DE60118350T2

DE60118350T2 - Fluoreszenz-verfahren zum nachweis von proteasen oder peptidasen

Info

Publication number: DE60118350T2
Application number: DE60118350T
Authority: DE
Inventors: Pierre Bernard ROQUES; Nathalie Luciani; Marie-Claude Fournie-Zaluski; Hugues De Rocquigny
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: JP4966469B2; US7169574B2; JP2003530370A; FR2807523A1; WO2001077369A1; ATE321877T1; FR2807523B1; ES2256224T3; EP1268850B1; DE60118350D1; CA2405183A1; CA2405183C; EP1268850A1; US20040214256A1

Description

Die Erfindung betrifft ganz allgemein die Verwendung eines PyA-(Z)_x-pNF-Restes in Substraten für Peptidasen oder Proteasen zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Verbindungen, die in der Lage sind, diese zu inhibieren. Sie ist insbesondere auf die Verwendung eines solchen Restes und speziell des PyA-pNF-Restes in einer Sequenz zur quantitativen Analyse des Endothelin-Konversions-Enzyms und/oder zur Identifizierung von Inhibitoren dieses Enzyms gerichtet.
Die Kontrolle des arteriellen Drucks findet in Abhängigkeit von mehreren Peptiden statt, die entweder auf die Blutgefäße verengend (was insbesondere auf Angiotensin II, die Endotheline und Urotensin zutrifft) oder gefäßerweiternd (was insbesondere auf Bradykinin oder das atrionatriuretische Peptid, das außerdem eine Rolle bei der Entfernung von Wasser und Natriumchlorid spielt, zutrifft) wirken.
Von all diesen Peptiden wird das Endothelin-1 (ET-1), das ein Peptid ist, das einen cyclischen Teil, der über zwei Disulfidbrücken gebildet wird, und einen kurzen linearen Teil (1) besitzt, aufgrund seiner Wirkung auf die glatten Muskeln der Gefäßwände, insbesondere des Herzens (Koronararterien), als sehr leistungsfähiges Vasokonstringenz angesehen.
Endothelin-1 gehört zu einer Isopeptidfamilie, in welcher man auch Endothelin-2 (ET-2) und Endothelin-3 (ET-3), die sich von ET-1 nur durch einige punktuelle Aminosäureveränderungen (2) unterscheiden, findet.
Die Endotheline werden von Endothelzellen in Form von inaktiven Vorstufen, den "big-Endothelinen", ausgeschieden, die von zinkhaltigen Metallpeptidasen, die als Endothelin-Konversions-Enzym (ECE) bezeichnet werden, gespalten werden, um die aktiven Peptide zu ergeben. So hydrolysiert, wenn man das Beispiel des ET-1 nimmt, das ECE-1 die Trp²¹-Val²²-Bindung des big-Endothelin-1, das 38 Aminosäuren enthält, um zwei Fragmente zu erzeugen, wovon eines, das N-terminale, das aktive Endothelin-1 bildet. Im Falle des ET-3 ist es die Trp²¹-Ile²²-Bindung, die gespalten wird.
Big-ET-1 und ET-1 werden im Plasma detektiert, und ECE ist ein Cytosol- oder Membranenzym, das in diesem Fall durch ein kurzes intrazelluläres Fragment mit einer anschließenden Transmembranhelix mit etwa 25 Aminosäuren und einer sehr großen extrazellulären Domäne, die das aktive Zentrum enthält, charakterisiert wird. Das Enzym besteht aus zwei identischen Untereinheiten, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind (Shimada et al., Biochem. J., 315, 863–867 (1996)).
Die Verabreichung kleiner Dosen von big-Endothelin bewirkt eine starke Erhöhung des arteriellen Blutdrucks, was die Spaltung der Vorstufe mit Bildung des Endothelins anzeigt. Diese Antwort kann durch einen Antagonisten des ET-1 am Rezeptor blockiert werden.
Es besteht daher ein großes Interesse an der Inhibition des ECE durch Verbindungen, deren Verwendungen bei kardiovaskulären Störungen potenziell sehr zahlreich sind. Davon ist insbesondere die Behandlung von Herzinfarkt, Angor, auf eine Gehirnblutung folgenden Gefäßkrämpfen, Krämpfen peripherer Gefäße, Lungenbluthochdruck, Herz- und/oder Niereninsuffizienz, mit Diabetes verbundenen Störungen und Asthma und der Vorbeugung von Restenosen und Herz- und Gefäßfibrosen zu nennen.
Im vorliegenden Fall könnten bestimmte kardiovaskuläre Erkrankungen demzufolge durch eine Verringerung der zirkulierenden Konzentration von Endothelinen verhindert oder wenigstens gemildert werden, indem das Enzym, das sie entstehen lässt, d.h. das ECE, inhibiert wird.
