JP4966469B2 - プロテアーゼ又はペプチダーゼの蛍光検出 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は一般に、ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する阻害能をもつ化合物の同定及び／又は特性解明を目的とした、これらペプチダーゼ又はプロテアーゼの基質へのPyA-(Z)X-pNF残基の使用に関する。本発明は特に、エンドセリン変換酵素の検定及び／又は同酵素の阻害剤の同定を目的とした配列への、かかる残基の、より具体的にはPyA-pNF残基の使用に関する。
【０００２】
動脈圧の調節は数種のペプチドの制御を受けるが、それらのペプチドは血管収縮作用をもつか(特にアンギオテンシンII、エンドセリン類及びウロテンシンの場合)、又は血管拡張作用をもつ(特にブラジキニンの場合、又は水分と塩化ナトリウムの排出でも一役買っている心房性ナトリウム利尿ペプチドの場合)。
これらすべてのペプチドのうち、2つジスルフィド架橋を伴う環状部分と短い線状部分をもつペプチド、エンドセリン-1 (ET-1)は、特に心臓レベル(冠状動脈)の血管壁の平滑筋に作用するきわめて強力な血管収縮物質であるとされている(図1)。
【０００３】
ET-1が属するアイソペプチド・ファミリーには、ET-1との違いが二、三のアミノ酸残基の違いにとどまるエンドセリン-2 (ET-2)とエンドセリン-3 (ET-3)も含まれる(図2)。
エンドセリン類は内皮細胞により不活性型の前駆体「ビッグエンドセリン」として分泌され、それがエンドセリン変換酵素(ECE)のZnメタロペプチダーゼによる開裂を経て活性型ペプチドとなる。たとえばET-1の場合には、ECE-1が38アミノ酸残基からなるビッグエンドセリン-1のTrp21-Val22結合を加水分解して2つの断片を生成するが、そのうちのN-末端断片が活性型のET-1である。ET-3の場合には、開裂するのはTrp21-Ile22結合である。
【０００４】
ビッグ-ET-1とET-1は血漿中で検出される。またECEはサイトゾル又は膜結合酵素であり、この場合は、短い細胞内部分、約25アミノ酸残基の膜貫通ヘリックス、さらに活性部位を含む非常に大きな細胞外ドメインからなるのが特徴である。ECEはジスルフィド架橋で結合された2つのまったく同じサブユニットからなる(Shimada et al., Biochem. J. (1996) 315, 863-867)。
【０００５】
ビッグエンドセリンを低用量投与すると動脈圧が大幅に上昇し、該前駆体の分解によるエンドセリンの形成を裏付ける。この応答はET-1受容体の拮抗薬により阻害することができる。
従って、心臓血管疾患できわめて多数の応用分野が見込まれる化合物類を用いてECEを阻害する利点は大きい。そうした応用分野としては、特に心筋梗塞、狭心症、脳出血後の血管痙攣、抹消血管痙攣、肺高血圧症、心／腎不全、糖尿病性疾患及び喘息の治療、並びに再狭窄や心／血管線維症の予防などが挙げられよう。
【０００６】
たとえば、ある種の心臓血管病はいずれ、エンドセリン類を生成させる酵素すなわちECEを阻害してエンドセリン類の循環濃度を低下させることにより、予防又は少なくとも軽減が可能になるかもしれない。
しかし、そうした阻害剤を徹底的に探索するには、きわめて多数の検定を短期間に実施できるようにするための自動化が可能な、単純な同定試験法を開発しなければならない。
【０００７】
さて、今日の試験法は難しい、時間がかかりすぎる、比較的非特異的である、費用がかかりすぎるといった難点がある。
ビッグ-ETに対するECEの作用で生成される2つの断片をHPLCで検定するという試験方法は、多量の酵素とビッグ-ETを必要とするのが大きな難点である。
125I標識ビッグ-ETの分解、125I-ET-1の生成、及びその受容体への結合による同定を基礎にした試験法は高速大量処理の検定には使用できない(Fawzi, A.B., Clemen, R.M. & Wright, D.L. (1994) Anal. Biochem. 222, 342-350)。ET-1とその受容体の結合により誘発されるcGMPの増加を測定する細胞検定法も同断である。
【０００８】
放射免疫測定法(RIA)は非常に複雑な一連の連続試験を必要とし、選択性が比較的低く、またビッグ-ETと125I-ET-1の両方を必要とする。これらの複雑な検定法は、試験法の自動化による厖大な潜在阻害剤の高速大量処理スクリーニングには不向きであり、使用期限の短い放射性ヨウ化エンドセリンを合成又は購入する必要もある。
【０００９】
もっと最近では、Trp-Val開裂部位を含む21アミノ酸残基からなるペプチドのN-末端分へのトリチウム化プロピオニル残基の結合によって得られる放射性基質の使用を基礎とする試験法が提唱されている(FR No. 96 02673)。生成した放射性N-末端代謝産物を有機溶媒で撹拌しながら抽出し、この溶媒試料を取り出してシンチレーション液と混合してから、カウンターで放射能を測定するというものである。この場合も、一連のステップが検定の自動化になじまないうえに、放射性元素の使用が、従ってトリチウム化基質の定期的な合成が必要となる。
【００１０】
本発明の目的は、前述の諸試験法に見られる難点の解消を可能にする新規検定試験法の提供に他ならない。
もっと具体的に言えば、本発明は修飾酸L-パラ-ニトロフェニルアラニン(pNF)を結合させたピレニルアラニン(PyA)の使用が診断目的に特に有利である旨の立証を基礎にしている。
【００１１】
ピレニルアラニンは蛍光能が大きい合成アミノ酸である。好都合にも、このPyA残基の蛍光能はPyAの近くに、好ましくは近接して、pNF残基が存在するとほぼ完全に抑制される。
従って、PyA本来の蛍光能はPyA残基がpNF残基の抑制作用をもはや受けなくなって初めて発現する。それはたとえば、特にプロテアーゼ又はペプチダーゼ(それがメタロペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼのいずれの種類に属するかは問わない)による開裂でpNF残基から物理的に切り離されたときである。
【００１２】
従って、PyA-pNF型の残基は、基質の中に、特にペプチド又は擬似ペプチド配列の中に導入して、開裂の出現を蛍光で視覚化しようとするときに、特に有利な道具となりそうである。
従って本発明の第1の態様は、PyAとpNFの間に確立された直接又は間接の結合を開裂させる傾向のある化合物類及び／又は該結合を開裂させうる既知化合物に対する阻害又は活性化作用をもつ化合物類の蛍光法による検出、同定及び／又は検定を目的とした、基質への
PyA-(Z)x-pNF残基
の使用に関連するが、式中ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸残基の配列を表わし、またxは1又は0を表わす。
【００１３】
請求項記載の使用は、プロテアーゼ又はペプチダーゼ型の化合物類を、その種類たとえばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロペプチダーゼといった種類を問わず検出、同定及び／又は検定するうえで、格別に有利である。
本発明は、PyAとpNFの間に確立された結合の開裂による両残基の分離に起因する蛍光の出現を基礎とする。
【００１４】
従ってZは、好ましくは20種の天然アミノ酸からなるリストより選択される4個までの同じ又は異なるアミノ酸残基を含むことができる。Zで表わされる該アミノ酸鎖の長さは実際には、該ペプチダーゼの基質特異性に応じて、またPyAとpNFを隔てる距離がPyAによる本来の蛍光発光に対するpNFの抑制効果の発現と両立しうるように、調節することになる。
【００１５】
こうした調節のための第2の基準は、PyA-(Z)x-pNFを含む基質を本来的に開裂する化合物の特異性と親和性の保持という課題に関連する。従って、PyA-(Z)x-pNF残基の選択はこれら2つの基準を考慮して行われる。
ペプチジル残基PyA-(Z)x-pNFの導入先となる基質はペプチド基質である。
本発明の一実施態様はECEにより認識されるペプチド配列へのPyA-(Z)x-pNF残基の、好ましくはPyA-pNFの導入に関する。こうして、ECEもしくはECE阻害剤又は活性化剤の同定、検出及び／又は検定が可能になる。PyA-pNF残基の加水分解は蛍光をきわめて大幅に(基質の分解が5%の場合で約150〜800倍)増強する。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様によれば、ジペプジジル残基PyA-pNFはECEにより認識されるペプチド配列中の、該残基により置換される天然の開裂部位に存在する。
意外にも、ジペプジジル残基PyA-pNFはECEによる開裂が可能であると判明しており、また同残基を含むペプチド配列に対するECEの親和性又は特異性を損なわない。
【００１７】
該ペプチド配列がビッグ-ET-1又は-2のペプチド配列に相当する場合には置換される結合はTrp21-Val22であり、ビッグ-ET-3のペプチド配列に相当する場合には置換される結合はTrp21-Ile22である。
