur de BoNT/A.
12. Méthode de diagnostic in vitro de la présence de la BoNT/A dans un 15 échantillon biologique déterminé, comprenant: - une étape de mise en présence en solution d'un substrat selon_ l'une des __ revendications 1 à 6 avec un échantillon biologique déterminé; - la mesure de la fluorescence émise par les éventuels métabolites fluorescents selon l'une des revendications 7 à 9 formés lors de l'étape précédente, témoignant de la présence de BoNT/A dans ledit échantillon, qui peut être quantifiée à l'aide de courbes étalons appropriées, et le contrôle par rapport à un témoin positif et/ou un témoin négatif, - le cas échéant, l'élimination de la fluorescence émise lors de l'étape susmentionnée par addition d'un chélatant du zinc, comme par exemple, et de manière non limitative, l'éthylène diamine tétracétate EDTA qui inhibe l'activité métalloprotéasique de la BoNT/A.
13. Kits comprenant un substrat selon l'une des revendications 1 à 6, et, le cas échéant de la BoNT/A, ainsi que les réactifs nécessaires à la détermination des pouvoirs inhibiteurs ou activateurs des molécules testées, ou de la présence de la BoNT/A dans un échantillon déterminé.
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