Jedoch erfordert die gründliche Suche nach solchen Inhibitoren, über einen einfachen und robotergestützten Test zu ihrer Identifizierung derart verfügen zu können, dass er die Durchführung einer großen Anzahl von Versuchen innerhalb eines kurzen Zeitraums erlaubt.
Die bisherigen Tests sind jedoch schwierig, langwierig, wenig spezifisch und/oder teuer.
Die Tests, in welchen die zwei Fragmente, die durch die Einwirkung des ECE auf das big-ET produziert worden sind, durch HPLC quantitativ analysiert werden, haben den großen Nachteil, dass sie große Mengen an Enzym und big-ET erfordern.
Der Test, der auf der Spaltung des mit Iod 125 markierten big-ET, welche das ¹²⁵I-ET-1 entstehen lässt, und dessen Bestimmung durch Bindung an seinen Rezeptor basiert, ist für Versuche mit hohem Durchsatz nicht anwendbar (Fawzi, A. B., Clemen, R. M. und Wright, D. L., Anal. Biochem., 222, 342–350 (1994)). Dasselbe trifft auf Zelltests zu, in welchen die Erhöhung des GMPc gemessen wird, die von der Bindung des ET-1 an dessen Rezeptor bewirkt wird.
Was die radioimmunologischen Messungen RIA betrifft, so benötigen sie eine Reihe von aufeinander folgenden, sehr komplexen Versuchen, die relativ wenig selektiv sind und die gleichzeitige Verwendung von big-ET und ¹²⁵I-ET-1 erfordern. Diese komplexen quantitativen Analysen eignen sich nicht für Tests mit hohem Durchsatz von sehr großen Reihen potentieller Inhibitoren und die Robotisierung und verlangen die Synthese oder den Kauf von mit radioaktivem Iod markiertem Endothelin, dessen Verwendungszeit begrenzt ist.
In jüngster Zeit ist ein Test vorgeschlagen worden, der auf der Verwendung eines radioaktiven Substrats basiert, das durch Bindung eines tritiierten Propionylrests an den N-terminalen Teil von Peptiden mit 21 Aminosäuren, welche die Spaltungsstelle Trp-Val enthalten, erhalten worden ist ( FR 96 02673 ). Es wird der gebildete radioaktive N-terminale Metabolit mit einem organischen Lösungsmittel unter Rühren extrahiert und eine Probe dieses Lösungsmittels entnommen, mit einer Szintillationsflüssigkeit gemischt und anschließend die Radioaktivität mittels eines Zählrohrs gemessen. Dabei erlaubt es auch hier wieder die Abfolge von Stufen nicht, den Versuch zu robotisieren, und erfordert außerdem die Verwendung eines Radioelements und damit die regelmäßige Synthese des tritiierten Substrats.
Von Fitzgerald et al. (Anal. Biochem., 154, 226–230 (1997)) ist die Verwendung eines Substrats mit gelöschter Fluoreszenz, das Abz (Aminobenzoesäure) und pNF, die durch 2 Aminosäuren voneinander getrennt sind, enthält, für die Detektion des Proteoms des Katzen-Immunschwächevirus (FIV) offenbart.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, einen neuen quantitativen Test vorzuschlagen, der es erlaubt, die Nachteile der zuvor beschriebenen Tests zu beheben.
Die Erfindung beruht insbesondere auf dem Nachweis der Erfinder, dass die Verwendung von Pyrenylalanin (PyA) zusammen mit der modifizierten Säure L-p-Nitrophenylalanin (pNF) zu Diagnostikzwecken besonders interessant ist.
Pyrenylalanin ist eine synthetische Aminosäure, die ein beträchtliches Fluoreszenzvermögen besitzt. Vorteilhafterweise ist diese Fluoreszenz des PyA-Restes fast völlig verschwunden, wenn sich PyA in der Nähe von dem und vorzugsweise angelagert an den pNF-Rest befindet.
Demzufolge kann sich diese natürliche Fluoreszenz des PyA erst ab dem Moment manifestieren, in welchem dieser Rest nicht mehr dem unterdrückenden Effekt des pNF-Restes ausgesetzt ist, beispielsweise, wenn er, insbesondere durch Spaltung durch eine Protease oder Peptidase unabhängig von der Klasse (Metallpeptidase, Serinprotease, Aspartylprotease und Cysteinprotease), zu welcher sie gehört, physikalisch abgetrennt wird.