出発物として使用されるビッグ-ET-1 (19-35)は通常の方法で、たとえば特にFmoc技術により、Applied Biosystemsの431Aモデルなどのような固相自動合成機を使用して、参考文献E. ATHERTON and R.C. SHEPPARD (1989) Solid Phase Peptide Sythesis: a practical approach, IRL Press, Oxfordに記載の要領で調製することができる。
【００１８】
請求項記載の使用はきわめて高感度であるため、2〜50μM程度の低基質濃度に対して50〜100μl程度のごく少量で間に合う。
本発明の第2の態様は一般式Ｉ
Ac-(X1)n-PyA-(Z)x-pNF-(X’1)m-R (Ｉ)
で示される生成物に関連するが、式中
−記号X1とX’1はアミノ酸残基である;
−ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸残基の鎖であり、またxは1又は0である;
−RはOH又はNH2基である;
−Acはアセチル基である;
−nは2〜6の整数、またmは0〜16の、好ましくは3〜13の整数である。
【００１９】
こうして、本発明の試験法は式Ｉで示されるペプチド類の使用を基礎とするが、該ペプチド類のN-末端部分はアシル化されており、それにはアミノペプチダーゼによる開裂からの保護及び加水分解によって生成するN-末端断片の疎水性の強化という少なくとも2つの利点がある。
蛍光の発現は一般式II
Ac-(X1)n-PyA-(Z’)x (II)
で示される代謝産物の開裂による生成に関連するが、式中
−X1とnは前記のとおりである;
−Z’はL型系列の1個以上の天然又は非天然アミノ酸残基である;
−xは1又は0である。
より好ましくは、式Ｉ及びII中xは0である。
【００２０】
本発明の第1変法によれば、式Ｉの化合物類は一般式IA
Ac-(Z1)-(Z2)-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-(Z4)-(Z5)-(Z6)-COOH (SEQ ID No.1) (IA)
に相当するが、式中Z1、Z2、Z4、Z5及びZ6は同じでも異なってもよいが、1個のアミノ酸残基を表わす。
【００２１】
より具体的には、式Ｉ又はIA中
−Z1とZ2は次のとおりである:
Z1とZ2が単結合であるか、
又はZ1が単結合であり、Z2がアミノ酸Aspであるか、
又はZ1、Z2がそれぞれアミノ酸Leu、Aspである;
−Z4、Z5及びZ6は次のとおりである:
Z4、Z5及びZ6が単結合であるか、
又はZ5とZ6が単結合であり、Z4がアミノ酸Proであるか、
又はZ6が単結合であり、Z4、Z5がそれぞれアミノ酸Pro、Argであるか、
又はZ4、Z5、Z6がそれぞれアミノ酸Pro、Arg、Serである。
【００２２】
ECEによって認識される基質は、特にこの一般式IAにより網羅される。
ECEによって認識され一般式Ｉに従う基質の代表例としては
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-
Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2
(SEQ ID No.3)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.8)
が特に挙げられよう。
【００２３】
SEQ ID No.2はさらに、一般式IAにも従う。
同様に、式IIで示される代謝産物の代表例としては
Ac-Ile-Ile-PyA (SEQ ID No.4)
Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Gln-PyA (SEQ ID No.5)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala (SEQ ID No.9)
が特に挙げられよう。
【００２４】
本発明の第2変法によれば、一般式Ｉの化合物類は一般式IB
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-(Z)x-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.6) (IB)
に相当するが、式中Zとxの定義は一般式Ｉの場合と同じである。
同変法によれば、生成する代謝産物は一般式IIa
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-(Z’)x (SEQ ID No.7)
に相当するが、式中Z’とxの定義は一般式Ｉの場合と同じである。
【００２５】
本発明の一般式IBで示される基質の例としては、次のものが挙げられよう:
・ セリンプロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのカリクレインの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Ile-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.10)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys (SEQ ID No.11)]
・ システインプロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのパパインの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-Lys-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.12)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu (SEQ ID No.13)]
・ アスパラギン酸プロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのペプシンの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.14)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu (SEQ ID No.13)]
・ メタロエンドペプチダーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのネプリライシンの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Phe-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.15)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys (SEQ ID No.11)]
・ メタロジペプチジルカルボキシペプチダーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのACEの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Ala-Gly-Phe-pNF-OH
(SEQ ID No.16)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-PyA-Ala-Gly (SEQ ID No.17)]
本発明の化合物類の調製は当業者の技術範囲内である。
【００２６】
請求項記載の化合物類は、たとえばApplied Biosystemsの431A装置などのような自動合成機を用いて、Merrifield法による通常の固相合成法で得られよう。使用される化学反応はE. Atherton and R.C. Sheppard (1989), “Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford”に記載されているように、Fmoc技術と側鎖の保護に対応し、トリフルオロ酢酸による側鎖の開裂を可能にする。
【００２７】
式Ｉの化合物類を生成するためのアシル化反応は技術上周知の条件下で行うことができる。
L-ピレニルアラニンは、J.M. Soleilhac et al., Anal. Biochem. (1996) 241, 120-127に記載の不斉合成法で得られる。最終生成ペプチド類の純度は逆相HPLCで99%超と見積もられ、またペプチド類の同定はエレクトロスプレー質量分析で行う。
【００２８】
カップリングは、常法により、HATU又はPyBropなどのようなカップリング剤を用いて、また好ましくはジクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行う。
本発明の別の態様は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロペプチダーゼから選択されるプロテアーゼの、より好ましくはECEの、検出、同定及び／又は検定、並びに該酵素に対する阻害能又は活性化能を有する化合物類の研究を目的とした、前述の一般式Ｉで示される化合物の使用に関する。本発明の好ましい変法によれば、検定対象の化合物はECEであるか又はECEに対する阻害能又は活性化能を有する化合物である。
【００２９】
本発明の主題はまた、ECEに対する阻害能又は活性化能を有する化合物を検出、同定及び／又は検定する方法であり、該方法は