Ein Rest vom Typ PyA-pNF erweist sich deshalb als ein besonders interessantes Werkzeug, wenn er in ein Substrat und insbesondere in eine Peptid- oder Pseudopeptidsequenz eingebaut wird, um das Stattfinden einer Spaltung durch Fluoreszenz sichtbar zu machen.
Ein erstes erfindungsgemäßes Merkmal betrifft daher die Verwendung eines Restes PyA-(Z)_x-pNF, wobei Z eine Kette, die bis zu 4 gegebenenfalls nicht natürliche Aminosäuren der L-Reihe umfasst, und x 1 oder 0 bedeutet, in einem Substrat für die Detektion, Identifizierung und/oder quantitative Analyse einer Protease oder Peptidase, die in der Lage ist, die oder eine Bindung zwischen PyA und pNF zu spalten, und/oder einer Verbindung mit inhibierender oder aktivierender Wirkung auf eine Protease oder Peptidase, die in der Lage ist, diese Bindung zu spalten, durch Fluoreszenz.
Die beanspruchte Verwendung ist besonders interessant, um Verbindungen vom Typ Peptidasen oder Proteasen, unabhängig von der Gruppe, zu welcher sie gehören, d.h. Serinproteasen, Cysteinproteasen, Aspartylproteasen und Metallproteasen, durch Fluoreszenz zu detektieren, zu identifizieren und/oder quantitativ zu analysieren.
Die Erfindung beruht auf dem Auftreten einer Fluoreszenz, das durch die Trennung von PyA und pNF durch Spaltung einer zwischen ihnen vorhandenen Bindung ausgelöst wird.
Z umfasst bis zu vier Aminosäuren, die gegebenenfalls voneinander verschieden und vorzugsweise aus der Liste der 20 natürlichen Aminosäuren ausgewählt sind. Dabei ist die Länge der von Z repräsentierten Aminosäurekette in Abhängigkeit von der Substratspezifität der Peptidase und derart einzustellen, dass der Abstand, der PyA und pNF voneinander trennt, sich mit dem Auftreten des unterdrückenden Effekts des pNF auf die natürlicherweise von PyA abgestrahlte Fluoreszenz verträgt.
Ein zweites Kriterium für diese Einstellung ist mit der Notwendigkeit verbunden, die Spezifität und Affinität der das PyA-(Z)_x-pNF enthaltende Substrat natürlicherweise spaltenden Verbindung zu bewahren. Demzufolge wird die Auswahl des PyA-(Z)_x-pNF-Restes so durchgeführt, dass diese beiden Kriterien berücksichtigt werden.
Das Substrat, in welches der Peptidylrest PyA-(Z)_x-pNF eingebaut wird, ist peptidisch.
Eine spezielle erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft den Einbau eines Restes PyA-(Z)_x-pNF und vorzugsweise PyA-pNF in die von ECE erkannten Peptidsequenzen. So können ECE und Inhibitoren oder Aktivatoren des ECE identifiziert, detektiert und/oder quantitativ analysiert werden. Die Hydrolyse des Restes PyA-pNF ergibt eine sehr starke Erhöhung der Fluoreszenz (etwa das 150- bis 800fache bei einem 5%igen Abbau des Substrats).
Entsprechend einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Dipeptidylrest PyA-pNF in der von dem ECE erkannten Peptidsequenz an der natürlichen Spaltungsstelle, an welcher er sich substituiert, vorhanden.
Überraschenderweise erweist sich der Dipeptidylrest PyA-pNF von ECE spaltbar und verändert die Affinität und Spezifität dieses Enzyms gegenüber der Peptidsequenz, die ihn enthält, nicht.
In dem speziellen Fall, in welchem die Peptidsequenz derjenigen des big-Endothelins-1 oder 2 entspricht, ist die substituierte Bindung die Trp²¹-Val²²-Bindung, und des big-Endothelins-3 entspricht, Trp²¹-Ile²².
Big-ET-1 (19–35), das als Ausgangsstoff verwendet wird, kann entsprechend den üblichen Verfahren hergestellt werden, insbesondere in einem automatischen Festphasensynthesizer, beispielsweise dem Modell 431A von Applied Biosystems, in welchem die Fmoc-Technologie angewendet wird und welcher in der Bezugnahme Atherton, E. und Sheppard, R. C., Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford (1989) beschrieben ist.
Die extreme Empfindlichkeit der beanspruchten Verwendung erlaubt es, mit sehr kleinen Volumina von etwa 50 bis 100 μl und geringen Substratkonzentrationen von etwa 2 bis 50 μM zu arbeiten.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal betrifft Produkte mit der Formel I: Ac(X₁)_nPyA-(Z)_x-pNF-(X'₁)_m-R (I),in welcher:

– die Symbole X₁ und X'₁ Aminosäuren bedeuten,
– Z eine Kette aus gegebenenfalls nichtnatürlichen Aminosäuren der L-Reihe und x 1 oder 0,
– R eine OH- oder NH₂-Gruppe,
– Ac eine Acetylgruppe und
– n eine ganze Zahl von 2 bis 6 und m 0 bis 16 und vorzugsweise 3 bis 13 bedeutet.

Der erfindungsgemäße Test beruht somit auf der Verwendung von Peptiden mit der Formel (I), deren N-terminaler Teil acyliert ist, was mindestens zwei Vorteile hat: den Schutz vor Spaltung durch Aminopeptidasen und die Verstärkung der Hydrophobie des N-terminalen Fragments, das durch Hydrolyse erzeugt wird.
Dieses Auftreten der Fluoreszenz ist verbunden bei der Spaltung mit der Erzeugung eines Metaboliten mit der allgemeinen Formel II: AC-(X₁)_n-PyA-(Z')_x (II)in welcher

– x₁ und n wie zuvor definiert sind und
– Z' eine oder mehrere, gegebenenfalls nichtnatürliche Aminosäuren der L-Reihe und
– x 1 oder 0 bedeutet.

Vorzugsweise bedeutet x in den Formeln (I) und (II) 0.
Entsprechend einer ersten erfindungsgemäßen Abwandlung entsprechen die Verbindungen mit der Formel (I) der allgemeinen Formel (IA)
in welcher Z₁, Z₂, Z₄, Z₅ und Z₆ gegebenenfalls voneinander verschieden sind und jeweils eine Aminosäure bedeuten.
Insbesondere sind die Verbindungen mit der Formel I oder IA so, dass

– Z₁ und Z₂ derart sind, dass
• Z₁ und Z₂ jeweils eine Einfachbindung bedeuten,
• Z₁ eine Einfachbindung und Z₂ die Aminosäure Asp bedeutet oder
• Z₁ und Z₂ jeweils die Aminosäuren Leu und Asp bedeuten und
– Z₄, Z₅ und Z₆ derart sind, dass
• Z₄, Z₅ und Z₆ jeweils eine Einfachbindung bedeuten,
• Z₅ und Z₆ eine Einfachbindung bedeuten und Z₄ die Aminosäure Pro bedeutet,
• Z₆ eine Einfachbindung bedeutet und Z₄ und Z₅ jeweils die Aminosäuren Pro und Arg bedeuten oder
• Z₄, Z₅ und Z₆ jeweils die Aminosäuren Pro, Arg und Ser bedeuten.

Von dieser allgemeinen Formel (IA) werden insbesondere von ECE erkannte Substrate eingeschlossen.
Beispielhaft für Substrate, die von ECE erkannt werden und der allgemeinen Formel I entsprechen, sind insbesondere zu nennen:
Dabei entspricht SEQ ID Nr. 2 außerdem der allgemeinen Formel IA.
Weiterhin sind beispielhaft für Metaboliten mit der Formel II insbesondere zu nennen:
Entsprechend einer zweiten erfindungsgemäßen Abwandlung entsprechen die Verbindungen mit der allgemeinen Formel I der allgemeinen Formel (IB)
wobei Z und x wie für die allgemeine Formel I definiert sind.
Gemäß dieser speziellen Abwandlung entspricht. der erzeugte Metabolit der allgemeinen Formel IIa:
wobei Z' und x wie für die allgemeine Formel II definiert sind.
Beispielhaft für der erfindungsgemäßen Formel IB entsprechende Substrate sind insbesondere zu nennen:

– als Substrat des Kallikreins als Modell für ein Enzym aus der Familie der Serinproteasen
– als Substrat des Papains als Modell für ein Enzym aus der Familie der Cysteinproteasen
– als Substrat des Pepsins als Modell für ein Enzym aus der Familie der Aspartylproteasen
– als Substrat des Neprilysins als Modell für ein Enzym aus der Familie der Metallendopeptidasen
– als Substrat des ACE als Modell für ein Enzym aus der Familie der Metalldipeptidylcarboxypeptidasen

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt innerhalb der Kenntnisse des Durchschnittsfachmanns.
Die beanspruchten Verbindungen können durch die üblichen Verfahren der Festphasensynthese gemäß dem Merrifield-Verfahren in einem automatischen Synthesizer, beispielsweise dem Apparat 431A von Applied Biosystems, erhalten werden. Die angewendete Chemie entspricht der Fmoc-Technologie und der Schutz der Seitenketten erlaubt deren Spaltung durch Trifluoressigsäure, wie beschrieben von E. Atherton und R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford (1989).
Die Acylierungsreaktion, um Verbindungen mit der Formel I zu ergeben, kann unter dem Fachmann bekannten üblichen Bedingungen durchgeführt werden.
Das L-Pyrenylalanin wird erhalten gemäß einem asymmetrischen Syntheseverfahren, das beschrieben ist in der Veröffentlichung von Soleilhac, J. M. et al., Anal. Biochem., 241, 120–127 (1996). Die Reinheit der fertigen Peptide wird durch Umkehrphasen-HPLC als über 99% und die Identität der Peptide durch Elektrospray-Massenspektroskopie bestimmt.
Die Bindungen wurden entsprechend herkömmlicher Verfahren mit Hilfe eines Kopplungsmittels wie HAUT und PyBrop und vorzugsweise, indem Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol verwendet wurde, durchgeführt.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal betrifft die Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel I wie weiter oben definiert für die Detektion, Identifizierung und/oder quantitative Analyse einer Protease, die aus der Familie der Serinproteasen, Cysteinproteasen, Aspartylproteasen und Metallproteasen ausgewählt ist, und insbesondere von ECE, und die Untersuchung von Verbindungen, die in der Lage sind, dieses Enzym zu inhibieren oder zu aktivieren.
Entsprechend einer bevorzugten erfindungsgemäßen Abwandlung ist die quantitativ zu analysierende Verbindung entweder ECE oder eine Verbindung, die in der Lage ist, das Endothelin-Konversions-Enzym zu hemmen oder zu aktivieren.
Die Erfindung hat weiterhin zum Gegenstand ein Verfahren zur Detektion, Identifizierung und/oder quantitativen Analyse einer Verbindung, die in der Lage ist, das Endothelin-Konversions-Enzym zu inhibieren oder zu aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass es das:

– In-Berührung-Bringen einer Verbindung mit der allgemeinen Formel I, die von dem Endothelin-Konversions-Enzym erkannt wird, mit dem Endothelin-Konversions-Enzym und mit mindestens einer Verbindung, die in der Lage ist, das ECE zu inhibieren oder zu aktivieren, in Lösung, und
– Messen der Fluoreszenz, die bei Anwesenheit und gegebenenfalls bei Abwesenheit der zu detektierenden, zu identifizierenden und/oder quantitativ zu analysierenden Verbindung emittiert wird, umfasst, und dass die
– Abwesenheit oder eine Verringerung der Fluoreszenz das Vorhandensein einer das Endothelin-Konversions-Enzym inhibierenden Verbindung anzeigt.