− ECEによって認識される一般式Ｉの化合物を溶液中で該ECE及び該ECEを阻害又は活性化する傾向のある1以上の化合物と接触させるステップ、
− 検出、同定及び／又は検定対象の化合物の存在下で、また適切な場合には不存在下で、放出される蛍光を測定するステップ、及び
− 蛍光の不存在又は減少が、ECEを阻害する化合物の存在を示唆するステップを含むことを特徴とする。
【００３０】
3化合物を接触させる順序は実際には決定因ではない。まず一般式Ｉの化合物をECEと接触させ、次に阻害剤又は活性化剤と推定される化合物を後続のステップで導入することも可能である。
別の変法では、一般式Ｉの化合物をまず検定対象の化合物と、次いでECEと接触させる。
【００３１】
ECE阻害活性を測定する試験の対象となる前述の化合物は種類が無制限に多様であろうし、またたとえばホスホンアミド類、ホスファミド類およびそれら化合物の誘導体、もしくはメタロプロテイナーゼ類たとえばチオール誘導体、カルボキシレート又はヒドロキサメートから選択することができる。また、そのECE阻害活性が判明しているホスホラミドンやN-(フェニルエチルホスホニル)-Leu-Trp (TAKEDA)などの化合物も挙げられよう。
【００３２】
試験対象の化合物は単離形態をとってもよいし、既知でも未知でも、及び／又は化合物ライブラリー、生物学的抽出物又は水の中に存在してもよい。
好ましい変法によれば、該基質は
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-
Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)(ペプチド1s)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2
(SEQ ID No.3)(ペプチド2s)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.8)(ペプチド3s)
である。
【００３３】
たとえば一般式Ｉの基質に対するECEの酵素活性を阻害しうる化合物の逓増量の追加は、ECEにより形成される式Ac-Ile-Ile-PyA (ペプチド1m)、Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Glu-PyA (SEQ ID No.5) (ペプチド2m)又はAc-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala (SEQ ID No.9) (ペプチド3m)の代謝産物に由来する蛍光の強度を低下させ、その蛍光強度が数時間ほとんど変わらないという結果を招くであろう。基質と形成される蛍光代謝産物との混合物で確立される標準曲線と関連づけて行われる該強度の測定は従って、生成物Pの任意の規定濃度における阻害率としての阻害能を評価するか、又はそのIC50を、次いでそのKIを、基質のKmといくつかの生成物P濃度を用いて精密に算出することを可能にする。
【００３４】
該試験法は感度がきわめて高く、ごく少量(100μl)でも、基質1sなら20μM程度の濃度(すなわち検定当たり4.43μgに対応する2 nmole)に対し、又は基質2sなら5μMに対して、有効である。従って、該試験法は96穴以上のプレートにも楽に使用することが可能であり、適当な市販ソフトウエアを備えたコンピューターに読取り蛍光光度計を連結すれば、KI値の自動計算による試験の自動化が可能になる。
【００３５】
ペプチド1s、2s及び3sはECEとインキュベートすると、HPLCによる反応系の分析から明らかなように、PyA-pNFペプチド結合の単一開裂に対応する2つの代謝産物を生成するだけである。
好都合にもこれらの基質はきわめて選択性が高い。というのも、ECEと同じファミリーに属する精製Znメタロペプチダーゼ類たとえばネプリライシン(NEP)又はアンギオテンシン変換酵素(ACE)と37℃で2時間インキュベートした後にHPLCで分析しても開裂はまったく観測されないからである。
【００３６】
最後に、該試験法は高感度、高特異性であるため、精製ECE類 (Takahashi et al., J. Biol. Chem. (1993) 268, 21395-21398) だけでなく、ECEをその中に予め導入したCHO細胞の膜調製品 (Xu et al., Cell (1994) 78, 473-485)も、又はECE濃度が高い動物組織(ラットの肺又は脳)さえも、使用が可能である。ECEの配列と構造は生物種間の保存度がきわめて高く、ラットとヒトでは特にそうであるため、精製又は非精製げっ歯類ECEで得られる結果(たとえば阻害剤のKI値)は組換えヒト酵素で得られる結果と全く同じである。
【００３７】
本発明は従って、ごく迅速な、再現性の高い蛍光光度検定法を用いてECE阻害剤を同定するための、またその阻害能を決定するための試験法を提供して、自動化が可能な、従ってまた阻害性分子の高速大量スクリーニングへの適合が可能なきわめて多数の試験を行えるようにする。
本発明はまた、新規工業製品の生産を可能にするが、該製品は凍結乾燥ECEか又は一般式Ｉ及び1s、2s及び3sの基質を入れてあるインスタント96穴、192穴及び384穴プレートを含むキットとして使用することも随意に可能であり、その場合には所要の試薬を加えれば一連の分子の阻害能を、随意にコンピューターを用いて、決定することができる。
【００３８】
本発明のもう1つの態様は、前記の式Ｉ化合物を使用して、血漿中の異常なエンドセリン変換酵素濃度に関連した病理を診断する方法に関する。
添付の図と実施例は本発明の非限定的な説明を目的に示す。
【００３９】
実施例1
ペプチドの調製
ピレニルアラニン残基をもつペプチド1s及び2s並びに対応する蛍光代謝産物の調製を、“Solid Phase Peptide Sythesis: a practical approach, IRL Press, Oxford”に記載の要領で、固相自動合成機で、Merrifield法により、Fmoc技術と一般にt-ブチル、エーテル又はエステル、トリチル又はBoc残基の形をとる側鎖の保護とを用いて行う。
【００４０】
カップリングはN-メチルピロリドンに溶かしたジシククロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行う。側鎖の開裂とトリフルオロ酢酸による脱保護を経て目的のペプチドが得られる。溶液を減圧で蒸発させ、ペプチドをエーテルで沈殿させ、HPLCによりVyDac C18カラムで精製する。
ペプチド類の分析には質量分析と1H NMR (400又は600 MHz)を用いる。
化合物1s Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
MH+ (exp): 2101.1 ; MH+ (theo): 2102.7
化合物2s Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID No.3)
MH+ (exp): 1558.8 ; MH+ (theo): 1559.7
これらのペプチドは凍結乾燥後に粉末として暗所に4℃で又は−20℃で、変質せずに6か月余り保存することができる。同様に、基質ストック液(10-3〜10-4 M)もまた暗所に4℃で数週間保存することができる。
【００４１】
実施例2
2.1: 材料と方法
種々のECE含有調製品、たとえばCos-1細胞中で発現する組換えヒトECE-1c (Shimada et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 18275-18278) 又はCHO細胞 (Xu et al., Cell (1994) 78, 473-485) などが使用可能である。いずれの場合も、ウェスタン・ブロット法で抗体を用いて該酵素の有無を試験し、その濃度を精製酵素との比較で評価する。
【００４２】
ECE活性は96穴プレートを使用して一般に次の条件で測定する:
100μlの50mMトリス-マレエート緩衝液(pH 6.5)、20μM又は5μMの蛍光ペプチド1s又は2s、及びECEの純度に応じてかつ蛍光基質の開裂が5%未満に止まるように希釈した10μlのECE液。インキュベーションは使用基質次第で20分間〜1時間、20℃〜37℃で、潜在阻害剤の存在下又は不存在下に、その濃度を(たとえば5×10-6Mや10-6Mに) 固定して又はKI値を求められるよう10-11〜10-5Mの範囲で逓増させて行う。反応を種々の方法で、たとえば90℃への加熱、4℃への急冷、最終容量の20%を限度とするジオキサンなどの有機溶媒の添加により停止させ、次いで随意に自動分析装置へと連結した蛍光光度計(λex = 340nm; λem = 400 nm)で値を読み取る。ネットワーク蛍光光度計の使用は377nmでの蛍光読取りにより検定感度をさらに大幅に向上させる。コントロール試験は諸々の試薬の存在下に、ただしECEを用いずに、又は90℃、5分間の熱処理で予め不活性化したECEを用いて、行う。ENZFITTERソフトウエアを用いて計算した基質のKm値(基質に対する酵素の親和性を表わす定数)は次のとおりである:
1s, Km = 22.1±0.9 μM;
2s, Km =2±0.5 μM.