Die Reihenfolge des In-Berührung-Bringens der drei Verbindungen ist nicht entscheidend. Es kann zunächst die Verbindung mit der allgemeinen Formel I mit dem ECE in Berührung gebracht und danach in einer anschließenden Stufe der vermutete Inhibitor oder Aktivator zugegeben werden.
Entsprechend einer weiteren Abwandlung wird die Verbindung mit der allgemeinen Formel I zunächst mit der quantitativ zu analysierenden Verbindung und anschließend mit dem ECE in Berührung gebracht.
Die wie zuvor definierte Verbindung, auf welche der weiter oben definierte Test angewendet wird, um ihre das ECE inhibierende Aktivität zu bestimmen, kann von verschiedenem Charakter sein, ohne Einschränkung, und kann beispielsweise aus Phosphonimiden, Phosphamiden und den Derivaten dieser Stoffe oder auch den Inhibitoren von Metallproteinasen wie den Thiol-, Carboxylat- oder Hydroxamat-Verbindungen ausgewählt werden.
Weiterhin sind als Verbindung zu nennen Phosphoramidon und N-(Phenylethylphosphonyl)-Leu-Trp (TAKEDA), deren das ECE inhibierenden Aktivitäten bekannt sind.
Die zu untersuchende Verbindung kann in einer gegebenenfalls unbekannten isolierten Form und/oder in einer Bank von Verbindungen, einem biologischen Extrakt oder in Wasser vorliegen.
Gemäß einer bevorzugten Abwandlung ist das Substrat
Die Zugabe von steigenden Dosen einer Verbindung, die in der Lage ist, die Enzymaktivität des ECE beispielsweise gegenüber dem Substrat mit der allgemeinen Formel I zu inhibieren, drückt sich in einer Verringerung der Intensität der Fluoreszenz aufgrund des von dem ECE gebildeten Metaboliten mit der Formel Ac-Ile-Ile-PyA (Peptid 1m), Ac-Arg-Pro-Lys-Gln-Gln-PyA (SEQ ID Nr. 5) (Peptid 2m) oder Ac-Ser-Gly-PyA-Lys-Ala (SEQ ID Nr. 9) (Peptid 3m) aus, dessen Fluoreszenz innerhalb von mehreren Stunden nicht modifiziert wird. Die Messung dieser Intensität, bezogen auf eine Kalibrierkurve, die mit Gemischen aus dem Substrat mit dem gebildeten fluoreszierenden Metaboliten aufgestellt worden ist, erlaubt es somit, entweder das Inhibitionsvermögen als Prozentsatz der Inhibition bei einer feststehenden gegebenen Konzentration des Produktes P oder seine IC₅₀ und anschließend seine K_I mittels der K_m des Substrats und mehrerer Konzentrationen des Produktes P genau zu bestimmen.
Die extreme Empfindlichkeit dieser quantitativen Analyse erlaubt es, mit sehr kleinen Volumina (100 μl) und Konzentrationen von etwa 20 μM des Substrats 1s (2 nmol, entsprechen 4,43 μg pro Versuch) oder 5 μM des Substrats 2s zu arbeiten. Der Versuch lässt sich daher sehr leicht durchführen in Platten mit 96 Vertiefungen oder mehr und erlaubt seine Robotisierung und die automatische Bestimmung der K_I, wenn das registrierende Fluorimeter an einen Computer angeschlossen wird, der über ein geeignetes kommerzielles Rechenprogramm verfügt.
Mit ECE inkubiert, führen die Peptide 1s, 2s und 3s nur zu zwei Metaboliten, wie es die Analyse der Reaktion durch HPLC zeigt, und entsprechend nur zu einer einzigen Spaltung der Peptidbindung PyA-pNF.
Vorteilhafterweise sind diese Substrate äußerst selektiv, da nach einer 2 h langen Inkubation bei 37°C mit gereinigten Zink-Metallpeptidasen, die zu derselben Familie wie ECE gehören, beispielsweise Neprilysin (NEP) oder Angiotensin-Konversions-Enzym (ACE), mit HPLC keine Spaltung beobachtet wurde.
Schließlich sind Sensibilität und Spezifität des Tests derart, dass sowohl gereinigte ECE (Takahashi et al., J. Biol. Chem., 268, 21395–21398 (1993)) als auch ein Membranpräparat aus CHO-Zellen, in welche das ECE transfektiert worden ist (Xu et al., Cell, 78, 473–485 (1994)) oder sogar ein Membranpräparat aus einem ECE-reichen Tiergewebe (Rattenlunge oder -gehirn) verwendet werden kann. Die Sequenz und die Struktur des ECE bleiben von einer Spezies zur anderen sehr weitgehend erhalten, was insbesondere auf die Ratte und den Menschen zutrifft, weshalb die Ergebnisse (beispielsweise K_I von Inhibitoren), die mit gegebenenfalls nicht gereinigtem Nagetier-ECE erhalten werden, mit denjenigen identisch sind, die mit dem rekombinanten humanen Enzym erhalten werden.
Erfindungsgemäß wird somit ein Test für die Identifizierung von Inhibitoren des ECE sowie die Bestimmung ihres Inhibitionsvermögens durch einen fluorimetrischen Versuch vorgeschlagen, der sehr schnell, reproduzierbar und robotisierbar ist und sehr zahlreiche Tests erlaubt, die sich somit an eine Selektion mit hohem Durchsatz von inhibierenden Molekülen anpassen lassen.
Erfindungsgemäß wird auch die Herstellung neuer industrieller Erzeugnisse vorgeschlagen, die gegebenenfalls in Form von Kits verwendbar sind, die 96-, 192- und 384-Loch-Platten umfassen, die einsatzbereit sind und entweder gefriergetrocknetes ECE oder ein Substrat enthalten, das in der allgemeinen Formel I definiert und in den Fällen 1s, 2s und 3s veranschaulicht ist, zu welchen, gegebenenfalls robotergestützt, die Reagenzien zugegeben werden, die für die Bestimmung des Inhibitionsvermögens von Molekülreihen erforderlich sind.
Ein anderes erfindungsgemäßes Merkmal betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, die mit einem anormalen Plasmagehalt an Endothelin-Konversions-Enzym verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass in ihm eine Verbindung mit der weiter oben definierten Formel I verwendet wird.
Die folgenden Beispiele und die im Anhang befindlichen Figuren sollen die Erfindung erläutern und nicht beschränken, wobei
1 die Peptidsequenz des big-Endothelins,
2 Peptidsequenzen der Endotheline ET-1, ET-2 und ET-3 und
3 Diagramme, die das Fluoreszenzemissionsspektrum des Peptids 1s und dessen Metaboliten 1m (3a) und des Peptids 2s und dessen Metaboliten 2m (3b) veranschaulichen,
zeigt.
Beispiel 1: Herstellung von Peptiden
Die Peptide, die anschließend als 1s und 2s bezeichnet werden, und die entsprechenden fluoreszierenden Metaboliten, die den Pyrenylalanin-Rest enthalten, wurden durch das Merrifield-Festphasenverfahren in einem automatischen Synthesizer unter Anwendung der Fmoc-Strategie und Schutz der Seitenketten, im Allgemeinen in Form des Rests tert.-Butyl, Ether oder Ester, Trityl oder Boc, wie in "Solid Phase Peptide Synthesis: A practial approach IRL Press Oxford" beschrieben, hergestellt.
Die Bindungen wurden unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol in N-Methylpyrrolidon durchgeführt. Das fertige Peptid wurde nach Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten mit Trifluoressigsäure erhalten. Die Lösung wurde unter Vakuum eingedampft, das Peptid durch Ether ausgefällt und durch HPLC über einer Vydac-C₁₈-Säule gereinigt.
Die Peptide wurden durch Massenspektroskopie und ¹H-NMR-Spektroskopie (400 oder 600 MHz) analysiert.
MH⁺ _(exp): 2 101,1; MH⁺ _(theo): 2 102,7
MH⁺ _(exp): 1 558,8; MH⁺ _(theo): 1 559,7.
Diese Peptide können nach Gefriertrocknung pulverförmig, vor Licht geschützt bei 4°C oder –20°C mehr als sechs Monate lang ohne Veränderung aufbewahrt werden. Außerdem können Mutterlösungen der Substrate (10^–3 bis 10^–4 M) mehrere Wochen lang bei 4°C und vor Licht geschützt aufbewahrt werden.
Beispiel 2
2.1: Ausrüstung und Verfahren