阻害剤のKI値は、種々の濃度での減衰率及び標準範囲との比較を用いて自動的に求めることができる。IC50値が蛍光の観測値から直接、線形近似後に得られるので、それをCheng-Prussof式、KI = IC50/1 + ([S]/ Km)に代入すればKIが得られる(式中[S]は基質濃度である)。
【００４３】
2.2: 阻害剤の不存在下での蛍光ペプチド1s及び2sに関するECE活性の検定
基質1s及び2sの蛍光は、またそれらの代謝産物の蛍光も、阻害剤の不存在下に評価した。採用したプロトコールは前述のとおりである。
図3a及び3bはそれぞれ、ペプチド1sとその代謝産物1m及びペプチド2sとその代謝産物2mの蛍光発光スペクトルを示す。
【００４４】
生成物は、基質選択性の検証を目的に、HPLCでヌクレオシルC18カラム[7μm/300Å(4.6×70mm)により、緩衝液B [TFAのCH3CH/H2O(容量比9/1) 0.038%溶液]と緩衝液Bの40〜47%／10分グラジエントを用いて分析する(送液流量1ml毎分)。
いずれの場合でも、L.PyA-L.pNFジペプチドに単一開裂部位が観測され、生成代謝産物は2つだけであった。
【００４５】
実施例3
いくつかの化合物の阻害作用を実施例2の場合と同じプロトコールで評価した。
試験化合物は次のとおりである:
採用した個別検定条件は次のとおりである:
【表１】
* 6N HCl又は80℃、10分間の加熱処理で変性させた酵素を使用するとブランクの残留蛍光はほとんど変わらない。
【００４６】
プレインキュベーションを37℃で10分間行う。次いでECE基質を所定量加える。全混合液を37℃で20分間〜1時間インキュベートし、冷却により、又はジオキサン(20μl)添加により反応を停止させる。
蛍光プレートリーダーでの読取りは4℃で、次の個別条件下で行う: 励起光波長340nm、観測光波長400nm、利得85。
【００４７】
検定は96穴プレートで行う。
表Ｉは試験化合物の内容と濃度をウェルごとに示している。化合物の試験は2濃度で実施した。
【表２】
実施例4
表IIは蛍光強度の測定値をウェルごとに示している。低蛍光値は試験化合物の強い阻害活性を物語る。化合物Pの阻害活性は完全に検証されている。
【００４８】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ビッグエンドセリンのペプチド配列。
【図２】 エンドセリンET-1、ET-2及びET-3のペプチド配列。
【図３】 ペプチド1sとその代謝産物1mの蛍光発光スペクトルを示すグラフ(図3a)及びペプチド2sとその代謝産物2mの蛍光発光スペクトルを示すグラフ(図3b)。
【配列表】
本発明は一般に、ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対する阻害能をもつ化合物の同定及び／又は特性解明を目的とした、これらペプチダーゼ又はプロテアーゼの基質へのPyA-(Z)X-pNF残基の使用に関する。本発明は特に、エンドセリン変換酵素の検定及び／又は同酵素の阻害剤の同定を目的とした配列への、かかる残基の、より具体的にはPyA-pNF残基の使用に関する。
【０００２】
動脈圧の調節は数種のペプチドの制御を受けるが、それらのペプチドは血管収縮作用をもつか(特にアンギオテンシンII、エンドセリン類及びウロテンシンの場合)、又は血管拡張作用をもつ(特にブラジキニンの場合、又は水分と塩化ナトリウムの排出でも一役買っている心房性ナトリウム利尿ペプチドの場合)。
これらすべてのペプチドのうち、2つジスルフィド架橋を伴う環状部分と短い線状部分をもつペプチド、エンドセリン-1 (ET-1)は、特に心臓レベル(冠状動脈)の血管壁の平滑筋に作用するきわめて強力な血管収縮物質であるとされている(図1)。
【０００３】
ET-1が属するアイソペプチド・ファミリーには、ET-1との違いが二、三のアミノ酸残基の違いにとどまるエンドセリン-2 (ET-2)とエンドセリン-3 (ET-3)も含まれる(図2)。
エンドセリン類は内皮細胞により不活性型の前駆体「ビッグエンドセリン」として分泌され、それがエンドセリン変換酵素(ECE)のZnメタロペプチダーゼによる開裂を経て活性型ペプチドとなる。たとえばET-1の場合には、ECE-1が38アミノ酸残基からなるビッグエンドセリン-1のTrp21-Val22結合を加水分解して2つの断片を生成するが、そのうちのN-末端断片が活性型のET-1である。ET-3の場合には、開裂するのはTrp21-Ile22結合である。
【０００４】
ビッグ-ET-1とET-1は血漿中で検出される。またECEはサイトゾル又は膜結合酵素であり、この場合は、短い細胞内部分、約25アミノ酸残基の膜貫通ヘリックス、さらに活性部位を含む非常に大きな細胞外ドメインからなるのが特徴である。ECEはジスルフィド架橋で結合された2つのまったく同じサブユニットからなる(Shimada et al., Biochem. J. (1996) 315, 863-867)。
【０００５】
ビッグエンドセリンを低用量投与すると動脈圧が大幅に上昇し、該前駆体の分解によるエンドセリンの形成を裏付ける。この応答はET-1受容体の拮抗薬により阻害することができる。
従って、心臓血管疾患できわめて多数の応用分野が見込まれる化合物類を用いてECEを阻害する利点は大きい。そうした応用分野としては、特に心筋梗塞、狭心症、脳出血後の血管痙攣、抹消血管痙攣、肺高血圧症、心／腎不全、糖尿病性疾患及び喘息の治療、並びに再狭窄や心／血管線維症の予防などが挙げられよう。
【０００６】
たとえば、ある種の心臓血管病はいずれ、エンドセリン類を生成させる酵素すなわちECEを阻害してエンドセリン類の循環濃度を低下させることにより、予防又は少なくとも軽減が可能になるかもしれない。
しかし、そうした阻害剤を徹底的に探索するには、きわめて多数の検定を短期間に実施できるようにするための自動化が可能な、単純な同定試験法を開発しなければならない。
【０００７】
さて、今日の試験法は難しい、時間がかかりすぎる、比較的非特異的である、費用がかかりすぎるといった難点がある。
ビッグ-ETに対するECEの作用で生成される2つの断片をHPLCで検定するという試験方法は、多量の酵素とビッグ-ETを必要とするのが大きな難点である。
125I標識ビッグ-ETの分解、125I-ET-1の生成、及びその受容体への結合による同定を基礎にした試験法は高速大量処理の検定には使用できない(Fawzi, A.B., Clemen, R.M. & Wright, D.L. (1994) Anal. Biochem. 222, 342-350)。ET-1とその受容体の結合により誘発されるcGMPの増加を測定する細胞検定法も同断である。
【０００８】
放射免疫測定法(RIA)は非常に複雑な一連の連続試験を必要とし、選択性が比較的低く、またビッグ-ETと125I-ET-1の両方を必要とする。これらの複雑な検定法は、試験法の自動化による厖大な潜在阻害剤の高速大量処理スクリーニングには不向きであり、使用期限の短い放射性ヨウ化エンドセリンを合成又は購入する必要もある。
【０００９】
もっと最近では、Trp-Val開裂部位を含む21アミノ酸残基からなるペプチドのN-末端分へのトリチウム化プロピオニル残基の結合によって得られる放射性基質の使用を基礎とする試験法が提唱されている(FR No. 96 02673)。生成した放射性N-末端代謝産物を有機溶媒で撹拌しながら抽出し、この溶媒試料を取り出してシンチレーション液と混合してから、カウンターで放射能を測定するというものである。この場合も、一連のステップが検定の自動化になじまないうえに、放射性元素の使用が、従ってトリチウム化基質の定期的な合成が必要となる。
【００１０】
本発明の目的は、前述の諸試験法に見られる難点の解消を可能にする新規検定試験法の提供に他ならない。
もっと具体的に言えば、本発明は修飾酸L-パラ-ニトロフェニルアラニン(pNF)を結合させたピレニルアラニン(PyA)の使用が診断目的に特に有利である旨の立証を基礎にしている。
【００１１】
ピレニルアラニンは蛍光能が大きい合成アミノ酸である。好都合にも、このPyA残基の蛍光能はPyAの近くに、好ましくは近接して、pNF残基が存在するとほぼ完全に抑制される。
従って、PyA本来の蛍光能はPyA残基がpNF残基の抑制作用をもはや受けなくなって初めて発現する。それはたとえば、特にプロテアーゼ又はペプチダーゼ(それがメタロペプチダーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼのいずれの種類に属するかは問わない)による開裂でpNF残基から物理的に切り離されたときである。