Es können verschiedene ECE enthaltende Präparate, beispielsweise rekombinantes humanes ECE-1c, das in Cos-1- (Shimada et al., J. Biol. Chem., 269, 18275–18278 (1994)) oder in CHO-Zellen (Xu et al., Cell, 78, 473–485 (1994)) exprimiert worden ist, verwendet werden.
In allen Fällen wurde das Vorhandensein des Enzyms durch Western blot mittels eines Antikörpers nachgewiesen und seine Konzentration durch Vergleich mit dem gereinigten Enzym bestimmt.
Die ECE-Aktivität wurde in 96-Loch-Platten, im Allgemeinen unter folgenden Bedingungen, bestimmt:
100 μl Puffer 50 mM Tris-Maleat, pH 6,5, 20 μM oder 5 μM fluoreszierendes Peptid 1s oder 2s und 10 μl einer Lösung von ECE, die abhängig von seiner Reinheit und derart verdünnt worden war, dass die Spaltung des fluoreszierenden Substrats unter 5% blieb, wurden vereinigt. Es wurde 20 Minuten bis 1 h lang je nach dem verwendeten Substrat von 20 bis 37°C in Gegenwart oder Abwesenheit eines potenziellen Inhibitors mit festgelegten Konzentrationen (beispielsweise 5·10^–6 M und 10^–6 M) oder bei zunehmenden Konzentrationen von 10^–11 bis 10^–5 M inkubiert, um die K_I zu bestimmen. Die Reaktion wurde auf verschiedene Arten und Weisen abgebrochen, beispielsweise durch Erhitzen auf 90°C, plötzliche Abkühlung auf 4°C oder Zugabe eines organischen Lösungsmittels wie Dioxan mit 20% des Endvolumens, anschließend wurden die Messwerte von einem Fluorimeter (λ_ex = 340 nm; λ_em = 400 nm), an welches gegebenenfalls ein robotisiertes Analysensystem angeschlossen war, abgelesen. Durch Verwendung eines Gitterfluorimeters wird die Empfindlichkeit der quantitativen Analyse durch Ablesen des Messwerts für die Fluoreszenz bei 377 nm noch beträchtlich erhöht. Die Kontrollen wurden in Gegenwart aller Reagenzien, aber ohne ECE oder mit ECE, das zuvor durch eine 5 Minuten lange Erhitzung auf 90°C inaktiviert worden war, durchgeführt. Die K_m der Substrate (Affinitätskonstante des Enzyms für ein Substrat), berechnet durch Anwendung des Programms ENZFITTER, waren:
1s, K_m = 22,1 ± 0,9 μM,
2s, K_m = 2 ± 0,5 μM.
Die Werte für K_I der Inhibitoren können automatisch aus den Prozentsätzen des Abbaus bei verschiedenen Konzentrationen und Vergleich mit einem Kalibrierbereich bestimmt werden. Die beobachtete Fluoreszenz liefert direkt nach Linearisierung einen IC₅₀-Wert, der in K_I ausgehend von der Cheng-Prussof-Gleichung umgewandelt wird, K_I = IC₅₀/1 + ([S]/K_m), mit [S] als die Substratkonzentration.
2.2: Messung der ECE-Aktivität gegenüber den fluoreszierenden Peptiden 1s und 2s ohne Inhibitoren
Die Fluoreszenz der Substrate 1s und 2s sowie die ihrer Metaboliten wurde ohne Inhibitoren bestimmt. Die eingehaltene Vorschrift war die zuvor beschriebene.
In den 3a und 3b werden jeweils die Fluoreszenzemissionsspektren des Peptids 1s und seines Metaboliten 1m und des Peptids 2s und seines Metaboliten 2m berücksichtigt.
Was die gebildeten Produkte betrifft, so wurde ihre Analyse, um sich über die Selektivität des Substrats zu vergewissern, durch HPLC über einer C₁₈-Nucleosyl-Säule, 7 μm/300 Å (4,6 mm × 70 mm), indem ein Puffer B (0,038% TFA in CH₃CN/H₂O, 9/1 Vol./Vol.) und ein Gradient von 40 bis 47% des Puffers B verwendet wurde, innerhalb von 10 Minuten (Durchfluss 1 ml/min), durchgeführt.
In allen Fällen wurde nur eine einzige Spaltungsstelle des Dipeptids L·PyA-Lp·NF beobachtet, an welcher nur zwei Metaboliten erzeugt wurden.
Beispiel 3
Indem die in Beispiel 2 beschriebene Vorschrift wiederholt wurde, wurde die Bewertung des inhibierenden Verhaltens mehrerer Verbindungen durchgeführt.
Die getesteten Verbindungen waren:

negativer Bezug R = Retrothiorphan

T = Thiorphan

C = Captopril

L = Lysinhopril

positiver Bezug P = Phosphoramidon.
Die für die Versuche eingehaltenen speziellen Bedingungen waren:

* Durch Verwendung des Enzyms, das mit HCl 6 N oder durch 10 Minuten langes Erwärmen bei 80°C denaturiert worden war, modifizierte die Restfluoreszenz der Kontrolle nicht.

Es wurde 10 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert. Das ECE-Substrat wurde anschließend mit einem Verhältnis von 10°C zugegeben. Das Ganze wurde zwischen 20 Minuten und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und anschließend die Umsetzung entweder durch Abkühlung oder Zugabe von Dioxan (20 μl) abgebrochen.
Die Messwertgewinnung auf Cytofluor wurde bei 4°C mit folgenden Kennwerten durchgeführt: Anregung 340 nm, Emission 400 nm und mit meinem Gewinn von 85.
Die Versuche wurden mit einer 96-Loch-Mikrotiterplatte durchgeführt.
In Tabelle 1 ist für jede Vertiefung der Charakter der gestesteten Verbindung sowie deren Konzentration angegeben. Die Verbindungen wurden bei zwei Konzentrationen getestet.
Tabelle 1
Beispiel 4
In Tabelle II ist die für jede Vertiefung gemessene Fluoreszenzintensität angegeben. Ein kleiner Fluoreszenzwert zeigt eine starke inhibierende Aktivität der getesteten Verbindung an. Das inhibierende Verhalten der Verbindung P wurde vollständig bestätigt.
Tabelle 2
SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines PyA-(Z)x-pNF-Restes, wobei Z eine Kette, die bis zu 4 gegebenenfalls nicht natürliche Aminosäuren der L-Reihe umfasst, und x 1 oder 0 bedeutet, in einem Substrat für die Detektion, Identifizierung und/oder quantitative Analyse einer Protease oder Peptidase, die in der Lage ist, die oder eine Bindung zwischen PyA und pNF zu spalten, und/oder einer Verbindung mit inhibierender oder aktivierender Wirkung auf eine Protease oder Peptidase, die in der Lage ist, diese Bindung zu spalten, durch Fluoreszenz.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus den Familien der Serinproteasen, Cysteinproteasen, Aspartylproteasen und Metallproteasen ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine Metallprotease ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine Peptidsequenz ist, die von dem Endothelin-Konversions-Enzym (ECE) erkannt wird, und dass das ECE oder ein Inhibitor des ECE detektiert, identifiziert und/oder quantitativ analysiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Peptidylrest PyA-(Z)x-pNF x 0 bedeutet.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Dipeptid PyA-pNF in der Peptidsequenz vorhanden ist, die von dem ECE an der natürlichen Spaltungsstelle, an welcher dieses sich substituiert, erkannt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die substituierte Bindung die Trp21-Val22-Bindung von big-Endothelin-1 oder big-Endothelin-2 ist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die substituierte Bindung die Trp21-Ile22-Bindung von big-Endothelin 3 ist.
Verbindung mit der Formel (I): Ac(X1)nPyA-(Z)x-pNF-(X'1)m-R(I), in welcher: – X1 und X'1 unabhängig voneinander eine Aminosäure bedeuten, – Z eine Kette, die bis zu 4 gegebenenfalls nicht natürliche Aminosäuren der L-Reihe umfasst, und x 1 oder 0, – R OH oder NH2, – Ac eine Acetylgruppe und – n eine ganze Zahl von 2 bis 6 und m 0 bis 16 bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass x gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 9 oder 10 mit der Formel (Ia)
in welcher Z1, Z2, Z4, Z5 und Z6, die gegebenenfalls voneinander verschieden sind, eine Aminosäure bedeuten.
Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass – Z1 und Z2 derart sind, dass: • Z1 und Z2 jeweils eine Einfachbindung bedeuten, • Z1 eine Einfachbindung und Z2 die Aminosäure Asp bedeutet oder • Z1 und Z2 jeweils die Aminosäuren Leu und Asp bedeuten und – Z4, Z5 und Z6 derart sind, dass: • Z4, Z5 und Z6 jeweils eine Einfachbindung bedeuten, • Z5 und Z6 eine Einfachbindung bedeuten und Z4 die Aminosäure Pro bedeutet, • Z6 eine Einfachbindung bedeutet und Z4 und Z5 jeweils die Aminosäuren Pro und Arg bedeuten oder • Z4, Z5 und Z6 jeweils die Aminosäuren Pro, Arg und Ser bedeuten.
Verbindung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich handelt um:
Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie der Formel (IB) entspricht:
in welcher – Z eine Kette, die bis zu 4 gegebenenfalls nicht natürliche Aminosäuren der L-Reihe umfasst, und x 1 oder 0 bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich handelt um:
Verbindung mit der allgemeine Formel II: Ac(x1)nPyA(Z')x(II), in welcher – X1 gegebenenfalls voneinander verschieden sind und eine Aminosäure bedeuten und – n eine ganze Zahl von 2 bis 6, – x 0 oder 1 und – Z' eine Kette, die bis zu 4 gegebenenfalls nicht natürliche Aminosäuren der L-Reihe umfasst, bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich handelt um:
Verwendung einer wie in den Ansprüchen 9 bis 15 definierten Verbindung zur Detektion, Identifizierung und/oder quantitativen Analyse einer Protease, die aus der Familie der Serinproteasen, Cysteinproteasen, Aspartylproteasen und Metallproteasen ausgewählt ist, oder einer Verbindung, die in der Lage ist, dieses Enzym zu inhibieren oder zu aktivieren.
Verwendung nach Anspruch 18 zur Detektion, Identifizierung und/oder quantitativen Analyse von Metallproteasen.
Verfahren zur Detektion, Identifizierung und/oder quantitativen Analyse einer Verbindung, die in der Lage ist, das Endothelin-Konversions-Enzym (ECE) zu inhibieren oder zu aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass es das: – In-Berührung-Bringen einer Verbindung mit der allgemeinen Formel I, wie in den Ansprüchen 9 bis 15 definiert, die von dem Endothelin-Konversions-Enzym erkannt wird, mit dem Endothelin-Konversions-Enzym und mit mindestens einer Verbindung, die in der Lage ist, das ECE zu inhibieren oder zu aktivieren, in Lösung, und – Messen der Fluoreszenz, die bei Anwesenheit und gegebenenfalls bei Abwesenheit der zu detektierenden, zu identifizierenden und/oder quantitativ zu analysierenden Verbindung emittiert wird, umfasst, und dass die – Abwesenheit oder eine Verringerung der Fluoreszenz das Vorhandensein einer das Endothelin-Konversions-Enzym inhibierenden Verbindung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit der allgemeinen Formel I:
ist.
Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, die mit einem anormalen Plasmagehalt an Endothelin-Konversions-Enzym verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass in ihm eine Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 15 verwendet wird.