【００１２】
従って、PyA-pNF型の残基は、基質の中に、特にペプチド又は擬似ペプチド配列の中に導入して、開裂の出現を蛍光で視覚化しようとするときに、特に有利な道具となりそうである。
従って本発明の第1の態様は、PyAとpNFの間に確立された直接又は間接の結合を開裂させる傾向のある化合物類及び／又は該結合を開裂させうる既知化合物に対する阻害又は活性化作用をもつ化合物類の蛍光法による検出、同定及び／又は検定を目的とした、基質への
PyA-(Z)x-pNF残基
の使用に関連するが、式中ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸残基の配列を表わし、またxは1又は0を表わす。
【００１３】
請求項記載の使用は、プロテアーゼ又はペプチダーゼ型の化合物類を、その種類たとえばセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロペプチダーゼといった種類を問わず検出、同定及び／又は検定するうえで、格別に有利である。
本発明は、PyAとpNFの間に確立された結合の開裂による両残基の分離に起因する蛍光の出現を基礎とする。
【００１４】
従ってZは、好ましくは20種の天然アミノ酸からなるリストより選択される4個までの同じ又は異なるアミノ酸残基を含むことができる。Zで表わされる該アミノ酸鎖の長さは実際には、該ペプチダーゼの基質特異性に応じて、またPyAとpNFを隔てる距離がPyAによる本来の蛍光発光に対するpNFの抑制効果の発現と両立しうるように、調節することになる。
【００１５】
こうした調節のための第2の基準は、PyA-(Z)x-pNFを含む基質を本来的に開裂する化合物の特異性と親和性の保持という課題に関連する。従って、PyA-(Z)x-pNF残基の選択はこれら2つの基準を考慮して行われる。
ペプチジル残基PyA-(Z)x-pNFの導入先となる基質はペプチド基質である。
本発明の一実施態様はECEにより認識されるペプチド配列へのPyA-(Z)x-pNF残基の、好ましくはPyA-pNFの導入に関する。こうして、ECEもしくはECE阻害剤又は活性化剤の同定、検出及び／又は検定が可能になる。PyA-pNF残基の加水分解は蛍光をきわめて大幅に(基質の分解が5%の場合で約150〜800倍)増強する。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様によれば、ジペプジジル残基PyA-pNFはECEにより認識されるペプチド配列中の、該残基により置換される天然の開裂部位に存在する。
意外にも、ジペプジジル残基PyA-pNFはECEによる開裂が可能であると判明しており、また同残基を含むペプチド配列に対するECEの親和性又は特異性を損なわない。
【００１７】
該ペプチド配列がビッグ-ET-1又は-2のペプチド配列に相当する場合には置換される結合はTrp21-Val22であり、ビッグ-ET-3のペプチド配列に相当する場合には置換される結合はTrp21-Ile22である。
出発物として使用されるビッグ-ET-1 (19-35)は通常の方法で、たとえば特にFmoc技術により、Applied Biosystemsの431Aモデルなどのような固相自動合成機を使用して、参考文献E. ATHERTON and R.C. SHEPPARD (1989) Solid Phase Peptide Sythesis: a practical approach, IRL Press, Oxfordに記載の要領で調製することができる。
【００１８】
請求項記載の使用はきわめて高感度であるため、2〜50μM程度の低基質濃度に対して50〜100μl程度のごく少量で間に合う。
本発明の第2の態様は一般式Ｉ
Ac-(X1)n-PyA-(Z)x-pNF-(X’1)m-R (Ｉ)
で示される生成物に関連するが、式中
−記号X1とX’1はアミノ酸残基である;
−ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸残基の鎖であり、またxは1又は0である;
−RはOH又はNH2基である;
−Acはアセチル基である;
−nは2〜6の整数、またmは0〜16の、好ましくは3〜13の整数である。
【００１９】
こうして、本発明の試験法は式Ｉで示されるペプチド類の使用を基礎とするが、該ペプチド類のN-末端部分はアシル化されており、それにはアミノペプチダーゼによる開裂からの保護及び加水分解によって生成するN-末端断片の疎水性の強化という少なくとも2つの利点がある。
蛍光の発現は一般式II
Ac-(X1)n-PyA-(Z’)x (II)
で示される代謝産物の開裂による生成に関連するが、式中
−X1とnは前記のとおりである;
−Z’はL型系列の1個以上の天然又は非天然アミノ酸残基である;
−xは1又は0である。
より好ましくは、式Ｉ及びII中xは0である。
【００２０】
本発明の第1変法によれば、式Ｉの化合物類は一般式IA
Ac-(Z1)-(Z2)-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-(Z4)-(Z5)-(Z6)-COOH (SEQ ID No.1) (IA)
に相当するが、式中Z1、Z2、Z4、Z5及びZ6は同じでも異なってもよいが、1個のアミノ酸残基を表わす。
【００２１】
より具体的には、式Ｉ又はIA中
−Z1とZ2は次のとおりである:
Z1とZ2が単結合であるか、
又はZ1が単結合であり、Z2がアミノ酸Aspであるか、
又はZ1、Z2がそれぞれアミノ酸Leu、Aspである;
−Z4、Z5及びZ6は次のとおりである:
Z4、Z5及びZ6が単結合であるか、
又はZ5とZ6が単結合であり、Z4がアミノ酸Proであるか、
又はZ6が単結合であり、Z4、Z5がそれぞれアミノ酸Pro、Argであるか、
又はZ4、Z5、Z6がそれぞれアミノ酸Pro、Arg、Serである。
【００２２】
ECEによって認識される基質は、特にこの一般式IAにより網羅される。
ECEによって認識され一般式Ｉに従う基質の代表例としては
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-
Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2
(SEQ ID No.3)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.8)
が特に挙げられよう。
【００２３】
SEQ ID No.2はさらに、一般式IAにも従う。
同様に、式IIで示される代謝産物の代表例としては
Ac-Ile-Ile-PyA (SEQ ID No.4)
Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Gln-PyA (SEQ ID No.5)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala (SEQ ID No.9)
が特に挙げられよう。
【００２４】
本発明の第2変法によれば、一般式Ｉの化合物類は一般式IB
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-(Z)x-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.6) (IB)
に相当するが、式中Zとxの定義は一般式Ｉの場合と同じである。
同変法によれば、生成する代謝産物は一般式IIa
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-(Z’)x (SEQ ID No.7)
に相当するが、式中Z’とxの定義は一般式Ｉの場合と同じである。
【００２５】
本発明の一般式IBで示される基質の例としては、次のものが挙げられよう:
・ セリンプロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのカリクレインの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Ile-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.10)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys (SEQ ID No.11)]
・ システインプロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのパパインの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-Lys-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.12)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu (SEQ ID No.13)]
・ アスパラギン酸プロテアーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのペプシンの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.14)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu (SEQ ID No.13)]
・ メタロエンドペプチダーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのネプリライシンの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Phe-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.15)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys (SEQ ID No.11)]
・ メタロジペプチジルカルボキシペプチダーゼ・ファミリーのモデル酵素としてのACEの基質として
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Ala-Gly-Phe-pNF-OH
(SEQ ID No.16)
[生成代謝産物:Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-PyA-Ala-Gly (SEQ ID No.17)]
本発明の化合物類の調製は当業者の技術範囲内である。
【００２６】
請求項記載の化合物類は、たとえばApplied Biosystemsの431A装置などのような自動合成機を用いて、Merrifield法による通常の固相合成法で得られよう。使用される化学反応はE. Atherton and R.C. Sheppard (1989), “Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford”に記載されているように、Fmoc技術と側鎖の保護に対応し、トリフルオロ酢酸による側鎖の開裂を可能にする。
【００２７】
式Ｉの化合物類を生成するためのアシル化反応は技術上周知の条件下で行うことができる。
L-ピレニルアラニンは、J.M. Soleilhac et al., Anal. Biochem. (1996) 241, 120-127に記載の不斉合成法で得られる。最終生成ペプチド類の純度は逆相HPLCで99%超と見積もられ、またペプチド類の同定はエレクトロスプレー質量分析で行う。
【００２８】
カップリングは、常法により、HATU又はPyBropなどのようなカップリング剤を用いて、また好ましくはジクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行う。
本発明の別の態様は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロペプチダーゼから選択されるプロテアーゼの、より好ましくはECEの、検出、同定及び／又は検定、並びに該酵素に対する阻害能又は活性化能を有する化合物類の研究を目的とした、前述の一般式Ｉで示される化合物の使用に関する。本発明の好ましい変法によれば、検定対象の化合物はECEであるか又はECEに対する阻害能又は活性化能を有する化合物である。
【００２９】
本発明の主題はまた、ECEに対する阻害能又は活性化能を有する化合物を検出、同定及び／又は検定する方法であり、該方法は
− ECEによって認識される一般式Ｉの化合物を溶液中で該ECE及び該ECEを阻害又は活性化する傾向のある1以上の化合物と接触させるステップ、
− 検出、同定及び／又は検定対象の化合物の存在下で、また適切な場合には不存在下で、放出される蛍光を測定するステップ、及び
− 蛍光の不存在又は減少が、ECEを阻害する化合物の存在を示唆するステップを含むことを特徴とする。
【００３０】
3化合物を接触させる順序は実際には決定因ではない。まず一般式Ｉの化合物をECEと接触させ、次に阻害剤又は活性化剤と推定される化合物を後続のステップで導入することも可能である。
別の変法では、一般式Ｉの化合物をまず検定対象の化合物と、次いでECEと接触させる。
【００３１】
ECE阻害活性を測定する試験の対象となる前述の化合物は種類が無制限に多様であろうし、またたとえばホスホンアミド類、ホスファミド類およびそれら化合物の誘導体、もしくはメタロプロテイナーゼ類たとえばチオール誘導体、カルボキシレート又はヒドロキサメートから選択することができる。また、そのECE阻害活性が判明しているホスホラミドンやN-(フェニルエチルホスホニル)-Leu-Trp (TAKEDA)などの化合物も挙げられよう。
【００３２】
試験対象の化合物は単離形態をとってもよいし、既知でも未知でも、及び／又は化合物ライブラリー、生物学的抽出物又は水の中に存在してもよい。
好ましい変法によれば、該基質は
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-
Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)(ペプチド1s)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2
(SEQ ID No.3)(ペプチド2s)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2
(SEQ ID No.8)(ペプチド3s)
である。
【００３３】
たとえば一般式Ｉの基質に対するECEの酵素活性を阻害しうる化合物の逓増量の追加は、ECEにより形成される式Ac-Ile-Ile-PyA (ペプチド1m)、Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Glu-PyA (SEQ ID No.5) (ペプチド2m)又はAc-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala (SEQ ID No.9) (ペプチド3m)の代謝産物に由来する蛍光の強度を低下させ、その蛍光強度が数時間ほとんど変わらないという結果を招くであろう。基質と形成される蛍光代謝産物との混合物で確立される標準曲線と関連づけて行われる該強度の測定は従って、生成物Pの任意の規定濃度における阻害率としての阻害能を評価するか、又はそのIC50を、次いでそのKIを、基質のKmといくつかの生成物P濃度を用いて精密に算出することを可能にする。
【００３４】
該試験法は感度がきわめて高く、ごく少量(100μl)でも、基質1sなら20μM程度の濃度(すなわち検定当たり4.43μgに対応する2 nmole)に対し、又は基質2sなら5μMに対して、有効である。従って、該試験法は96穴以上のプレートにも楽に使用することが可能であり、適当な市販ソフトウエアを備えたコンピューターに読取り蛍光光度計を連結すれば、KI値の自動計算による試験の自動化が可能になる。
【００３５】
ペプチド1s、2s及び3sはECEとインキュベートすると、HPLCによる反応系の分析から明らかなように、PyA-pNFペプチド結合の単一開裂に対応する2つの代謝産物を生成するだけである。
好都合にもこれらの基質はきわめて選択性が高い。というのも、ECEと同じファミリーに属する精製Znメタロペプチダーゼ類たとえばネプリライシン(NEP)又はアンギオテンシン変換酵素(ACE)と37℃で2時間インキュベートした後にHPLCで分析しても開裂はまったく観測されないからである。
【００３６】
最後に、該試験法は高感度、高特異性であるため、精製ECE類 (Takahashi et al., J. Biol. Chem. (1993) 268, 21395-21398) だけでなく、ECEをその中に予め導入したCHO細胞の膜調製品 (Xu et al., Cell (1994) 78, 473-485)も、又はECE濃度が高い動物組織(ラットの肺又は脳)さえも、使用が可能である。ECEの配列と構造は生物種間の保存度がきわめて高く、ラットとヒトでは特にそうであるため、精製又は非精製げっ歯類ECEで得られる結果(たとえば阻害剤のKI値)は組換えヒト酵素で得られる結果と全く同じである。
【００３７】
本発明は従って、ごく迅速な、再現性の高い蛍光光度検定法を用いてECE阻害剤を同定するための、またその阻害能を決定するための試験法を提供して、自動化が可能な、従ってまた阻害性分子の高速大量スクリーニングへの適合が可能なきわめて多数の試験を行えるようにする。
本発明はまた、新規工業製品の生産を可能にするが、該製品は凍結乾燥ECEか又は一般式Ｉ及び1s、2s及び3sの基質を入れてあるインスタント96穴、192穴及び384穴プレートを含むキットとして使用することも随意に可能であり、その場合には所要の試薬を加えれば一連の分子の阻害能を、随意にコンピューターを用いて、決定することができる。
【００３８】
本発明のもう1つの態様は、前記の式Ｉ化合物を使用して、血漿中の異常なエンドセリン変換酵素濃度に関連した病理を診断する方法に関する。
添付の図と実施例は本発明の非限定的な説明を目的に示す。
【００３９】
実施例1
ペプチドの調製
ピレニルアラニン残基をもつペプチド1s及び2s並びに対応する蛍光代謝産物の調製を、“Solid Phase Peptide Sythesis: a practical approach, IRL Press, Oxford”に記載の要領で、固相自動合成機で、Merrifield法により、Fmoc技術と一般にt-ブチル、エーテル又はエステル、トリチル又はBoc残基の形をとる側鎖の保護とを用いて行う。
【００４０】
カップリングはN-メチルピロリドンに溶かしたジシククロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて行う。側鎖の開裂とトリフルオロ酢酸による脱保護を経て目的のペプチドが得られる。溶液を減圧で蒸発させ、ペプチドをエーテルで沈殿させ、HPLCによりVyDac C18カラムで精製する。
ペプチド類の分析には質量分析と1H NMR (400又は600 MHz)を用いる。
化合物1s Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
MH+ (exp): 2101.1 ; MH+ (theo): 2102.7
化合物2s Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID No.3)
MH+ (exp): 1558.8 ; MH+ (theo): 1559.7
これらのペプチドは凍結乾燥後に粉末として暗所に4℃で又は−20℃で、変質せずに6か月余り保存することができる。同様に、基質ストック液(10-3〜10-4 M)もまた暗所に4℃で数週間保存することができる。
【００４１】
実施例2
2.1: 材料と方法
種々のECE含有調製品、たとえばCos-1細胞中で発現する組換えヒトECE-1c (Shimada et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 18275-18278) 又はCHO細胞 (Xu et al., Cell (1994) 78, 473-485) などが使用可能である。いずれの場合も、ウェスタン・ブロット法で抗体を用いて該酵素の有無を試験し、その濃度を精製酵素との比較で評価する。
【００４２】
ECE活性は96穴プレートを使用して一般に次の条件で測定する:
100μlの50mMトリス-マレエート緩衝液(pH 6.5)、20μM又は5μMの蛍光ペプチド1s又は2s、及びECEの純度に応じてかつ蛍光基質の開裂が5%未満に止まるように希釈した10μlのECE液。インキュベーションは使用基質次第で20分間〜1時間、20℃〜37℃で、潜在阻害剤の存在下又は不存在下に、その濃度を(たとえば5×10-6Mや10-6Mに) 固定して又はKI値を求められるよう10-11〜10-5Mの範囲で逓増させて行う。反応を種々の方法で、たとえば90℃への加熱、4℃への急冷、最終容量の20%を限度とするジオキサンなどの有機溶媒の添加により停止させ、次いで随意に自動分析装置へと連結した蛍光光度計(λex = 340nm; λem = 400 nm)で値を読み取る。ネットワーク蛍光光度計の使用は377nmでの蛍光読取りにより検定感度をさらに大幅に向上させる。コントロール試験は諸々の試薬の存在下に、ただしECEを用いずに、又は90℃、5分間の熱処理で予め不活性化したECEを用いて、行う。ENZFITTERソフトウエアを用いて計算した基質のKm値(基質に対する酵素の親和性を表わす定数)は次のとおりである:
1s, Km = 22.1±0.9 μM;
2s, Km =2±0.5 μM.
阻害剤のKI値は、種々の濃度での減衰率及び標準範囲との比較を用いて自動的に求めることができる。IC50値が蛍光の観測値から直接、線形近似後に得られるので、それをCheng-Prussof式、KI = IC50/1 + ([S]/ Km)に代入すればKIが得られる(式中[S]は基質濃度である)。
【００４３】
2.2: 阻害剤の不存在下での蛍光ペプチド1s及び2sに関するECE活性の検定
基質1s及び2sの蛍光は、またそれらの代謝産物の蛍光も、阻害剤の不存在下に評価した。採用したプロトコールは前述のとおりである。
図3a及び3bはそれぞれ、ペプチド1sとその代謝産物1m及びペプチド2sとその代謝産物2mの蛍光発光スペクトルを示す。
【００４４】
生成物は、基質選択性の検証を目的に、HPLCでヌクレオシルC18カラム[7μm/300Å(4.6×70mm)により、緩衝液B [TFAのCH3CH/H2O(容量比9/1) 0.038%溶液]と緩衝液Bの40〜47%／10分グラジエントを用いて分析する(送液流量1ml毎分)。
いずれの場合でも、L.PyA-L.pNFジペプチドに単一開裂部位が観測され、生成代謝産物は2つだけであった。
【００４５】
実施例3
いくつかの化合物の阻害作用を実施例2の場合と同じプロトコールで評価した。
試験化合物は次のとおりである:
【表１】
【００４６】
プレインキュベーションを37℃で10分間行う。次いでECE基質を所定量加える。全混合液を37℃で20分間〜1時間インキュベートし、冷却により、又はジオキサン(20μl)添加により反応を停止させる。
蛍光プレートリーダーでの読取りは4℃で、次の個別条件下で行う: 励起光波長340nm、観測光波長400nm、利得85。
【００４７】
検定は96穴プレートで行う。
表Ｉは試験化合物の内容と濃度をウェルごとに示している。化合物の試験は2濃度で実施した。
【表２】
表IIは蛍光強度の測定値をウェルごとに示している。低蛍光値は試験化合物の強い阻害活性を物語る。化合物Pの阻害活性は完全に検証されている。
【００４８】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ビッグエンドセリンのペプチド配列。
【図２】 エンドセリンET-1、ET-2及びET-3のペプチド配列。
【図３】 ペプチド1sとその代謝産物1mの蛍光発光スペクトルを示すグラフ(図3a)及びペプチド2sとその代謝産物2mの蛍光発光スペクトルを示すグラフ(図3b)。
【配列表】
Claims (31)
- PyA-(Z)x-pNFで表わされる残基であって、ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸の4個までの鎖を表わし、xは1又は0を表わす前記残基の、PyAとpNFの間に確立された直接又は間接の結合を開裂させる傾向のあるプロテアーゼ又はペプチダーゼ、及び／又は該結合を開裂させうるプロテアーゼ又はペプチダーゼに対する阻害又は活性化作用をもつ化合物の蛍光法による検出、同定及び／又は検定を目的とした、基質への使用。
- プロテアーゼがセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼのファミリーから選択される請求項1記載の使用。
- プロテアーゼがメタロプロテアーゼである請求項2記載の使用。
- 基質がエンドセリン変換酵素(ECE)によって認識されるペプチド配列であり、かつ検出、同定及び／又は検定されるのがECE又はECE阻害剤である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の使用。
- ペプチジル残基PyA-(Z)x-pNFにおいてxが0である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の使用。
- ジペプチドPyA-pNFが、ECEによって認識される配列中の、該ジペプチドの置換先となる自然開裂部位に存在する請求項4又は5に記載の使用。
- 置換される結合がビッグエンドセリン-1又はビッグエンドセリン-2のTrp21-Val22結合である請求項6記載の使用。
- 置換される結合がビッグエンドセリン-3のTrp21-Ile22結合である請求項6記載の使用。
- 一般式Iで示されるペプチドであって、
Ac-(Z a ')-PyA-(Z)x-pNF-(Z a '')-R (I)
Z a 'は同一の又は異なる2〜6個のアミノ酸からなる鎖であり、
Z a ''は同一の又は異なる0〜16個のアミノ酸からなる鎖であり、
ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸の4個までの鎖であり、
xは1又は0であり、
RはOH又はNH2基であり、
Acはアセチル基である、前記ペプチド。 - xが0である請求項9記載のペプチド。
- 一般式Iaで示される請求項9又は10記載のペプチドであって、
Ac-(Z1)-(Z2)-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-(Z4)-(Z5)-(Z6)-COOH (Ia) (SEQ ID No.1)
Z1、Z2、Z4、Z5及びZ6は同一の又は異なる1個のアミノ酸を表わす、前記ペプチド。 - 次の条件を満たす請求項11記載のペプチド:
−Z1とZ2は次のとおりである:
Z1とZ2が単結合であるか、
又はZ1が単結合であり、Z2がアミノ酸Aspであるか、
又はZ1、Z2がそれぞれアミノ酸Leu、Aspである;
−Z4、Z5及びZ6は次のとおりである:
Z4、Z5及びZ6が単結合であるか、
又はZ5とZ6が単結合であり、Z4がアミノ酸Proであるか、
又はZ6が単結合であり、Z4、Z5がそれぞれアミノ酸Pro、Argであるか、
又はZ4、Z5、Z6がそれぞれアミノ酸Pro、Arg、Serである。 - 次の式で示される、請求項10ないし12のいずれか1項に記載のペプチド。
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID No.3)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.8) - 式(IB)に相当する請求項9記載のペプチドであって、
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-(Z)x-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2 (IB) (SEQ ID No.6)
ZはL型系列の天然又は非天然アミノ酸の4個までの鎖であり、
xは1又は0である、前記ペプチド。 - 次の式で示される、請求項14記載のペプチド。
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Ile-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.10)
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-Lys-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.12)
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.14)
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys-Phe-pNF-Gly-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.15)
又は
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Ala-Gly-Phe-pNF-OH (SEQID No.16) - 一般式IIで示される化合物であって、
Ac-(Z'')-PyA-(Z’)x (II)
Z''は同一の又は異なる2〜6個のアミノ酸からなる鎖であり、
xは1又は0であり、
Z’はL型系列の天然又は非天然アミノ酸の4個までの鎖である、前記化合物。 - 次の式で示される、請求項16記載の化合物。
Ac-Ile-Ile-PyA (SEQ ID No.4)
Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Gln-PyA (SEQ ID No.5)
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Lys (SEQ ID No.11)
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Leu (SEQ ID No.13)
又は
Ac-Ser-Lys-Gly-PyA-Ala-Gly (SEQ ID No.17) - セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼのファミリーから選択されるプロテアーゼ又は該酵素に対する阻害能又は活性化能を有する化合物の検出、同定及び／又は検定を目的とした、請求項9ないし15のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
- セリンプロテアーゼ、又は該セリンプロテアーゼに対する阻害能又は活性化能を有する化合物の検出、同定及び／又は検定を目的とした、請求項18記載の使用。
- セリンプロテアーゼがカリクレインであり、前記ペプチドが配列番号10記載の配列からなる、請求項18又は19記載の使用。
- システインプロテアーゼ、又は該システインプロテアーゼに対する阻害能又は活性化能を有する化合物の検出、同定及び／又は検定を目的とした、請求項18記載の使用。
- システインプロテアーゼがパパインであり、前記ペプチドが配列番号12記載の配列からなる、請求項18又は21記載の使用。
- アスパラギン酸プロテアーゼ、又は該アスパラギン酸プロテアーゼに対する阻害能又は活性化能を有する化合物の検出、同定及び／又は検定を目的とした、請求項18記載の使用。
- アスパラギン酸プロテアーゼがペプシンであり、前記ペプチドが配列番号14記載の配列からなる、請求項18又は23記載の使用。
- メタロプロテアーゼ、又は該メタロプロテアーゼに対する阻害能又は活性化能を有する化合物の検出、同定及び／又は検定を目的とした、請求項18記載の使用。
- メタロプロテアーゼがネプリライシンであり、前記ペプチドが配列番号15記載の配列からなる、請求項18又は25記載の使用。
- メタロプロテアーゼがアンギオテンシン変換酵素(ACE)であり、前記ペプチドが配列番号16記載の配列からなる、請求項18又は25記載の使用。
- メタロプロテアーゼがエンドセリン変換酵素(ECE)であり、前記化合物がECEに対する阻害能又は活性化能を有する化合物である、請求項18又は25記載の使用。
- エンドセリン変換酵素(ECE)に対する阻害能又は活性化能を有する化合物を検出、同定及び／又は検定する方法であって、
− ECEによって認識される請求項9ないし15のいずれか1項に記載の一般式Iのペプチドを、溶液中で、該ECE及び該ECEを阻害又は活性化する傾向のある1以上の化合物と接触させるステップ、及び
− 検出、同定及び／又は検定対象の化合物の存在下で、また適切な場合には不存在下で、放出される蛍光を測定するステップを含み、
蛍光の不存在又は減少が、ECEを阻害する化合物の存在を示唆することを特徴とする方法。 - 一般式Iのペプチドが
Ac-Ile-Ile-PyA-pNF-Asn-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-COOH (SEQ ID No.2)
Ac-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PyA-pNF-Gly-Leu-Met-NH2 (SEQ ID No.3)
又は
Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala-Phe-Ala-pNF-Gly-Lys-NH2 (SEQ ID No.8)
である請求項29記載の方法。 - 請求項9ないし15のいずれか1項に記載のペプチドを使用して、試料中のエンドセリン変換酵素濃度を測定する方法。
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